ES2351492B2 - Uso de la proteína rgs-14 para potenciar la memoria. - Google Patents
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Abstract
Uso de la proteína RGS-14 para
potenciar la memoria.
La administración de la proteína
RGS-14, también conocida como regulador de la
proteína-G señalizadora 14, en cerebro provoca un
incremento de la memoria en el reconocimiento de objetos en ratones.
Así, la proteína RGS-14 es útil para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de
desórdenes de la memoria en un mamífero así como de enfermedades
asociadas a estos desórdenes, tales como enfermedades neurológicas,
enfermedades neurodegenerativas, desórdenes del desarrollo o el
envejecimiento.
Description
Uso de la proteína RGS-14 para
potenciar la memoria.
La invención está relacionada con el campo de la
medicina, en particular con la neurología, y especialmente con un
compuesto de naturaleza proteica para la fabricación de medicamentos
para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de desórdenes
cognitivos y de la memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
La memoria es la función cerebral resultado de
las conexiones sinápticas entre neuronas mediante la cual el ser
humano puede registrar, codificar, consolidar, almacenar, recuperar
y evocar información y experiencias pasadas. Esta información
pasada, según el alcance temporal con el que se corresponda, se
clasifica convencionalmente, en memoria a corto plazo (consecuencia
de la simple excitación de la sinapsis para reforzarla o
sensibilizarla transitoriamente) y memoria a largo plazo
(consecuencia de un reforzamiento permanente de la sinapsis gracias
a la activación de ciertos genes y a la síntesis de las proteínas
correspondientes).
La memoria a corto plazo es el lugar donde se
almacena la información nueva; es un proceso de retención y
almacenamiento con capacidad y duración de varios segundos. Supone
el uso de la información (verbal o visual) durante un breve periodo
de tiempo (20 ó 30 segundos) y esta información sólo se consolida si
se transfiere a la memoria a largo plazo. La memoria a corto plazo y
la memoria de trabajo (operativa) son términos que se solapan en
ciertos aspectos. La memoria de trabajo es la capacidad para retener
la información al mismo tiempo que se trabaja con ella.
La memoria a largo plazo es un almacén al que se
hace referencia cuando comúnmente hablamos de memoria en general. Es
en donde se almacenan recuerdos vividos, conocimiento acerca del
mundo, imágenes, conceptos, estrategias de actuación, etc. Dispone
de capacidad desconocida y contiene información de distinta
naturaleza. Se considera como la base de datos en la que se inserta
la información a través de la memoria operativa, para poder
posteriormente hacer uso de ella.
Los desórdenes de la memoria pueden manifestarse
por la incapacidad de aprender nueva información y/o por la
incapacidad de recordar información aprendida anteriormente. La
pérdida de memoria es el primer síntoma de la demencia y puede ser
también un síntoma que se pone de manifiesto en distintas
enfermedades neurológicas, psiquiátricas y neurodegenerativas, en
desórdenes del desarrollo y también durante el envejecimiento. El
número de pacientes con desórdenes de memoria se ha incrementado
significativamente en las últimas décadas y el elevado coste del
tratamiento y el deterioro de la calidad de vida se han convertido
en un enorme problema social. La población anciana es otro frente en
el que este desorden aparece como el principal factor que afecta a
su calidad de vida y los hace más dependientes. La revista Medical
Reports estima que, hacia el 2015, el número de estos pacientes se
duplicará debido al incremento de la población anciana.
Los fallos en la memoria pueden surgir a
cualquier edad, pero son más frecuentes medida que el sujeto avanza
en edad. En torno a los 65 años de edad, un gran número de personas
comienza a presentar problemas de memoria, y no les da importancia
pensando que son consecuencia inevitable del proceso natural de
envejecimiento. Pero a veces pueden ser 1os primeros avisos de
patologías serias como la depresión, la enfermedad de Alzheimer u
otros tipos de demencia. En el Deterioro Cognitivo Ligero (DCL), los
fallos de memoria se sitúan entre lo que podríamos llamar normal
para una persona mayor y una demencia (p. ej. enfermedad de
Alzheimer). Estudios recientes calculan que un 20% de personas
mayores de 75 años sufren DCL. Un 15% de los pacientes con DCL se
convertirán en demencias transcurrido un año desde el diagnóstico de
DCL y este porcentaje se incrementa a un 50% a los 5 años.
Algunos de los tratamientos aprobados para la
pérdida de memoria son la tacrina, el hidrocloruro de donepecilo, la
galantamina, y la rivastigmina, que actúan inhibiendo la
colinesterasa. Otros agentes potencialmente útiles incluyen los
antagonistas del receptor NMDA como la memantina, antagonistas del
receptor muscarínico MI, estatinas como la lovastatina o la
pravastatina, el aripipazol, la fenserina, o la risperidona. Además,
se administra la fluoxetina para la depresión, el trastorno
obsesivo-compulsivo y la bulimia nerviosa. El
clorhidrato de metilfenidato se prescribe en el tratamiento de la
narcolepsia, la depresión en los ancianos, la demencia senil,
Alzheimer, la fibromialgia, el síndrome de la fatiga crónica, la
impaciencia de los miembros, dolores secundarios en los cánceres,
síncopes, traumatismos craneales, shocks
post-anestésicos y en la hiperactividad infantil con
o sin déficit de atención. Sin embargo, no existe un tratamiento que
sea específico contra la pérdida de memoria y que además no tenga
efectos secunda-
rios.
rios.
Por lo tanto, es deseable proporcionar nuevos
métodos y productos para la Prevención y el tratamiento de la
pérdida de la memoria y de las enfermedades asociadas a ella.
\newpage
Los inventores han encontrado que la
administración de la proteína RGS-14, también
conocida como regulador de la proteína-G
señalizadora 14, en cerebro provoca un incremento de la memoria en
el reconocimiento de objetos en ratones. Los resultados que se
indican más adelante, demuestran que la proteína
RGS-14 es útil para tratar o prevenir desórdenes
cognitivos y de la memoria en un mamífero, incluido el hombre.
Los inventores han utilizado el test de memoria
de reconocimiento de objetos (ORM) para ensayar el aprendizaje y
memoria en ratones. En estos tests, se presentaron a las ratas dos
objetos idénticos durante 3 minutos en un "campo abierto" y
tras esto, se analizó por cuánto tiempo podrían retener en la
memoria la información de esos objetos. Durante la sesión de prueba
de ORM, uno de los dos objetos se sustituía por un nuevo objeto y se
medía el tiempo de exploración para ambos objetos. Hay cierta
discusión sobre las áreas del cerebro relacionadas con la
adquisición y consolidación de la ORM. Algunos estudios recientes
argumentan que la ORM es un fenómeno multifásico en el que el córtex
perirrinal está involucrado en la familiarización del objeto,
mientras que el hipocampo participa tanto en la formación de una
relación entre los objetos y las señales espaciales, como en la
consolidación de la información adquirida.
A partir de los experimentos, se observa que la
sobreexpresión de la proteína RGS-14 en cerebro de
ratas promueve la conversión de la memoria a corto plazo para ORM,
que normalmente llega hasta 45 minutos, en una memoria a largo
plazo, que se mantiene tras varios meses. Por lo tanto,
RGS-14 potencia la memoria tanto a corto plazo como
a largo plazo. Además, la sobreexpresión de RGS-14
también potencia la memoria espacial en ratas.
Además de en ratas, el efecto de
RGS-14 en la memoria también se observó en ratón y
en mono. Existe una gran similitud entre especies en cómo se procesa
la memoria y en las estructuras cerebrales entre mono y hombre, por
lo que los resultados de funcionalidad de RGS-14 en
ratón, rata y mono serían extrapolables a la especie humana.
Un aspecto de la invención se refiere al uso de
la proteína RGS-14 para la fabricación de un
medicamento para potenciar la memoria en un mamífero, incluido un
humano. En relación a lo anterior, la invención también se refiere
al uso de la proteína RGS-14 para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento o la prevención de desórdenes
cognitivos y de la memoria en un mamífero, incluido un humano. La
invención puede alternativamente formularse como un método para el
tratamiento terapéutico y/o preventivo de un mamífero incluyendo el
hombree, de desórdenes cognitivos y de la memoria, comprendiendo la
administración a dicho mamífero, de una cantidad efectiva de la
proteína RGS-14.
La proteína RGS-14 es un miembro
de la familia de reguladores de la proteína-G
señalizadora. Esta proteína posee un dominio conservado RGS; un
dominio GoLoco; un dominio de unión a Rap1/2; y otras regiones con
funciones no conocidas. La proteína atenúa la actividad señalizadora
de las proteínas-G por su unión, a través de su
dominio GoLoco, a tipos específicos de subunidades activadas alfa G
unidas a GTP. Actuando como una proteína activadora GTPasa (GAP), la
proteína aumenta la tasa de conversión de GTP a GDP. Esta hidrólisis
permite que las subunidades alfa G se unan a heterodímeros de
subunidades G beta/gamma, formando heterotrímeros de
proteína-G inactiva, terminando así la señal. La
proteína RGS-14 está asociada con los microtúbulos y
se sabe que es un importante factor en la mitosis. Aunque la
expresión de la proteína RGS-14 se ha observado en
el cerebro adulto (cfr. M.F. López-Aranda et
al "Localization of the GoLoco motif carrier regulator of
G-protein signalling 12 and 14 proteins m monkey and
rat brain", Eur J Neurosci 2006, vol. 23, pp. 2971), se conoce
muy poco acerca de su papel en las funciones
cerebrales.
cerebrales.
En realizaciones particulares de la invención,
la memoria es la memoria visual, la memoria espacial, la memoria
episódica (pasajera) o la memoria de procesamiento de la información
visual. En una realización más particular, la memoria es la memoria
visual, que es la memoria relacionada con la información de un
objeto, una escena o un evento.
En otra realización particular, la memoria es la
memoria espacial, que es la memoria sobre la información de un
objeto en un sitio o posición determinados. En otra realización
particular, la memoria es la memoria a corto plazo; y en otra
realización de la invención la memoria es la memoria a largo
plazo.
El concepto de cognición hace referencia a la
facultad de los seres de procesar información a partir de la
percepción, el conocimiento adquirido y características subjetivas
que permiten valorar y considerar ciertos aspectos en detrimento de
otros. Los desórdenes cognitivos más claros son la amnesia, la
demencia y el delirio. Otros incluyen desórdenes relacionados con la
ansiedad como las fobias, el pánico, el trastorno
obsesivo-compulsivo, la ansiedad generalizada y el
estrés post-traumático. Los desórdenes como la
depresión, la esquizofrenia o el trastorno bipolar también son
desórdenes cognitivos.
Los desórdenes cognitivos y de la memoria pueden
manifestarse por la incapacidad de aprender nueva información y/o
por la incapacidad de recordar información aprendida anteriormente.
Las alteraciones de la memoria se suelen dividir en aquellas
cuantitativas y cualitativas. Entre las alteraciones cuantitativas,
la amnesia es la ausencia de recuerdos de un período determinado de
la vida. El sujeto suele ser consciente de que son recuerdos que
existieron pero que se han perdido. Puede ser parcial o total. La
hipomnesia es la disminución de la capacidad de la memoria debido a
una dificultad tanto en la fijación como en la evocación. Se observa
en personas psiquiátricamente normales con preocupaciones profundas
que acaparan la atención, así como en pacientes con neurosis. La
hipermnesia es el aumento o hiperactividad de la memoria, frecuente
en pacientes maníacos o delirantes, pero se presenta en sujetos con
entrenamiento especial de la memoria. La dismnesia es una alteración
cuantitativa que traduce siempre en una disminución de la memoria,
imposibilita evocar un recuerdo en un momento dado y evoca otros en
forma borrosa o poco nítida.
Las alteraciones cualitativas se agrupan bajo la
denominación de paramnesias, es decir, los falsos reconocimientos o
recuerdos inexactos que no se ajustan a la realidad. Los principales
son el fenómeno de lo ya visto; el fenómeno de lo nunca visto y la
ilusión de la memoria.
La proteína RGS-14 puede ser
administrada a un mamífero, preferiblemente un humano. El propósito
de la administración del producto RGS-14 puede ser
preventivo (para evitar o retrasar el desarrollo de los desórdenes
cognitivos y de la memoria) y/o terapéuticos (para tratar los
desórdenes cognitivos y de la memoria o las enfermedades asociadas a
ellos una vez se han desarrollado).
Los desórdenes cognitivos y de la memoria pueden
estar asociados con un gran número de enfermedades neurológicas,
neurodegenerativas y con desórdenes del desarrollo. Entre las
enfermedades relacionadas encontramos el deterioro cognitivo ligero;
la amnesia; demencia; la enfermedad de Alzheimer; demencias
vasculares; la demencia relacionada con el SIDA; la enfermedad de
Huntington; la hidrocefalia; la depresión; la demencia por cuerpos
de Lewis; la enfermedad de Pick; el síndrome de
Creutzfeldt-Jakob; la enfermedad de Parkinson; la
esclerosis lateral amiotrófica; la degeneración frontotemporal; el
infarto o un daño cerebral; el retraso mental; o el síndrome de
Down.
La RGS-14 puede ser útil en
estas enfermedades así como en la pérdida de memoria debida a
desórdenes neuropsiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia,
el autismo, el desorden de déficit de atención, la hiperactividad
infantil con déficit de atención, enfermedades relacionadas con la
ansiedad, desórdenes alimenticios, desórdenes por drogas de abuso,
trastornos de personalidad y otras enfermedades mentales.
En otra realización particular, los desórdenes
cognitivos y de la memoria están asociados al envejecimiento.
La proteína RGS-14 puede ser
administrada a un mamífero, preferiblemente un humano, para
incrementar la capacidad de su memoria normal.
En una realización particular de la invención,
la proteína RGS-14 se administra en forma de un
ácido nucleico que codifica para la proteína. En los ejemplos, la
administración se realiza en la capa 6 del área V2 del cerebro
mediante un lentivirus que tiene integrado la secuencia de
nucleótidos de RGS-14, que una vez en el cerebro se
expresa. Sin embargo, la invención contempla que la administración
de la proteína se haga mediante la sobreexpresión de la proteína a
partir de su secuencia de nucleótidos así como también manipulando
la expresión de la proteína endógena para que aumente su cantidad en
el tejido cerebral (mediante gene targeting y terapia celular).
También se contemplan otras formas de administración siempre con el
fin de aumentar la cantidad de RGS-14 en cerebro,
tales como la administración oral o inyección local de la proteína o
de la secuencia que la codifica.
La secuencia de aminoácidos completa de la
proteína RGS-14 es la que se indica en el GenBAnk
con número de acceso AY987041 ó NP_006471.
La invención se relaciona también con el uso de
un fragmento de la proteína RGS-14 para potenciar la
memoria. Fragmentos que podrían usarse son los que comprenden los
dominios RGB, RGS o GoLoco.
Se entiende que la proteína
RS-14 se administra en una forma farmacéuticamente
aceptable. Los expertos en la materia pueden probar la dosis
apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis
debe ser una cantidad efectiva de la proteína RGS-14
para que produzca una mejora en la memoria del individuo tratado. La
proteína RGS-14 puede administrarse sola o en una
composición con transportadores o excipientes farmacéuticamente
aceptables. El experto en la materia adaptará la composición
dependiendo del modo particular de administración. Las composiciones
pueden comprender la proteína RGS-14 como único
agente, o bien acompañarla de otros agentes.
A menos que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo
significado a los comúnmente entendidos por una persona experta en
el campo de la invención. Métodos y materiales similares o
equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica
de la presente invención. A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra la respuesta comportamental de
los animales en tareas de ORM. En el experimento de la Fig. 1A,
cuando se mostraba un objeto durante 3 minutos, las ratas normales
podían mantener la información del objeto en su memoria durante 30 y
45 minutos (min) pero no podían mantenerla durante 60 minutos. En la
Fig. 1B se muestra cómo la inyección de lentivirus RGS14 dentro de
la capa 6 del área V2 incrementó la capacidad de ORM del animal de
manera que no sólo rebasaban el límite de 45 minutos, sino que eran
capaces de mantener la misma información del objeto durante más de
24 semanas, "d" significa día y "w", semana. La Fig. 1C
muestra cómo la capacidad de los animales inyectados con
RGS-14 para convertir la memoria 45 minutos en
memoria a largo plazo se mantenía después de 14 meses tras la
inyección, cuando se presentaba un nuevo estímulo visual. Se
representa en el eje de las x los meses después de la inyección. La
Fig. 1D muestra cómo los animales normales eran capaces de retener
información de dos objetos diferentes (obj) pero no podían hacerlo
cuando se les mostraba 4 objetos. Los animales inyectados con
RGS-14 fueron capaces de mantener en su memoria,
información de 6 objetos distintos. En todas las figuras, el tiempo
de exploración (ET, s) corresponde a un "objeto viejo" (barra
blanca) y un "objeto nuevo" (barra negra), excepto en la Fig.
1D donde los valores proceden de múltiples "objetos viejos"
como se indica en la figura y un "objeto nuevo". Los valores se
han presentado como una media + SEM obtenida de un número (n) de
animales indicados bajo las barras. * indica un tiempo de
exploración significativamente más alto para el "nuevo objeto"
(p< 0.05).
La Fig. 2 muestra la localización de la proteína
RGS-14 en animales inyectados con lentivirus
RGS-14. (A): Tinción con violeta de cresilo del área
V2. (B): Una sección coronal del cerebro muestra la localización de
la proteína RGS-14 como fluorescencia verde en la
capa 6 de la corteza visual V2. (C y D): Los dibujos muestran la
localización de la proteína RGS-14 (*) en el sitio
de inyección, obtenidos del análisis de secciones seriadas coronales
(C) y sagitales (D). El área V2 está delimitada por finas líneas
dentro de la corteza cerebral en ambos (C y D). La distribución de
las capas corticales desde la capa 1 (I) hasta la capa 6 (VI) se
muestran en (A). CC es cuerpo calloso; Hp es hipocampo. La barra de
escala en A y B son 125 \mum.
La Fig. 3 muestra los resultados de la inyección
de Ox7-SAP en la capa 6 y la determinación de ORM.
(A) Una visión normal de la capa 6 (VI) de la corteza visual V2
teñida con violeta de cresilo. Fig. 3B: La inyección de
Ox7-SAP (Ox7) dentro de la capa 6 del área V2
provocó la pérdida de la mayoría de la población neuronal de esta
capa. Fig. 3C: La respuesta comportamental de los animales
inyectados en la corteza visual V2 con Ox7-SAP en
tareas de ORM, mostró una pérdida completa de la memoria visual
normal de 45 minutos. De forma similar, cuando los animales
inyectados con RGS-14 con un incremento en el ORM
confirmado como se muestra en la Fig. 1, se trataron con
Ox7-SAP, el efecto mediado por la proteína
RGS-14 quedó eliminado. Fig. 3D: La inyección de
Ox7-SAP dentro de la misma capa de la corteza
parietal, en un área adyacente a la corteza visual V2, no produjo
ningún efecto en la memoria normal. Además, al contrario de lo que
ocurría para la corteza visual V2, RGS-14 no tenía
efecto en ORM en este área. ET significa tiempo de exploración,
"objeto viejo" está representado por una barra blanca y
"objeto nuevo" con una barra negra. Los valores están
presentados como una media \pm SEM, obtenido de
5-8 animales en cada caso. * muestra un tiempo de
exploración significativamente más alto para el nuevo objeto (p<
0.05).
La Fig. 4 muestra que la inyección del vehículo
(control v), de solución salina (control s) y de
RGS-12, una proteína que pertenece al la misma
familia que la proteína RGS-14, dentro de la capa 6
del área V2 del cerebro de rata, no produjo ningún efecto y los
niveles de ORM eran similares a las ratas normales no inyectadas
(normal). Los cuatro grupos no fueron capaces de mantener la
información del objeto durante 60 minutos. Estos resultados indican
que el incremento de memoria es específico de la inyección de RGS
14. Los valores son la media \pm SEM de 5-16
animales en cada grupo. ET es tiempo de exploración, "objeto
viejo" está representado por una barra blanca y "objeto
nuevo" con una barra negra.
Fig. 5. Durante la sesión inicial de exploración
de los dos objetos idénticos, el grupo de animales inyectados con
RGS-14 mostró, en general, una media más alta en
cuanto al tiempo de exploración se refiere (18.62 \pm 1.47
segundos; n=15) que los que tenían el vehículo control (16.09 \pm
0.81 s; n=16). Sin embargo, la diferencia entre ambos grupos no fue
significativa.
La Fig. 6. La inyección de
RGS-14 dentro de las capas 2 y 3 de la corteza
visual (Ctx), dorsal al sitio diana de inyección; el giro dentado
(DG); y el CAI del hipocampo, ventral al sitio diana de inyección,
no provocó ningún efecto. Los valores son medias \pm SEM de
5-8 animales en cada grupo. ET es tiempo de
exploración, "objeto viejo" está representado por una barra
blanca y "objeto nuevo" con una barra negra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron tareas de ORM en animales para
evaluar el estado de la memoria visual. En estas tareas, a las ratas
se les presentaron dos objetos idénticos durante 3 minutos en un
"campo abierto" y tras esto, se analizó por cuánto tiempo
podían retener en la memoria la información de esos objetos. Durante
la sesión de prueba de ORM, uno de los dos objetos se sustituía por
un nuevo objeto y se medía el tiempo de exploración para ambos
objetos.
Preparación de lentivirus: El cDNA de
RGS-14 humano (GenBank, número de acceso AY987041)
se insertó en el vector pLenti6/Ubc/V5-DEST Gateway
y se produjeron lentivirus de RGS14 de acuerdo con los protocolos de
ViraPower^{TM} Lentiviral Expression Systems de Invitrogen.
Animales: Se colocaron ratas Wistar Han
(Charles River, Francia) en cajas eurostandard type III H (42.5 x
26.6 x 18.5 cm^{3}), en una habitación de temperatura regulada (20
\pm 2ºC) en ciclos de luz/oscuridad de 12 h. El agua y la comida
estuvieron disponibles ad libitum. Se aclimataron los
animales a la habitación durante al menos una semana antes de
empezar los experimentos, los cuales tuvieron lugar durante la fase
de luz.
\newpage
Inyección de lentivirus: Se anestesiaron
ratas de entre 290 y 320 g con ketamina (75 mg/kg, i.p.) y
medetomidina (0.5 mg/kg) y se colocaron en un marco estereotáxico de
acuerdo con las coordenadas obtenidas del atlas Steriotaxic
Coordinates of Rat Brain de G. Paxinos y C. Watson (4ª edición). Las
coordenadas de inyección dentro de la capa 6 del área V2 de la
corteza visual fueron AP -4.3, ML +2.1, DV -1.9 y de la corteza
parietal fueron AP -4.3, ML +3.6, DV -2.1. Se inyectó un volumen
total de inyección de 2 \mul de lentivirus RGS-14
de un stock cuyo título era de 3.4 x 10^{6} TU/ml, tanto
unilateralmente como bilateralmente a través de una cánula de acero
inoxidable de 30 gauge (Heraeus). A las ratas se les concedió un
período de recuperación de 8 días antes de las pruebas de
comportamiento.
Ensayos de ORM: Antes del test, las ratas
se manipularon durante 8 minutos diariamente durante 5 días
consecutivos y los dos siguientes días se habituaron en un "campo
abierto" (100 x 100 x 50 cm) durante 12 minutos. El día del
experimento y durante las sesiones de exploración, las ratas se
colocaron en el mismo "campo abierto" con 2 objetos idénticos y
se les permitió explorarlas libremente durante 3 minutos. Tras una
demora de 30 minutos o más, los animales fueron testados para el ORM
con un objeto presentado previamente y un objeto nuevo. El tiempo de
exploración se tomó tanto durante la exploración como durante las
sesiones de ensayar la ORM, para los animales control y los animales
con RGS-14. Respecto al test de la capacidad de
carga de memoria, que es la capacidad de los animales para mantener
la información de múltiples objetos en el cerebro, se colocaron
varios objetos de forma similar a como se indica en la Fig. 1 en el
campo abierto durante las sesiones de exploración de 3 minutos y se
reemplazó un objeto por uno nuevo durante la sesión del test de
memoria para el mismo tiempo. En el test de la capacidad de carga de
memoria, no se pudieron estudiar más de 6 objetos debido al espacio
limitado del campo abierto.
Estadística: La significación estadística
entre el tiempo de exploración del objeto antiguo y el objeto nuevo,
tanto de los animales control como de los inyectados con
RGS-14 fue analizada con la t de Student usando el
programa SigmaStat (SPSS, Inc.). Los valores de p menores de 0.05
fueron considerados significativos.
Tras el test de memoria, con una demora de 30,
45 y 60 minutos, se observó que los animales normales eran capaces
de retener la información de un objeto durante 30 y 45 minutos y,
sin embargo, no eran capaces de retener esa información tras 60
minutos (Fig. 1A). Este límite en la memoria de un animal normal se
define aquí como memoria ORM a corto plazo o ORM normal, y
sobrepasar el límite de la ORM normal es considerado como un
incremento en la memoria. Con la aplicación de esta estrategia, se
inyectaron animales normales con lentivirus de
RGS-14 en la capa 6 del área V2 del cerebro de rata
tres semanas antes de realizar el test de nivel de ORM. Se observó
que la sobreexpresión de la proteína RGS-14 en la
capa 6, provocaba un gran incremento de la memoria ORM respecto a la
normal (Fig. 1B). Al contrario de lo que ocurría en los animales
normales, donde la ORM llegaba hasta 45 minutos, un estímulo visual
de la misma duración de tiempo en los animales con
RGS-14 daba lugar a una memoria ORM a largo plazo
que llegaba hasta varios meses (Fig. 1B). La inyección de lentivirus
de RGS-12, una proteína que pertenece a la misma
familia que RGS-14, solución salina o vehículo del
lentivirus, dentro de la misma área, mostró que no provocaban
cambios en los niveles de ORM y su comportamiento era similar a los
animales no inyectados (Fig. 4). Además, la media del tiempo de
exploración durante los primeros 3 minutos de la sesión de
exploración de los dos objetos idénticos no fue significativamente
diferente entre los animales inyectados con el vehículo control
(16.09 \pm 0.81 segundos; n=16) y los animales inyectados con
RGS-14 (18.62 \pm 1.47 s; n=15) (Fig. 5), de
manera que se excluye la posibilidad de la implicación de otros
factores que no sean la proteína RGS-14 en el
incremento de la memoria. También se observó que la inyección de
lentivirus de RGS-14 en las capas 2 y 3 de la
corteza visual V2, un área dorsal al sitio diana, así como en CAI y
el giro dentado del hipocampo, que son áreas ventrales al sitio
diana, no producía un efecto similar al observado con la inyección
en la capa 6 de V2 de la corteza visual (Fig. 6). Por consiguiente,
la conversión de la memoria a corto plazo (normal) de ORM en memoria
a largo plazo es específica de la capa 6 del área V2, y este proceso
es facilitado por proteínas RGS-14. La
sobreexpresión de proteína RGS-14 en esta capa no
sólo incrementó la ORM sino que los animales inyectados después de
20 meses mantenían esta condición frente a estímulos visuales (Fig.
1C) (en la figura se llega a los 14 meses pero el seguimiento de los
animales ha sido hasta los 20 meses). Además, la capacidad para
retener información de múltiples objetos también fue mayor en
animales inyectados con RGS-14. Los animales
normales pudieron retener la información de 2 objetos diferentes
pero no podían con 4 objetos. Sin embargo, a diferencia de los
animales normales, los animales inyectados con
RGS-14 fueron capaces de retener la información de 6
objetos (Fig. 1D). Estos resultados sugieren que el incremento en la
capacidad de memoria mediada por la proteína RGS-14,
está relacionada tanto con el tiempo que puede mantener la
información de los objetos, como en el número de objetos.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras el estudio del comportamiento, se
procesaron los cerebros de los animales inyectados con el lentivirus
RGS-14 mediante inmunocitoquímica para localizar el
área/sitio de expresión de la proteína inyectada, con el objetivo de
poner de manifiesto una correlación anatómica al incremento de
memoria observado en esos animales. Se llevó a cabo como se describe
en I. Stepniewska et al. "Topographic patterns of V2
cortical connections in macaque monkeys", J. Comp. Neurol.
1996, vol. 371, pp. 129-152; y R. Gattas et
al., "Cortical projections of area V2 in the macaque",
Cereb Cortex 1997 vol. 7, pp. 110-29). En
resumen, tras determinar el estudio de comportamiento en tareas de
ORM, las ratas se perfundieron transcardialmente con un fijador que
contenía 4% de paraformaldehído, 1.37% L-lisina y
0.21% meta-periodato, y posteriormente se
crioprotegieron con sacarosa el 30%. Las secciones de cerebro fueron
incubadas con anticuerpos específicos para RGS-14
(cfr. M.F. López-Aranda et al., 2006
supra) acoplados con un fluorocromo verde para visualizar la
proteína. Se incubaron secciones coronales y sagitales del cerebro,
de un espesor de 30 \mum durante toda la noche a 4ºC con un
anticuerpo purificado de conejo
anti-RGS-14 (dilución 1:30). Las
secciones se incubaron durante 90 minutos con IgG Alexa Fluor 488 de
cabra anti-conejo (dilución 1:1000; Molecular
Probes) y se detectó por inmunofluorescencia con el microscopio.
Tinción de violeta de cresilo: Las
secciones de cerebro se montaron sobre portaobjetos gelatinizados, y
fueron teñidas durante 15 minutos con 1% de violeta de cresilo. Las
secciones se deshidrataron y se montaron para su análisis al
microscopio.
Se observó que la expresión de la proteína
RGS-14 inyectada en el área V2 estaba principalmente
localizada en la capa 6 (Fig. 2B). El análisis del sitio de
inyección en secciones secuenciales de cerebro tanto en cortes
coronales (Fig. 2C) como sagitales (Fig. 2D) confirmó la
localización de la proteína RGS-14 en la capa 6 del
área V2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la importancia de las neuronas de la
capa 6 del área V2 en la formación de ORM, mediante la eliminación
selectiva de neuronas de esta capa. Se planteó la cuestión de si la
eliminación de esta capa de neuronas podría eliminar tanto la
memoria normal (memoria a corto plazo) como la memoria a largo plazo
mediada por la proteína RGS-14. Por lo tanto, se
inyectó Ox7-SAP, una inmunotoxina saporina que
elimina neuronas de forma selectiva en la capa 6 del área V2 y se
evaluó el estado de memoria de los animales (cfr. N. Traissard et
al., "Combined damage to entorhinal cortex and cholinergic
basal forebrain neurons, two early neurodegenerative features
accompanying Alzheimer's disease: effects on locomotor activity and
memory functions in rats", Neuropsychopharmacology 2007,
vol. 32, pp. 851-71; y B.C. Nolan et al.,
"Purkinje cell loss by OX7-saporin impairs
excitatory and inhibitory eyeblink conditioning", Behavioral
Neuroscience 2005, vol. 119, pp. 190-201).
Inyección de Ox7-SAP: la
inyección de Ox7-SAP (0.9 \mug en 1 \mul) dentro
del cerebro se llevó a cabo de forma similar a la descrita
anteriormente para el lentivirus. El Ox7-SAP se
obtuvo de Advanced Targeting Systems.
La inyección de inmunotoxina provocó la pérdida
de casi todas las neuronas de este área, dejando otras células y
estructuras intactas (Fig. 3B). La respuesta comportamental de los
animales inyectados con Ox7-SAP en tareas de ORM
mostró una pérdida total de la memoria ORM (demora de 45 minutos en
Fig. 3C), sugiriendo un papel significativo de las neuronas de la
capa 6 en la memoria visual. Además de facilitar la formación de
memoria a largo plazo en ORM, las neuronas de la capa 6 son
cruciales para el normal funcionamiento de la ORM. Además, la
inyección de Ox7-SAP en animales inyectados con
RGS-14, eliminó el incremento en ORM mediado por
esta proteína (demora de 60 minutos en Fig. 3C). Este resultado
además confirmó la asociación de las neuronas de la capa 6 en la
formación de memoria a largo plazo en ORM. Sin embargo, al contrario
de lo que ocurre en la corteza visual V2, la inyección de
Ox7-SAP en la capa 6 de la corteza parietal, un área
adyacente al área V2, no produjo ningún efecto en la ORM normal
(demora de 45 minutos en Fig. 3D). De forma similar, la
sobreexpresión de la proteína RGS-14 en otras áreas
tales como las capas 2 y 3 del área V2, giro dentado y CA1 de
hipocampo (Fig. 6), y la capa 6 de la corteza parietal (Fig. 3D),
tampoco tuvo efecto en la memoria a largo plazo en ORM (demora de 60
minutos).
Claims (7)
1. Uso de la proteína RGS-14,
también conocida como el regulador de la proteína-G
señalizadora 14, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de desórdenes cognitivos y de la memoria
en un mamífero, incluido un humano.
2. Uso según la reivindicación anterior donde la
memoria es la memoria visual de reconocimiento de objetos.
3. Uso según la reivindicación 1 donde la
memoria es la memoria a corto plazo.
4. Uso según la reivindicación 1 donde la
memoria es la memoria a largo plazo.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde la proteína se administra en forma de ácido
nucleico que codifica RGS-14.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 donde los desórdenes cognitivos y de la memoria están
asociados a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en
una enfermedad neurológica, una enfermedad neurodegenativa y un
desorden del desarrollo.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 donde los desórdenes cognitivos y de la memoria están
asociados al envejecimiento.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930223A ES2351492B2 (es) | 2009-05-28 | 2009-05-28 | Uso de la proteína rgs-14 para potenciar la memoria. |
| PCT/ES2010/000239 WO2010136622A1 (es) | 2009-05-28 | 2010-05-28 | Uso de la proteína rgs-14 para fabricar un potenciador de la memoria |
| PCT/ES2010/000238 WO2010136621A1 (es) | 2009-05-28 | 2010-05-28 | Uso de la proteína rgs- 14 para fabricar un medicamento para el tratamiento o la prevención de desórdenes cognitivos y de la memoria. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930223A ES2351492B2 (es) | 2009-05-28 | 2009-05-28 | Uso de la proteína rgs-14 para potenciar la memoria. |
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|---|---|
| ES2351492A1 ES2351492A1 (es) | 2011-02-07 |
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Family
ID=43222185
Family Applications (1)
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
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