ES2353638T9

ES2353638T9 - Oligonucleótidos de lna y el tratamiento del cáncer.

Info

Publication number: ES2353638T9
Application number: ES05800759T
Authority: ES
Inventors: Lene SØNderbye Kjerulff; Christoph Rosenbohm; Majken Westergaard; Marlene Asklund; Bo Hansen; Margit Wissenbach
Original assignee: Santaris Pharma AS
Current assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS
Priority date: 2004-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2011-06-16
Anticipated expiration: 2025-11-09
Also published as: ATE482271T1; DK1824975T3; ZA200704254B; ES2353638T3; CN101065485A; DE602005023772D1; CN101065485B

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente Invención proporciona composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento del cáncer. Las composiciones comprenden un oligonucleótido de LNA particular que tiene excelentes propiedades con respecto a la inhibición de la expresión de Survivina. La presente invención también proporciona un procedimiento para tratar el cáncer y diversos kits. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Survivina es una de las nuevas dianas del cáncer más atractivas. El papel clínico de la Survivina en el cáncer se ha enfatizado por detección de altos niveles de esta proteína en casi todos los tipos tumorales. Una expresión elevada de Survivina en tumores se asocia generalmente con un aumento de las recidivas del cáncer de mal pronóstico y de la resistencia a terapia, tanto a radiación como a quimioterapia. El hecho de que la expresión de Survivina, con unas pocas excepciones, no se encuentre en tejidos adultos normales hace que la Survivina sea un gen central en el cáncer.

El inhibidor de proteínas apoptóticas (IAP) Survivina está implicado en dos acontecimientos biológicos clave: (i) control de la proliferación celular (mitosis) y (ii) regulación de la muerte celular programada (apoptosis). Además, la Survivina desempeña un papel importante en la angiogénesis tumoral.

Una combinación de ARNic que se dirige a Survivina y Taxol da como resultado una inducción de la apoptosis aumentada en células SHEP en comparación con ARNic y Taxol en solitario (Zangemelster-Wlttke 2003; Ann. N.Y. Acad. Sci. 1002: 90-94).

Wang y col., 2003; Zhonghua Xue Ye Za Zhi 24, 351-54. “Survivin antisense RNA enhances Taxol-induced apoptosis in leukemia cell line HL-60”.

Una amplia variedad de oligonucleótidos de LNA antisentido posibles se describieron en la publicación de solicitud de patente internacional anterior de los solicitantes Nº WO 2004/069991 A2. Sin embargo, las sorprendentemente buenas propiedades de los oligonucleótidos de LNA desveladas en el presente documento no se han descrito todavía en la técnica anterior. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto principal de la presente Invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de taxano y un oligonucleótido de LNA en un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

MeCx

5’-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(C)-3’ (SEC ID Nº: 28); en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de βD-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que las unidades de nucleótidos entre paréntesis representan cada una una unidad opcional; y en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a 1:25.

Un segundo aspecto principal de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de taxano y un conjugado en un vehículo farmacéuticamente aceptable, consistiendo dicho conjugado en un oligonucleótido de LNA y al menos un resto no nucleotídico/no polinucleotídico unido covalentemente a dicho oligonucleótido, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28), que tiene preferentemente un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y que comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 1), en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y la parte de oligonucleótido de LNA del conjugado en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a

1:25. Un tercer aspecto principal de la presente invención se refiere a un kit que comprende

(a): un primer componente que contiene una o más dosis de solución inyectable de un oligonucleótido de LNA, y

(b): un segundo componente que contiene una o más soluciones inyectables de uno o más compuestos de taxano;

en el que dicho oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1), en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que la proporción en peso entre el al menos un compuesto de taxano en una solución del segundo componente y al menos un oligonucleótido de LNA en una solución del primer componente está en el intervalo de 50:1 a 1:25.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la estabilidad de la SEC ID Nº: 2 en plasma de ratón y humano en comparación con la SEC ID Nº: 25 de control. Los oligonucleótidos se incubaron a concentraciones de 20 µM a 37ºC durante 0, 1, 2, 4, 24, 48 ó 96 horas. No pueden detectar productos de degradación de la SEC ID Nº: 2 incluso después de 96 horas de digestión en cualquier suero. La Figura 2A muestra la regulación negativa de la proteína Survivina en células de cáncer de próstata 15PC3 transfectadas con SEC ID Nº: 2. Las células 15PC3 se transfectaron con 1, 10 y 25 nM de la SEC ID Nº: 2 y se analizaron a los puntos temporales de 12, 24 y 48 horas para determinar la regulación negativa de la proteína Survivina por transferencia de Western. Las células transfectadas con SEC ID Nº: 2 o con transfección simulada se recogieron y se compararon para determinar la expresión de proteína Survivina. Se controló al mismo tiempo la proteína Bcl-2. La Figura 2B muestra una cuantificación de la proteína Survivina usando ELISA después del tratamiento de células 15PC3 con SEC ID Nº: 2 en comparación con las tratadas con el control negativo SEC ID Nº: 24 y las de tratamiento simulado durante 24 horas. Las células 15PC3 se transfectaron con SEC ID Nº: 2 a cuatro concentraciones que variaban de 0,045 nM o con el control negativo SEC ID Nº: 24 a 5 nM. La Figura 2C muestra la expresión de las 3 isoformas diferentes de ARNm de Survivina (Survivina de longitud completa, Survivina2B y SurvivinaAex3) en células 15PC3 después del tratamiento con SEC ID Nº: 2 5 nM, en comparación con la SEC ID Nº: 24 5 nM o con tratamiento simulado. La expresión se normaliza respecto a la expresión de GAPDH y se relaciona con el promedio de la expresión en las células con tratamiento simulado. Es evidente que la SEC ID Nº: 2 es capaz de regular negativamente todas las isoformas expresadas de Survivina humana, mientras que el control negativo SEC ID Nº: 24 no lo es. La Figura 3 muestra la apoptosis medida como la actividad de la Caspasa 3/7 inducida después de 13-72 horas de tratamiento con la SEC ID Nº: 2 en células 15PC3. Las células 15PC3 se transfectaron con la SEC ID Nº: 2 o con el control negativo, la SEC ID Nº: 24, a cinco concentraciones que variaban de 0,2-100 nM. La inducción en veces se presenta respecto al tratamiento simulado como valor medio de tres experimentos independientes. La desviación típica se presentada en cada barra. La Figura 4 muestra que el tratamiento de células HeLa con la SEC ID Nº: 2 5 nM o 25 nM conduce la inducción dependiente de la dosis de apoptosis temprana y tardía medida por tinción con Anexina V-FITC/PI analizada por citometría de flujo. A las mismas concentraciones, el oligonucleótido de control negativo SEC ID Nº: 24 no induce apoptosis. La Figura 5 muestra la proliferación de células de cáncer de próstata 15PC3 después del tratamiento con SEC ID Nº: 2 durante 13-72 horas después de la transfección. Las células 15PC3 se transfectaron con SEC ID Nº: 2 o con un oligonucleótido de control negativo, la SEC ID Nº: 24, a 0,2, 1, 5, 25 y 100 nM. Se muestra el número relativo de células viables en comparación con las células no tratadas, con tratamiento simulado. Los datos proceden de tres experimentos independientes. La desviación típica se presenta en cada barra. La SEC ID Nº: 2 conduce a una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación mientras que el control negativo SEC ID Nº: 24 no lo hace. La Figura 6A muestra la apoptosis medida como la actividad de la Caspasa 3/7 inducida después de 24-72 horas de tratamiento con la SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 2 o Taxol en células de cáncer de próstata 15PC3. Las células se trataron con la SEC ID Nº: 22 o la SEC ID Nº: 2 a 10 nM en combinación con Taxol (10 nM o 100 nM), se usó DMSO al 0,1% como vehículo. La inducción en veces se presenta respecto al tratamiento simulado como valor medio. La combinación de la SEC ID Nº: 2 con Taxol muestra un claro efecto aditivo sobre la inducción de apoptosis después de tanto 48 horas como 72 horas. La Figura 6B muestra la expresión de ARMn de Survivina en células 15PC3 después de 24 horas y 48 horas de tratamiento con SEC ID Nº: 2 2 nM o con SEC ID Nº: 2 2 nM combinado con Taxol 10 nM. La expresión se analiza mediante qPCR, se normaliza respecto a la expresión de GAPDH y se relaciona con el nivel de expresión en células con tratamiento simulado (DMSO al 0,1%). Se encuentra que el ARNm de Survivina está regulado negativamente en ambos programas de tratamiento y en ambos puntos temporales. La Figura 6C muestra la expresión de ARNm de Survivina y ARNm de Bcl-2 en células 15PC3 después de 24 horas de tratamiento con SEC ID Nº: 26 10 nM (específica de Bcl2), SEC ID Nº: 2 10 nM, SEC ID Nº: 24 de control 10 nM, SEC ID Nº: 27 10 nM (control negativo para la SEC ID Nº: 26) o combinaciones de 10 nM de cada uno de los oligonucleótidos. Toda la expresión se analiza mediante qPCR, se normaliza respecto a la expresión de GAPDH y se relaciona con el nivel de expresión en células con tratamiento simulado. La SEC ID Nº: 26 es específica de Bcl-2 y no tiene ningún efecto sobre la Survivina, ni como agente en solitario ni en combinación con compuestos de control (SEC ID Nº: 24 o SEC ID Nº: 27). La SEC ID Nº: 2 es un fuerte Inductor de la apoptosis y tiene efectos sobre la expresión de Survivina y Bcl-2, como agente en solitario o en combinación con compuestos de control (SEC ID Nº: 24 o SEC ID Nº: 27). Las Figuras 7A y 7B muestran un análisis del ciclo celular en células 15PC3 tratadas con SEC ID Nº: 2 y Taxol. Se transfectaron células 15PC3 con 2 nM de la SEC ID Nº: 2 y se expusieron a 10 nM de Taxol (en DMSO al 0,1%) o vehículo (DMSO al 0,1%). Las células se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por FACS después de 24 horas y 48 horas (Figura 7a) o 24 horas (Figura 7b) en comparación con células 15PC3 tratadas asimismo con 10 nM del control negativo SEC ID Nº: 24. Este ensayo muestra el efecto específico de la SEC ID Nº: 2 en solitario y en combinación con Taxol. Se aumentan las fracciones celulares en la fase G2 o incluso G4 cuando se detiene el ciclo celular. Las células tratadas con SEC ID Nº: 2 se detienen en el ciclo celular conduciendo a proporciones de G1.G2 de 1:1 frente a 1:0,25 en las de tratamiento simulado, mientras que el contrato negativo SEC ID Nº: 24 no tiene efecto sobre el ciclo celular. El taxol combinado con la SEC ID Nº: 2 conduce a una detención adicional observada como una proporción de G1:G2 de 1:3. La Figura 8 muestra las propiedades in vivo de la SEC ID Nº: 2 y de la SEC ID Nº: 2 en combinación con Taxol. Los compuestos se administraron en dos programas de dosis diferentes (A y B) como se resume en el panel inferior de la figura. Se observa una reducción del peso tumoral usando ambos programas por comparación de los dos grupos que reciben SEC ID Nº: 2 combinada con Taxol después de 27 días con los de tratamiento con agente en solitario o solución salina (tratamiento simulado). La Figura 9 muestra un análisis tumoral, se muestran niveles reducidos tanto de ARNm como de proteína Survivina después de Inyecciones Intratumorales de la SEC ID Nº: 2. Se administró solución salina o SEC ID Nº: 2 25 mg/kg 6 veces (50 µl de volumen)

intratumoralmente a lo largo de 2 semanas. Se realizó una toma de muestras 24 horas

después de la última dosis.

La Figura 10A muestra el contenido de SEC ID Nº: 2 en hígado de primates cynomolgus

después del tratamiento sistémico de acuerdo con el Ejemplo 19 con formulaciones

tamponadas con PBS de la SEC ID Nº: 2. Los animales en recuperación (R) se dejaron sin

tratar durante 4 semanas y muestran que la SEC ID Nº: 2 era detectable después de este

periodo en el tejido.

La Figura 10B muestra lo mismo que la 10A pero en riñón en lugar de en hígado. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores se han dado cuenta de que los oligonucleótidos de LNA de una clase específica presentan propiedades sorprendentemente buenas con respecto a la inhibición de la expresión de Survivina por medio de un mecanismo antisentido. Como será evidente a partir de los ejemplos, los oligonucleótidos de LNA de esta clase específica (en solitario o en combinación con compuestos de taxano) inhiben la expresión de Survivina, conduciendo de este modo a una reducción o inhibición del desarrollo de tumores in vivo.

Los oligonucleótidos de LNA descritos en el presente documento están representados por el potente oligonucleótido de LNA de la SEC ID Nº: 2 que se dirige a Survivina. Este compuesto es superior a otros oligonucleótidos de LNA que se dirigen a ARNm de Survivina medido por lecturas funcionales tales como la inducción de apoptosis y la inhibición de la proliferación. Además, el compuesto candidato SEC ID Nº: 2 es potente en la regulación negativa de proteína y ARNm de Survivina en líneas celulares de cáncer transfectadas. Además, el compuesto candidato SEC ID Nº: 2 induce una apoptosis en combinación con Taxol superior en comparación con otros oligonucleótidos de LNA de dicha combinación. Una visión de conjunto de los datos in vitro obtenidos para la SEC ID Nº: 2, así como la SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 21, se muestra en el Ejemplo 21.

Los estudios de xenoinjerto in vivo en ratones atímicos muestran una reducción de Survivina en los tumores de ratones tratados con un solo agente, que conduce a la inhibición del crecimiento del tumor cuando se usa en combinación con fármacos quimioterápicos. Es la primera vez que un oligonucleótido antisentido que se dirige a Survivina muestra un efecto en combinación con Taxol in vivo. El ensayo de eficacia in vivo se realizó usando el modelo de xenoinjerto en ratón de cáncer de próstata humano PC3. Además, la SEC ID Nº: 2 tiene un buen perfil toxicológico y no se encontraron signos clínicos notables en un estudio de DMT i.v. en monos cynomolgus.

Oligonucleótidos de LNA

Los oligonucleótidos de LNA útiles tienen un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprenden la (sub)secuencia:

)MeCx MeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28), 5 que tiene preferentemente un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y que comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCx MeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1), en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas

10 designan un desoxinucleótido, el subrayado (es decir, MeC y G) designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos, y en la que las unidades de

15 nucleótidos entre paréntesis (es decir, (MeCx), (Tx), (Gx) y (c)) representan cada una una unidad opcional. Las expresiones “oligonucleótido de LNA definido en el presente documento”, “oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención” y similares se refieren al “oligonucleótido de LNA” definido anteriormente, consúltense las SEC ID Nº: 1 y 28, así como las realizaciones,

20 variantes, sales, profármacos, etc. descritos en lo Siguiente: Los análogos de nucleótidos de LNA se seleccionan de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-Damino-LNA y α-L-oxi-LNA. Los análogos de nucleótidos modificados se ilustran en la figura siguiente:

imagen1

imagen2

en la que B designa una base de ácido nucleico, es decir, adenina (A), citosina (C), timina (T), guanina (G) o metil-citosina (MeC). Para el β-D-amino-LNA, R es un sustituyente o hidrógeno en el átomo de nitrógeno del anillo. R puede ser, por ejemplo, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, bencilo, etc. o puede representar un enlace con un grupo funcional.

En una realización, los análogos de nucleótidos de LNA se seleccionan de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA y β-D-amino-LNA. En otra realización, los análogos de nucleótidos de LNA se seleccionan de β-D-oxi-LNA y α-L-oxi-LNA. En una realización actualmente más preferida, todos los análogos de nucleótidos de LNA son β-D-oxi-LNA.

Cuando se usa en el presente documento, el término “nucleótido” se refiere a una unidad de 2-desoxirribosa (o ribosa) que se une por su átomo de carbono número uno a una de las bases de nitrógeno adenina (A), citosina (C), timina (T), uracilo (U) o guanina (G), y que se une por su átomo de carbono número tres y/o cinco a un grupo fosforodiéster o fosforotioato internucleosídico.

La (sub)secuencia SEC ID Nº: 28 tiene al menos 12 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, pero se prefiere que la (sub)secuencia esté representada por al menos 13 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, en particular al menos 14 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Los oligonucleótidos de LNA definidos anteriormente pueden — además de la (sub)secuencia SEC ID Nº: 28— comprender 1-4 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos de LNA adicionales, en particular nucleótidos adicionales tales como 1, 2, 3 ó 4 2desoxinucleótidos adicionales. Por lo tanto, típicamente, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-20, ó 13-20 ó 14-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Preferentemente, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 14-19, tal como 14-18, ó 15-18, ó 16-18, ó 14-17, ó 15-17 ó 16-17 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Más preferentemente el oligonucleótido de LNA es un compuesto de la secuencia SEC ID Nº: 28, es decir el oligonucleótido de LNA tiene un total de 14-16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, por ejemplo 14 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, 15 nucleótidos/análogos de

nucleótidos de LNA o 16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA.

Por lo tanto, cuando no están presentes todas las unidades de nucleótidos entre paréntesis, una variante preferida es aquella en la que (MeCx)(Tx) están presentes en el extremo 5’ y (i) en la que (Gx)(c) están ausentes en el extremo 3’ (proporcionado un compuesto de 14 unidades) o (ii) en la que (Gx) está presente y en la que (c) está ausente (proporcionando un compuesto de 15 unidades) o (iii) en la que ambos (Gx)(c) están presentes (proporcionando un compuesto de 16 unidades). Otra variante más preferida es aquella en la que (Gx)(c) están presentes en el extremo 3’ y (i) en la que (MeCx)(Tx) están ausentes en el extremo 5’ (proporcionando un compuesto de 14 unidades) o (ii) en la que (Tx) está presente y en la que

(MeCx

) está ausente (proporcionando un compuesto de 15 unidades). Una realización aún más preferida es aquella en la que (Tx) está presente en el extremo 5’ y en la que (Gx) está presente en el extremo 3’ (proporcionando un compuesto de 14 unidades).

Con respecto a las unidades subrayadas, se prefiere que MeCx designe un análogo de nucleótido de LNA. Por lo tanto, todos los de meCx, A y G pueden representar un análogo de nucleótido de LNA o MeCx puede representar un desoxinucleótido y A y G pueden representar un análogo de nucleótido de LNA, etc.

La (sub)secuencia preferida SEC ID Nº: 1 tiene 16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Los oligonucleótidos de LNA definidos anteriormente pueden —además de la (sub)secuencia SEC ID Nº: 1— comprender 1-4 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos de LNA adicionales, en particular nucleótidos adicionales tales como 1, 2, 3 ó 4 2desoxinucleótidos adicionales. Por lo tanto, típicamente, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Preferentemente, el oligonucleótido de LNA tiene un total 16-19, tal como 16-18 ó 16-17 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Más preferentemente, el oligonucleótido de LNA es un compuesto de la

secuencia: SEC ID Nº: 1, es decir, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16

nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA.

Se: señala que la subsecuencia AsAstscscsastsgsgs MeC de la SEC ID Nº: 28 y la

MecC

subsecuencia Asastscscsastsgsgs de la SEC ID Nº: 1 se indican como totalmente fosforotioladas, consúltese el subíndice “s”. Aunque esto no se prefiere actualmente, se cree que uno, y posiblemente también dos, de los enlaces fosforotioato pueden sustituirse por otros enlaces, en particular fosforodiéster, sin comprometer gravemente la estabilidad del oligonucleótido de LNA. Por lo tanto, dichas variantes en las que uno o dos de los enlaces fosforotioato se sustituyen, por ejemplo, por enlaces fosforodiéster, también se incluyen en el ámbito deseado de la presente invención.

Los ejemplos ilustrativos de (sub)secuencias particulares de la SEC ID Nº: 28 y 1 son

5

10

15

10

las SEC ID Nº: 2-20 enumeradas en la Tabla 1. Tabla 1-Oligonucleótidos de LNA

SEC ID Nº:: Secuencia y diseño Diseño

2: 5’MeCsTs MeCsAsastscscsastsgsgs MeCxAxGxc-3’ 4-8-3-1

3: 5’MeCTMeCAsastscscsastsgsgs MeCxAxGxc-3’ 4-8-3-1

4: 5’MeCTMeCAsastscscsastsgsgs MeCxAxGxc-3’ 4-8-3-1

5: 5’MeCsTs MeCsAsastscscsastsgsgs MeCxAxGxc-3’ 4-8-2-2

6: 5’-CsTs MeCAsastsCsCsastsgsgs MeCsAsGsC-3’ 1-3-8-3-1

7: 5’MeCTMeCAsastscscsastsgsgs MeCAgsc-3’ 4-8-2-2

8: 5’MeCsTMeCAsastscscsastsgsgs MeCAGsc-3’ 1-3-8-3-1

9: 5’MeCTMeCAsastscscsastsgsgs MeCAgxc-3’ 4-8-2-2

10: 5’MeCTMeCAsastscscsastsgsgs MeCAGc-3’ 1-3-8-3-1

11: 5’MeCa sTa s MeCa sAa sastscscsastsgsgs MeCa sAa sGa sc-3’ 4-8-3-1

12: 5’MeCsTs MeCsAa sastscscsastsgsgs MeCa sAsGsc-3’ 4-8-3-1

13: 5’MeCaTaMeCaAa sastscscsastsgsgs MeCaAaGa xc-3’ 4-8-3-1

14: 5’MeCaTaMeCaAa sastscscsastsgsgs MeCaAaGa xc-3’ 4-8-3-1

15: 5’MeCa sTa s MeCa sAa sastscscsastsgsgs MeCa sAasgsc-3’ 4-8-2-2

16: 5’MeCsTa s MeCa sAa sastscscsastsgsgs MeCa sAa sGa sc-3’ 1-3-8-3-1

17: 5’MeCaTaMeCaAa sastscscsastsgsgs MeCa sAa sgsc-3’ 4-8-2-2

18: 5’MeCsTaMeCaAa sastscscsastsgsgs MeCaAaGa sc-3’ 1-3-8-3-1

19: 5’MeCaTa s MeCaAa sastscscsastsgsgs MeCaAagc-3’ 4-8-2-2

20: 5’MeCTaMeCaAa sAstscscsastsgsgs MeCaAaGac-3’ 1-3-8-3-1

En la Tabla 1, las letras mayúsculas (sin superíndice) designan un análogo de nucleótido β-D-oxi-LNA (β-D-oxi-LNA); el superíndice “α” después de una letra mayúscula (por ejemplo, Gα), sin embargo, denota que el análogo de nucleótido de LNA es un análogo de nucleótido de α-L-LNA (α-L-oxi-LNA), las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos, y ningún subíndice entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos designa un enlace fosforodiéster. Todos los monómeros de LNA-C son 5-metil-C (MeC).

En realizaciones atractivas, el oligonucleótido de LNA comprende una (sub)secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Más particularmente, el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

En una realización actualmente más preferida, el oligonucleótido de LNA comprende la (sub)secuencia SEC ID Nº: 2. Aún más preferentemente, el oligonucleótido de LNA es el compuesto con la SEC ID Nº: 2. Preparación de los oligonucleótidos de LNA

Los componentes básicos de análogos de nucleótidos de LNA (β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA) pueden prepararse siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en los mismos, véase, por ejemplo, el documento, WO 03/095467 A1; D.

S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; M. D. S∅rensen, L. Kvaern∅, T. Bryld, A. E. Håkansson, B. Verbeure, G. Gaubert,

P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176; S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2’-Amino-and 2’-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079; C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2’-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663; y documento WO 2004/069991 A2.

Los oligonucleótidos de LNA pueden prepararse como se describe en los Ejemplos y en los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 y WO 03/006475. Por lo tanto, los oligonucleótidos de LNA pueden producirse usando las técnicas de oligomerización de química de ácidos nucleicos bien conocidas por un experto en la materia de la química orgánica. Generalmente, se usan ciclos de oligomerización convencionales de la estrategia de fosforamidita (S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223) pero, por ejemplo, también puede usarse química de H-fosfonato, química de fosfotriéster.

Para algunos monómeros, puede ser necesario o beneficioso un mayor tiempo de acoplamiento y/o acoplamientos repetidos y/o el uso de reactivos de acoplamiento más concentrados.

Las fosforoamiditas empleadas se acoplan típicamente con rendimientos por etapas >95% satisfactorios. La oxidación del Fósforo(III) a Fósforo(V) se realiza normalmente con, por ejemplo, yodo/piridina/H2O. Esto produce, después de la desprotección, el enlace internucleosídico fosforodiéster nativo. En el caso de que se prepare un enlace internucleosídico fosforotioato, se realiza una etapa de tiolación por cambio de la oxidación normal, por ejemplo, con yodo/piridina/H2O, usada para la síntesis de enlaces internucleosídicos fosforodiéster, por una oxidación usando el reactivo ADTT (hidruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo:piridina 9:1; v/v). También es posible usar otros reactivos de tiolación tales como Beaucage y PADS. Los oligonucleótidos de LNA con fosforotioato se sintetizaron eficazmente con rendimientos de acoplamientos por etapas >=98%.

Los oligonucleótidos de LNA que comprenden β-D-amino-LNA, β-D-tio-LNA y α-L-LNA también pueden sintetizarse eficazmente con rendimientos de acoplamiento por etapas ≥98% usando los procedimientos de fosforamidita.

La purificación de los oligonucleótidos de LNA puede efectuarse usando cartuchos de purificación de fase inversa desechables y/o HPLC de fase inversa y/o precipitación a partir de etanol o butanol. Se usó electroforesis en gel capilar, HPLC de fase inversa, MALDI-EM y IENEM para verificar la pureza de los oligonucleótidos de LNA sintetizados. Sales

Los oligonucleótidos de LNA pueden emplearse en una diversidad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que conserven la actividad biológica deseada del oligonucleótido de LNA y presenten efectos toxicológicos no deseados mínimos. Los ejemplos no limitantes de dichas sales pueden formarse con sales de adición de bases y aminoácidos orgánicas formadas con cationes metálicos tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado a partir de amoniaco, N,Ndibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o combinaciones, por ejemplo, una sal de tanato de cinc o similar.

Dichas sales se forman, a partir de los oligonucleótidos de LNA que poseen un grupo fosforodiéster y/o grupos fosforotioato y, por ejemplo, sales con bases adecuadas. Estas sales incluían, por ejemplo, sales de metales no tóxicas que proceden de metales de los grupos Ia, Ib, IIa y IIb del Sistema Periódico de los elementos, en particular, sales de metales alcalinos adecuadas, por ejemplo, sales de litio, sodio o potasio, o sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo, sales de magnesio o calcio. Incluyen además sales de cinc y amonio y también sales que se forman con aminas orgánicas adecuadas, tales como mono-, di-o tri-alquilaminas sustituidas con hidroxilo o no sustituidas, en particular, mono-, di-o tri-alquilaminas, o con compuestos de amonio cuaternario, por ejemplo con N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, mono-, bis-o tris-(2-hidroxi-alquilo inferior)aminas, tales como mono-, bis-o tris-(2hidroxietil)amina, 2-hidroxiterc-butilamina o tris(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquilo inferior-N-(hidroxi-alquilo inferior)aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-amina o tri-(2hidroxietil)amina, o N-metil-D-glucamina o compuestos de amonio cuaternario tales como sales de tetrabutilamonio. Se prefieren sales de litio, sales de sodio, sales de magnesio, sales de cinc o sales de potasio, prefiriéndose particularmente sales de sodio.

Profármacos

En una realización, el oligonucleótido de LNA puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son en virtud iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos se reduce en comparación con equivalentes neutros o lipófilos. Este “impedimento” de polaridad puede evitarse usando la estrategia de profármaco (véase, por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, págs. 103-140). En esta estrategia, los oligonucleótidos de LNA se preparan de una forma protegida de mono que los oligonucleótidos de LNA sean neutros cuando se administren. Estos grupos de protección se diseñan de tal modo que puedan eliminarse cuando el oligonucleótido de LNA se capta por las células. Son ejemplos de dichos grupos de protección S-acetiltioetilo (SATE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE). Estos grupos de protección son resistentes a nucleasas y se eliminan selectivamente intracelularmente. Conjugados

En el presente contexto, el término “conjugado” pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un oligonucleótido de LNA como se describe en el presente documento (es decir, un compuesto que comprende una secuencia de nucleósidos y análogos de nucleósidos de LNA) con uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos.

Por lo tanto, los oligonucleótidos de LNA pueden, por ejemplo, conjugarse o formar quimeras con restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos, incluyendo Ácidos Peptidonucleicos (PNA), proteínas (por ejemplo, anticuerpos para un proteína diana), macromoléculas, sustancias farmacológicas de bajo molecular, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcares, glicoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol), grupos formadores de micelas, anticuerpos, carbohidratos, grupos de unión a receptor, esteroides tales como colesterol, polipéptidos, agentes intercalantes tales como un derivado de acridina, un alcohol de cadena larga, un dendrímero, un fosfolípido y otros grupos lipófilos o combinaciones de los mismos, etc., igual que los oligonucleótidos de LNA pueden disponerse en estructuras diméricas o dendríticas. Los oligonucleótidos de LNA o conjugados también pueden conjugarse

o conjugarse además con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un agente antibacteriano, un compuesto quimioterápico o un antibiótico.

La conjugación de este modo confiere propiedades ventajosas con respecto a las características farmacocinéticas de los oligonucleótidos de LNA. En particular, la conjugación de esta forma consigue una captación celular aumentada.

En una realización, un oligonucleótido de LNA se une a ligandos para formar un conjugado, estando dichos ligandos destinados a aumentar la captación celular del conjugado respecto a los oligonucleótidos de LNA antisentido. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones terminales 5’/3’-OH, pero los ligandos también pueden tener lugar en los azúcares y/o las bases. En particular, el factor de crecimiento con el que puede conjugarse el oligonucleótido de LNA antisentido puede comprender transferrina o folato. Pueden prepararse complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos de folato-polilisinaoligonucleótido para su captación por células que expresan altos niveles de receptor de transferrina o folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercalantes de dúplex tales como acridina, poli-L-lisina, “protección terminal” con uno o más grupos de enlaces resistentes a nucleasas tales como fosforomonotioato y similares.

La preparación de complejos de transferrina como vehículos de captación de oligonucleótidos en células se describe por Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 34103414 (1990). La administración celular de conjugados macromoleculares de folato por medio de la endocitosis de receptores de folato, incluyendo la administración de un oligonucleótido antisentido, se describe por Low y col., Patente de Estados Unidos 5.108.921. Véase también, Leamon y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991). Composición Farmacéutica

Debería entenderse que la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se ha definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un vehículo acuoso. La composición farmacéutica es preferentemente adecuada para inyección.

Las instrucciones para la preparación de composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en: “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” por Alfonso R. Gennaro, y en lo siguiente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de unión y adyuvantes, son parte de la composición farmacéutica. Las cápsulas, comprimidos y píldoras, etc., pueden contener, por ejemplo, los compuestos siguientes: celulosa microcristalina, goma

o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes edulcorantes o saporíferos. Para cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un vehículo líquido como aceites grasos. Asimismo, los revestimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la unidad de dosificación. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser emulsiones de los principios activos farmacéuticos (incluyendo el oligonucleótido de LNA) y un lípido que forme una emulsión micelar.

Un oligonucleótido de LNA puede mezclarse con cualquier material que no confiera la acción deseada, o con materiales que complementen la acción deseada. Estos podrían incluir otros fármacos, incluyendo otros compuestos nucleosídicos.

Para su administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril (por ejemplo, agua), tampón o tampones, reguladores de la tonicidad y fuerza iónica y antibacterianos. El compuesto activo puede prepararse con vehículos que faciliten la captación, protejan frente a la degradación o protejan frente a la eliminación inmediata del cuerpo, incluyendo implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los vehículos preferidos son solución salina fisiológica (0,9%) o solución salina tamponada con fosfato.

Preferentemente, un oligonucleótido de LNA se incluye en una formulación unitaria, tal como en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin causar efectos secundarios graves en el paciente tratado.

En realizaciones preferidas de las composiciones farmacéuticas, el oligonucleótido de LNA se formula en un vehículo acuoso, en particular un vehículo acuoso que comprende un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5, y que tiene una fuerza iónica de 202000 mM.

La expresión “vehículo acuoso” se refiere a que la composición farmacéutica en cuestión está en forma líquida y que el vehículo líquido predominantemente está compuesto por agua, es decir, que al menos el 80% (p/p) o al menos el 90% (p/p) o incluso al menos el 95% (p/p) del vehículo consiste en agua. También pueden usarse otros ingredientes líquidos, por ejemplo, etanol, DMSO, etilenglicol, etc.

El vehículo acuoso preferentemente comprende un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5. Preferentemente, el tampón mantendrá el pH en el intervalo de 5,0-8,0, tal como en el intervalo de 6,0-7,5.

La fuerza iónica/tonicidad de la composición farmacéutica también es importante. Por lo tanto, típicamente, la composición farmacéutica líquida tiene una fuerza iónica en el intervalo de 20-2000 mM, tal como en el intervalo de 50-1500 mM, o en el intervalo de 100-1000 mM.

En una realización, los análogos de nucleótidos de LNA se seleccionan de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA y β-D-amino-LNA, o de β-D-oxi-LNA y α-L-oxi-LNA, en particular todos los análogos de nucleótidos de LNA son β-D-oxi-LNA.

En una realización adicional, que puede combinarse con lo anterior, los oligonucleótidos de LNA tienen un total de 16-19, tal como 16-18, ó 16-17, en particular 16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Como alternativa, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-18, tal como 13-18, ó 14-17, en particular 14 ó 15 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA.

En otra realización más, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA comprende una (sub)secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Más particularmente, el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Aún más preferentemente, el oligonucleótido de LNA comprende la (sub)secuencia SEC ID Nº: 2 y, más preferentemente, el oligonucleótido de LNA es el compuesto con la SEC ID Nº: 2.

En una realización adicional más, que puede combinarse con lo anterior, la composición comprende además al menos un compuesto de taxano (véase además a continuación en “Fármaco de combinación” para detalles adicionales). En particular, la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA (la parte de oligonucleótido de LNA del conjugado) en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a

1:25. Para el segundo aspecto, puede preferirse si el al menos un resto no nucleotídico/no polinucleotídico comprende un compuesto de taxano.

Fármaco de combinación

La composición farmacéutica también puede comprender un agente adicional seleccionado de los grupos que consisten en compuestos quimioterápicos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales, compuestos citostáticos, compuestos antiangiogénicos, compuestos antiproliferativos, compuestos proapoptóticos, moduladores de la transducción de señales e inhibidores de quinasa.

En una variante interesante, el agente adicional es al menos un compuesto quimioterápico. Son ejemplos adecuados de dichos compuestos quimioterápicos los seleccionados del grupo que consiste en adrenocorticoesteroides, tales prednisona, dexametasona o decadrón; altretamina (hexaleno, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidex); andrógenos, tales como testosterona; asparaginasa (elspar); bacilo de calmette-guérin; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (myleran); carboplatino (paraplatino); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatino (platinol); arabinósido de citosina (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegén); daunorubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorubicina (adriomicina); epirubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, tales como dietilestilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, etopofós); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hydrea); idarubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (luprón); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza de nitrógeno); melfalán (alkerari); mercaptopurina (purinatol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreotida (sandostatina); pentostatina (2desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); Taxol (paclitaxel); tenipósido (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hycamtin); tretinoína (vesanold, ácido retinoico todo trans); vinblastina (valban); vincristina (oncovin) y vinorelbina (navelbina).

En una variante, la presente Invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más oligonucleótidos de LNA y (b) uno o más compuestos quimioterápicos distintos que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Cuando se usan con los oligonucleótidos de LNA, dichos compuestos quimioterápicos pueden usarse individualmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleótido) o en combinación con uno o más de dichos compuestos quimioterápicos distintos o en combinación con radioterapia. Todos los compuestos quimioterápicos conocidos por un experto en la materia, incluyendo los mencionados explícitamente anteriormente, se incorporan en el presente documento como tratamientos de combinación con compuestos de acuerdo con la invención.

En una realización preferida, la composición farmacéutica se administra en combinación con un compuesto de taxano.

La expresión “compuesto de taxano” pretende incluir paclitaxel (Taxol®), derivados de paclitaxel, docetaxel, taxotere, taxanos modificados y análogos de taxoide. El paclitaxel Taxol®) es un diterpeno aislado de la corteza del tejo del Pacífico occidental, Taxus brevifolia, y es representativo en una clase de agentes terapéuticos que tienen un sistema de anillo de taxano. El paclitaxel y sus análogos se han producido por síntesis parcial a partir de 10desacetilbacatina III, un precursor obtenido de agujas y ramitas de tejo, y por síntesis total. Véase, Holton, y col., J. Am. Chem. Soc. 116:1597-1601 (1994) y Nicolaou, y col., Nature 367: 630 (1994). El paclitaxel ha demostrado eficacia en varios tumores humanos en ensayos clínicos. Véase McGuire, y col., Ann. Int. Med. 111: 237-279 (1989); Holmes, y col., J. Natl. Cancer Inst. 83:1797-1805 (1991); Kohn y col., J. Nati. Cancer Inst. 86: 18-24 (1994); y Kohn, y col., American Society for Clinical Oncology 12 (1993). Los análogos de taxoide o taxano modificado son los compuestos que tienen un anillo de taxano que lleva cadenas laterales modificadas. Varios de estos análogos tienen propiedades mejoradas, tales como una mayor estabilidad y solubilidad en agua que el paclitaxel de origen natural. Estos análogos son conocidos por los expertos en la materia y se desvelan, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.278.324; 5.272.171; 5.254.580; 5.250.683; 5.248.796; y 5.227.400. El paclitaxel y el taxotere pueden prepararse por los procedimientos de los documentos WO93/18210, EP0253739, EP0253739 y WO92/09589. En realizaciones particulares, el compuesto de taxano es paclitaxel o taxotere.

La proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA en dicha composición está típicamente en el intervalo de 50:1 a 1:25, tal como en el intervalo de 25:1 a 1:25, o en el intervalo de 10:1 a 1:25, o en el intervalo de 1:1 a 1:25, o en el intervalo de 50:1 a 1:10, o en el intervalo de 1:1 a 1:50 o en el intervalo de 25:1 a 1:10.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente Invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de taxano y un oligonucleótido de LNA en un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

MeCx

5’-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28), que tiene preferentemente un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y que comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 1)

en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado

de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas

designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA

como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un

enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el

subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre

nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y

en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el

oligonucleótido de LNA en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a 1:25.

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1), en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y la parte de oligonucleótido de LNA del conjugado en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a

1:25.

El primer y segundo aspectos principales se combinan ventajosamente con la memoria descriptiva y las preferencias con respecto al oligonucleótido de LNA, el conjugado y la composición farmacéutica proporcionadas además anteriormente. Se cree que las siguientes realizaciones representan totalmente los beneficios de la invención.

En una realización adicional, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA tiene un total 16-18, tal como 16-18, ó 16-17, en particular 16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Como alternativa, los oligonucleótidos de LNA tienen un total de 12-18, tal como 13-18, ó 14-17, en particular 14 ó 15 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA.

En una realización adicional más, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA comprende una (sub)secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Más particularmente, el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Aún más preferentemente, el oligonucleótido de LNA comprende la (sub)secuencia SEC ID Nº: 2 y, más preferentemente, el oligonucleótido de LNA es el compuesto con la SEC ID Nº: 2.

En todavía una realización adicional más, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA (o conjugado) y el compuesto o compuestos de taxano están presentes en un vehículo acuoso. Preferentemente, el vehículo acuoso comprende un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5 y tiene una fuerza iónica de 20-2000 mM (véase también anteriormente para detalles adicionales acerca del tampón).

Para el segundo aspecto, puede preferirse si el al menos un resto no nucleotídico/no polinucleotídico comprende un compuesto de taxano.

En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos de LNA y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Además, los medicamentos que comprenden los oligonucleótidos de LNA pueden usarse en combinación con radioterapia, etc., véase también la sección Experimental. Procedimiento de tratamiento

Las composiciones farmacéuticas son particularmente relevantes para el tratamiento del cáncer.

Las composiciones farmacéuticas y procedimientos de la invención se emplean preferentemente para el tratamiento o la profilaxis frente a enfermedades causadas por cáncer, particularmente para el tratamiento del cáncer que puede aparecer en tejidos tales como cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, pulmón, hígado, tiroides, riñón, cerebro, testículos, estómago, intestino delgado y grueso, médula espinal, senos, vejiga, tracto urinario, ovario, cabeza y cuello, hematológico, piel, gástrico u óseo.

La invención descrita en el presente documento incluye un procedimiento de prevención

o tratamiento de cáncer, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido de LNA modulador de Survivina, incluyendo, pero sin limitación, altas dosis del oligonucleótido de LNA, en un ser humano que necesita dicha terapia. La invención incluye además el uso de un corto periodo de administración de un oligonucleótido de LNA modulador de Survivina. Las células normales no cancerosas se dividen a una frecuencia característica para el tipo celular particular. Cuando una célula se ha transformado en un estado canceroso, se produce una proliferación celular descontrolada y una muerte celular reducida y, por lo tanto, una división celular o crecimiento celular promiscuo es un distintivo de un tipo celular canceroso. Los ejemplos de tipos de cáncer incluyen, pero sin limitación, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple), carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, cáncer cervical, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cánceres de sitio primario desconocido, neoplasias, cánceres del sistema nervioso periférico, cánceres del sistema nervioso central, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, seminoma, carcinoma embrionaro, tumor de Wilms, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma y retinoblastoma), enfermedad de cadenas pesadas, metástasis o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular anormal o descontrolado.

Son enfermedades cancerosas particularmente relevantes las seleccionadas de leucemia mielocítica aguda, linfoma de células B difuso, leucemia linfocítica aguda, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer del tracto urinario y cáncer colorrectal.

El término “carcinoma” pretende indicar un tumor maligno de origen epitelial. El tejido epitelial cubre o reviste las superficies corporales del interior y exterior del cuerpo. Son ejemplos de tejido epitelial la piel y la mucosa y serosa que revisten las cavidades corporales y órganos internos, tales como intestinos, vejiga urinaria, útero, etc. El tejido epitelial también puede extenderse hacia capas de tejido más profundas para formar glándulas, tales como glándulas secretoras de moco. El término “sarcoma” pretende indicar un tumor maligno que crece a partir de tejido conectivo, tal como cartílago, grasa, músculos, tendones y hueso. El término “glioma”, cuando se usa en el presente del documento, pretende abarcar un tumor maligno que se origina a partir de células gliales.

Se cree que las composiciones de la presente invención son particularmente relevantes para el tratamiento de formas de cáncer relacionadas con tumores. Dicho tratamiento puede combinarse con radioterapia.

Un tercer aspecto principal de la presente invención se refiere al uso de una composición de acuerdo con la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero, en particular un ser humano, que padece o es susceptible de padecer una enfermedad cancerosa.

El tercer aspecto principal se combina ventajosamente con la memoria descriptiva y preferencias con respecto al oligonucleótido de LNA, el conjugado y la composición farmacéutica proporcionados además anteriormente. Por lo tanto, las composiciones a las que se hace referencia en el tercer aspecto principal son preferentemente como se definen para las composiciones farmacéuticas definidas anteriormente además en “Composición farmacéutica” y “Fármaco de combinación”. Se cree además que las siguientes realizaciones representan totalmente los beneficios de la invención.

La enfermedad a la que se hace referencia puede ser una cualquiera de las definidas además anteriormente, sin embargo, seleccionada preferentemente del grupo que consiste en leucemia mielocítica aguda, linfoma difuso de células B, leucemia linfocítica aguda, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer del tracto urinario y cáncer colorrectal.

En una realización adicional, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA tiene un total 16-19, tal como 16-18, ó 16-17, en particular 16 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA. Como alternativa, el oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-18, tal como 13-18, ó 14-17, en particular 14 ó 15 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA.

En una realización adicional más, que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA comprende una (sub)secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Más particularmente, el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, en particular del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Aún más preferentemente, el oligonucleótido de LNA comprende la (sub)secuencia de la SEC ID Nº: 2 y, más preferentemente, el oligonucleótido de LNA es el compuesto con la SEC ID Nº: 2.

En el tercer aspecto principal, que puede combinarse con lo anterior, la composición comprende al menos un compuesto de taxano (véase además anteriormente en “Fármaco de combinación” para detalles adicionales). En particular, la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA (parte de oligonucleótido de LNA del conjugado) en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a 1:25.

En relación con la realización mencionada anteriormente, el compuesto o compuestos de taxano pueden estar presentes en la primera composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de LNA (o el conjugado). En este caso, la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el oligonucleótido de LNA (o la parte de oligonucleótido de LNA del conjugado) en dicha composición está preferentemente en el intervalo de 50:1 a

1:25. Como alternativa, el compuesto o compuestos de taxano pueden estar presentes en una segunda composición farmacéutica que no comprende el oligonucleótido de LNA (o el conjugado). En este caso, la primera composición farmacéutica y la segunda composición farmacéutica pueden administrarse conjuntamente o, como alternativa, la primera composición farmacéutica y la segunda composición farmacéutica se administran de forma secuencial.

En todavía una realización adicional más que puede combinarse con lo anterior, el oligonucleótido de LNA (o el conjugado) y cualquier compuesto o compuestos de taxano están presentes en un vehículo acuoso. Preferentemente, el vehículo acuoso comprende un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5, y tiene una fuerza iónica de 20-2000 mM (véase también anteriormente para detalles adicionales acerca del tampón).

Kits

La presente invención también proporciona diversos kits útiles en el tratamiento médico de un paciente que lo necesite.

En una variante, el kit comprende un conjunto útil para el tratamiento de combinación, es decir, el tratamiento con un oligonucleótido de LNA (o conjugado del mismo) y uno o más compuestos de taxano.

Por lo tanto, un cuarto aspecto principal de la presente invención se refiera a un kit que comprende

(b): un segundo componente que contiene una o más soluciones inyectables de uno o más compuestos de taxano; en el que dicho oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(C)-3’ (SEC ID Nº: 1), en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que la proporción en peso entre el al menos un compuesto de taxano en una solución del segundo componente y el al menos un oligonucleótido de LNA en una dosis del primer composición está en el intervalo de 50:1 a 1:25, y/o en la que las dosis de solución inyectable del oligonucleótido de LNA comprenden un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5 y que tiene una fuerza iónica de 20-2000 mM. En una realización preferida, el tampón, por ejemplo, solución salina o solución salina tamponada, tiene un pH de 6,0-8,0 y una fuerza iónica de 100-500 mM. En una realización más preferida, la solución salina o solución salina tamponada tiene un pH de 7,0-8,0 y una fuerza iónica de 120-250 mM. Un kit similar que comprende un conjugado de un oligonucleótido de LNA y un resto no

nucleotídico/no polinucleotídico también constituye un aspecto de la invención, cambiando lo que se deba cambiar.

Debería entenderse que las dosis de solución inyectable del oligonucleótido de LNA (o conjugado de un oligonucleótido de LNA y un resto no nucleotídico/no polinucleotídico) y los compuestos de taxano son preferentemente como se ha definido anteriormente además en “Composición farmacéutica” y “Fármaco de combinación”, respectivamente.

Si la composición farmacéutica en forma líquida está en riesgo de someterse a condiciones que comprometerán la estabilidad del oligonucleótido de LNA, puede preferirse producir el producto terminado que contiene el oligonucleótido de LNA en una forma sólida, por ejemplo, como un material secado por congelación, y almacenar el producto en dicha forma sólida. El producto puede reconstituirse después (por ejemplo, disolverse o suspenderse) antes de la administración.

Por lo tanto, un décimo aspecto principal de la invención se refiere a un kit que comprende: a) un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA en forma sólida y

(b) un segundo componente que contiene solución salina o una solución de tampón (por ejemplo, solución salina tamponada) adaptada para la reconstitución (por ejemplo, disolución o suspensión) de dicho oligonucleótido de LNA, preferentemente dicha solución de tampón tiene un pH en el intervalo de 4,0-8,5 y una fuerza iónica de 20-2000 mM; en el que dicho oligonucleótido de LNA tiene un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28), que tiene preferentemente un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de

LNA y que comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCxMeCx

5’-MeCxTx AsAstscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1),

en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA

seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras

minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de

nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el

subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos

de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace

fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

Los kits mencionados anteriormente incluyen también preferentemente unas directrices escritas para combinar el primer y segundo componentes. Administración

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser (a) oral, (b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica, incluyendo epidérmica, transdérmica, oftálmica y en membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal; o (d) parenteral, incluyendo inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. En una realización, el oligonucleótido de LNA se administra por vía intravenosa, intraperitoneal, oral, tópica o como una inyección en embolada, o se administra directamente en el órgano diana.

Actualmente se cree que la forma de administración más apropiada es por infusión intravenosa u oral. Dosificación

La dosificación depende de la gravedad y sensibilidad de la patología a tratar y del ciclo de tratamiento, que dura de varios días a varios meses, o hasta que se logre una cura o se consiga una disminución de la patología. También pueden evaluarse programas de dosificación óptimos por mediciones de fármacos en el cuerpo del paciente o por marcadores sustitutos.

Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales. Generalmente, puede estimarse basándose en las CE50 que se encuentre que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de 0,01 µg a 1 g por kg de peso corporal y puede administrarse una vez o más al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 10 años, o por infusión continua durante de horas hasta varios meses. Los índices de repetición para la dosificación pueden estimarse basándose en los tiempos de residencia medidos y en las concentraciones del fármaco en tejidos o fluidos corporales. Después del tratamiento con éxito, puede ser deseable que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para evitar la reaparición de la patología. Se cree actualmente que las dosis más relevantes son de 0,01 mg a 100 mg, tal como de 0,1 mg a 40 mg o de 0,5 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Dichas dosis pueden administrarse una vez al día, pero más preferentemente con menor frecuencia, por ejemplo, 1-3 veces por semana, durante un periodo de 1-4 semanas. La terapia de mantenimiento puede continuarse, por ejemplo, 1-4 veces al mes o incluso menos frecuentemente, tal como 1-10 veces al año.

Sin desear quedar ligado a la teoría particular alguna, se prevé que el efecto combinado (y efecto potencialmente sinérgico) de un compuesto quimioterápico y un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención hará posible reducir la dosificación del compuesto quimioterápico o del oligonucleótido de LNA o ambos. Usos adicionales

Los oligonucleótidos de LNA de la presente invención también pueden utilizarse como reactivos de investigación para diagnóstico, terapia y profilaxis. En investigación, los oligonucleótidos de LNA antisentido pueden usarse para inhibir específicamente la síntesis de proteína Survivina en células y animales de experimentación, facilitando de este modo el análisis funcional de la diana o una valoración de su utilidad como diana para intervención terapéutica. En el diagnóstico, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para detectar y cuantificar la expresión de Survivina en células y tejidos por transferencia de Northern, hibridación in situ o técnicas similares. Para la terapia, un animal o un ser humano sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que puede tratarse por modulación de la expresión de Survivina se trata administrando oligonucleótidos de LNA antisentido de acuerdo con la presente invención.

Se proporcionan además procedimientos de tratamiento de un animal, particularmente ratón y rata, y de tratamiento de un ser humano, sospechoso de tener o que tiene tendencia a una enfermedad o afección asociada con la expresión de Survivina, por administración de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligonucleótidos de LNA antisentido o conjugados.

La invención proporciona además un procedimiento de modulación de la expresión de Survivina en células o tejidos, comprendiendo el procedimiento poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se define en el presente documento, en particular una composición farmacéutica como se define en el presente documento, de modo que la expresión de Survivina se module.

Aún más, la invención proporciona un procedimiento de modulación de la expresión de un gen implicado en una enfermedad cancerosa, que comprende poner en contacto el gen o ARN del gen con un oligonucleótido de LNA o un conjugado como se define en el presente documento, en particular una composición farmacéutica como se define en el presente documento, por lo que se modula la expresión del gen. El gen es preferentemente el gen de Survivina.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento de inducción de la apoptosis celular, que comprende poner en contacto la célula o ARN de la célula con una composición farmacéutica como se define en el presente documento, por lo que se induce la apoptosis celular. La inducción de apoptosis puede ser in vitro o in vivo. La inducción puede provocarse en un ensayo celular, o dentro de una muestra de tejido o dentro del mamífero en vivo.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento de prevención o reducción de la proliferación celular, que comprende poner en contacto la célula o ARN de la célula con una composición farmacéutica como se define en el presente documento, por lo que se evita o reduce la proliferación celular. La prevención o reducción de la proliferación puede ser in vitro o in vivo. La prevención puede realizarse en un ensayo celular,

: o dentro de una muestra de tejido dentro del mamífero vivo. PARTE EXPERIMENTAL

Un ejemplo actualmente preferido de los oligonucleótidos de LNA definidos en el presente documento es el oligonucleótido de LNA de la SEC ID Nº: 2. Los siguientes ejemplos ilustran las sorprendentemente buenas propiedades de este oligonucleótido de LNA, pero se cree que otros oligonucleótidos de LNA que comprenden (o tienen) la secuencia SEC ID Nº: 1

: o SEC ID Nº: 28 tienen propiedades interesantes de forma similar.

Ejemplo 1: Síntesis de monómero

Los componentes básicos monoméricos de LNA y derivados de los mismos se prepararon siguiendo procedimientos publicados y las referencias citadas en los mismos, véase:

Documento WO 03/095467 A1

D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

M. D. Sørensen, L. Kværnø, T. Bryld, A. E. Håkansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-I-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176.

S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1]

Ribonucleosides: 2’-Amino-and 2’-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.

C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sørensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2’-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.

D. S. Pedersen, T. Koch (2003) Analogues of LNA (Locked Nucleic Acid). Synthesis of the 2’-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites, Synthesis 4, 578-582.

Ejemplo 2: Síntesis de oligonucleótidos

Se sintetizaron oligonucleótidos usando la estrategia de fosforamidita en un sintetizador Expedite 8900/MOSS (Sistema de Síntesis de Múltiples Oligonucleótidos) a una escala de 1 µmol o 15 µmol. Para una síntesis a mayor escala se usó un Äkta Oligo Pilot. Al final de la síntesis (sobre DMT), los oligonucleótidos se escindieron del soporte sólido usando amoniaco acuoso durante 1-2 horas a temperatura ambiente y se desprotegieron adicionalmente durante 4 horas a 65ºC. Los oligonucleótidos se purificaron por HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Después de la eliminación del grupo DMT, los oligonucleótidos se caracterizaron por AE-HPLC, RP-HPLC y CGE y la masa molecular se confirmó adicionalmente mediante IEN-EM. Véase a continuación para más detalles. Preparación del soporte sólido de LNA: Preparación del succinil hemiéster de LNA

Se disolvió monómero de 5’-O-DMT-3’-hidroxi-LNA (500 mg), anhídrido succínico (1,2 eq.) y DMAP (1,2 eq.) en DCM (35 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después de extracciones con NaH2PO4 0,1 M pH 5,5 (2x) y salmuera (1x), la fase orgánica se secó adicionalmente con Na2SO4 anhidro filtrado y se evaporó. El derivado de hemiéster se obtuvo en un rendimiento del 95% y se usó sin ninguna purificación adicional. Preparación del soporte de LNA

El derivado de hemiéster preparado anteriormente (90 µmol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF, se añadió DIEA y pyBOP (90 µmol) y se mezcló todo junto durante 1 min. La mezcla preactivada se combinó con LCAA-CPG (500 Å, tamaño de malla 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1,5 horas a temperatura ambiente, el soporte se retiró por filtrado y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después de secar, se determinó que la carga era de 57 µmol/g (véase Tom Brown, Dorcas J. S. Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. En: F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14). Elongación del oligonucleótido

El acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz)) o T-β-cianoetil

fosforamidita) se realizó usando una solución de 0,1 M de la amidita protegida con 5’-O-DMT y DCL (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M) como activador. La tiolación se llevó a cabo usando cloruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo:piridina al 10%). El resto de los agentes eran los típicamente usados para la síntesis de oligonucleótidos. El protocolo proporcionado por el

5 proveedor se optimizó convenientemente. Purificación mediante RP-HPLC:

Columna: Xterra RP18 Caudal: 3 ml/min Tampones: acetato de amonio 0,1 M pH 8 y acetonitrilo

10 Abreviaturas DMT: Dimetoxitritilo DCI: 4,5-Dicianoimidazol DMAP: 4-Dimetilaminopiridina DCM: Diclorometano

15 DMF: Dimetilformamida THF: Tetrahidrofurano DIET: N,N-diisopropiletilamina PyBOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirroildino-fosfonio Bz: Benzoílo

20 Ibu: Isobutirilo

Ejemplo 3: Diseño del oligonucleótido de LNA

Tabla 2 -LNA Oligonucleotides α

SEC ID Nº: Secuencia y diseño diseños

MeCx MeCx

1 5’-MeCxTx Asastscscsastsgsgs AxGxc-3’

MeCs MeCs

2 5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs AsGsC-3’ 4-8-3-1

Reduciendo la cantidad de enlaces fosforotioato

3 5’-MeCTMeCAsastscsCsastsgsgsMeCAGsc-3’ 4-8-3-1

4 5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3 4-8-3-1

Reduciendo la cantidad de unidades monoméricos de LNA

MeCs MeCs

5

5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs Asgsc-3 4-8-2-2

MeCs MeCs

6

5’-csTs Asastscscsastsgsgs AsGsc-3’ 1-3-8-3-1

Reduciendo la cantidad de enlaces fosforotioato y unidades monoméricos de LNA 7 5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAxgsc-3’ 4-8-2-2

8

5’-csTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ 1-3-8-3-1

9

5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAgc-3’

4-8-2-2

SEC ID Nº: Secuencia y diseño diseños
10
5’-cTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3’ 1-3-8-3-1
Oligonucleótidos de LNA que contienen unidades monoméricas de α-L-LNA
MeCαs MeCα
11
5’-MeCα sTαsAαsastscscsastsgsgs sAα sGα sc-3’ 4-8-3-1
MeCα
12
5’-MeCsTsMeCsAα sastscscsastsgsgs sAα sGα sc-3’ 48-3-1
MeCαAαGα
13
5’-MeCαTαMeCαAα sastscscsastsgsgs sc-3’ 4-8-3-1
14 5’-MeCαTαMeCαAα sastscscsastsgsgsMeCαAαGαc-3’ 4-8-3-1
MeCα MeCα
15 5’-MeCα sTαs sAα sastscscsastsgsgs sAα sgsc-3’ 4-8-2-2
MeCα MeCα
16 5’-csTαs sAα sastscscsastsgsgs sAα sGα sc-3’ 1-3-8-3-1
MeCα
17 5’-MeCαTαMeCα sAα sastscscsastsgsgs sAαgsc-3’ 4-8-2-2
TαMeCαAα MeCαAαGα
18 5’-cssastscscsastsgsgs sc-3’ 1-3-8-3-1
19 5’-MeCαTαMeCαAα sastscscsastsgsgsMeCαAαGαgc-3’ 4-8-2-2
20 5’-cTαMeCα sAαsastscscsastsgsgsMeCαAαGαc-3’ 1-3-8-3-1
Oligonucleótidos de referencia
21 TsGsTsGsCstsasts4cstsgstsgsAsAsTsT 4-10-4
MeCsMeCsasgststsgsasasasMeCsAα
22 5’-Gs As sGsc-3’ 4-8-3-1
MeCs MeCsmeCs
23 5-Gs AsGstsgsgsastsgsasasGs A-3’ 4-8-4
MeCs MeCsMeCsMeCst
24 Gs AsgsaststsasgsasasAs 4-8-3-1
25 tsgstsgscstsaststscstsgstsgsasastst
MeCs MeCsMeCsa
26 Tscscscsasgscsgstsgscsgs
MeCscsgscsgstsgscsgsascscsMeCs
27 As Tsc
)MeCx MeCx
28 5’-(MeCx)(TxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’
En la Tabla 2, las letras mayúsculas (sin superíndice) designan un análogo de nucleótido de β-D-oxi-LNA (β-D-oxi-LNA); el superíndice “α” después de una letra mayúscula (por ejemplo, Gα), sin embargo, denota que el análogo de nucleótido de LNA es un análogo de nucleótido de α
5 LNA (α-L-oxi-LNA), las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y ningún subíndice entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos designa un enlace fosforodiéster. Todos los monómeros C del LNA son 5-metil-C (MeC). Los compuestos se diseñaron para dirigirse a diferentes regiones del ARN de Survivina humana, usando las
10 secuencias publicadas (número de acceso de Genbank NM_001168).
Ejemplo 4: Medición de Tm
Medición de la temperatura de fusión (Tm) de los compuestos: una solución de 3 µM de la SEC ID Nº: 2 en fosfato sódico 10 mM/NaCl 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 7,0 se mezcló con su ADN/ARN complementario 3 µM en fosfato sódico 10 mM/NaCl 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 7,0 a 90ºC durante un minuto y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La Tm del dúplex se determinó después aumentando la temperatura a 1ºC/min de 25 a 95ºC. La Tm de la SEC ID Nº: 2 se muestra en la Tabla 7 en el ejemplo 21.
Ejemplo 5: Estabilidad de la SEC ID Nº: 2 en plasma humano y de ratón
Estabilidad de la SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 2 20 µM y en plasma humano y de ratón (Li-Heparine (Taconic, M&B)) a 37ºC a diferentes alícuotas temporales: 0, 1, 2, 4, 24, 48 y 96 horas. También se incluyó un marcador de peso molecular disponible en el mercado (son visibles 10 y 20 unidades en el PAGE). (Véase la Figura 1). Ejemplo 6: Modelo in vitro. Cultivo celular
El efecto de los compuestos antisentido sobre la expresión de ácido nucleico diana puede ensayarse en cualquiera de una diversidad de tipos celulares con tal de que el ácido nucleico diana esté presente a niveles medibles. La diana puede expresarse endógenamente o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico.
El nivel de expresión del ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando, por ejemplo, análisis de transferencia de Northen, PCR cuantitativa, ensayos de protección de ribonucleasa. Los siguientes tipos celulares se proporcionan con fines ilustrativos, pero pueden usarse de forma rutinaria otros tipos celulares con tal de que la diana se exprese en el tipo celular seleccionado.
Se cultivaron las células en el medio apropiado como se describe a continuación y se mantuvieron a 37ºC a una humedad del 95-98% y CO2 al 5%. Las células se pasaron de forma rutinaria 2-3 veces por semana.
15PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano 15PC3 la donó amablemente el Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Países Bajos y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina.
PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se adquirió en la ATCC y se cultivó en F12 de Coon con glutamina (Gibco) + FBS al 10% + gentamicina.
518A2: La línea celular de cáncer de melanoma humano 518A2 la donó amablemente el Dr. B. Jansen, Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, Universidad de Viena y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina. Ejemplo 7: Modelo in vitro: Tratamiento con oligonucleótido antisentido
Cultivo celular y transfecciones. Se sembraron células 15PC3 en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante dos días a 37ºC (CO2 al 5%) en DMEM complementado con FBS al 10%, Glutamax I y Gentamicina. Cuando las células tenían una confluencia del 60-70%, se transfectaron por duplicado con diferentes concentraciones de oligonucleótidos (0,2-25 nM) usando Lipofectamine 2000 (10 µg/ml). Se llevaron a cabo transfecciones esencialmente como se describe por Dean y col. (1994, JBC 269:16416-16424). En resumen, se incubaron células durante 10 min con Lipofectamine en OptiMEM, seguido de la adición de oligonucleótido a un volumen total de 0,5 ml de mezcla de transfección por pocillo. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se retiró y las células se lavaron y se cultivaron a 37ºC durante aproximadamente 20 horas (análisis de ARNm) o 12-72 horas (análisis de proteína) en el medio de cultivo apropiado. Después las células se recogieron para análisis de proteína y ARN.
Ejemplo 8: Modelo in vitro. Extracción de ARN y síntesis de ADNc
Aislamiento de ARN Total
Se aisló el ARN total usando el mini-kit RNeasy (Qiagen). Las células se lavaron con PBS y se añadió Tampón de Lisis Celular (RTL, Qiagen) complementado con mercaptoetanol al 1% directamente a los pocillos. Después de unos pocos minutos, las muestras se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Síntesis de la primera cadena
Se realizó la síntesis de la primera cadena usando el kit de Transcriptasa Inversa OmniScript de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Para cada muestra, se ajustaron 0,5 µg de ARN total a 12 µl y se mezclaron con 0,2 µl de poli(dT)12-18 (0,5 µg/µl) (Life Technologies), 2 µl de mezcla de dNTP (5 mM de cada uno), 2 µl de tampón RT 10X, 0,5 µl de Inhibidor de ARNasa RNAguard™ (33 unidades/ml, Amersham) y 1 µl de Transcriptasa Inversa OmniScript, seguido de incubación a 37ºC durante 60 min e inactivación térmica a 93ºC durante 5 min. Ejemplo 9: Modelo in vitro: Análisis de la Inhibición por Oligonucleótido de la expresión de Survivina, Bcl-2 o variante de corte y empalme de Survivina mediante PCR a tiempo real.
Para determinar el nivel relativo de ARNm de Survivina en células tratadas y no tratadas con oligonucleótidos, el ADNc generado se usó en un análisis de PCR cuantitativa usando un iCycler de BioRad. El ADNc se diluyó 5 veces y se mezclaron 8 µl con 52 µl de mezcla maestra de sonda Taqman, que contenía 30 µl de Mezcla Maestra de PCR Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2X (Invitrogen), 3 µl de sonda Taqman 20X y mezcla de cebadores (cebador directo: 5’AAGGACCACCGCATCTCTACA (SEC ID Nº: 29), final 0,9 µM, cebador inverso: 5’CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT (SEC ID Nº: 30), final 0,6 µM y sonda taqman: FAMCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA (SEC ID Nº: 31), final 0,1 µM) y 19 µl de H2O. Los 60 µl se dispersaron en dos pocillos (placas de 96 pocillos) con 25 µl en cada pocillo. Para Bcl-2 humano los cebadores de PCR eran: cebador directo: 5’ CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA 3’ (concentración final en el ensayo; 0,6 µM) (SEC ID Nº: 32), cebador inverso: 5’ GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA 3’ (concentración final en el ensayo; 0,6 µM) (SEC ID Nº: 33) y la sonda de PCR era: 5’ FAM-CCTGGTGGACAACATCGCCCTGT-TAMRA 3’ (concentración final en el ensayo; 0,1 µM) (SEC ID Nº: 34) . Para la PCR de la variante de corte y empalme de Survivina se usaron los cebadores y concentraciones siguientes. Variante de corte y empalme 1 (Completa). Cebador directo: 5’-GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3’ (SEC ID Nº: 35) (Concentración final en el ensayo 0,6 µM). Cebador inverso 5’-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3’ (SEC ID Nº: 36) (Concentración final en el ensayo 0,6 µM). Variante de corte y empalme 2 (2B) Cebador directo 5’-GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3’ (SEC ID Nº: 35) (Concentración final en el ensayo 0,3 µM). Cebador inverso 5’-AAGTGCTGGTATTACAGGCGT-3’ (SEC ID Nº: 37) (Concentración final en el ensayo 0,3 µM). Variante de corte y empalme 3 (ΔEx3). Cebador directo 5’GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3’ (SEC ID Nº: 35) (Concentración final en el ensayo 0,3 µM). Cebador inverso 5’-ATTGTTGGTTTCCTTTGCATG-3’ (SEC ID Nº: 38) (Concentración final en el ensayo 0,3 µM). Sonda taqman 5’-FAM-CACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACT-TAMRA-3’ (SEC ID Nº: 39) (Concentración final en el ensayo 0,1 µM).
Los cebadores y sondas se obtuvieron en Proligonucleotide (Francia). Para normalizar cualquier varianza en la preparación de muestras, el ARNm de GAPDH endógena se cuantificó usando un reactivo de ensayo Taqman pre-revelado de Applied Biosystems (4310884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron diluciones de dos veces de ADNc, sintetizado a partir de células 15PC3 no tratadas (que expresaban tanto Survivina como GAPDH), para preparar curvas patrón para los ensayos. El programa de PCR era el siguiente: 50ºC durante 2 min, 95ºC durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95ºC 15 s, 60ºC 1 min. Se determinaron las cantidades relativas de ARNm de Survivina a partir del umbral de ciclos calculado usando el programa informático de Sistema de Detección a Tiempo Real iCycleriQ. Véanse las figuras 6B, 6C, 9 y 2C. Ejemplo 10: Análisis in vitro: Análisis de transferencia de Western de los niveles de proteína Survivina Transferencia de Western:
El efecto in vitro de los oligonucleótidos de Survivina sobre los niveles de proteína Survivina en células transfectadas se determinó por transferencia de Western.
Las células se recogieron y se lisaron en Tris-HCl 50 mM pH 6,8, glicerol al 10%, SDS al 2,5%, DTT 5 mM y urea 6 M complementado con cóctel inhibidor de proteasas (Roche). Se midieron las concentraciones de proteína total usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Se procesaron 50 µg de proteína total en un gel de Bis-Tris al 12% en tampón MOPS y se transfirió sobre membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de una incubación de una noche en tampón de bloqueo (PBS-T complementado con leche en polvo semidesnatada al 5%, las membranas se incubaron durante una noche con una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal anti-Survivina Novus 500201, seguido de una incubación de una hora con una dilución 1:1000 de anti-Bcl (DAKO). Después, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios (anticuerpos secundarios
5 conjugados con HRP de DAKO o anticuerpos conjugados con AP de Invitrogen diluidos 1:1000) y se visualizó la Survivina y la Bcl2 usando un kit de inmunodetección cromogénica (Invitrogen) o un kit de detección de ECL+ quimioluminiscente (Amersham). Véase la Figura 2A.
Ejemplo 11: Análisis in vitro: Análisis de ELISA de los niveles de proteína Survivina
10 Se lisaron las células recogidas y se ensayó la Survivina usando el R&D Systems Human Survivin DuoSet IC ELISA (Nº de Catálogo DYC647), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Véase la Figura 2B. Ejemplo 12: Análisis in vitro: Inhibición Antisentido de la Expresión de Survivina Humana usando oligonucleótidos antisentido
15 De acuerdo con la presente invención, se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirse a diferentes regiones del ARN de Survivina humana usando secuencias publicadas (número de acceso de GenBank NM_001168). Véase la Tabla 2 -Oligonucleótidos de LNA. Se evaluaron los oligonucleótidos de LNA para determinar su potencial para reducir la expresión de ARNm de Survivina (knockdown) en células 15PC3. Los datos se presentan
20 como porcentaje de regulación negativa respecto a células con transfección simulada. Se controló el estado estacionario de transcritos mediante PCR a tiempo real y se normalizó respecto al estado estacionario de transcritos de GAPDH, véase la Tabla 3. Obsérvese que todas las C del LNA son 5-metil-Citosina. Tabla 3

oligonucleótido
oligonucleótido: CI50 [nM] CI75 [nM]

diseño 4-8-3-1: diseño 4-8-4

SEC ID Nº: 23: 2,5 (0,5) 6,2 (1,6)

SEC ID Nº: 2: 2,9 (0,4) 4,8 (0,3)

25
Los experimentos se realizaron al menos tres veces. Los números entre paréntesis son las desviaciones típicas.
Ejemplo 13: Inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación por oligonucleótidos de LNA antisentido
30 Cultivo de células: se cultivaron 15PC3 en DMEM (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10%, Glutamax I y gentamicina a 37ºC, humedad del 95% y CO2 al 5%. La línea celular de carcinoma cervical HeLa se cultivó en MEM (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10%, Glutamax I y gentamicina a 37ºC, humedad del 95% y CO2 al 5%. Cuando se alcanzó una confluencia del 60-70%, las células se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (5 µg/ml). Medición de la actividad de Caspasa 3/7 activa
5 Se sembraron células 15PC3 a una densidad de 10000 células por pocillo en placas de 96 pocillos blancas (Nunc 136101) en DMEM el día antes de la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado, seguido de la adición de 72 µl de OptiMEM que contenía Lipofectamine2000 5 µg/ml (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 18 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de
10 oligonucleótidos variaba de 0,2 nM a 100 nM. Después de 4 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 100 µl de DMEM que contenía suero. Después del tratamiento con oligonucleótido, se dejó que las células se recuperaran durante el periodo indicado antes de que se retiraran del incubador de CO2 y se equilibraran a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadieron 15 µl del Reactivo de Caspasa 3/7-GloTM altamente
15 sensible (Promega) directamente a las células y las placas se incubaron durante 20 min. Se registró la luminiscencia (actividad luciferasa) en un instrumento Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems). La actividad luciferasa se mide como Unidades Relativas de Luz por segundo (URL/s). Los datos se analizaron usando el programa informático Ascent 2.4.2. Se generaron gráficas de la inducción en veces respecto al tratamiento simulado usando MS Excel.
20 Se demostró la especificidad de Caspasa 3/7 de la respuesta apoptótica incubando células transfectadas con un inhibidor de caspasa 3/7. Las células inducidas con Estaurosporina, Camptotecina o Taxol sirvieron como controles positivos (véanse las Figuras 3, 6A y laTabla 4 más el Ejemplo 21). Tabla 4 -Medición de Caspasa 3/7 de células transfectadas 24 horas después de la transfección
25 de células 15PC3

Ensayo de Caspasa 3/7: Oligonucleótido Inducción en veces de apoptosis

Inducción en veces (24 horas, 5 nM): SEC ID Nº: 2 SEC ID Nº: 24 3,5x 1,5x

Inducción máxima Inducción en veces (conc., tiempo): SEC ID Nº: 2 SEC ID Nº: 24 6,9x (25 nM, 48 horas) 3,1x (100 nM, 48 horas)

Análisis de citometría de flujo de Anexina V-FITC
Se sembraron 0,4 x 106 células HeLa en matraces T25 un día antes de la transfección. El día de la transfección, las células se lavaron una vez en OptiMEM a 37ºC, seguido de la adición 30 de 2,8 ml de OptiMEM que contenía Lipofectamine2000 5 µg/ml (Invitrogen). Se incubaron las
5
10
15
20
25
30
36
células durante 7 min antes de la adición de 700 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM a una concentración final de 5 nM o 25 nM. Las células con transfección simulada sirvieron como control. Después de 4 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 3 ml de medio de cultivo. Después del tratamiento con oligonucleótido se dejó que las células se recuperaran durante 48 horas antes de recogerse por raspado y lavarse dos veces en PBS. Se incubaron 0,2 x 106 células con 5 µl de Anexina V-FITC y 10 µl de yoduro de propidio (PI-10 mg/ml) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La incubación de las células transfectadas con Anexina V recombinante purificada antes de añadir Anexina V-FITC se usó para demostrar la especificidad y selectividad de la tinción. Además, se usaron células HeLA (0,5 µg/ml) inducidas con TRAIL (Apo2L) como control positivo (véase la Figura 4). Medición de células viables en proliferación usando el ensayo de MTS
Se sembraron células a una densidad de 10000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos transparente (Scientific Orange Nº 1472030100) en DMEM el día antes de la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado, seguido de la adición de 72 µl de OptiMEM que contenía Lipofectamine 2000 5 µg/ml (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 18 µl de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de oligonucleótido variaba de 5 nM a 100 nM. Después de 4 horas de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añadieron 100 µl de DMEM que contenía suero. Después del tratamiento con oligonucleótido, se dejó que las células se recuperaran durante el periodo indicado, se midieron las células viables añadiendo 20 µl del compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina, PES; CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Se midieron las células viables a 490 nm y 650 nm en un Powerwave (Biotek Instruments).
La inhibición de la velocidad de crecimiento ΔDO(490-650 nm)/h se representó frente a la concentración de oligonucleótido respecto al tratamiento simulado, que se ajustó al 100%. La inhibición máxima de la proliferación observada en el ensayo de MTS era del 70% (mínima del 30%). (Tabla 5 y Figura 5).
Tabla 5 -Inhibición de la proliferación de células 15PC3 transfectadas con oligonucleótido

Ensayo de MTS: Oligonucleótido Inhibición de la proliferación

CI50 (48 horas): SEC ID Nº: 2 SEC ID Nº: 24 4,9 nM 86,9 nM

Ejemplo 14: Inducción de Apoptosis por la SEC ID Nº: 2 en combinación con taxol
Cultivo celular: Se sembraron células 15PC3 de cáncer de próstata humano
(suministradas por cortesía del Dr. F Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Países Bajos) a una densidad de 8 x 10E5 células en matraces T75 y se cultivaron durante dos días a 37ºC y CO2 al 5% en DMEM complementado con FBS al 10%, Glutamax y Gentamicina. Dos días después de sembrar las células, se transfectaron con SEC ID Nº: 2 2-10 nM usando Lipofectamine a una concentración final de 7,5 g/ml. Las transfecciones se llevaron a cabo como se describe por Dean y col. (1994, JBC 269 págs. 16416 16424). En resumen, se incubaron células con Lipofectamine diluida en OptiMEM durante 7-10 min, seguido de la adición del oligonucleótido a un volumen total de 8,7 ml por matraz T75. 4 horas después de la transfección, las células se lavaron en OptiMEM y se cultivaron a 37ºC durante 12-96 horas en medio de cultivo completo con o sin adición de 2-100 nM de Taxol (Sigma Aldrich). Las células se recogieron para extracción de ARNm, ensayo de Caspasa 3/7 o se fijaron, se tiñeron con PI y se analizaron por análisis de FACS.
Ensayo de Caspasa 3/7: Una cantidad equivalente de células 15PC3 que variaba de 2500-10000 células se recogió por centrifugación a los periodos indicados y se sembró en placas de 96 pocillos blancas (Nunc 136101) en DMEM. Se añadieron 100 µl del Reactivo de Caspasa 3/7-Glo™ altamente sensible (Promega) directamente a las células en placas 96 pocillos, y las placas se incubaron durante 1 hora antes de registrar la luminiscencia (actividad de luciferasa) en un instrumento Luminoskan Ascent de Thermo Labsystems después de un periodo de retardo de 1 min adicional. La actividad luciferasa se mide como Unidades Relativas de Luz por segundo (URL/s). Los datos se procesaron en el programa informático Ascent 2.4.2 y se dibujaron las gráficas de inducción en veces en relación con el tratamiento simulado en Excel. Las células transfectadas incubadas con el inhibidor de caspasa 3/7, que bloquea la actividad de la caspasa 3/7 activa, se usaron para demostrar la especificidad de la respuesta apoptótica. Además, las células inducidas con Estaurosporina, Camptotecina o Taxol sirvieron como control positivo. Véase la Figura 6. Ejemplo 15: Análisis del ciclo celular por la SEC ID Nº: 2 en combinación con taxol
Cultivo celular y transfecciones: Como en el ejemplo 13.
Fijación y tinción con PI: Las células se lavaron en PBS, se recogieron y se resuspendieron en 100 µl de PBS enfriado en hielo. Se añadieron 900 µl al 70% enfriado en hielo y las células fijadas se mantuvieron a -20ºC hasta su uso.
Las células fijadas se recogieron y se resuspendieron en 700 µl de PBS (temperatura ambiente). Se añadieron 300 µl de tampón Fosfato-Ácido cítrico (Na2PO4 0,19 M, Ácido cítrico 4 mM pH 7,8) y las células se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se recogieron de nuevo y se incubaron durante 30 min en solución de tinción de PI (ARNasa A 1 mg/ml, yoduro de propidio 33 mg/ml, Triton-X-100 al 0,2% (v/v) en PBS pH 7,4).
Se llevó a cabo un análisis de FACS usando un FACS Calibur de Becton Dickinson.
Las células 15PC3 transfectadas con SEC ID Nº: 2 se expusieron a diferentes concentraciones de Taxol y se analizaron por tinción con Yoduro de Propidio y posterior análisis de FACS (Figura 7a-c). Este ensayo también muestra el efecto de adición de la SEC ID Nº: 2 y el Taxol mediante una cantidad creciente de células retenidas en la fase G2 o incluso G4. Véanse las Figuras 7A y 7B más el Ejemplo 21. Ejemplo 16: Modelo in vivo: Inhibición del crecimiento tumoral de células tumorales humanas cultivadas in vivo por tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Modelo: Células de cáncer de próstata humano PC-3 (ECACC) se mezclan con Matrigel y se inyectan s.c. en ambos flancos de ratones Balb/cA-un hembra el Día 0.
Dosificación: Solución salina de SEC ID Nº: 2 de acuerdo con el programa, solución de trabajo 2 mg/ml, volumen de dosificación 10 ml/kg; se usó Taxol en la formulación clínica. Los animales se dosificaron de acuerdo con un peso promedio del grupo el Día 0.
Administración: Oligonucleótidos i.p. (véase la Figura 8) o intratumorales (véase la Figura 9), Taxol i.v., todo de acuerdo con el programa.
Observaciones: Mortalidad (diaria), peso corporal (dos veces por semana).
Volumen tumoral: Durante el experimento, el volumen tumoral se midió dos veces por semana y se calculó de acuerdo con la fórmula (L x D2 x 0,5), donde L representa el diámetro mayor y D el diámetro del tumor perpendicular a L (mm).
Actividad antitumoral: El peso tumoral medio de los tumores tratados se comparará con el grupo de control.
Final del estudio: Los animales se sacrificarán por dislocación cervical. Se pesarán los tumores, hígados y bazos. Análisis de tumores
Aislamiento de ARN total: Se homogeneizaron aproximadamente 20 mg de tejido tumoral en 400 µl de tampón RTL (Qiagen) complementado con mercaptoetanol al 1%. Se aisló el ARN total usando un mini-kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis de ADNc: Se realizó la síntesis de la primera cadena usando un kit de Transcriptasa Inversa OmniScript de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Para cada muestra, se ajustaron 0,5 µg de ARN total a 12 µl y se mezclaron con 0,2 µl de poli(dT)12-18 (0,5 µg/µl) (Life Technologies), 2 µl de mezcla de dNTP (5 mM de cada uno), 2 µl de tampón RT 10x, 0,5 µl de inhibidor de ARNasa RNAguard™ (33 unidades/ml, Amersham) y 1 µl de Transcriptasa Inversa OmniScript, seguido de incubación a 37ºC durante 60 min e inactivación térmica a 93ºC durante 5 min.
Intratumoral: Se administraron 25 mg/kg de SEC ID Nº: 2 o solución salina 6 veces (50 µl
de volumen) durante 2 semanas. La toma de muestras se realizó 24 horas después de la última dosis. Se estableció el nivel de expresión con 9 tumores (SEC ID Nº: 2) frente a 8 tumores (solución salina) a nivel de ARNm. Se analizaron los niveles de proteína en tumores individuales por transferencia de western (véase la Figura 9).
Análisis de PCR a tiempo real: Para determinar el nivel relativo de ARNm de Survivina en tumores tratados y no tratados, se usó el ADNc generado en el análisis de PCR cuantitativa usando un iCycler de BioRad. El ADNc se diluyó 5 veces y se mezclaron 8 µl con 52 µl de mezcla maestra de sonda Taqman que contenía 30 µl de mezcla maestra de PCR Platinum Quantitative SuperMix UDG 2x (Invitrogen), 3 µl de sonda Taqman 20x y mezcla de cebadores (Cebador directo: 5’-AAGGACCACCGCATCTCTACA-3’ (SEC ID Nº: 29), final 0,9 µM. Cebador inverso: 5’CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT-3’ (SEC ID Nº 30), final 0,6 µM y sonda taqman: FAM-5’CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA-3’ (SEC ID Nº 31), final 0,1 µM) y 19 µl de H2O. Se dispersaron 60 µl en dos pocillos (placas de 96 pocillos) con 25 µl en cada pocillo. Los cebadores y las sondas se obtuvieron en Proligonucleotide, Francia. Para normalizar cualquier varianza en la preparación de muestras, se cuantificó el ARNm de GAPDH endógena usando un reactivo de ensayo Taqman pre-revelado de Applied Biosystems (4310884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron diluciones de 2 veces del ADNc sintetizado a partir de 15PC3 no tratadas (que expresaban tanto Survivina como GAPDH) para preparar curvas patrón para los ensayos. El programa de PCR era el siguiente: 50ºC durante 2 min, 95ºC durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95ºC 15 s, 60ºC 1 min. Se determinaron las cantidades relativas de ARNm de Survivina a partir del Umbral de ciclos calculado usando el programa informático del Sistema de Detección a Tiempo Real iCycler iQ. Véase la Figura 9.
Aislamiento de proteína total y Transferencia de Western: Se homogeneizaron aproximadamente 50 mg de tejido tumoral usando un homogeneizador Retsch en Tris-HCl 50 mM pH 6,8, glicerol al 10%, SDS al 2,5%, DTT 5 mM y urea 6 M complementado con cóctel inhibidor de proteasas (Roche). Se midieron las concentraciones de proteína total usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Se procesaron 50 µg de proteína total en un gel de Bis-Tris al 12% en tampón MOPS y se transfirieron sobre membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de una incubación durante una noche en tampón de bloqueo (PBS-T complementado con leche en polvo semidesnatada al 5%), las membranas se incubaron durante una noche con una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal anti-Survivina Novus 500-201, seguido de una incubación de una hora con una dilución 1:1000 de anti-Bcl (DAKO). Después, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios (anticuerpos secundarios conjugados con HRP de DAKO o anticuerpos conjugados con AP de Invitrogen diluidos 1:1000) y se visualizaron la Survivina y la Bcl2 usando un kit de inmunodetección cromogénica (Invitrogen) o un kit de detección de ECL+ quimioluminiscente (Amersham). Véase la Figura 9.
Ejemplo 17: Combinación in vitro de oligonucleótido antisentido de Survivina y radiación
Existen pruebas crecientes en la bibliografía científica que demuestran una correlación entre la sobreexpresión de la proteína inhibidora de apoptosis (IAP) Survivina y la radiorresistencia. Además, se ha demostrado que la regulación negativa de la Survivina causa radiosensibilización en líneas celulares de cáncer in vitro.
La transfección de las líneas celulares de melanoma JR8 y M14, transfectadas de forma estable con una construcción que expresa una ribozima que se dirige a Survivina, daba como resultado una regulación negativa del 50-60% de la proteína Survivina, una apoptosis aumentada medida por la activación de Caspasa 3 y tinción con yoduro de propidio, así como una sensibilidad aumentada a irradiación γ, evaluada como cambios de viabilidad por el ensayo clonogénico (Pennati y col., 2003; J. Invest. Dermatol. 120, 648-54).
En líneas celulares de cáncer colorrectal, se ha demostrado una clara correlación entre los niveles de expresión de Survivina y la radiosensibilidad (Rödel y col., 2003; Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 55, 1341-47). Las células SW 480 con la menor radiosensibilidad mostraban la mayor expresión espontánea de Survivina. En realidad, la proteína Survivina estaba incluso regulada positivamente 48 horas después de la irradiación en células SW 480. Por el contrario, la expresión de Survivina era reducida en las no tratadas y no aumentaba después de la irradiación en la mayoría de líneas celulares radiosensibles SW 48.
Las células de cáncer pancreático MIAPaCa-2 que sobreexpresan Survivina recombinante son menos radiosensibles que las células no transformadas. Por el contrario, la línea celular de cáncer de páncreas radiorresistente Panc-1, cuando se transforma con un mutante de Survivina negativo dominante, aumenta su radiosensibilidad y su actividad de Caspasa 3 (Asanuma y col., 2002; Jpn. J. Cancer Res. 93, 1057-62).
El tratamiento de la línea celular de cáncer pulmonar H460 con un oligonucleótido antisentido de Survivina disminuía la viabilidad celular de células H460 irradiadas in vitro (Lu y col., 2004; Cancer Research 64, 2840-45). In vivo, el retraso del crecimiento tumoral en xenoinjertos de H460 en ratones atímicos tratados con una combinación de un oligonucleótido antisentido de Survivina e irradiación era superior que en ratones tratados con el oligonucleótido o irradiación solamente (Cao y col., 2004; Oncogene 23, 7047-52).
Estos datos indican claramente que la Survivina desempeña un papel importante en la radiorresistencia, y que la regulación negativa de la Survivina puede dar como resultado un beneficio terapéutico en el campo del tratamiento del cáncer con radiación. La sensibilización de células cancerosas a radioterapia puede dar como resultado dosis de radiación reducidas y,
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por lo tanto, efectos secundarios menos graves e incluso una eficacia aumentada.
La combinación de SEC ID Nº: 2 e irradiación se realizará transfectando diversas líneas celulares incluyendo células U87 y U373 (glioblastoma), H460 (NSCLC) y células LS 174 T (cáncer de colon) con el oligonucleótido y tratándolas posteriormente con irradiación. El efecto se relacionará con las células con transfección simulada que reciben el mismo régimen de tratamiento, lo que mostrará el efecto de la radiación solamente. Después de la irradiación, las células se analizarán para determinar su viabilidad usando el ensayo de MTT y el ensayo clonogénico. Se evaluará la apoptosis por mediciones de la actividad de la Caspasa 3, ensayo de TUNEL y tinción con Hoechst. Ejemplo 18: Combinación in vivo de oligonucleótido antisentido de Survivina SEC ID Nº: 2 y radioterapia fraccionada en xenoinjertos subcutáneos de glioblastoma U87 en ratones atímicos
Se inyectaron 2 x 106 células U87 cultivadas in vitro en el flanco derecho de ratones NMR nu/nu macho de 6-7 semanas de edad. Cuando los tumores habían alcanzado un tamaño medio de 200 mm3, los animales se trataron con la SEC ID Nº: 2, el oligonucleótido de control negativo SEC ID Nº: 24 o Nacl (solución salina) al 0,9% i.p. Los oligonucleótidos se inyectaron como soluciones salinas a 20 mg/kg/tratamiento día.
Se incluyeron en el estudio los grupos siguientes, comprendiendo cada uno 8 ratones:

1.: NaCl i.p. al 0,9%

2.: SEC ID Nº: 2 i.p.

3.: SEC ID Nº: 24 i.p.

4.: SEC ID Nº: 2 i.p. + Radioterapia

5.: SEC ID Nº: 24 i.p. + Radioterapia

6.: NaCl i.p. al 0,9% + Radioterapia.

Se administró la radioterapia como una sola dosis de 3 Gy antero-posteriormente como dos campos laterales opuestos, en cuatro fracciones en cuatro días de acuerdo con el programa de tratamiento a continuación. Durante la terapia de radiación, los animales se anestesiaron con ketalar y rompún. Los animales que no recibieron terapia de radiación se anestesiaron de la misma forma.

Día de Tratamiento: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tratamiento i.p.: X X X X X X

Terapia de radiación: X X X X

Se determinó el crecimiento tumoral mediante dos mediciones perpendiculares (d1 y d2) usando un indicador deslizante. Se calcularon los volúmenes tumorales [V(t)] de acuerdo con
la fórmula siguiente:
V(t) = 0,35 (d1 (t) x d2 (t))3/2
Se midió el crecimiento tumoral hasta que los tumores alcanzaron un tamaño de 1000
3
mm . Se determinó el peso corporal de todos los animales al comienzo del tratamiento, después una vez por semana.
Ejemplo 19: Estudios preclínicos de toxicidad de GLP con SEC ID Nº: 2 en roedores y monos Cynomolgus
Para la SEC ID Nº: 2 se descubrió, entre otras cosas, lo siguiente en estudios
preclínicos de toxicidad: En estudios de toxicidad aguda i.v. en ratones, se descubrió que la dosis máxima no letal era de 1000 mg/kg. En estudios de toxicidad aguda i.v. en ratas, se descubrió que la dosis letal mínima era de 1000 mg/kg. En un estudio de DMT i.v. en monos cynomolgus, no se encontraron signos clínicos notables, sin embargo, eran evidentes pruebas de toxicidad hepática y renal en todos los animales. Los animales se trataron con un diseño de aumento a escala de la dosis con una dosis máxima de 160 mg/kg x 3 (dosis total de 930 mg/kg) o 120 mg/kg x 5 durante 2 semanas. En un estudio de toxicidad a dosis repetidas de 4 semanas i.v. en monos cynomolgus se administró la SEC ID Nº: 2 a dosis de 0, 6, 15 y 60 mg/kg/ocasión dos veces por semana durante cuatro semanas. En los grupos de animales que recibieron 0, 15 ó 60 mg/kg/ocasión, se realizó un seguimiento de algunos animales durante un periodo de recuperación de 4 semanas sin tratamiento.
Se congelaron rápidamente tejidos, incluyendo muestras de hígado y riñón, y se almacenaron a -70ºC para su análisis posterior.
Ejemplo 20: Contenido de oligonucleótido en tejidos de monos cynomolgus
Preparación de muestras: Extracción de tejidos hepático y renal.
Productos químicos/reactivos: Proteinasa K (25,1 mg/ml): Sigma P4850. Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1(v/v/v), saturado con Tris 10 mM, pH: 8,0,
EDTA 1mM: Sigma P2069 Igepal CA-630: Sigma, I8896. Tampón de extracción: Igepal CA-630 al 0,5%, Tris 25 mM pH 8,0, EDTA 25 mM, NaCl
100 mM, pH 8,0 (ajustado con NaOH 1 N).
1 mg/ml de Proteinasa K en tampón de extracción: Preparada antes de cada extracción.
Se pesan tejidos (∼100 mg) (el tejido se mantiene en nieve carbónica antes y después del pesado). Se añaden 500 µl de tampón de extracción que contiene proteinasa K (1 mg/ml). El tejido se homogeneiza mecánicamente y el homogeneizado se incuba durante una noche a 37ºC.
Se preparan muestras de referencia disolviendo la SEC ID Nº: 2 en tampón de extracción al intervalo de concentraciones pertinente. Exactamente se pesan 100 mg de tejido hepático de animales no tratados (mantenido en nieve carbónica antes y después del pesado). Se añade tampón de extracción (con proteinasa K, 1 m/ml) que contiene el material de referencia a las muestras de tejido hasta un volumen total de 0,5 ml. El tejido se homogeneiza mecánicamente y se incuba durante una noche a 37ºC. La señal de detección de la SEC ID Nº: 2 de estas muestras se usa para preparar una curva patrón que abarque las concentraciones mínima y máxima encontradas en los animales tratados.
Se transfieren las muestras de tejido a microtubos de 2 ml con tapones de rosca. Se añade fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 (v/v/v)) después de agitar enérgicamente durante 5 min. La separación de fases se logra por centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. Se transfiere la fase acuosa (fase superior) a un nuevo tubo (compatible con el evaporador) y se añaden 500 µl de H2O Milli-Q a la fase orgánica (residual de la primera extracción). Los tubos se agitan enérgicamente de nuevo durante 5 min, después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 min (SAN039 en la sala 115). Las fases acuosas (fases acuosas de la 1ª extracción y lavado) se combinan y se evaporan hasta la sequedad (80ºC, en nitrógeno). El residuo se reconstituye en 200 µl de Agua Milli-Q después de la centrifugación a 4000 RPM durante 15 min. Las muestras se transfieren a viales de HPLC para su análisis.
Análisis de HPLC de oligonucleótido en tejidos hepático y renal: Después de la extracción, la SEC ID Nº: 2 se analizó por HPLC de intercambio iónico:
Columna: Dionex, DNA pac PA 100: 2 x 50 mm (centinela), 2 x 250 mm (analítica).
Temp. de columna: 42ºC.
Vol. de inyección: 50 µl.
Disolvente de lavado: H2O Milli-Q
Disolvente de purga: H2O Milli-Q
Detección: UV, 260 nm. Disolventes
Tampón A: EDTA 1 mM, TRIS-Cl 20 mM, NaClO4 10 mM, pH: 7,6 (NaOH 1 N) Tampón B: EDTA 1 mM, TRIS-Cl 20 mM, NaClO4 1 M, pH: 7,6 (NaOH 1 N) Véanse las Figuras 10A y 10B
Tabla 7

Ejemplo 21: Resumen de los resultados

SEC ID Nº: 2: SEC ID Nº: 23 SEC ID Nº: 22 SEC ID Nº: 21

Tamaño (véase la Tabla 2): 16 unidades 16 unidades 16 unidades 18 unidades

Diseño: 4-8-3-1 4-8-4 4-8-3-1 4-10-4

Apoptosis a 5 nM, 24 horas (véase la Fig. 3): 3,5 veces 2 veces Sin actividad Sin actividad

Apoptosis Máx. (véase la Fig. 3): 6,5 veces (25 nM, 24 horas) 5,5 veces (25 nM, 48 horas) 2,5 veces (25 nM, 48 horas) 2,5 veces (25 nM, 48 horas)

Proliferación CI50 (48 horas, nM) (véase la Fig. 5): 5,0 n.d. 25 25

Detención del ciclo celular G2/M G1:G2 (24 horas) 0 nM 2 nM 2 nM+10 nM Taxol (véanse las Fig. 7A y 7B): 1:0,25 1:1 1:3 n.d. n.d. n.d.

Tm (ºC) ARN complementario: 75,3 n.d. n.d. 62,7

La SEC ID Nº: 2 conduce a una regulación negativa de Bcl-2 que no se encuentra con los controles negativos.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Santaris Pharma A/S
<120> OLIGONUCLEÓTIDOS DE LNA Y EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER
<130> 16018PCT00
<160> 34
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<400> 14 imagen2
<210> 15
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<210> 16
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
<400> 17 imagen2
<210> 18
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Enlace fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato <220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
<400> 18 imagen2
<210> 19
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<400> 19 imagen2
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato
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<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (1)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<222> (1)..(17)
<223> Enlace fosforotioato
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<222> (15)..(18)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<210> 22
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (1)..(1)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<222> (2)..(2)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<222> (3)..(3)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<222> (4)..(4)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada de 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature <222> (14)..(15)
<223> Citosina de LNA modificado con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220> <221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<400> 24 imagen2
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> Enlace fosforotioato
<400> 25 imagen2
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
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<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
<400> 26 imagen2
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (1)..(1)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlace fosforotioato
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<222> (15)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<222> (1)..(1)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> Nucleótido modificado de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> Enlace fosforotioato
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<221> misc_feature <222> (13)..(13)
<223> Citosina de LNA modificada con 5-metilo
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<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Nucleótido modificado de LNA
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<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia oligonucleotídica sintética
<400> 30 imagen2
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia oligonucleotídica sintética
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Secuencia oligonucleotídica sintética
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<212> ADN
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<223> Secuencia oligonucleotídica sintética
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia oligonucleotídica sintética
<400> 34 imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de taxano y un oligonucleótido de LNA en un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

MeCx

5’-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28);

en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA

seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras

minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de

nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el

subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos

de LNA vecinos, y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace

fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en la que

las unidades de nucleótidos entre paréntesis representan cada una una unidad

opcional; y

en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y el

oligonucleótido de LNA en dicha composición está en el intervalo de 50:1 a 1:25.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCxMeCx

5’-MeCxTx AsastsCsCsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1).
3.

La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que todos los análogos de nucleótidos de LNA son β-D-oxi-LNA.
4.

La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

MeCsMeCs

5’-MeCsTs AsastsCsCsastsgsgs AsGsC-3’ (SEC ID Nº: 2),

5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 3),

5’-MeCTMeCAsastsCscsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 4), MeCsMeCs

5’-MeCsTs AsastsCscsastsgsgs Asgsc-3’ (SEC ID Nº: 5), MeCsMeCs

5’-CsTs AsastsCscsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 6), 5’-MeCTMeCAsastsCsCsastsgsgsMeCAgsc-3’ (SEC ID Nº: 7),

5’-csTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 8), 5’-MeCTMeCAsastsCsCsastsgsgsMeCAgc-3’ (SEC ID Nº: 9) y 5’-cTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 10).
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el oligonucleótido de LNA

MeCsMeCs

es el compuesto con la secuencia 5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 2).
6. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de taxano y un conjugado en un vehículo farmacéuticamente aceptable, consistiendo dicho conjugado en un oligonucleótido de LNA y al menos un resto no nucleotídico/no polinucleotídico unido covalentemente a dicho oligonucleótido, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

MeCx

5’-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28); en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y en el que las unidades de nucleótidos entre paréntesis representan cada una una unidad opcional; y en la que la proporción en peso entre el compuesto o compuestos de taxano y la parte de oligonucleótido de LNA del conjugado en dicha composición está en el intervalo de

50:1 a 1:25.
7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCxMeCx

5’-MeCxTx Asastscscsastsgsgs AGxc-3’ (SEC ID Nº: 1).
8.

Uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero, en particular un ser humano, que padece o es susceptible de padecer una enfermedad cancerosa.
9.

El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCxMeCx

5’-MeCxTx AsastsCsCsastsgsgs AxGxC-3’ (SEC ID Nº: 1).
10.

El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que todos los análogos de nucleótidos de LNA son β-D-oxi-LNA.
11.

El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

MeCsMeCs

5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 2),

5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 3),

5’-MeCTMeCAsastsCsCsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 4), MeCsMeCs

5’-MeCsTs AsastsCsCsastsgsgs Asgsc-3’ (SEC ID Nº: 5), MeCsMeCs

5’-csTs Asastscscsastsgsgs AsGsC-3’ (SEC ID Nº: 6), 5’-MeCTMeCAsastsCscsastsgsgsMeCAgsc-3’ (SEC ID Nº: 7), 5’-csTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 8), 5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAgc-3’ (SEC ID Nº: 9) y 5’-cTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 10).
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el oligonucleótido de LNA es el

MeCsMeCs

compuesto con la secuencia 5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 2).
13.

El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en el que la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielocítica aguda, linfoma difuso de células B, leucemia linfocítica aguda, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer del tracto urinario y cáncer colorrectal.
14.

Una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para tratar a un mamífero, en particular a un ser humano, que padece o es susceptible de padecer una enfermedad cancerosa.
15.

La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCxMeCx

5’-MeCxTx Asastscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1).
16.

La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en la que todos los análogos de nucleótidos de LNA son β-D-oxi-LNA.
17.

La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que el oligonucleótido de LNA es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

MeCsMeCs

5’-MeCsTs AsastsCsCsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 2),

5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 3),

5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 4), MeCsMeCs

5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs Asgsc-3’ (SEC ID Nº: 5), MeCsMeCs

5’-CsTs AsastsCsCsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 6), 5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAgsc-3’ (SEC ID Nº: 7), 5’-csTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGsc-3’ (SEC ID Nº: 8), 5’-MeCTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAgc-3’ (SEC ID Nº: 9) y 5’-CTMeCAsastscscsastsgsgsMeCAGc-3’ (SEC ID Nº: 10).
18. La composición de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el oligonucleótido de

MeCsMeCs

LNA es el compuesto con la secuencia 5’-MeCsTs Asastscscsastsgsgs AsGsc-3’ (SEC ID Nº: 2).
19.

La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielocítica aguda, linfoma difuso de células B, leucemia linfocítica aguda, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer del tracto urinario y cáncer colorrectal.
20.

Un kit que comprende

(a) un primer componente que contiene una o más dosis de solución inyectable de un oligonucleótido de LNA, teniendo dicho oligonucleótido de LNA un total de 12-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA, y comprendiendo la (sub)secuencia siguiente:

)MeCxMeCx

5’-(MeCx)(TxAsAsAscscsastsgsgs Ax(Gx)(c)-3’ (SEC ID Nº: 28); en la que las letras mayúsculas designan un análogo de nucleótido de LNA seleccionado de β-D-oxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA y α-L-oxi-LNA, las letras minúsculas designan un desoxinucleótido, el subrayado designa un análogo de nucleótido de LNA como se ha definido anteriormente o un desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos, y el subíndice “x” designa un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiéster entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos; y

5 en la que las unidades de nucleótidos entre paréntesis representan cada una una unidad opcional; y

(b) un segundo componente que contiene una o más soluciones inyectables de uno o más compuestos de taxano; y en el que la proporción en peso entre el al menos un compuesto de taxano en una solución del segundo componente y el al menos un

10 oligonucleótido de LNA en una dosis de solución del primer componente está en el intervalo de 50:1 a 1:25 y/o en el que las dosis de solución inyectable del oligonucleótido de LNA comprenden un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5 y tienen una fuerza iónica de 202000 mM.

15
21. El kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que las dosis de solución inyectable de un oligonucleótido de LNA son composiciones farmacéuticas como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

20 22. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20-21, en el que el oligonucleótido de LNA tiene un total de 16-20 nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA y comprende la (sub)secuencia siguiente:

MeCx MeCx

5’-MeCxTx Asastscscsastsgsgs AxGxc-3’ (SEC ID Nº: 1).

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