ES2353801T3 - Aislamiento y purificación de carotenoides de las flores de la caléndula. - Google Patents

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Abstract

Método de producción de carotenoides ricos en luteína a partir de los pétalos de las flores de la caléndula que comprende los pasos siguientes: (a) ensilado de los pétalos de las flores de la caléndula bajo condiciones anaerobias controladas para fijar y enriquecer los carotenoides presentes en los pétalos, (b) deshidratación a través de un proceso de secado ecológico para obtener harina desecada, (c) peletización de la harina, (d) extracción con solvente de la harina peletizada utilizando hexanos de grado alimenticio para obtener ésteres de carotenoides ricos en oleorresina de la caléndula, (e) hidrólisis de los ésteres de carotenoides con álcali tras homogeneizar la oleorresina en alcohol absoluto, (f) precipitación de los cristales de carotenoides utilizando una mezcla de alcohol y agua, (g) lavado con una cantidad suficiente de agua caliente para eliminar los jabones hidrosolubles, clorofilinas y otras impurezas orgánicas como trazas de hexanos residuales, (h) filtración de los cristales de carotenoides utilizando un filtro prensa, centrífuga y filtro de Neutch, (i) secado para obtener los cristales de carotenoides puros con altos niveles de pureza, contenido de humedad considerablemente bajo y sin solventes residuales perjudiciales.

Description

Aislamiento y purificación de carotenoides de las flores de la caléndula.
Sector de la invención
La presente invención se refiere a cristales de carotenoides puros obtenidos de las flores de la caléndula y particularmente a su proceso de aislamiento y purificación.
Antecedentes de la invención
Está demostrado científicamente que los cristales de carotenoides puros obtenidos de las flores de la caléndula, que comprenden predominantemente xantofilas como luteína, zeaxantina y criptoxantina y bajos niveles de \beta-caroteno, reducen el riesgo de padecer degeneración macular asociada a la edad (referencia: Moeller SM, Jacques PF, Blumberg JB "The potential role of dietary Xanthophylls in cataract and age related macular degeneration", (El papel potencial de las xantofilas de la dieta en las cataratas y la degeneración macular asociada a la edad), Journal of the American College of Nutrition, 2000; 19: 522S-527S), controlan el nivel de colesterol LDL (referencia: Chopra M., Thurnham DI, "Effect of Lutein on oxidation of low density lipoproteins (LDL) in vitro", (Efecto de la luteína sobre la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) in vitro ), Proceedings of the Nutrition Society, 1994; 53:1993, nº 18A), previenen enfermedades arteriales coronarias (referencia: Howard AN, Williams NR, Palmer CR, Cambou JP, Evans AE, Foote JW, et al., "Do hydroxy-carotenoids prevent coronary heart disease? A comparison between Belfast and Toulouse", (¿Previenen los hidroxi-carotenoides la enfermedad arterial coronaria? Una comparación entre los casos de Belfast y Toulouse), International Journal of Vitamin and Nutrition Research, 1996; 66: 113-118), y son capaces de captar radicales libres e incrementar la inmunidad (referencia: Chew BP, Wong MW, Wong TS, "Effects of Lutein from Marigold extract on immunity and growth of mammary tumors in mice", (Efectos de la luteína de extractos de la caléndula sobre la inmunidad y el crecimiento de tumores mamarios en ratones), Anticancer Research, 1996; 16: 3689-3694).
La luteína (\beta-\varepsilon-caroteno-3-3'-diol) y la zeaxantina (\beta-\beta-caroteno-3-3'-diol) pertenecen al grupo de las xantofilas dentro de la familia de los carotenoides con grupos hidroxilo altamente reactivos los cuales no pueden ser sintetizados ni por el ser humano ni por los animales.
Los carotenoides son una clase de pigmentos naturales liposolubles que se encuentran principalmente en plantas, algas, y bacterias fotosintéticas donde juegan un papel crítico en el proceso fotosintético. Estos pigmentos se encuentran también en algunas bacterias no fotosintéticas, levaduras, y mohos, donde pueden realizar una función protectora frente a los efectos perjudiciales de la luz y el oxígeno. Aunque los animales parecen ser incapaces de sintetizar carotenoides, algunos los incorporan a través de su dieta. Una vez dentro del organismo, los carotenoides proporcionan una coloración brillante, actúan como antioxidantes, y pueden ser una fuente de compuestos con actividad de vitamina A (Ong y Tee 1992; Britton et al., 1995).
Los carotenoides son responsables de muchas de las tonalidades rojas, anaranjadas, y amarillas de las hojas, frutas, y flores, así como de los colores de algunas aves, insectos, peces, y crustáceos. Como ejemplos familiares de la coloración debida a los carotenoides se pueden mencionar el naranja de las zanahorias y frutas cítricas, el rojo de los pimientos y tomates, y el rosado de los flamencos y salmones (Pfander 1992). Se conocen hasta 600 carotenoides diferentes en la naturaleza (Ong y Tee 1992), y aún quedan nuevos por identificar (Mercadante 1999).
Los carotenoides se definen en función de su estructura química. La mayoría de ellos derivan de una cadena de polieno de 40 átomos de carbono, que podría considerarse el esqueleto de la molécula. Esta cadena puede tener grupos cíclicos (anillos) en su extremo final y puede estar complementada con grupos funcionales que contienen oxígeno. A los carotenoides hidrocarbonados se les denomina carotenos, mientras que sus derivados oxigenados son denominados xantofilas. El beta-caroteno, el principal carotenoide de las zanahorias, es un caroteno familiar, mientras que la luteína, el pigmento amarillo primordial de los pétalos de las flores de la caléndula, es una xantofila común.
La estructura de un carotenoide determina en última instancia su(s) potencial(es) función(es) biológi-
ca(s). El patrón distintivo de dobles y simples enlaces alternantes en el esqueleto de polieno de los carotenoides es lo que les permite absorber el exceso de energía de otras moléculas, mientras que la naturaleza de los grupos finales específicos puede influir en su polaridad.
La primera característica puede aclarar las propiedades antioxidantes de los carotenoides biológicos, mientras que la segunda puede explicar las diferentes formas que tienen los carotenoides individuales de interaccionar con las membranas biológicas (Britton 1995).
La patente norteamericana nº 5.382.714 indica que la oleorresina saponificada de la caléndula de Industrias Kemin (Des Moines, Iowa) que contiene luteína libre es el material de partida preferido para aislar luteína pura. El paso de saponificación incluye un elevado porcentaje de glicol de propileno y el tiempo de saponificación se realiza durante un periodo mínimo de tres horas sometiendo el producto a calor por un periodo prolongado, lo que incrementa también la duración del proceso.
En la patente norteamericana nº 5.648.564 se utiliza álcali acuoso y glicol de propileno en donde los ésteres de carotenoides ni son solubles ni libremente miscibles y, por tanto, se requiere un tiempo muy prolongado a mayor temperatura para saponificar los ésteres grasos lo que puede dar lugar a que el producto esté expuesto al calor y al aire por un periodo más largo, lo que promueve la formación de productos de degradación oxidativa y que la duración del proceso sea demasiado larga para un lote comercial.
En la patente norteamericana nº 6.743.953 se describe el paso final de purificación el cual incluye múltiples solventes como acetato de etilo, hexano, acetona y metanol con la posibilidad de que queden residuos en el producto. De igual forma, el proceso incluye un tiempo de saponificación de hasta 3 horas sometiendo el producto a calor a una temperatura de 70ºC durante más tiempo lo cual puede producir productos de degradación oxidativa en la masa saponifica-
da.
La patente norteamericana nº 6.380.442 establece que la hidrólisis de los carotenoides se lleva a cabo utilizando alcohol isopropílico con un tiempo de saponificación de 90 minutos.
En la patente norteamericana nº 6.504.067 se manifiesta que la oleorresina de la caléndula se pre-trata con carbonato sódico y se neutraliza posteriormente con ácido fosfórico diluido, antes de someter el producto a la reacción de saponificación utilizando álcali acuoso a una temperatura de 90ºC durante 8 horas. A continuación, se reajusta el pH de la masa de reacción a 5,0 con ácido acético y se lavan los residuos con agua en exceso para conseguir que el pH sea neutro. La desventaja de este proceso reside en que se somete el producto a calor por un periodo prolongado y hay demasiados pasos de acidificación y neutralización implicados en la eliminación de impurezas.
Breve sumario de la invención
La presente invención es un proceso realista y eficiente para el aislamiento de carotenoides, predominantemente luteína, de los pétalos de las flores de la caléndula (como fuente preferida). El proceso incluye el ensilado de los pétalos de las flores de la caléndula bajo condiciones anaerobias controladas para fijar y enriquecer los carotenoides presentes en los pétalos, y la deshidratación que consta de dos pasos como trituración en prensa de tornillo y secado por lecho fluido que utiliza gas pobre ecológico como medio calentador del secador sin que haya emisiones nocivas de chimeneas obteniéndose harina desecada. Esta harina desecada se peletiza hasta obtener un tamaño, densidad y dureza convenientes para facilitar una mejor extracción de los ésteres de carotenoides. Los sedimentos son extraídos con solvente utilizando hexanos de grado alimenticio y se separan reduciendo el nivel de dicho solvente lo máximo posible obteniéndose una oleorresina con un nivel de degradación muy bajo.
La oleorresina se homogeneiza entonces con alcohol absoluto antes de añadir el álcali y los ésteres son saponificados a una temperatura comprendida entre 70ºC y 80ºC durante un periodo máximo de 30 minutos únicamente. Los carotenoides hidrolizados se precipitan luego utilizando una mezcla de agua y alcohol y se lavan con agua caliente para eliminar todas las trazas de impurezas indeseables. Los cristales lavados se filtran con centrífuga y se secan al vacío o bien a presión atmosférica para eliminar, si existe, la humedad y las impurezas orgánicas volátiles.
Las ventajas de la presente invención radican en que los ésteres de carotenoides se pueden saponificar en sólo 30 minutos obteniéndose un grado de saponificación superior al 99% y que el producto no está sometido a calor por un periodo prolongado lo que podría dar lugar a la formación de productos de degradación oxidativa. La masa saponificada se precipita inmediatamente con la ayuda de una mezcla de alcohol y agua bajo condiciones ligeramente calientes lo que favorece la eliminación de la mayor parte de las impurezas indeseables sin reaccionar en un único paso. Todo el proceso de homogeneización, saponificación, precipitación, lavado y filtrado se puede completar en un intervalo de tiempo de 3 horas.
La presente invención es ventajosa en cuanto a su combinación tiempo-temperatura, la simplicidad del procedimiento y el uso de bajas cantidades de solventes. Todos estos factores contribuyen a optimizar el rendimiento y la estabilidad del producto abaratándose el coste de producción a escala comercial.
Descripción detallada de la invención
La presente invención es un proceso realista y eficiente para el aislamiento y purificación de carotenoides de los pétalos de las flores de la caléndula que comprenden predominantemente luteína. La especie Tagetes erecta es cultivada en base a un paquete de prácticas establecido que incluye la producción, la recolección y el transporte de semillas a la unidad de deshidratación a las pocas horas de la recogida. El paquete de prácticas comprende el desarrollo de semillas no transgénicas y el cultivo adaptado a condiciones tropicales. Las flores se cogen inmediatamente para su ensilado en silos tras su limpieza física y se pulverizan con un aditivo antioxidante para ensilaje a una concentración apropiada bajo estrechas condiciones anaerobias.
Preferiblemente, el ensilado se lleva a cabo bajo condiciones anaerobias utilizando depuradores y selladores de oxígeno lo que minimiza la pérdida de pigmento debida a la formación de productos de oxidación indeseables.
El ensilado se monitoriza a través del pH y la temperatura del ensilaje y se asegura la fermentación total sobre un periodo de dos a tres semanas.
Entonces, las flores ensiladas se recolectan de los silos y se someten al proceso de deshidratación en una serie de pasos. Las flores ensiladas se exponen a una prensa de tornillo industrial en dos etapas y son prensadas para extraer el agua sobrante, disminuyendo el contenido de humedad del 88% al 75%. Las flores prensadas son sometidas luego a trituración antes de secarlas utilizando un secador de lecho fluido. Las flores trituradas se secan en un secador de lecho fluido que utiliza aire caliente generado por la combustión del gas pobre producido por un gasificador ecológico sin emisión alguna de chimeneas. El secador de lecho fluido industrial de tipo túnel consta de cámaras de secado a diferentes temperaturas que lo atraviesan desde la entrada, siendo la zona de temperatura máxima (85ºC a 90ºC), hasta la salida en donde la temperatura es de 45ºC a 50ºC.
El tiempo de tránsito dentro del SLF desde la entrada hasta la salida es de sólo 30 minutos como máximo, en donde el nivel de humedad en el producto se reduce del 75% al 10%. La ventaja de este proceso de secado reside en que el producto no está sometido a calor elevado durante un periodo de tiempo extenso, minimizándose la formación de productos de degradación oxidativa que podrían generarse debido a exposiciones prolongadas al calor y al aire.
La harina desecada de la caléndula se muele utilizando un molino de martillo industrial hasta que el tamaño de las partículas sea inferior a 400 micras.
La harina molida de la caléndula se peletiza utilizando una peletizadora industrial hasta obtener un tamaño de sedimentos de 6 mm a 10 mm y la densidad a granel deseada con la ayuda de vapor/agua caliente como aglutinante.
Los sedimentos de las flores de la caléndula se someten a extracción con disolvente utilizando hexanos de grado alimenticio en una batería de extractores que funcionan a contracorriente para conseguir la máxima extracción de los principios activos, es decir, xantofilas y carotenoides junto con los otros resinoides y lípidos. Entonces, la miscela pobre se concentra en evaporadores de película descendente y ascendente para reducir la concentración del solvente del 90%-95% al 5% aproximadamente. La miscela concentrada se somete a destilación al vacío para reducir el nivel de solvente del 5% al 1%. Esta oleorresina cruda de la caléndula conteniendo un 1% de solvente se concentra posteriormente mediante la eliminación de dicho solvente con corriente de nitrógeno y vapor para que los niveles de solvente en la oleorresina final sean inferiores a 1.000 ppm. En ningún momento de toda la operación de concentración el producto estuvo sometido a temperaturas superiores a 60ºC, minimizándose la formación de productos de degradación oxidativa como epóxidos.
La oleorresina de la caléndula obtenida se homogeneiza en un reactor con agitación a una temperatura no superior a 45ºC por un periodo máximo de 10 minutos.
La oleorresina de la caléndula homogeneizada se hidroliza después en el mismo reactor añadiendo de 1,2 a 2,0 volúmenes de una solución de hidróxido potásico alcohólico del 13% al 15%, de la cantidad de oleorresina, a una temperatura comprendida entre 70ºC y 80ºC durante un periodo de tiempo no superior a 30 minutos en donde el alcohol utilizado es alcohol etílico absoluto con un contenido de humedad inferior al 5%. El grado de saponificación se verifica bien mediante cromatografía en capa fina o bien por cromatografía líquida de alta presión y la cocción final se realiza durante 10 minutos a la misma temperatura tras comprobar que la saponificación total fue superior al 99%.
A la masa saponificada, se le añade agua caliente a una temperatura de 65ºC a 75ºC que ha sido generada en un vaso separado y se homogeneiza bien durante 10 minutos a la misma temperatura para favorecer la cristalización de los carotenoides presentes en la mezcla de agua y alcohol absoluto en la proporción de 1:1, en donde la proporción de alcohol etílico respecto al agua es de 50:50, lo que promueve una mejor cristalización de los carotenoides y también disuelve las impurezas indeseables como jabones, lípidos, grasas y otros componentes orgánicos.
La masa diluida se filtra bombeándola a través de un filtro prensa asistida por presión positiva utilizando nitrógeno o aire. La masa recolectada dentro de la placa del filtro prensa se lava con una cantidad suficiente de agua caliente a una temperatura de 60ºC a 70ºC hasta que el pH sea neutro con un valor de 7,0.
Preferiblemente, el lavado se lleva a cabo utilizando un volumen de 15 veces de agua caliente a una temperatura comprendida entre 50ºC y 70ºC para asegurar que el pH del producto sea neutro y que no contiene trazas ni de álcali ni de impurezas perjudiciales indeseables.
La masa húmeda recolectada de la placa del filtro prensa se pone en bandejas en capas finas y se seca en un secador de bandejas a una temperatura comprendida entre 50ºC y 55ºC a presión atmosférica o en un secador de bandejas al vacío a presión reducida a una temperatura comprendida entre 40ºC y 45ºC por un periodo de tiempo suficiente (normalmente de 3 a 4 horas) para que el nivel de humedad en el producto sea inferior al 1% y las impurezas orgánicas volátiles nocivas estén por debajo del límite detectable por cromatografía de gases.
El producto resultante contiene un mínimo del 90% de carotenoides determinado mediante espectrofotometría y un mínimo del 90% de all-trans-luteína, del 5% al 8% de all-trans-zeaxantina, menos del 1% de cada una de las cis-luteínas, beta-caroteno y criptoxantina, determinado por medio de cromatografía líquida de alta presión de fase normal.
La recuperación química de los principios activos, es decir, carotenoides y xantofilas en el producto final oscila entre el 55% y el 80% dependiendo de la pureza deseada del producto final y de las condiciones variables de la misma utilizadas en base a los parámetros del proceso anterior según ligeras modificaciones del presente proceso.
El producto acabado de cristales de carotenoides obtenido se formulan y estabilizan a granel, en forma de polvos, perlas, gránulos, dispersiones oleosas y acuosas con concentraciones que varían del 1% al 40% añadiendo excipientes y emulsionantes de grado farmacéutico adecuados dependiendo del uso final de acuerdo con las normas de productos alimenticios y nutricionales.
Ejemplo 1
25 kg de oleorresina de la caléndula con un contenido en xantofilas de 92,19 g/kg o del 9,22% se ponen en un reactor de 100 litros de capacidad con un agitador. La oleorresina se homogeneiza durante 10 minutos con agitación a una temperatura de 40ºC empleando vapor o agua caliente de la camisa del reactor como medio calentador. Se prepara KOH etanólico tomando 5 kg de KOH con una pureza del 95% y disolviéndolo en 35 litros de alcohol etílico (1:1,4 volúmenes). El KOH etanólico preparado se añade lentamente en el vaso de reacción el cual contiene la masa homogeneizada. La reacción de saponificación se realiza a una temperatura de 75ºC durante 30 minutos. Después de verificar que el grado de saponificación es superior al 99% por HPLC, se añaden a la masa reaccionada 40 litros de agua caliente desmineralizada que ha sido mantenida a una temperatura de 70ºC y se continúa agitando durante 10 minutos. La masa diluida con los cristales de carotenoides se bombea dentro de un filtro prensa para recuperar dichos cristales. A través del filtro prensa se bombean 250 litros de agua caliente adicional para lavar las impurezas indeseables y reducir el pH del efluente a uno neutro de valor 7,0. Tras asegurar la neutralización, se aplica al filtro prensa una presión positiva de 1,25 kg con nitrógeno para extraer los cristales retenidos dentro del filtro. Los cristales húmedos se recogen de las placas del filtro prensa y se disponen en una capa fina en las bandejas de un secador donde se secan a una temperatura de 55ºC durante 3 horas bajo presión normal.
La recuperación física del producto final es del 6,76%. Los cristales de carotenoides obtenidos contenían un 91,28% de carotenoides (determinado por espectrofotometría) de los cuales el 81,99% es all-trans-luteína, el 6,90% es all-trans-zeaxantina, el 0,27% son cis-luteínas, el 0,23% es beta-caroteno y el 0,5% es criptoxantina (determinado por HPLC). La recuperación química del producto final es del 66,9%.
El producto final tenía un contenido de humedad del 0,57% y el análisis por cromatografía de gases no detectó trazas de hexanos residuales.
Ejemplo 2
25,5 kg de oleorresina de la caléndula con un contenido en xantofilas de 102,18 g/kg o del 10,22% se ponen en un reactor de 100 litros de capacidad con un agitador.
La oleorresina se homogeneiza durante 10 minutos con agitación a una temperatura de 45ºC empleando vapor o agua caliente de la camisa del reactor como medio calentador. Se prepara KOH etanólico tomando 5,1 kg de KOH con una pureza del 95% y disolviéndolo en 40 litros de alcohol etílico (1:1,56 volúmenes).
El KOH etanólico preparado se añade lentamente en el vaso de reacción el cual contiene la masa homogeneizada. La reacción de saponificación se realiza a una temperatura de 73ºC durante 30 minutos. Después de verificar que el grado de saponificación es superior al 99% por HPLC, se añaden a la masa reaccionada 45 litros de agua caliente desmineralizada que ha sido mantenida a una temperatura de 65ºC y se continúa agitando durante 10 minutos. La masa diluida con los cristales de carotenoides se bombea dentro de un filtro prensa para recuperar dichos cristales. A través del filtro prensa se bombean aproximadamente 275 litros de agua caliente adicional para lavar las impurezas indeseables y reducir el pH del efluente a uno neutro de aproximadamente 7,0. Tras asegurar la neutralización, se aplica al filtro prensa una presión positiva de 1,2 kg con nitrógeno para extraer los cristales retenidos dentro del filtro. Los cristales húmedos se recogen de las placas del filtro prensa y se disponen en una capa fina en las bandejas de un secador donde se secan a una temperatura de aproximadamente 45ºC durante 2 horas bajo presión de vacío de 600 mm
Hg.
La recuperación física del producto final es del 7,67%. Los cristales de carotenoides obtenidos contenían un 93,76% de carotenoides (determinado por espectrofotometría) de los cuales el 92,86% es all-trans-luteína, el 6,14% es all-trans-zeaxantina, el 0,12% son cis-luteínas, el 0,22% es beta-caroteno y el 0,52% es criptoxantina (determinado por HPLC). La recuperación química del producto final es del 70,53%.
El producto final tenía un contenido de humedad del 0,63% y el análisis por cromatografía de gases no detectó trazas de hexanos residuales.

Claims (14)

1. Método de producción de carotenoides ricos en luteína a partir de los pétalos de las flores de la caléndula que comprende los pasos siguientes: (a) ensilado de los pétalos de las flores de la caléndula bajo condiciones anaerobias controladas para fijar y enriquecer los carotenoides presentes en los pétalos, (b) deshidratación a través de un proceso de secado ecológico para obtener harina desecada, (c) peletización de la harina, (d) extracción con solvente de la harina peletizada utilizando hexanos de grado alimenticio para obtener ésteres de carotenoides ricos en oleorresina de la caléndula, (e) hidrólisis de los ésteres de carotenoides con álcali tras homogeneizar la oleorresina en alcohol absoluto, (f) precipitación de los cristales de carotenoides utilizando una mezcla de alcohol y agua, (g) lavado con una cantidad suficiente de agua caliente para eliminar los jabones hidrosolubles, clorofilinas y otras impurezas orgánicas como trazas de hexanos residuales, (h) filtración de los cristales de carotenoides utilizando un filtro prensa, centrífuga y filtro de Neutch, (i) secado para obtener los cristales de carotenoides puros con altos niveles de pureza, contenido de humedad considerablemente bajo y sin solventes residuales perjudiciales.
2. El método de la reivindicación 1 (a), en donde dichas flores de la caléndula pertenecen a la especie Tagetes erecta que se han desarrollado a partir de semillas no transgénicas utilizando las prácticas de cultivo adaptado a condiciones tropicales.
3. El método de la reivindicación 1 (a), en donde el ensilado se lleva a cabo verdaderamente bajo condiciones anaerobias utilizando depuradores y selladores de oxígeno, lo que minimiza la pérdida de pigmento debida a la formación de productos de oxidación indeseables.
4. El método de la reivindicación 1 (b), en donde la deshidratación a través del proceso de secado ecológico se realiza utilizando secadores de lecho fluido con un mecanismo calentador que emplea el gas pobre producido por gasificadores, sin que haya emisiones nocivas de chimeneas.
5. El método de la reivindicación 1 (c), en donde la peletización se realiza utilizando un compactador adecuado para favorecer más la extracción con solvente.
6. El método de la reivindicación 1 (d), en donde la extracción con solvente se lleva a cabo utilizando hexanos de grado alimenticio para obtener oleorresina de la caléndula que contiene una cantidad mínima de solventes residuales, empleando un procedimiento de extracción a contracorriente para obtener la máxima extracción de los carotenoides.
7. El método de la reivindicación 1 (d), en donde la temperatura no supera los 60ºC minimizándose la formación de productos de degradación oxidativa.
8. El método de la reivindicación 1 (e), en donde la homogeneización de la oleorresina se realiza utilizando alcohol absoluto a una temperatura no superior a los 45ºC durante un periodo de tiempo de 10 minutos.
9. El método de la reivindicación 1 (e), en donde la hidrólisis de los ésteres de carotenoides se lleva a cabo utilizando hidróxido potásico etanólico.
10. El método de la reivindicación 1 (e), en donde la temperatura de hidrólisis está comprendida entre 70ºC y 80ºC y el tiempo de saponificación no supera los 30 minutos.
11. El método de la reivindicación 1 (f), en donde la precipitación de los cristales de carotenoides se realiza utilizando una mezcla de agua y alcohol absoluto en una proporción de 50:50.
12. El método de la reivindicación 1 (g), en donde el lavado se lleva a cabo utilizando un volumen de 15 veces de agua caliente a una temperatura comprendida entre 50ºC y 70ºC para asegurar que pH del producto es neutro y que no contiene trazas ni de álcali ni de impurezas perjudiciales indeseables.
13. El método de la reivindicación 1 (i), en donde el secado se realiza a 50ºC-55ºC a presión ambiental o a 40ºC-45ºC bajo presión reducida.
14. El método de la reivindicación 1, en donde los cristales de carotenoides puros así obtenidos son formulados y estabilizados a granel, en forma de polvos, perlas, gránulos, dispersiones oleosas y acuosas.
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