ES2352534T3 - PARVOVIRUS DOTADO DE UN GENOMA ENRIQUECIDO EN CpG ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER. - Google Patents

Abstract

Un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con motivo CpG, en el cual el genoma contiene al menos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.

Description

La presente invención se refiere a un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con CpG, en que el genoma contiene por lo menos dos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural. La presente invención también se refiere a la utilización de dicho parvovirus para el tratamiento contra el cáncer. 5

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Los virus oncolíticos como los parvovirus de roedores representan nuevas herramientas en el tratamiento contra el cáncer. Además de destruir de forma específica las células cancerígenas (oncólisis), estos agentes también proporcionan señales de peligro, induciendo al sistema inmunitario a eliminar tumores infectados por virus. Como consecuencia de los eventos oncolíticos, los sistemas inmunitarios innato y adaptativo consiguen acceder a los antigenes del tumor, lo cual tiene como resultado unos efectos de iniciación cruzada y vacunación. Los parvovirus de 10 roedores son virus con ADN de hebra simple que poseen actividad oncolítica “intrínseca”, es decir, que preferentemente se replican en, y destruyen células cancerígenas tanto de origen murino como humano (1). A pesar de ello, la eficacia anti-cáncer de los candidatos más prometedores para aplicaciones clínicas en seres humanos (incluyendo el H-1PV) requiere alguna mejora.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar parvovirus mejorados para usos terapéuticos. 15

De acuerdo con la invención, ello se consigue a través de los aspectos que se definen en las reivindicaciones. La presente invención se basa en los descubrimientos del solicitante en el sentido que pueden generarse virus oncolíticos mejorados combinando las características beneficiosas de la oncólisis y la vacunación. Se diseñó un vector de parvovirus oncolítico con motivos CpG extra en su genoma, lo cual provocó que se acumulasen de forma selectiva en células tumorales a través de la amplificación del genoma vírico, es decir, derivados de H-1PV que contenían motivos 20 CpG fueron preparados y comparados con los virus parentales en relación con su capacidad para mejorar la eficacia de una vacuna anti-tumor autóloga en un modelo preestablecido de metástasis de pulmón de hepatoma de rata (2). Se prepararon dos variantes de H-1PV enriquecidas con CpG (JabCG1 y JabCG2), preservando tanto la competencia de replicación como las características oncolíticas del virus parental. Los virus fueron inoculados ex vivo en la vacuna antes de su inyección subcutánea en animales que presentaban tumores. Estas son condiciones en las que el H-1PV deja de 25 tener un efecto oncolítico directo significativo en las metástasis, y actúa esencialmente como un adyuvante, modulando el grado de efectividad de la vacuna para provocar una respuesta de inmunidad anti-tumor (3). En concordancia con su contenido aumentado de CpG, los genomas JabCG1 y JabCG2 demostraron ser unos activadores in vitro más potentes de señales mediadas por TLR-9 que el ADN de H-1PV en estado natural. La actividad antitumoral fue evaluada en un modelo de metástasis de pulmón por hepatoma MH3924A de rata, en que los virus parentales y modificados fueron 30 inoculados ex vivo como adyuvantes de una vacuna autóloga administrada de forma subcutánea. En esta configuración, que excluye los efectos oncolíticos directos sobre las metástasis, el vector JabCG2 mostró una mejora en la inmunogeneicidad, induciendo a los marcadores de inmunidad celular (IFN-) y de activación de células dendríticas (CD80, CD86) en ganglios linfáticos mediastínicos (drenado de tumor). Ello tuvo como consecuencia un índice metastático significativamente menor (50%) en comparación con otros programas de vacunación (células tratadas con 35 H-1 PV, JabCG1, JabGC o de control). Los motivos CpG pueden añadirse al genoma H-1PV sin alterar la capacidad del virus de replicar y lisar las células tumorales. Y lo que es todavía más interesante, la adición de motivos CpG puede mejorar la capacidad de los parvovirus, por ejemplo, el H-1PV, de convertir las células tumorales infectadas en una vacuna que provoque estimulación inmunitaria y supresión de metástasis en condiciones en que el virus en estado natural tiene un efecto limitado. Esta es la primera demostración de que la oncosupresión inducida por virus puede 40 mejorarse modificando el número de motivos CpG activadores en el genoma del virus, lo cual tiene como resultado la inmunoestimulación in vivo.

En resumen, los datos presentes proporcionan una evidencia de que aumentar el número de motivos CpG inmunoestimulatorios en los virus oncolíticos hace que resulte posible mejorar su efecto anti-cáncer global a través de la inducción de vacunación antitumor. El hecho que los parvovirus se repliquen de forma selectiva en las células 45 neoplásticas debería limitar la amplificación de motivos CpG a la zona del tumor, minimizando de esta manera el riesgo de efectos colaterales.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Construcción y propiedades in vitro de los virus modificados con CpG

(A). Secuencias de fragmentos que contienen CpG (con motivos CpG en negrita) clonados en el sitio Hpal del vector 50 pSR19. La organización del genoma de H-1PV se representa de forma esquemática con las ubicaciones de la cápsida (VP1/2), las proteínas no estructurales (NS1/2) los genes y sus promotores respectivos (P4, P38). También se indican las posiciones de las zonas de restricción de Hpall y Acll. Las secuencias enmarcadas en JabCG1 representan los motivos que unen los PIF.

(B). Análisis de tipo Southern blot del ADN viral extraído de las células NBK 48 horas después de la infección (a una 55 multiplcidad de 1 unidad de replicación por célula) sirviendo como referencia los diferentes virus de CpG (JabCG1, JabCG2, JabGC) o H-1PV en estado natural. Se indican las posiciones del ADN viral de una sola hebra (ss), y las formas de replicación del monómero (mRF) y el dímero (dRF).

(C). Supervivencia de las células medida utilizando el ensayo MTT y expresada en porcentaje de células vivas en cultivos tratados con virus en relación con cultivos de control. Las células de NBK (inyectadas en una placa de cultivo de 96 cavidades a 2 x 103 células / cultivo) fueron analizadas 72 horas después de la inoculación de virus modificados con H-1PV o CpG en las multiplicidades de infección indicadas (MOI). Los valores indicados son el promedio de las mediciones realizadas por cuadruplicado. 5

(D). Estado de metilación del ADN viral extraído de células de NBK 48 horas después de la infección (MOI 1), tanto con JabCG2 como con H-1PV. Después de la purificación, el ADN viral fue sometido (o no) a tratamiento con las enzimas de restricción indicadas. La presencia de las formas replicativas virales y los cambios en su tamaño después de la digestión están indicados con flechas. Los resultados son representativos de tres experimentos.

Figura 2: Activación de macrófagos y células HEKTLR9 dependiente de TLR9 por ADN de H-1PV en estado natural y 10 modificado.

(A). Emisión de NO de macrófagos RAW 264.7. Las células (1 x 105 células por cultivo en una placa de cultivo de 96 cavidades) fueron preactivadas el día anterior con IFN- recombinante (10 U / ml) antes de la estimulación con los oligonucleótidos indicados (CpG28, PTOCG1, PTOCG2 y PTOGC) (5g / ml) or ADN ss viral (JabCG1, JabCG2, JabGC, H-1PV) (5g / ml); se utilizó ADN de E. Coli en la misma concentración como control positivo. Se incluyeron 15 células RAW tratadas con medio (MED) suplementado (o no) con IFN- o Lipofectamina como controles negativos. Los niveles de NO se determinaron a las 18 horas utilizando la reacción Greiss. Algunas de las muestras de ADN ss fueron preincubadas con LipofectaminaTM 2000 (Lip; 1g / cavidad) antes de su aplicación sobre las células. El ADN ss absorbido por las células de RAW264.7 fue detectado por el PCR 18 horas después del tratamiento utilizando una serie de iniciadores común tanto para el genoma modificado con H-1PV como para el modificado con CpG. 20

(B). Señalización dependiente de TLR9 en las células tratadas con ADN viral. Las células HEK que expresaban de forma estable mTLR9 y que contenían un gen indicador de luciferasa activado por NFxB fueron inyectadas en placas de cultivo de 96 cavidades (2 x 103 células por cavidad) y estimuladas con los ADN ss indicados (JabCG1, JabCG2, JabCG, 10g / ml). El tratamiento con oligonucleótidos cGpCODN-1826 y sCpGODN-1826 (5g / ml) sirvió como control negativo y positivo, respectivamente. 6 horas después del tratamiento, se evaluó la inducción de NFxB por mediación de 25 TLR-9 midiendo la actividad de luciferasa en el lisado celular. Los resultados que se muestran son valores medios de 3 experimentos independientes.

Figura 3: Potencial anticáncer in vivo de virus modificados con CpG

(A). Índices de metástasis en ratas inyectadas i.v. con células tumorales MH3924A en el día 0, vacunadas s.c. con células autólogas irradiadas e infectadas por vector H-1PV o Jab en el día 10 y analizadas en el día 30. Las diferencias 30 significativas (p<0.05) en relación con los animales no tratados están indicadas con un asterisco.

(B). Detección de RT-PCR de expresión de indicadores inmunológicos en los ganglios linfáticos mediastínicos de los grupos de animales de la parte superior. Se indican los datos de las ratas individuales con sus números de metástasis correspondientes (por encima de 2 mm de diámetro) indicado en la parte superior de las columnas. Las muestras fueron comparadas tomando –actin como referencia. 35

De esta manera, la presente invención proporciona un parvovirus (y un vector basado en parvovirus) caracterizado por un genoma enriquecido con un motivo CpG, en que el genoma contiene por lo menos un motivo CpG que no se encuentra presente en el genoma en estado natural.

El término “parvovirus” tal como se utiliza en el presente documento comprende el estado natural o sus derivados modificados competentes desde el punto de vista de la replicación, así como los virus o vectores relacionados basados 40 en dichos virus o derivados. Los parvovirus, derivados, etc. adecuados, así como las células que pueden ser utilizadas para producir dichos parvovirus son fácilmente determinables dentro de la experiencia en la técnica sobre la base de lo que aquí se divulga, sin ningún esfuerzo empírico indebido.

El término “motivo CpG” significa un oligonucleótido que contiene o que consta del dímero 5‟-CG-3‟, que es, preferiblemente, ADN. 45

El término “en que el genoma contiene por lo menos... motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural” se refiere a un genoma del parvovirus que contiene los motivos CpG adicionales de manera que (a) el parvovirus retiene su capacidad de multiplicarse y diseminarse en las células neoplásticas y (b) su competencia para la oncólisis y / o la citopatogenicidad no resulta impedida.

En base a las instrucciones proporcionadas en los Ejemplos que se indican más abajo, la persona con experiencia en la 50 técnica puede determinar (a) puntos adecuados para la inserción de motivos CpG y (b) el número óptimo de motivos CpG que tienen como resultado una mejora en el efecto adyuvante y terapéutico.

La distancia preferente entre los motivos CpG individuales tiene un rango de 1 a 200 nt.

En una realización preferente de la presente invención, el parvovirus contiene motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural en un rango de 2 a 30, y preferiblemente de 6 a 12. En una realización particularmente preferente, el parvovirus contiene 6 motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.

En otra realización preferente de la invención, los motivos CpG adicionales se insertan en un intrón o una región 3‟ no 5 traducida de un gen. En base a las secuencias de nucleótido conocidas de los genomas de los diferentes parvovirus que resultan útiles para las finalidades de la presente invención, la persona con experiencia en la técnica puede determinar con facilidad puntos adecuados para la inserción de los motivos CpG. Asimismo, la inserción de motivos CpG puede llevarse a cabo a través de procedimientos standard, por ejemplo, mutagénesis dirigidas al punto objetivo, etc.

En una realización más preferente del parvovirus de la presente invención, los motivos CpG están insertados en la 10 región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción VP. De forma alternativa, el enriquecimiento del genoma del parvovirus con motivos CpG puede realizarse mediante la utilización de un codón alternativo. Por ejemplo, el codón AGA (código de arginina) podría ser sustituido por los codones CGA, CGT, CGG o CGC y para la secuencia de aminoácido Asp – Val podrían utilizarse los codones AAC – GTT.

En otra realización más preferente del parvovirus de la presente invención, los motivos CpG comprenden la secuencia 15 nucleótida AACGTT o GTCGTT.

En una realización particularmente preferente, el parvovirus de la invención contiene tres motivos AACGTT y tres motivos GTCGTT dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP.

En una de las realizaciones más preferentes, el parvovirus de la invención está basado en H-1 PV (es decir, derivado de H-1 PV) y contiene la secuencia nucleótida 5‟-GTT AAC GTT TAC AGC TGA CTA GTC GTT TGC TCAG TCT AAC GTT 20 CTT GTCT ATT GTC GTT TAC TAG TCT CTT AAC GTT TCAT CTA CTT GTC GTT AAC-3‟ dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP.

Los parvovirus particularmente útiles son los parvovirus H1 (H-1 PV) o un parvovirus relacionado con los roedores, como el virus diminuto del ratón (MMV), el parvovirus del ratón (MPV), el virus diminuto de la rata (RMV), el parvovirus de la rata (RPV) o el virus de la rata (RV). 25

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene un parvovirus de la invención o una célula que produce dicho parvovirus (agente parvoterapéutico), por ejemplo, el 293(T) humano, NBK o RG2.

Para su administración, el agente terapéutico puede combinarse con los portadores farmacéuticos adecuados. Los portadores farmacéuticos adecuados son de un tipo muy conocido en el sector y que pueden obtenerse comercialmente con facilidad, e incluyen soluciones salinas amortiguadas de fosfatos (PBS), agua, emulsiones como emulsiones de 30 aceite / agua, agentes humectantes de distintos tipos, soluciones estériles, etc. Dichos portadores pueden ser formulados con el / los agente / s parvoterapéutico /s a través de métodos de formulación convencionales para su administración al sujeto en una dosis adecuada.

Los portadores farmacéuticamente compatibles adicionales pueden incluir geles, materiales de matriz biosorbibles, elementos de implantación que contengan el agente terapéutico o cualquier otro vehículo o medio o material adecuado 35 de dispensación o entrega.

Los pacientes tratables mediante los agentes parvoterapéuticos de la invención incluyen seres humanos, así como animales. Como ejemplo de estos últimos podemos citar vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros y gatos.

La administración de las composiciones farmacéuticas parvoterapéuticas a un paciente, por ejemplo un paciente con un tumor cerebral, pueden realizarse de muchas formas adecuadas, por ejemplo por administración intravenosa, 40 intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intracraneal e intratumoral. Por supuesto, la vía de administración depende de la naturaleza de la enfermedad y del agente o los agentes terapéuticos específicos que contiene la composición farmacéutica.

Si dicho / s agente / s parvoterapéutico / s comprende / n partículas de virus infecciosos con la capacidad de penetrar a través de la barrera sangre – cerebro, el tratamiento puede llevarse a cabo, o cuanto menos, iniciarse mediante una 45 inyección intravenosa de agente viral terapéutico, por ejemplo, H1-PV.

Dado que el tratamiento intravenoso a largo plazo es susceptible de acabar siendo ineficaz como resultado de la formación de anticuerpos neutralizantes sobre el agente viral terapéutico, pueden adoptarse diferentes modos de administración después de un régimen inicial de administración viral intravenosa o las mencionadas diferentes técnicas de administración, por ejemplo puede utilizarse como alternativa la administración intracraneal o intratumoral de virus a 50 lo largo de todo el tratamiento parvoviral.

Como otra técnica de administración específica, el agente parvoterapéutico (virus, vector y / o agente celular) puede ser administrado al paciente a partir de una fuente implantada en el paciente. Por ejemplo, un catéter, ya sea de silicona u otro material biocompatible, puede conectarse a un pequeño depósito subcutáneo (depósito de Rickham) instalado en el

paciente durante la extracción del tumor o mediante un procedimiento separado, con el fin de permitir que la composición parvoterapéutica sea inyectada de forma local en diferentes momentos sin ninguna otra intervención quirúrgica. El parvovirus o los vectores derivados también pueden ser inyectados, por ejemplo en un tumor, mediante técnicas quirúrgicas estereotácticas o por técnicas de inactivación por neuronavegación.

La administración de los agentes o composiciones parvovirales también puede realizarse por infusión continua de 5 partículas virales o de fluidos que contengan partículas virales a través de catéteres implantados en coeficientes de flujo bajos utilizando sistemas de bombeo adecuados, por ejemplo bombas de infusión peristáltica o bombas de administración por convección mejorada (CED).

Otro modo distinto de administración de la composición parvoterapéutica es a partir de un dispositivo implantado, construido y dispuesto con el fin de dispensar el agente parvoterapéutico en el locus deseado, por ejemplo, el tumor. 10 Por ejemplo, pueden emplearse gasas que hayan sido impregnadas con la composición parvoterapéutica, por ejemplo el parvovirus H1, en que la gasa se adhiere a los extremos de la cavidad de resección una vez finalizada la extracción quirúrgica del tumor. En dicha intervención terapéutica pueden utilizarse múltiples gasas.

Las células que producen de forma activa el agente parvoterapéutico, por ejemplo, el parvovirus H1 o los vectores H1, pueden inyectarse en el tejido deseado, por ejemplo el tumor, o en una cavidad tumoral después de la extracción del 15 tumor.

Las combinaciones de dos o más de los modos de administración descritos anteriormente pueden emplearse en cualquier forma adecuada, por ejemplo de forma concurrente, contemporánea o secuencial.

El régimen de dosificación del agente parvoterapéutico es fácilmente determinable para alguien con experiencia en la técnica, por parte del médico responsable sobre la base de los datos del paciente, la observación y otros factores 20 clínicos, incluyendo por ejemplo el tamaño del cliente, su área de superficie corporal, la edad, el sexo, el virus particular, las células, etc., que vayan a ser administrados, el tiempo y la vía de administración, el tipo de enfermedad, por ejemplo, el tipo y las características del tumor, el estado general de salud del paciente, y otras medicaciones o terapias a la cual el paciente esté siendo sometido.

En consecuencia, la presente invención también se refiere a la utilización de un parvovirus según la presente invención 25 o de una célula que produzca dicho parvovirus para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor. Un tumor preferido es el carcinoma de páncreas, el hepatoma y el linfoma, que se espera que sean particularmente susceptibles de tratamiento con un agente parvoterapéutico de la presente invención.

Los efectos que se indican más abajo explican la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1 30

Materiales y Métodos

(A) Reactivos

Las enzimas de restricción fueron compradas a New England Biolabs, Frankfurt, Alemania. Los iniciadores de PCR y los oligonucleótidos fosforotioados (CpG-28 (4), PTO-CG1, PTO-CG2, PTO-GC) fueron sintetizados por MWG, Ebersberg, Alemania. El ADN de E. coli, el IFN-, junto con los oligonucleótidos estimuladores (sCpGODN-1826) (5), y de control 35 (cGp-CODN-1826) (con motivos GpC invertidos) fueron obtenidos en InvivoGen, Francia. La LipofectaminaTM 2000 se compró en Invitrogen, Karlsruhe, Alemania,. El resto de reactivos procedían de Sigma, Deisenhofen, Alemania.

(B) Tratamiento y ensayos de los cultivos celulares

La línea celular embriónica de riñón humano HEK-TLR9 que expresa de forma estable el receptor de ratón TLR-9 fue un amable regalo del Dr. Stefan Bauer (Technical University, München, Alemania) (6). Las líneas celulares de fibroblasto 40 HEK-TLR9, 293T y NBK, así como las células de macrófago RAW 264.7 (ATCC, Manassas, Estados Unidos) fueron cultivadas en DMEM. La línea celular de hematoma de rata ACI MH2934A (2) fue cultivada en RPMI. Todos los medios fueron obtenidos en Sigma y suplementados con FCS (10%), penicilina (100 unidades / ml) y estreptomicina (10 mg / ml).

El efecto citopático de los diferentes aislados virales fue evaluado en células NBK utilizando un ensayo de citotoxicidad 45 con MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5 – bromuro de difeniltetrazolio) 72 horas después de la infección. Los cultivos celulares de MH2934A fueron -irradiados a 15 Gy con anterioridad a la inyección. Ambos procesos fueron realizados tal como se describe con anterioridad (2). La reacción de color de Greiss fue utilizada para determinar los niveles de NO en los supernadantes del cultivo de macrófagos RAW 264.7, tal como se indica (8). La Luciferasa se ensayó tal como se describe anteriormente (6). La transfección de LipofectaminaTM 2000 se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones 50 del fabricante.

(C) Virus y análisis del ADN viral

Los vectores JabCG1, JabCG2 y JabGC fueron constituidos insertando los fragmentos digeridos en Hpal que se muestran en la Figura 1ª en el vector pSR19 – un clon molecular infeccioso de H-1PV (8). Los vectores virales fueron producidos tal como se describe (8), mediante la transfección de células 293T con los plásmidos respectivos, seguido de la infección de células NBK y purificación con el fin de contener menos de 2.5 EU / ml de endotoxina. Los virus 5 fueron titulados en células NBK en un ensayo en un centro de infecciosos. Se utilizó el método de extracción de Hirt para aislar el ADN viral de viriones purificados o de células NBK infectadas. Las formas de ADN viral replicativas fueron digeridas y reveladas por Southern blotting (9). La enzima Dpnl corta solamente el ADN metilado („) en la secuencia GA‟TC, con múltiples ubicaciones potenciales a lo largo del genoma de H-1PV. La enzima Hpall digiere el ADN en motivos C‟CGG no metilados, cinco de los cuales se encuentran localizados en el extremo derecho del genoma viral 10 (ver Figura 1A). La enzima Acll corta el ADN solamente en las citosinas no metiladas dentro de la secuencia AAC‟GTT que fue insertada en tres copias, dando lugar a JabCG2 (Figura 1A). Todas las reacciones de restricción fueron realizadas bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.

(D) RT-PCR

El ARN total fue extraído de los ganglios linfáticos mediastínicos de animales tratados y transcritos inversamente en 15 ADN c, tal como se ha descrito anteriormente (2). Los iniciadores siguientes fueron utilizados para amplificar el ADN c de las ratas: para IFN-, 5‟-ATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGAACG-3 directo, 5‟-CCTTAGGCTAGATTCTGGTGACAGC-3‟ inverso; para CD80, 5‟-GGCATTGCTGTCCTGTGATTAC-3‟ directo, 5‟-ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG-3‟ inverso; para CD86, 5‟-GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC-3 directo, 5‟-CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC-3‟ inverso. Los tamaños de los productos PCR correspondientes fueron 290 bp 20 (IFN-), 314 bp (CD80), y 337 bp (CD86). Las secuencias de iniciadores para los PCR de -actin y H-1PV han sido publicadas con anterioridad (2).

(E) Animales y modelo de tumor

Las células de MH3924A fueron inoculadas a través de la arteria femoral de ratas ACI anestesiadas (1 x 105 células / animal) para inducir la metástasis, tal como se ha descrito anteriormente (2). La vacunación se realizó 10 días después 25 de la inducción de la metástasis. Para ello, las células MH3924A fueron infectadas o no con los respectivos virus purificados. Después de un lavado extensivo con PBS 24 horas después de la infección, las células fueron irradiadas e inyectadas subcutáneamente (1 x 106 células / animal) en las ratas. Los animales fueron sacrificados 20 días después de la vacunación. Después de abrir la cavidad torácica, la tráquea fue canulada con una jeringa, y los pulmones fueron insuflados con 5-6 ml de solución de tinta india al 2% en un 0.9% de Na Cl. Los nódulos metastáticos blancos (tamaño 30 1-2 mm) fueron visualizados sobre el fondo negro del tejido pulmonar, después de sumergir los pulmones en solución de Fekette (58% de etanol, 3% de formaldehído y 0.04% de ácido acético glacial). Los ganglios de la superficie del órgano fueron contados utilizando una lente de aumento. Los ganglios linfáticos mediastínicos fueron extirpados después de la resección de los pulmones. Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las normativas locales y europeas.

(F) Estadísticas 35

Se calcularon los promedios y las desviaciones standard de supervivencia celular, estimulación e incidencia de metástasis. La importancia estadística de las diferencias en la incidencia de la metástasis entre los grupos de tratamiento de los animales se evaluó a través de un análisis en un solo sentido de la variación, seguido de un test de la t de Student paramétrico para datos no apareados. La diferencia entre los valores individuales se consideró significativa en P < 0.05. Se utilizó software Instat 2.00 de Macintosh (GraphPad Software, San Diego, CA) para el análisis. 40

Ejemplo 2

Construcción y propiedades in vitro de virus modificados con CpG

Dado que la competencia de la replicación es esencial para permitir que los virus oncolíticos se extiendan en el tumor objetivo a través de círculos de infección secundarios, se construyó un parvovirus enriquecido con CpG que conservaba la capacidad de multiplicarse y extenderse en células neoplásticas. El genoma H-1PV es bastante pequeño, y codifica 45 las proteínas con funciones esenciales en el ciclo vital de los virus. Por lo tanto, se insertó una extensión de ADN que contenía CpG en una región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción VP. Tal como se indica en la Figura 1A, las secuencias clonadas en dos variantes de H-1PV (JabCG1, JabCG2), contenían diferentes números de dos tipos de motivo CpG: AACGTT (un elemento inmunoestimulador general, que se ha demostrado que resulta activo en modelos murinos) (4) y GTCGTT (un motivo que se ha demostrado que también activa las células humanas) (10). 50 Una tercera construcción (Jab GC) tuvo una orientación invertida (GC) dentro de los motivos y sirvió como control.

Se secuenciaron los genomas de los virus producidos después de la transfección de las células 293T con los construidos. Al efectuar pases tanto en líneas celulares permisivas como en animales, se comprobó que el virus JabCG1 acumulaba de forma progresiva mutaciones en los motivos CpG (no se muestran los datos). Se creó la hipótesis de que dicha tendencia podría ser debida a la presencia en JacCG1 de motivos ACGT en el entorno (Figura 55 1A, secuencias enmarcadas) que constituyen puntos de unión para el Factor de Iniciación del Parvovirus (PIF) (11). Ello

podría reducir la concentración de PIF disponible para la unión con el origen del extremo izquierdo del genoma, donde se realiza su función esencial, seleccionado de esta manera mutantes que no unen el PIF en la inserción. Siguiendo con este planteamiento, las variantes JabCG2 y JabGC (que carecían de homología con los puntos de unión del PIF) permanecieron estables durante múltiples pasos (no se muestran los datos).

Cuando se utilizaron en cantidades equivalentes (titulaciones de genoma), los mutantes JabCG1/2 y JabGC mostraron 5 la misma capacidad que el virus parental para replicarse en y destruir células NBK transformadas (Figura 1B, C). De esta manera, ninguna de las inserciones pareció impedir la competencia del virus para la oncólisis y la propagación. El estado de metilación del ADN viral en células infectadas se determinó por digestión de restricción con enzimas sensibles a la metilación (análisis RFLP). Las formas replicativas virales monoméricas y diméricas (Figura 1D) fueron refractarias a la digestión de Dpnl. Por otro lado, el ADN viral fue sensible al Hpall y, en el caso del virus JabCG, al Acll, que 10 reconoce algunos puntos específicos limitados a la inserción de CpG (AACGTT). En conjunto, estos resultados muestran que los productos de replicación de ADN viral, y en particular los residuos de citosina presentes dentro de los motivos CpG incorporados, fueron en gran medida no metilados – un pre-requisito para desencadenar la activación de TLR-9. (5). Como conclusión, los motivos CpG añadidos al genoma H-1PV no parecieron impedir la replicación viral ni la patogeneicidad, y permanecieron en forma no metilada, adecuada para la interacción con los receptores TLR9. 15

Ejemplo 3

Activación de macrófagos y células HEKTLR9 dependiente de TLR9 por ADN en estado natural y de H-1PV modificado

A continuación, se probó la capacidad del ADN de una sola cadena aislado de los diferentes virus para estimular la emisión de óxido de nitrógeno a partir de macrófagos RAW 264.7 preactivados con IFN- (7). Las células demostraron 20 ser positivas para el ADN de TLR9 por RT-PCR (no se muestran los datos) y respondieron funcionalmente al ADN de E. coli (Figura 2A). Se midió la emisión de NO de las células de RAW 264.7 incubadas con oligonucleótidos fosforotioados (PTO-CG1, PTO-CG2 y PTO-GC) con fragmentos idénticos a los utilizados para clonar (ver Figura 1A), o con ADN ss aislado de los diferentes virus (JabCG1, -CG2, -GC, o H-1PV). Se utilizó ADN de CpG-28 (un oligonucleótido activador publicado previamente) (4) y de E. coli como controles positivos. Tal como se muestra en la 25 Figura 2A, los motivos CpG añadidos del ADN parvoviral también mostraron una capacidad de activación. El ADN ss de JabCG2 tuvo una estimulación mayor que el de JabCG1, a pesar de contener menos motivos CpG (6 y 13, respectivamente). Ello resulta coherente con el hecho de que dichos motivos fueron mutados durante la propagación de JabCG1. De acuerdo con informes interiores, que muestran que la transfección con un agente formador de liposomas puede mejorar el efecto estimulador del ADN microbial a través de una mejor administración en el endosoma (12), se 30 consiguió una mayor captación celular (tal como se ha evaluado a través del PCR) cuando se utilizó Lipofectamina para transfectar células con el ADN ss de H-1PV o sus derivados enriquecidos en CpG (Figura 2B, panel inferior). Consecuentemente, la emisión de NO desde RAW 264.7 experimentó una mejora.

Para confirmar que la capacidad del ADN de JabCG de activar células de RAW 264.7 era debida al reconocimiento de los motivos CpG incorporados por TLR9, se midieron los efectos estimuladores de los ADN ss arriba mencionados 35 sobre las células HEK293 transferidas de forma estable con el ADN c de TLR9 de ratón. Normalmente, las células HEK293 no expresan ningún TLR, de manera que la activación de TRL9 podría ser monitorizada a través de la inducción del gen indicador de origen NF-kB integrado de forma estable (Luciferasa). Tal como se muestra en la Figura 2B, los ADN ss de JabCG1 y JabCG2 indujeron a la expresión de luciferasa a un nivel significativamente mayor que los ADN ss derivados de JabGC, los oligonucleótidos de control negativo (cGpC-1826) o el medio. Sin embargo, el ADN de 40 JabCG tuvo un efecto activador muy inferior al oligonucleótido de control positivo (CpG-1826), muy probablemente debido a que contienen menos motivos CpG por microgramo de ADN. A partir de estos datos puede llegarse a la conclusión de que el ADN ss de H-1PV posee la capacidad de desencadenar la activación de células inmunes y que el enriquecimiento de CpG puede mejorar este efecto vía la activación de TLR9.

Ejemplo 4 45

Armar los parvovirus con motivos CpG mejora su capacidad oncosupresiva

Debido a estos resultados, se investigó el impacto de los motivos CpG insertados sobre las actividades inmunomodulatorias y oncosupresivas del H-1PV in vivo. Para ello, se seleccionó un modelo de metástasis de hepatoma de pulmón de rata establecido, en que la capacidad inmunoestimulatoria de los parvovirus puede evaluarse en ausencia de cualquier efecto oncolítico directo sobre los tumores objetivo. Los mutantes de Jab derivados de H-1PV 50 fueron probados con el fin de comprobar sus efectos adyuvantes cuando se administran con una vacuna consistente en células tumorales (MH3924A) autólogas irradiadas por rayos X que proporcionan únicamente una protección limitada contra metástasis en ausencia de infección. El virus fue inoculado ex vivo en la vacuna antes de su irradiación e inyección subcutánea en las ratas portadoras de metástasis. En esta configuración los virus podrían actuar claramente únicamente como adyuvantes de la vacuna, dado que eran indetectables por parte de RT.PCR en los pulmones de las 55 ratas tratadas, y de esta manera, no podían ejercer ningún efecto oncolítico directo sobre las metástasis de pulmón. Tal como se muestra en la figura 3A, el efecto terapéutico de la vacuna celular solamente mejoró de manera ligeramente significativa cuando el virus adyuvante era H-1PV, JabGC o JabCG1. Ello está en concordancia con la falta o pérdida gradual de motivos CpG en estos virus. Por el contrario, la vacuna infectada con JabCG2 redujo el índice de metástasis

en más del 50% en comparación con los controles no tratados. Además de mostrar un número espectacularmente menor de ganglios de un tamaño superior a los 2 mm, el grupo tratado con la vacuna de JabCG2 no mostró ningún ganglio necrótico de gran tamaño (superior a 5 mm). Por el contrario, en los otros grupos de tratamiento, esta fase avanzada de la enfermedad fue común. La expresión de los indicadores que revelaban la activación de respuesta inmunitaria celular (IFN-) y la maduración de las células dendríticas (CD80, CD86) se midió por RT-PCR en ganglios 5 linfáticos mediastínicos, drenando los pulmones en que se encontraban localizadas las metástasis. Tal como se ilustra en la Figura 3B, estos indicadores de respuesta inmunitaria innata y adaptativa fueron fuertemente inducidos en el grupo tratado con JabCG2, en correlación con un resultado favorable de la enfermedad. Lo que resulta interesante es que los pocos animales que mostraron dicha elevación de indicadores en el grupo de tratamiento con JabCG1 también tuvieron menos metástasis. En conjunto, estos datos sugieren firmemente que resulta posible reforzar la capacidad antitumoral 10 de los parvovirus armándolos con motivos CpG que provocan una mejor activación inmunitaria. El mejor ejemplo de ello es el virus JabCG2, cuyos efectos adyuvantes y terapéuticos superiores tienen una clara relación con la preservación de los motivos CpG insertados a través de múltiples pasos.

Recientemente se ha demostrado que los oncolisados parvovirales de los melanomas humanos son unos activadores de la maduración de células dendríticas más fuertes que los extractos de congelación / descongelación (13). Se ha 15 descubierto que este efecto tiene relación con la inducción de expresión de HSP72 en las células infectadas por el tumor. Los resultados actuales muestran que esta actividad inmunoestimuladora parvoviral puede ser incrementada añadiendo motivos CpG extra al genoma viral. Ello significa que además de los posibles factores celulares inducidos por el virus, los constituyentes virales contribuyen a la inmunomodulación. Muy probablemente, dichos constituyentes incluyen especies de ADN viral producidas por células infectadas por tumor. 20

El tamaño reducido del genoma H-1PV limita el número de motivos CpG que pueden introducirse en él sin interferir en su envasado. Sin embargo, debería ser posible doblar el número de motivos CpG activadores añadidos, y tal vez mejorar todavía más la capacidad oncosupresiva de H-1PV. Ello puede conseguirse generando dichos motivos a través del uso de codones alternativos o mediante un intrón viral localizado en el promotor p38.

Lista de referencias 25

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9. Russell SJ, Brandenburger A, Flemming CL, Collins MK, Rommelaere J. Transformation-dependent expression of interleukin genes delivered by a recombinant parvovirus. J Virol 1992;66:2821-8.

10. Sivori S, Carlomagno S, Moretta L, Moretta A. Comparison of different CpG oligodeoxynucleotide classes for their capability to stimulate human NK cells. Eur J Immunol 2006;36:961-7.

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13. Moehler MH, Zeidler M, Wilsberg V, Cornelis JJ, Woelfel T, Rommelaere J, Galle PR, Heike M. Parvovirus H-1-induced tumor cell death enhances human immune response in vitro via increased phagocytosis, maturation, and cross-50 presentation by dendritic cells. Hum Gene Ther 2005;16:996-1005.

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante es únicamente para referencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. A pesar de que se ha tenido un gran cuidado a la hora de recopilar las referencias, no puede descartarse la posibilidad de que existan errores u omisiones, y la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto. 5

Literatura no de patentes citada en la descripción

 Parvoviruses as anticancer agents. Rommelaere J ; Giese N ; Cziepluch C ; Cornelis JJ. Viral Therapy of Human Cancers. Marcel Dekker, 2005, 627-75

• Raykov Z ; Balboni G ; Aprahamian M ; Rommelaere J. Carrier cell-mediated delivery of oncolytic parvoviruses for targeting metastases. Int J Cancer, 2004, vol. 109, 742-9 10

• Raykov Z ; Grekova S ; Galabov AS ; Balboni G ; Koch U ; Aprahamian M ; Rommelaere J. Combined oncolytic and vaccination activities of parvovirus H-1 in a metastatic tumor model. Oncol Rep, 2007, vol. 17, 1493-9

• Meng Y ; Carpentier AF ; Chen L ; Boisserie G ; Simon JM ; Mazeron JJ ; Delattre JY. Successful combination of local CpG-ODN and radiotherapy in malignant glioma. Int J Cancer, 2005, vol. 116, 992-7

• Krieg AM. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat Rev Drug Discov, 2006, vol. 5, 471-84 15

• Fischer SF ; Rehm M ; Bauer A ; Hofling F ; Kirschnek S ; Rutz M ; Bauer S ; Wagner H ; Hacker G. Toll-like receptor 9 signaling can sensitize fibroblasts for apoptosis. Immunol Lett, 2005, vol. 97, 115-22

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Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con motivo CpG, en el cual el genoma contiene al menos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.
2. 2. El parvovirus de la reivindicación nº1, que contiene al menos 5 motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural. 5
3. 3. El parvovirus de las reivindicaciones nº1 o 2, que contiene entre 5 y 20 motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.
4. 4. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 3, en que dichos motivos CpG adicionales son generados mediante la utilización de codones alternativos.
5. 5. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 3, en que dichos motivos CpG adicionales están insertados 10 en un intrón o una región 3‟ no traducida de un gen.
6. 6. El parvovirus de la reivindicación nº5, en que dicha región 3‟ no traducida es la región no traducida en el extremo 3‟ de una unidad de transcripción VP.
7. 7. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 6, en que dicho motivo CpG comprende la secuencia nucleótida AACGTTT o GTCGTT. 15
8. 8. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 7, en que dicho parvovirus es el parvovirus H1 (H-1PV) o un parvovirus de roedor relacionado.
9. 9. El parvovirus de la reivindicación nº8, en que dicho parvovirus de roedor relacionado es Lulll, el virus diminuto del ratón (MMV), el parvovirus del ratón (MPV), el virus diminuto de la rata (RMV), el parvovirus de la rata (RPV) o el virus de la rata (RV). 20
10. 10. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 9, en que dicho parvovirus contiene tres motivos AACGTT y tres motivos GTCGTT dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP.
11. 11. El parvovirus de la reivindicación nº10, que contiene la secuencia nucleótida 5‟-GTT AAC GTT TAC AGC TGA CTA GTC GTT TGC TCAG TCT AAC GTT CTT GTCT ATT GTC GTT TAC TAG TCT CTT AAC GTT TCAT CTA CTT GTC GTT AAC-3‟ dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP. 25
12. 12. Una composición farmacéutica que contiene un parvovirus según cualquiera de las reivindicaciones nº 1 a 11 o una célula que produce dicho parvovirus.
13. 13. Utilización de un parvovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una célula que produce dicho parvovirus para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
14. 14. La utilización de la reivindicación nº 13, en que dicho cáncer es un hepatoma, un linfoma o un carcinoma de 30 páncreas.