ES2350763T3 - Inhibición de la expresión génica mediada por interferencia de arn usando un ácido nucleico de interferencia corto (anic). - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificada químicamente que regula negativamente la expresión de un gen diana por interferencia de ARN (iARN), en la que: (a) el ANic comprende una cadena con sentido y una cadena antisentido distinta, en el que dicha cadena antisentido comprende una secuencia que es complementaria al ARN del gen diana, y en el que la cadena con sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la cadena antisentido; (b) cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene independientemente una longitud de 18 a 24 nucleótidos y el dúplex de ANic comprende de 17 a 23 pares de bases; (c) 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena del ANic con sentido y/o antisentido se modifican químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o, una molécula de protección terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o en una cadena diferente.
Description
Inhibición de la expresión génica mediada por
interferencia de ARN usando un ácido nucleico de interferencia corto
(ANic).
La presente invención reivindica el beneficio de
los documentos USSN 60/358.580 de Beigelman presentado el 20 de
febrero de 2002, USSN 60/363.124 de Beigelman presentado el 11 de
marzo de 2002, USSN 60/386.782 de Beigelman presentado el 6 de
junio de 2002, USSN 60/406.784 de Beigelman presentado el 29 de
agosto de 2002, USSN 60/408.378 de Beigelman presentado el 5 de
septiembre de 2002, USSN 60/409.293 de Beigelman presentado el 9 de
septiembre de 2002 y USSN 60/440.129 de Beigelman presentado el 15
de enero de 2003. La totalidad, incluyendo los dibujos, de dichas
solicitudes se incorporan en el presente documento por
referencia.
La presente invención se refiere a
procedimientos y reactivos útiles para modular la expresión génica
en una diversidad de aplicaciones, incluyendo el uso en
aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de validación de dianas
y descubrimiento genómico. Específicamente, la invención se refiere
a moléculas pequeñas de ácido nucleico, tales como moléculas de
ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia
corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN
(miARN) y ARN de horquilla corto (ARNhc) capaces de mediar la
interferencia de ARN (iARN).
Lo siguiente es una discusión de la técnica
pertinente que concierne a la iARN. La discusión se proporciona
sólo para la comprensión de la siguiente invención. El sumario no es
una admisión de que cualquiera de los trabajos descritos más
adelante sea de la técnica anterior a la invención reivindicada. En
el presente documento el solicitante demuestra que los ácidos
nucleicos de interferencia cortos modificados químicamente poseen
la misma capacidad para mediar la iARN que las moléculas de ARNic, y
se espera que posean una estabilidad y actividad in vivo
mejoradas; por lo tanto, esta discusión no tiene por objeto
limitarse sólo a ARNic y puede aplicarse a ANic de manera
general.
La interferencia de ARN se refiere al
procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional específico
de secuencia en animales mediado por los ARN de interferencia
cortos (ARNic) (Fire y col., 1998, Nature, 391, 806). El
procedimiento correspondiente en plantas se denomina comúnmente
silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN, y
también se denomina supresión en hongos. Se piensa que el
procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional es un
mecanismo de defensa celular conservado de forma evolutiva usado
para evitar la expresión de genes extraños, y flora y filos
diversos lo comparten comúnmente (Fire y col., 1999, Trends Genet.,
15, 358). Dicha protección frente a la expresión de genes extraños
puede haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN
bicatenarios (ARNbc) derivados de una infección viral o de la
integración aleatoria de elementos transponibles en un genoma
huésped mediante una respuesta celular que destruye específicamente
ARN monocatenario homólogo o ARN genómico viral. La presencia de
ARNbc en células desencadena la respuesta de iARN a través de un
mecanismo que aún tiene que caracterizarse completamente. Este
mecanismo parece ser diferente de la respuesta de interferón que se
produce como resultado de la activación mediada por ARNbc de la
proteína quinasa PKR y 2',5'-oligoadenilato
sintetasa, dando como resultado una escisión inespecífica del ARNm
por la ribonucleasa L.
La presencia de ARNbc largos en células estimula
la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada dicer. La
dicer está implicada en el procesamiento de los ARNbc en trozos
cortos de ARNbc conocidos como ARN de interferencia cortos (ARNic)
(Berstein y col., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN de interferencia
cortos derivados de la actividad de dicer típicamente tienen de
aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y
comprenden dúplex de aproximadamente 19 pares de bases (Elbashir y
col., 2001, Genes Dev., 15, 188). También se ha implicado a dicer
en la escisión de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22
nucleótidos a partir de ARN precursor de estructura conservada que
están implicados en el control traduccional (Hutvagner y col.,
2001, Science, 293, 834). La respuesta de iARN también presenta un
complejo de endonucleasa, denominado comúnmente complejo de
silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión de ARN
monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la cadena
antisentido del dúplex de ARNic. La escisión del ARN diana tiene
lugar en el centro de la región complementaria a la cadena
antisentido del dúplex de ARNic (Elbashir y col., 2001, Genes Dev.,
15,
188).
188).
La iARN se ha estudiado en una diversidad de
sistemas. Fire y col., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros
en observar la iARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999,
Nature Cell Biol., 2, 70, describen la iARN mediada por ARNbc en
embriones de ratón. Hammond y col., 2000, Nature, 404, 293,
describen la iARN en células de Drosophila transfectadas con
ARNbc. Elbashir y col., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN
inducida introduciendo dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos
en células de mamífero cultivadas incluyendo células embrionarias
de riñón humano y células HeLa. Trabajos recientes en lisados
embrionarios de Drosophila (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20,
6877) han revelado determinados requisitos de longitud, estructura,
composición química y secuencia de ARNic que son esenciales para
mediar una actividad de iARN eficaz. Estos estudios han demostrado
que los dúplex de ARNic de 21 nucleótidos son más activos cuando
contienen salientes dinucleotídicos 3'-terminales.
Además, la sustitución completa de una o ambas cadenas de ARNic con
nucleótidos 2'-desoxi (2'-H) o
2'-O-metilo suprime la actividad de
iARN, mientras que se demostró que se toleraba la sustitución de los
nucleótidos salientes de ARNic 3'-terminales con el
nucleótido 2'-desoxi (2'-H). También
se demostró que secuencias con un solo emparejamiento erróneo en el
centro del dúplex de ARNic suprimía la actividad de iARN. Además,
estos estudios también indican que la posición del sitio de
escisión en el ARN diana está definida por el extremo 5' de la
secuencia guía de ARNic en lugar del extremo 3' de la secuencia guía
(Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han
indicado que es necesario un fosfato 5' en la cadena complementaria
diana de un dúplex de ARNic para la actividad del ARNic y que, para
mantener el resto fosfato 5' en el ARNic, se utiliza ATP (Nykanen y
col., 2001, Cell, 107, 309).
Los estudios han demostrado que la sustitución
de los segmentos salientes de nucleótidos
3'-terminales de un dúplex de ARNic de 21 unidades,
que tiene salientes 3' de dos nucleótidos, con
desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la
actividad de iARN. Se ha indicado que la sustitución de hasta cuatro
nucleótidos en cada extremo del ARNic con desoxirribonucleótidos se
tolera bien, mientras que la sustitución completa con
desoxirribonucleótidos da como resultado la ausencia de actividad de
iARN (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Además, Elbashir y
col., anteriormente, también indican que la sustitución de ARNic con
nucleótidos 2'-O-metilo suprime
completamente la actividad de iARN. Li y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 00/44914, y Beach y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 01/68836 sugieren de forma preliminar que el
ARNic puede incluir modificaciones en la cadena principal de
azúcar-fosfato o en el nucleósido para incluir al
menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o de azufre, sin embargo,
ninguna solicitud postula en qué medida se tolerarían tales
modificaciones en moléculas de ARNic, ni proporciona ninguna
orientación adicional o ejemplos de dicho ARNic modificado.
Kreutzer y col., solicitud de patente canadiense Nº
2.359.180, también describen determinadas modificaciones químicas
para su uso en construcciones de ARNbc con el fin de contrarrestar
la activación de la proteína quinasa PKR dependiente de ARN
bicatenario, específicamente nucleótidos 2'-amino o
2'-O-metilo y nucleótidos que
contienen un puente de 2'-O- o
4'-C-metileno. Sin embargo, de
manera similar, Kreutzer y col. no proporcionan ejemplos u
orientaciones con respecto a en qué medida se tolerarían estas
modificaciones en moléculas de ARNic.
Parrish y col., 2000, Molecular Cell, 6,
1977-1087, ensayaron determinadas modificaciones
químicas dirigidas al gen unc-22 en C.
elegans usando transcritos largos de ARNic (> 25 nt). Los
autores describen la introducción de restos tiofosfato en estos
transcritos de ARNic incorporando análogos de nucleótidos tiofosfato
con ARN polimerasa de T7 y T3 y observaron que los ARN con dos
bases modificadas con fosforotioato tuvieron también disminuciones
sustanciales de su eficacia como iARN. Además, Parrish y
col., indicaron que la modificación con fosforotioato de más
de dos restos desestabilizaba enormemente los ARN in vitro de
forma que las actividades de interferencia no pudieron ensayarse.
Ídem en 1081. Los autores también ensayaron determinadas
modificaciones en la posición 2' del azúcar nucleotídico en los
transcritos largos de ARNic y encontraron que la sustitución de
ribonucleótidos por desoxinucleótidos producía una disminución
sustancial en la actividad de interferencia, especialmente en el
caso de sustituciones de Uridina a Timidina y/o Citidina a
desoxi-Citidina. Ídem. Además, los autores
ensayaron determinadas modificaciones de bases, incluyendo la
sustitución, en cadenas con sentido y antisentido del ARNic, de
uracilo por 4-tiouracilo,
5-bromouracilo, 5-yodouracilo y
3-(aminoalil)uracilo y guanosina por inosina. Mientras que
la sustitución con 4-tiouracilo y
5-bromouracilo parecía tolerarse, Parrish indicó
que la inosina producía una disminución sustancial en la actividad
de interferencia cuando se incorporaba en cualquier cadena. Parrish
también indicó que la incorporación de 5-yodouracilo
y 3-(aminoalil)uracilo en la cadena antisentido daba como
resultado también una disminución sustancial en la actividad de
iARN.
Se ha descrito el uso de ARNbc más largos. Por
ejemplo, Beach y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
01/68836, describen procedimientos específicos para atenuar la
expresión génica usando ARNbc obtenidos endógenamente. Tuschl y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 01/75164, describen un
sistema de iARN in vitro de Drosophila y el uso de
moléculas de ARNic específicas para determinadas aplicaciones
genómicas funcionales y terapéuticas; aunque Tuschl, 2001, Chem.
Biochem., 2, 239-245, duda que pueda usarse la ARNi
para curar enfermedades genéticas o infecciones virales debido al
peligro de activar la respuesta de interferón. Li y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 00/44914, describen el uso de
ARNbc específicos para atenuar la expresión de determinados genes
diana. Zernicka-Goetz y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 01/36646, describen determinados
procedimientos para inhibir la expresión de genes particulares en
células de mamífero usando determinadas moléculas de ARNbc. Fire y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 99/32619, describen
procedimientos particulares para introducir determinadas moléculas
de ARNbc en células para su uso en la inhibición de la expresión
génica. Plaetinck y col., Publicación internacional PCT Nº WO
00/01846, describen determinados procedimientos para identificar
genes específicos responsables de conferir un fenotipo particular a
una célula usando moléculas de ARNbc específicas. Mello y col.,
Publicación internacional PCT Nº WO 01/29058, describen la
identificación de genes específicos implicados en la iARN mediada
por ARNbc.
Deschamps Depaillette y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 99/07409, describen composiciones
específicas que consisten en moléculas de ARNbc particulares
combinadas con determinados agentes antivirales. Waterhouse y
col., Publicación Internacional PCT Nº 99/53050, describen
determinados procedimientos para disminuir la expresión fenotípica
de un ácido nucleico en células vegetales usando determinados ARNbc.
Driscoll y col., Publicación Internacional PCT Nº WO 01/49844,
describen construcciones de ADN específicas para su uso para
facilitar el silenciamiento génico en organismos diana.
Otros autores han indicado diversos sistemas de
iARN y silenciamiento génico. Por ejemplo, Parrish y col., 2000,
Molecular Cell, 6, 1977-1087, describen
construcciones específicas de ARNic modificados químicamente que se
dirigen al gen unc-22 de C. elegans.
Grossniklaus, Publicación Internacional PCT Nº WO 01/38551,
describe determinados procedimientos para regular la expresión del
gen polycomb en plantas usando determinados ARNbc. Churikov y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 01/42443, describen
determinados procedimientos para modificar las características
genéticas de un organismo usando determinados ARNbc. Cogoni y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 01/53475, describen
determinados procedimientos para aislar un gen de silenciamiento de
Neurospora y usos del mismo. Reed y col., Publicación Internacional
PCT Nº WO 01/68836, describen determinados procedimientos para el
silenciamiento génico en plantas. Honer y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 01/70944, describen determinados
procedimientos de selección de fármacos usando nemátodos
transgénicos como modelos de la enfermedad de Parkinson usando
determinados ARNbc. Deak y col., Publicación Internacional
PCT Nº WO 01/72774, describen determinados productos génicos
derivados de Drosophila que pueden estar relacionados con
iARN en Drosophila. Arndt y col., Publicación Internacional
PCT Nº WO 01/92513 describen determinados procedimientos para
mediar la supresión génica usando factores que potencian la iARN.
Tuschl y col., Publicación Internacional PCT Nº WO 02/44321,
describen determinadas construcciones de ARNic sintético. Pachuk y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 00/63364 y
Satishchandran y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
01/04313, describen determinados procedimientos y composiciones para
inhibir la función de determinadas secuencias polinucleotídicas
usando determinados ARNbc. Echeverri y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 02/38805, describen determinados genes de
C. elegans identificados mediante iARN. Kreutzer y
col., Publicaciones Internacionales PCT Nº WO 02/055692, WO
02/055693 y el documento EP 1144623 B1 describen determinados
procedimientos para inhibir la expresión génica usando iARN. Graham
y col., Publicaciones Internacionales PCT Nº WO 99/49029 y
WO 01/70949 y el documento AU 4037501 describen determinadas
moléculas de ARNic expresadas en vectores. Fire y col., documento
US 6.506.559, describen determinados procedimientos para inhibir la
expresión génica in vitro usando determinadas construcciones
largas de ARNbc (con más de 25 nucleótidos) que median la
iARN.
iARN.
La presente invención se refiere a compuestos,
composiciones y procedimientos útiles para modular la función del
ARN y/o la expresión génica en una célula. Específicamente, la
presente invención presenta moléculas sintéticas de ácido nucleico
pequeñas como se define en las reivindicaciones, tales como
moléculas de ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de
interferencia corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc),
micro-ARN (miARN) y ARN de horquilla corto (ARNhc)
capaces de modular la expresión génica en células mediante
inferencia de ARN (iARN). El ARNic de la presente invención, como
se define en las reivindicaciones, puede sintetizarse químicamente,
expresarse a partir de un vector o sintetizarse enzimáticamente. El
uso de ANic modificado químicamente puede mejorar diversas
propiedades de las moléculas de ARNic nativas a través de una
resistencia aumentada a la degradación por nucleasa in vivo
y/o una captación celular mejorada. Las moléculas ANic modificadas
químicamente de la presente invención proporcionan reactivos y
procedimientos útiles para una diversidad de aplicaciones
terapéuticas, de diagnóstico, agrícolas, de validación de dianas, de
descubrimiento genómico, de ingeniería genética y
farmacogenómicas.
En un ejemplo no limitante, la introducción de
nucleótidos modificados químicamente en moléculas de ácido nucleico
proporciona una herramienta poderosa para superar posibles
limitaciones de la estabilidad y biodisponibilidad in vivo
intrínsecas a las moléculas de ARN nativas que se administran de
forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico
modificadas químicamente puede permitir una dosis menor de una
molécula de ácido nucleico particular para un efecto terapéutico
dado, ya que las moléculas de ácido nucleico modificadas
químicamente tienden a tener una semivida en suero más larga.
Además, determinadas modificaciones químicas pueden mejorar la
biodisponibilidad de moléculas de ácido nucleico dirigiéndose a
células o tejidos particulares y/o mejorando la captación celular
de la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si se reduce
la actividad de una molécula de ácido nucleico modificada
químicamente en comparación con una molécula de ácido nucleico
nativa, por ejemplo, cuando se compara con una molécula de ácido
nucleico de ARN completa, la actividad global de la molécula de
ácido nucleico modificada puede ser mayor que la de la molécula
nativa debido a una estabilidad y/o suministro de la molécula
mejorados. A diferencia del ARNic nativo no modificado, el ANic
modificado químicamente también puede minimizar la posibilidad de
activar la actividad de interferón en seres humanos.
Las moléculas de ARNic de la invención pueden
diseñarse para inhibir la expresión génica por dirección de iARN de
una diversidad de moléculas de ARN. En una realización, las
moléculas de ARNic de la invención se usan para dirigir diversos
ARN que corresponden a un gen diana. Los ejemplos no limitantes de
dichos ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), variantes de corte y
empalme de ARN alternativas de un gen (o genes) diana, ARN
modificado postranscripcionalmente de un gen (o genes) diana,
pre-ARNm de un gen (o genes) diana. Si el corte y
empalme alternativo produce una familia de transcritos que se
distinguen por el uso de exones apropiados, la presente invención
puede usarse para inhibir la expresión génica a través de los exones
apropiados para inhibir específicamente o para distinguir entre las
funciones de los miembros de la familia de genes. Por ejemplo, una
proteína que contiene un dominio transmembrana de corte y empalme
alternativo puede expresarse en formas tanto unida a membrana como
secretada. El uso de la invención para dirigirse al exón que
contiene el dominio transmembrana puede usarse para determinar las
consecuencias funcionales de la dirección farmacéutica de la forma
unida a membrana a diferencia de la forma secretada de la proteína.
Los ejemplos no limitantes de aplicaciones de la invención que se
refieren a la dirección de estas moléculas de ARN incluyen
aplicaciones farmacéuticas terapéuticas, aplicaciones de
descubrimiento farmacéutico, aplicaciones de diagnóstico molecular y
de función génica y mapeo de genes, por ejemplo, usando el mapeo de
polimorfismos de un solo nucleótido con moléculas de ARNic de la
invención. Dichas aplicaciones pueden ponerse en práctica usando
secuencias génicas conocidas o a partir de secuencias parciales
disponibles de una etiqueta de secuencia expresada (EST).
En otra realización, las moléculas de ARNic de
la invención se usan para dirigirse a secuencias conservadas que
corresponden a una familia de genes o familias de genes. Como tal,
puede usarse un ARNic para caracterizar rutas de función génica en
una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención
puede usarse para inhibir la actividad de un gen (o genes) diana en
una ruta para determinar la función del gen (o genes) no
caracterizado en un análisis de función génica, análisis de función
de ARNm o análisis traduccional. La invención puede usarse para
determinar posibles rutas de genes diana implicadas en diversas
enfermedades y afecciones hacia el desarrollo farmacéutico. La
invención puede usarse para entender las rutas de expresión génica
implicadas en el desarrollo, tales como en el desarrollo prenatal,
desarrollo postnatal y/o envejecimiento.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) que regula
negativamente la expresión de una familia de genes por interferencia
de ARN. La familia de genes puede comprender más de una variante de
corte y empalme de un gen diana, más de un ARN modificado
postranscripcionalmente de un gen diana o más de un transcrito de
ARN que tiene una homología compartida. En una realización, la
familia de genes comprende genes del factor de crecimiento
epidérmico (por ejemplo, EGFR, tal como HER1, HER2, HER3 y/o HER4),
genes del factor de crecimiento endotelial vascular y del receptor
del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF,
VEGFR1, VEGF2 o VEGFR3) o genes virales que corresponden a
diferentes cepas virales (por ejemplo, HTV-1 y
VIH-2). Dichas familias de genes pueden establecerse
analizando secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, las
secuencias mostradas por los números de acceso de GenBank de la
Tabla V) para determinar la homología.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic)
bicatenario, como se define en las reivindicaciones, que regula
negativamente la expresión de un gen diana de mamífero endógeno
(por ejemplo, un gen humano), en el que la molécula de ANic
comprende modificaciones químicas y cada cadena del ANic
bicatenario tiene aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
En una realización, una molécula de ANic de la
invención no comprende ribonucleótidos. En otra realización, una
molécula de ANic de la invención comprende ribonucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que una de las cadenas
de la molécula de ANic bicatenario comprende una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos
del gen diana de mamífero endógeno o una parte del mismo, y en la
que la segunda cadena de la molécula de ANic bicatenario comprende
una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia
de nucleótidos del gen diana de mamífero endógeno o una parte del
mismo.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que cada cadena de la
molécula de ANic comprende de aproximadamente 19 a aproximadamente
23 nucleótidos, y en la que cada cadena comprende aproximadamente
19 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra
cadena.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic comprende una región antisentido que comprende una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos
del gen diana de mamífero endógeno o a una parte del mismo, y en la
que el ANic comprende adicionalmente una región con sentido, en la
que la región con sentido comprende una secuencia de nucleótidos
sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen diana
de mamífero endógeno o a una parte del mismo.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que cada una de la
región antisentido y la región con sentido comprende de
aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos y en la que la
región antisentido comprende aproximadamente 19 nucleótidos que son
complementarios a nucleótidos de la región con sentido.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic comprende una región con sentido y una región antisentido, y en
la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos
que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN
codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del
mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a la región antisentido.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos
distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y
el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula
de ANic. La región con sentido puede conectarse con la región
antisentido mediante una molécula de engarce, tal como un engarce
polinucleotídico o un engarce no nucleotídico.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic comprende una región con sentido y una región antisentido y en
la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos
que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN
codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del
mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a la región antisentido y en la
que los nucleótidos de pirimidina en la región con sentido son
nucleótidos de 2'-O-metil
pirimidina, 2'-desoxi nucleótidos y/o nucleótidos
de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos
distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y
el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula
de ANic, y en la que el fragmento que comprende la región con
sentido incluye un resto protector terminal en el extremo 5', el
extremo 3' o tanto en el extremo 5' como en 3' del fragmento que
comprende la región con sentido. En otra realización, el resto
protector terminal es un resto abásico desoxi invertido o un resto
glicerilo. En otra realización, cada uno de los dos fragmentos de la
molécula de ANic comprende 21 nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic comprende una región con sentido y una región antisentido y en
la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos
que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN
codificada por el gen diana de mamífero endógeno o una parte del
mismo, y la región con sentido comprende una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a la región antisentido y en la
que los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido,
comprenden nucleótidos de 2'-desoxi purina. En otra
realización, la región antisentido comprende un enlace
internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la región
antisentido. En otra realización, la región antisentido comprende
una modificación con glicerilo en el extremo 3' de la región
antisentido.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que regula negativamente la expresión de un gen diana de mamífero
endógeno (por ejemplo, un gen humano), en la que la molécula de
ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos
distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y
el segundo fragmento comprende la región antisentido de la molécula
de ANic, y en la que aproximadamente 19 nucleótidos de cada
fragmento de la molécula de ANic están formando pares de bases con
los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de
ANic, y en la que al menos dos nucleótidos
3'-terminales de cada fragmento de la molécula de
ANic no están formando pares de bases con los nucleótidos del otro
fragmento de la molécula de ANic. En otra realización, cada uno de
los nucleótidos 3'-terminales de cada fragmento de
la molécula de ANic son 2'-desoxi pirimidinas, tales
como 2'-desoxi timidina. En otra realización, los
21 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANic están
formando pares de bases con los nucleótidos complementarios del
otro fragmento de la molécula de ANic. En otra realización,
aproximadamente 19 nucleótidos de la región antisentido están
formando pares de bases con la secuencia de nucleótidos o con una
parte de la misma, del ARN codificado por el gen diana de mamífero
endógeno. En otra realización, 21 nucleótidos de la región
antisentido están formando pares de bases con la secuencia de
nucleótidos o con una parte de la misma, del ARN codificado por el
gen diana de mamífero endógeno. En otra realización, el extremo 5'
del fragmento que comprende dicha región antisentido incluye
opcionalmente un grupo fosfato.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que inhibe la expresión de una secuencia de ARN diana de mamífero
endógena (por ejemplo, en la que un gen humano codifica dicha
secuencia de ARN diana), en la que la molécula de ANic no comprende
ribonucleótidos y en la que cada cadena de la molécula de ANic
bicatenario comprende aproximadamente 21 nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) bicatenario
que inhibe la expresión de un gen diana de mamífero endógeno (por
ejemplo, un gen humano tal como el factor de crecimiento endotelial
vascular, el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular
(tal como, VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3), BCL2, HER2/neu,
c-Myc, PCNA, REL-A, PTP1B, BACE,
CHK1, PKC-alfa o EGFR), en la que la molécula de
ANic no requiere la presencia de un ribonucleótido dentro de la
molécula de ANic para dicha inhibición de la expresión de un gen
diana de mamífero endógeno y en la que cada cadena de la molécula de
ANic bicatenario tiene una longitud de aproximadamente 21
nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece un
medicamento que comprende una molécula de ANic de la invención.
En una realización, la invención ofrece un
principio activo que comprende una molécula de ANic de la
inven-
ción.
ción.
En una realización, la invención ofrece el uso
de una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic)
bicatenario para regular negativamente la expresión de un gen diana
de mamífero endógeno, en la que la molécula de ANic comprende una o
más modificaciones químicas y cada cadena del ANic bicatenario tiene
una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos.
En una realización, la molécula (o moléculas) de
ARNic y/o los procedimientos de la invención se usan para inhibir
la expresión de un gen (o genes) que codifican ARN a los que se hace
referencia mediante el número de acceso de GenBank de la Tabla V.
En otra realización, la molécula (o moléculas) de ARNic y/o los
procedimientos de la invención se usan para dirigir una secuencia
(o secuencias) de ARN a las que se hace referencia mediante el
número de acceso de GenBank en la Tabla V, o secuencias de ácido
nucleico que codifican dichas secuencias a las que se hace
referencia mediante el número de acceso de GenBank en la Tabla V.
Dichas secuencias se obtienen fácilmente usando los números de
acceso de GenBank de la Tabla V.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ANic que tiene actividad de iARN frente a un ARN que
codifica una proteína, en la que la molécula de ANic comprende una
secuencia complementaria al ARN que tiene una secuencia codificante
de proteína, tal como las secuencias que tienen los Nº de acceso de
GenBank mostrados en la Tabla V.
En otra realización, la invención ofrece una
molécula de ANic que tiene actividad de iARN frente a un gen, en la
que la molécula de ANic comprende una secuencia de nucleótidos
complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen, tal como
genes que codifican secuencias que tienen los Nº de acceso de
GenBank mostrados en la Tabla V. En otra realización, una molécula
de ANic de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que
puede interaccionar con una secuencia de nucleótidos de un gen y de
ese modo mediar el silenciamiento de la expresión génica, por
ejemplo, en la que el ANic media la regulación de la expresión
génica mediante procesos celulares que modulan la estructura de la
cromatina del gen e impiden la transcripción del gen.
En otra realización más, la invención ofrece una
molécula de ANic como se define en las reivindicaciones que
comprende una secuencia, por ejemplo, la secuencia antisentido de la
construcción de ANic, complementaria a una secuencia representada
por los Nº de acceso de GenBank mostrados en la Tabla V o una parte
de dicha secuencia.
En una realización, las moléculas de ácido
nucleico de la invención que actúan como mediadores de la respuesta
de silenciamiento génico de la interferencia de ARN son moléculas de
ácido nucleico bicatenario modificadas químicamente. Al igual que
en sus homólogos de ARN bicatenario nativos, las moléculas de ANic
consisten típicamente en dúplex que contienen aproximadamente 19
pares de bases entre oligonucleótidos que comprenden de
aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos. Se cree que
las moléculas de ARNic más activas tienen dichos dúplex con
extremos salientes de 1-3 nucleótidos, por ejemplo,
dúplex de 21 nucleótidos con 19 de pares de bases y salientes 3' de
2 nucleótidos. Estos segmentos salientes se hidrolizan fácilmente
mediante endonucleasas in vivo. Los estudios han demostrado
que la sustitución de los segmentos salientes 3' de un dúplex de
ARNic de 21 unidades que tiene salientes 3' de 2 nucleótidos, con
desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso sobre la actividad
de iARN. Se ha indicado que la sustitución de hasta 4 nucleótidos
en cada extremo del ARNic con desoxirribonucleótidos se tolera bien
mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos da
como resultado la ausencia de actividad de iARN (Elbashir y col.,
2001, BMBO J., 20, 6877). Además, Elbashir y col., anteriormente,
también indican que la sustitución de ARNic con nucleótidos
2'-O-metilo suprime completamente la
actividad de iARN. Li y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
00/44914 y Beach y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
01/68836 sugieren ambos que el ARNic puede incluir modificaciones en
la cadena principal de azúcar-fosfato o en el
nucleósido para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno
o azufre, sin embargo, ninguna solicitud muestra en qué medida se
toleran estas modificaciones en moléculas de ARNic ni proporciona
ningún ejemplo de dichos ARNic modificados. Kreutzer y Limmer,
solicitud de patente canadiense Nº 2.359.180, también describen
determinadas modificaciones químicas para su uso en construcciones
de ARNbc para contrarrestar la activación de la proteína quinasa
dependiente de ARN bicatenario, PKR, específicamente nucleótidos
2'-amino o
2'-O-metilo y nucleótidos que
contienen un puente 2'-O- o 4'-C-
metileno. Sin embargo, de manera similar, Kreutzer y Limmer no
muestran en qué medida se toleran estas modificaciones en moléculas
de ARNic ni proporcionan ningún ejemplo de dicho ARNic
modificado.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic modificados químicamente que tienen
especificidad por moléculas de ácido nucleico diana en una célula
(es decir, moléculas de ácido nucleico diana que comprenden o
codificadas por secuencias a las que se hace referencia en el
presente documento mediante los números de acceso de GenBank en la
Tabla V). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones
químicas incluyen, sin limitación, enlaces internucleotídicos de
fosforotioato, 2'-O-metil
ribonucleótidos,
2'-desoxi-2'-fluoro
ribonucleótidos, 2'-desoxi ribonucleótidos,
nucleótidos de "base universal", nucleótidos
5-C-metilo e incorporación de restos
abásicos desoxi invertidos. Estas modificaciones químicas, cuando
se usan en diversas construcciones de ANic, se demuestra que
conservan la actividad de iARN en células mientras que, al mismo
tiempo, aumentan espectacularmente la estabilidad de estos
compuestos en suero. Adicionalmente, al contrario que los datos
publicados por Parrish y col., anteriormente, el
solicitante demuestra que múltiples (más de una) sustituciones con
fosforotioato se toleran bien y confieren aumentos sustanciales de
la estabilidad en suero a construcciones de ANic modificadas.
En una realización, una molécula de ANic de la
invención comprende nucleótidos modificados al tiempo que mantiene
la capacidad de mediar la iARN. Los nucleótidos modificados pueden
usarse para mejorar características in vitro o in
vivo tales como la estabilidad, actividad y/o biodisponibilidad.
Por ejemplo, una molécula de ANic de la invención puede comprender
nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de
nucleótidos presentes en la molécula de ANic. Como tal, una
molécula de ANic de la invención puede comprender generalmente
nucleótidos modificados de aproximadamente el 5 a aproximadamente el
100% de las posiciones de nucleótidos (por ejemplo, el 5%, 10%,
15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones de nucleótidos). El
porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una
molécula de ANic dada depende del número total de nucleótidos
presentes en el ANic. Si la molécula de ANic es monocatenaria, el
porcentaje de modificación puede basarse en el número total de
nucleótidos presentes en las moléculas de ANic monocatenarias. Así
mismo, si la molécula de ANic es bicatenaria, el porcentaje de
modificación puede basarse en el número total de nucleótidos
presentes en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o
tanto en la cadena con sentido como en la antisentido.
Adicionalmente, el porcentaje real de nucleótidos modificados
presentes en una molécula de ANic dada, también puede depender del
número total de nucleótidos de purina y de pirimidina presentes en
el ANic, en el que, por ejemplo, todos los nucleótidos de
pirimidina y/o todos los nucleótidos de purina presentes en la
molécula de ANic están modificados.
La región antisentido de una molécula de ANic de
la invención puede comprender un enlace internucleotídico de
fosforotioato en el extremo 3' de dicha región antisentido. La
región antisentido puede comprender de aproximadamente uno a
aproximadamente cinco enlaces internucleotídicos de fosforotioato en
el extremo 5' de dicha región antisentido. Los salientes de
nucleótidos 3'-terminales de una molécula de ANic de
la invención pueden comprender ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos que están modificados químicamente en un
azúcar, base o cadena principal del ácido nucleico. Los salientes
de nucleótidos 3'-terminales pueden comprender uno o
más ribonucleótidos de bases universales. Los salientes de
nucleótidos 3'-terminales pueden comprender uno o
más nucleótidos acíclicos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente, como se define en las reivindicaciones, capaz de
mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro de una célula o de un
sistema in vitro reconstituido, en la que la modificación
química comprende uno o más enlaces internucleotídicos de
fosforotioato. Por ejemplo, en un ejemplo no limitante, la invención
presenta un ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente que tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más
enlaces internucleotídicos de fosforotioato en una cadena de ANic.
En otra realización más, la invención presenta un ácido nucleico de
interferencia corto (ANic) modificado químicamente que
individualmente tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más
enlaces internucleotídicos de fosforotioato en ambas cadenas de
ANic. Los enlaces internucleotídicos de fosforotioato pueden estar
presentes en una o ambas cadenas oligonucleotídicas del dúplex de
ANic, por ejemplo en la cadena con sentido, en la cadena antisentido
o en ambas cadenas. Las moléculas de ANic de la invención pueden
comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en
el extremo 3', en el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el
5' de la cadena con sentido, de la cadena antisentido o de ambas
cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANic ilustrativa de la
invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5
o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más) enlaces
internucleotídicos de fosforotioato consecutivos en el extremo 5' de
la cadena con sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En otro
ejemplo no limitante, una molécula de ANic ilustrativa de la
invención puede comprender uno o más (por ejemplo aproximadamente
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) enlaces internucleotídicos de
fosforotioato de pirimidina en la cadena con sentido, cadena
antisentido o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitante más, una
molécula de ANic ilustrativa de la invención puede comprender uno o
más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o
más) enlaces internucleotídicos de fosforotioato de purina en la
cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ANic como se define en las reivindicaciones, en la que
la cadena con sentido comprende uno o más de, por ejemplo,
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y uno o más (por ejemplo
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con
sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, específicamente
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena
antisentido. 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic
con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con
nucleótidos 2'-desoxi,
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro,
estando presentes uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o
en cadenas diferentes.
En otra realización, la invención ofrece una
molécula de ANic, como se define en las reivindicaciones, en la que
la cadena con sentido comprende de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5, específicamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, ó 5
enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por
ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con
sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de
aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, específicamente
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena
antisentido. 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de
ANic con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con
nucleótidos 2'-desoxi,
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro,
estando presentes de 1 a aproximadamente 5 o más, por ejemplo
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o
en cadenas diferentes.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ANic como se define en las reivindicaciones, en la que
la cadena antisentido comprende uno o más, por ejemplo,
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y/o aproximadamente uno o más
(por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de
la cadena con sentido; y en la que la cadena antisentido comprende
de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más, específicamente
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo 3',
el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena antisentido.
10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic con sentido
y/o antisentido están modificados químicamente con nucleótidos
2'-desoxi,
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro,
estando presentes uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo 3',
el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' en la misma cadena o en
cadenas diferentes.
En otra realización, la invención ofrece una
molécula de ANic, como se define en las reivindicaciones, en la que
la cadena antisentido comprende de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5 o más, específicamente aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o uno o más
(por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)
2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena con
sentido; y en la que la cadena antisentido comprende de
aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más, específicamente
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) 2'-desoxi,
2'-O-metilo,
2'-desoxi-2'-fluoro
y, opcionalmente, una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la cadena
antisentido. 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANic
con sentido y/o antisentido están modificados químicamente con
nucleótidos 2'-desoxi,
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro,
estando presentes de 1 a aproximadamente 5 o más, por ejemplo
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más, enlaces internucleotídicos de
fosforotioato y/o una molécula protectora terminal en el extremo
3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' en la misma cadena o
en cadenas diferentes.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente, como se define en las reivindicaciones, que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 5, específicamente
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más enlaces internucleotídicos de
fosforotioato en cada cadena de la molécula de ANic.
En otra realización, la invención ofrece una
molécula de ANic que comprende enlaces internucleotídicos
2'-5'. El enlace (o enlaces) internucleotídico
2'-5' puede estar en el extremo 3', el extremo 5' o
en ambos extremos 3' y 5' de una o ambas cadenas de la secuencia de
ANic. Adicionalmente, el enlace (o enlaces) internucleotídico
2'-5' puede estar presente en diversas posiciones
diferentes dentro de una o ambas cadenas de la secuencia de ANic,
por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más,
incluyendo cada enlace internucleotídico de un nucleótido de
pirimidina en una o ambas cadenas de la molécula de ANic, pueden
comprender un enlace internucleotídico 2'-5', o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, incluyendo cada
enlace internucleotídico de un nucleótido de purina en una o ambas
cadenas de la molécula de ANic, pueden comprender un enlace
internucleotídico 2'-5'.
En una realización, una molécula de ANic de la
invención comprende uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de ácido nucleico bloqueado
(LNA), por ejemplo en el extremo 5', el extremo 3', ambos extremos
5' y 3' o cualquier combinación de los mismos, de la molécula de
ANic.
En otra realización, una molécula de ANic de la
invención, comprende uno o más (por ejemplo aproximadamente 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos acíclicos, por ejemplo,
en el extremo 5', el extremo 3', ambos extremos 5' y 3' o cualquier
combinación de los mismos, de la molécula de ANic.
En una realización la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, en la que el ANic modificado
químicamente comprende una región con sentido, en la que cualquiera
de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina
presentes en la región con sentido son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o
todos) los nucleótidos de purina presentes en la región con sentido
son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo,
en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una
pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina).
En una realización la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, en la que el ANic modificado
químicamente comprende una región con sentido, en la que cualquiera
de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina
presentes en la región con sentido son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o
todos) los nucleótidos de purina presentes en la región con sentido
son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo,
en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una
pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina), en la que cualquiera de los
nucleótidos que comprenden un saliente de nucleótidos
3'-terminal que están presentes en dicha región con
sentido son 2'-desoxi nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, en la que el ANic modificado
químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera
de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o
todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido
son nucleótidos de 2'-O-metil
purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2-'O-metil purina, o de manera
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos
de 2'-O-metil purina).
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, en la que el ANic modificado
químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera
de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o
todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido
son nucleótidos de 2'-O-metil
purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'-O-metil purina, o
de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'-O- metil purina), en la que
cualquiera de los nucleótidos que comprenden un saliente de
nucleótidos 3'-terminal que están presentes en
dicha región antisentido son 2'-desoxi
nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, en la que el ANic modificado
químicamente comprende una región antisentido, en la que cualquiera
de (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina), y en la que cualquiera de (por ejemplo, uno o más o
todos) los nucleótidos de purina presentes en la región antisentido
son nucleótidos de 2'-desoxi purina (por ejemplo,
en la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina, o de manera alternativa, una
pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-desoxi purina).
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de
ARN (iARN) dentro de una célula o de un sistema in vitro
reconstituido, en la que el ANic modificado químicamente comprende
una región con sentido y una región antisentido. La región con
sentido comprende uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más nucleótidos de 2'-desoxi
purina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'-desoxi purina, o de manera
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'-desoxi purina). Opcionalmente
pueden estar presentes modificaciones abásicas desoxi invertidas en
el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5' de la
región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido comprende
adicionalmente un saliente 3'-terminal que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente
1, 2, 3, ó 4) 2'-desoxirribonucleótidos. La región
antisentido comprende uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más nucleótidos de
2'-O-metil purina (por ejemplo, en
la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-O-metil purina de manera
alternativa una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos
de 2'-O-metil purina).
Opcionalmente, está presente una modificación de protección
terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente
documento o mostrada en la Figura 22, en el extremo 3', el extremo
5' o en ambos extremos 3' y 5' de la secuencia antisentido.
Opcionalmente, la región antisentido comprende adicionalmente un
saliente de nucleótidos 3'-terminal que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente
1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos, en la que los
nucleótidos salientes pueden comprender además uno o más (por
ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato.
Se muestran ejemplos no limitantes de estos ANic modificados
químicamente en las Figuras 18 y 19 y la Tabla IV en el presente
documento.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de
ARN (iARN) dentro de una célula o de un sistema in vitro
reconstituido, en la que el ANic comprende una región con sentido y
una región antisentido, en la que la región con sentido comprende
uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más ribonucleótidos de purina (por ejemplo, en
la que todos los nucleótidos de purina son ribonucleótidos de
purina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
purina son ribonucleótidos de purina) y en la que la región
antisentido comprende uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más nucleótidos de
2'-O-metil purina (por ejemplo, en
la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-O-,metil-purina, o de manera
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos
de 2'-O-,metil-purina).
Opcionalmente, están presentes modificaciones abásicas desoxi
invertidas en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y
5' de la región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido
comprende adicionalmente un saliente 3'-terminal que
tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo,
aproximadamente 1, 2, 3 ó 4)
2'-desoxirribonucleótidos. Una modificación de
protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el
presente documento o mostrada en la figura 22, está opcionalmente
presente en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y
5' de la secuencia antisentido. Opcionalmente, la región
antisentido comprende adicionalmente un saliente de nucleótidos
3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a
aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4)
2'-desoxinucleótidos, en la que los nucleótidos
salientes pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó
4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Se muestran
ejemplos no limitantes de estos ANic modificados químicamente en las
Figuras 18 y 19 y la Tabla IV en el presente documento.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente de la invención, capaz de mediar la interferencia de
ARN (iARN) dentro de una célula o un sistema in vitro
reconstituido, en la que el ANic modificado químicamente comprende
una región con sentido y una región antisentido, en la que la
región con sentido comprende uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más nucleótidos de purina seleccionados entre el
grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos,
nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos (por
ejemplo, en la que todos los nucleótidos de purina se seleccionan
entre el grupo que consiste en 2'-desoxi
nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos, o de manera
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina se seleccionan
entre el grupo que consiste en 2'-desoxi
nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos) y en la que
la región antisentido comprende uno o más nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina, o de manera alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y uno o más nucleótidos de purina seleccionados entre
el grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos,
nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos (por ejemplo,
en la que todos los nucleótidos de purina se seleccionan entre el
grupo que consiste en 2'-desoxi nucleótidos,
nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos, o de manera
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina se seleccionan
entre el grupo que consiste en 2'-desoxi
nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA),
2'-metoxietil nucleótidos,
4'-tionucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos).
Opcionalmente, están presentes modificaciones abásicas desoxi
invertidas en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5'
de la región con sentido. Opcionalmente, la región con sentido
comprende además un saliente 3'-terminal que tiene
de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo,
aproximadamente 1, 2, 3, ó 4)
2'-desoxirribonucleótidos. Una modificación de
protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el
presente documento o mostrada en la Figura 22, está presente
opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos
3' y 5' de la secuencia antisentido. Opcionalmente, la región
antisentido comprende además un saliente de nucleótidos
3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a
aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, ó 4)
2'-desoxinucleótidos, en la que los nucleótidos
salientes pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3,
ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato.
En otra realización, cualquier nucleótido
modificado presente en las moléculas de ANic de la invención,
preferentemente en la cadena antisentido de las moléculas de ANic
de la invención, aunque también opcionalmente en las cadenas con
sentido y/o tanto antisentido como con sentido, comprenden
nucleótidos modificados que tienen propiedades o características
similares a los ribonucleótidos de origen natural. Por ejemplo, la
invención presenta moléculas de ANic que incluyen nucleótidos
modificados que tienen una conformación Norte (por ejemplo, ciclo de
pseudorrotación Norte, véase por ejemplo Saenger, Principles of
Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984).
Como tales, los nucleótidos modificados químicamente presentes en
las moléculas de ANic de la invención, preferentemente en la cadena
antisentido de las moléculas de ANic de la invención, aunque también
opcionalmente en las cadenas con sentido y/o tanto antisentido como
con sentido, son resistentes a la degradación por nucleasa mientras
que al mismo tiempo mantienen la capacidad de mediar la iARN. Los
ejemplos no limitantes de nucleótidos que tienen una configuración
Norte incluyen nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por
ejemplo,
2'-O,4'-C-metilen-(D-ribufuranosi
nucleótidos); 2'-metoxietoxi (MOE) nucleótidos;
2'-metil-tio-etil,
2'-desoxi-2'-fluoro
nucleótidos,
2'-desoxi-2'-cloro
nucleótidos, 2'-azido nucleótidos y
2'-O-metil nucleótidos.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificado
químicamente capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) dentro
de una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
modificación química comprende un conjugado unido covalentemente a
la molécula de ANic modificada químicamente. En otra realización,
el conjugado está unido covalentemente a la molécula de ANic
modificada químicamente, a través de un engarce biodegradable. En
una realización, la molécula de conjugado está unida en el extremo
3' de la cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas
de la molécula de ANic modificada químicamente. En otra
realización, la molécula de conjugado se une en el extremo 5' de la
cadena con sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas de la
molécula de ANic modificada químicamente. En otra realización más,
la molécula de conjugado se une tanto al extremo 3' como al extremo
5' de cualquiera de la cadena con sentido, la cadena antisentido o
ambas cadenas de la molécula de ANic modificada químicamente o
cualquier combinación de las mismas. En una realización, una
molécula de conjugado de la invención comprende una molécula que
facilita el suministro de una molécula de ANic modificada
químicamente en un sistema biológico, tal como una célula. En otra
realización, la molécula de conjugado unida a la molécula de ANic
modificada químicamente es un polietilenglicol, albúmina de suero
humano o un ligando para un receptor celular que puede mediar la
captación celular. Se describen ejemplos de moléculas de conjugado
específicas que contempla la presente invención que pueden unirse a
moléculas de ANic modificadas químicamente en Vargeese y col., Nº de
Serie de los Estados Unidos 10/201.394, que se incorpora por
referencia en el presente documento. El tipo de conjugado usado y
el grado de conjugación de las moléculas de ANic de la invención
puede evaluarse para determinar una mejora en los perfiles
farmacocinéticos, la biodisponibilidad y/o la estabilidad de las
construcciones de ANic mientras que al mismo tiempo se mantiene la
capacidad del ANic para mediar la actividad de iARN. Como tal, un
experto en la materia puede seleccionar construcciones de ANic que
están modificadas con diversos conjugados para determinar si el
complejo de ANic-conjugado posee propiedades
mejoradas a la vez que mantiene la capacidad de mediar la iARN, por
ejemplo, en modelos animales como se conocen generalmente en la
técnica.
En una realización, la invención ofrece una
molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) de la
invención, en la que el ANic comprende además un engarce
nucleotídico, no nucleotídico o mixto nucleotídico/no nucleotídico
que une la región con sentido del ANic con la región antisentido del
ANic. En una realización, un engarce nucleotídico de la invención
puede ser un engarce de \geq 2 nucleótidos de longitud, por
ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. En otra
realización, el engarce nucleotídico puede ser un aptámero de ácido
nucleico. "Aptámero" o "aptámero de ácido nucléico", como
se usan en el presente documento, significan una molécula de ácido
nucleico que se une específicamente a una molécula diana en la que
la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una
secuencia reconocida por la molécula diana en su entorno natural.
Como alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido
nucleico que se une a una molécula diana en la que la molécula
diana no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula
diana puede ser cualquier molécula de interés. Por ejemplo, el
aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión a ligando
de una proteína, impidiendo de ese modo la interacción del ligando
de origen natural con la proteína. Esto es un ejemplo no limitante
y los expertos en la materia reconocerán que pueden generarse
fácilmente otras realizaciones usando las técnicas conocidas
generalmente en el campo (véase, por ejemplo, Gold y col., 1995,
Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol.,
74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J.
Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y
Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.).
En otra realización más, un engarce no
nucleotídico de la invención comprende un nucleótido abásico,
poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido,
polihidrocarburo u otros compuestos poliméricos (por ejemplo,
polietilenglicoles tales como los que tienen entre 2 y 100 unidades
de etilenglicol). Los ejemplos específicos incluyen los descritos
por Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18: 6353 y Nucleic
Acids Res. 1987, 15: 3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc.
1991, 113: 6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991,
113: 5109; Ma y col., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2585 y
Biochemistry 1993, 32: 1751; Durand y col., Nucleic Acids Res.
1990, 18: 6353; McCurdy y col., Nucleosides & Nucleotides 1991,
10: 287; Jschke y col., Tetrahedron Lett. 1993, 34: 301; Ono y
col., Biochemistry 1991, 30: 9914; Arnold y col., Publicación
Internacional Nº WO 89/02439; Usman y col., Publicación
Internacional Nº WO 95/06731; Dudycz y col., Publicación
Internacional Nº WO 95/11910 y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc.
1991, 113: 4000. Un "no nucleótido" significa además cualquier
grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido
nucleico en el lugar de una o más unidades de nucleótido,
incluyendo sustituciones de azúcar y/o fosfato, y permite que las
bases restantes muestren su actividad enzimática. El grupo o
compuesto puede ser abásico en el sentido de que no contiene una
base de nucleótido reconocida comúnmente, tal como adenosina,
guanina, citosina, uracilo o timina, por ejemplo, en la posición CI
del azúcar.
Los presentes inventores proporcionan una
molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en
una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana.
La molécula de ANic monocatenario puede comprender un grupo fosfato
5'-terminal. La molécula de ANic monocatenario puede
comprender un grupo fosfato 5'-terminal y un grupo
fosfato 3'-terminal (por ejemplo, un fosfato
2',3'-cíclico). La molécula de ANic monocatenario
puede comprender de aproximadamente 19 a aproximadamente 29
nucleótidos. La molécula de ANic monocatenario puede comprender uno
o más nucleótidos modificados químicamente o no nucleótidos
descritos en el presente documento.
Los presentes inventores proporcionan una
molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en
una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana, y
en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic
son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-O-metil purina (por ejemplo, en
la que todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de
2'-O-metil purina o, de forma
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos
de 2'-O-metil purina) y una
modificación de protección terminal, tal como cualquier modificación
descrita en el presente documento o mostrada en la Figura 22, que
está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto
en el extremo 3' como el 5' de la secuencia antisentido,
comprendiendo además opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a
aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4)
2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de
la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden
comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces
internucleotídicos de fosforotioato, y en la que el ANic comprende
además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo
fosfato 5'- terminal.
Los presentes inventores proporcionan una
molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en
una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana, y
en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic
son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-desoxi purina (por ejemplo, en la que todos los
nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- desoxi purina o, de
forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'- desoxi purina) y una modificación de protección
terminal, tal como cualquier modificación descrita en el presente
documento o mostrada en la Figura 22, que está presente
opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo
3' como en el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además
opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por
ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4)
2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de
la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden
comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y en la que el ANic comprende
además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo
fosfato 5'- terminal.
Los presentes inventores proporcionan una
molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en
una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana y
en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic
son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina), y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de ácido
nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, en la que todos los
nucleótidos de purina son nucleótidos de LNA o, de forma
alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos
de LNA) y una modificación de protección terminal, tal como
cualquier modificación descrita en el presente documento o mostrada
en la Figura 22, que está presente opcionalmente en el extremo 3',
el extremo 5' o tanto en el extremo 3' como en el 5' de la
secuencia antisentido, comprendiendo además opcionalmente el ANic de
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, aproximadamente
1, 2, 3 ó 4) 2'-desoxinucleótidos terminales en el
extremo 3' de la molécula de ANic, en la que los nucleótidos
terminales pueden comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3
ó 4) enlaces internucleotídicos de fosforotioato y en la que el
ANic comprende además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal
como un grupo fosfato 5'- terminal.
Los presentes inventores proporcionan una
molécula de ANic monocatenario que media la actividad de iARN en
una célula o sistema in vitro reconstituido, en la que la
molécula de ANic comprende un polinucleótido monocatenario que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana y
en la que uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en el ANic
son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina (por ejemplo, en la que todos los nucleótidos de
pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos
de pirimidina son nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina) y en la que cualquiera de los nucleótidos de purina
presentes en la región antisentido son nucleótidos de
2'-metoxietil purina (por ejemplo, en la que todos
los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'- metoxietil purina
o, de forma alternativa, una pluralidad de nucleótidos de purina son
nucleótidos de 2'- metoxietil purina) y una modificación de
protección terminal, tal como cualquier modificación descrita en el
presente documento o mostrada en la Figura 22, que está presente
opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5' o tanto en el extremo
3' como en el 5' de la secuencia antisentido, comprendiendo además
opcionalmente el ANic de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por
ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3 ó 4)
2'-desoxinucleótidos terminales en el extremo 3' de
la molécula de ANic, en la que los nucleótidos terminales pueden
comprender además uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) enlaces
internucleotídicos de fosforotioato y en la que el ANic comprende
además opcionalmente un grupo fosfato terminal, tal como un grupo
fosfato 5'-terminal.
Cualquier nucleótido modificado presente en las
moléculas de ANic monocatenario puede comprender nucleótidos
modificados que tienen propiedades o características similares a los
ribonucleótidos de origen natural. Los mismos incluyen moléculas de
ANic incluyendo nucleótidos modificados que tienen una conformación
Norte (por ejemplo, ciclo de pseudorrotación Norte, véase, por
ejemplo Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure,
Springer-Verlag ed., 1984). Como tal, los
nucleótidos modificados químicamente presentes en las moléculas de
ANic monocatenario preferentemente son resistentes a la degradación
por nucleasa mientras que al mismo tiempo mantienen la capacidad de
mediar la iARN.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen dentro de una
célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que una de las
cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del
gen; y (b) introducir la molécula de ANic en una célula en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en la
célula.
En una realización, la invención presenta un
procedimiento para modular la expresión de un gen dentro de una
célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que una de las
cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del
gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic
comprende una secuencia sustancialmente similar a la secuencia del
ARN diana; y (b) introducir la molécula de ANic en una célula en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en la
célula.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de
una célula que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la
invención, que están modificadas químicamente, en las que una de
las cadenas de ANic comprende una secuencia complementaria al ARN de
los genes; (b) introducir las moléculas de ANic en una célula en
condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en la
célula.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de
una célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que una de las
cadenas de ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del
gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic
comprende una secuencia sustancialmente similar a la secuencia del
ARN diana; y (b) introducir las moléculas de ANic en una célula en
condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes en la
célula.
En una realización, las moléculas de ANic de la
invención se usan como reactivos en aplicaciones ex vivo.
Por ejemplo, se introducen reactivos de ANic en tejido o células que
se trasplantan a un sujeto para un efecto terapéutico. Las células
y/o el tejido se pueden obtener a partir de un organismo o sujeto
que posteriormente recibe el explante, o se pueden obtener a partir
de otro organismo o sujeto antes del trasplante. Las moléculas de
ANic se pueden usar para modular la expresión de uno o más genes en
las células o tejido, de forma que las células o tejido obtengan un
fenotipo deseado o sean capaces de realizar una función cuando se
trasplantan in vivo. En una realización, se extraen
determinadas células diana de un paciente. Estas células extraídas
se ponen en contacto con ANic que se dirigen a una secuencia de
nucleótidos específica dentro de las células en condiciones
adecuadas para la captación de los ANic por estas células (por
ejemplo, usando reactivos de suministro tales como lípidos
catiónicos, liposomas y similares o usando técnicas tales como
electroporación para facilitar el suministro de ANic a las
células). Las células después se vuelven a introducir en el mismo
paciente o en otros pacientes. Los ejemplos no limitantes de
aplicaciones ex vivo incluyen su uso en el trasplante de
órganos/tejidos, injerto de tejido o tratamiento de enfermedad
pulmonar (por ejemplo, reestenosis) o para prevenir la hiperplasia
de la neoíntima y/o aterosclerosis en injertos venosos. Tales
aplicaciones ex vivo también se pueden usar para tratar
afecciones asociadas con rechazo de injerto de derivación coronaria
y periférica, por ejemplo, tales procedimientos se pueden usar junto
con cirugía de injerto de derivación vascular periférica y cirugía
de injerto de derivación de la arteria coronaria. Las aplicaciones
adicionales incluyen trasplantes para tratar lesiones o daños del
SNC, incluyendo su uso en el tratamiento de afecciones
neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson, Epilepsia, Demencia, enfermedad de Huntington o
esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de
tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que una de las
cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del
gen, y (b) introducir la molécula de ANic en una célula del
explante de tejido obtenido a partir de un organismo particular en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el
explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende
además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a
partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese
organismo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de
tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que una de las
cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN del
gen y en la que la secuencia de la cadena con sentido del ANic
comprende una secuencia sustancialmente similar a la secuencia del
ARN diana; y (b) introducir la molécula de ANic en una célula del
explante del tejido obtenido a partir de un organismo particular en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el
explante de tejido. En otra realización, el procedimiento comprende
además introducir el explante de tejido de nuevo en el organismo a
partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo, en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese
organismo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un
explante de tejido, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic
de la invención, que están modificadas químicamente, en las que una
de las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al
ARN de los genes; (b) introducir las moléculas de ANic en una
célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo
particular en condiciones adecuadas para modular la expresión de los
genes en el explante de tejido. En otra realización, el
procedimiento comprende además introducir el explante de tejido de
nuevo en el organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en
otro organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión
de los genes en ese organismo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo
que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención,
que está modificada químicamente, en la que una de las cadenas del
ANic comprende una secuencia complementaria al ARN de los genes, y
(b) introducir la molécula de ANic en el organismo en condiciones
adecuadas para modular la expresión del gen en el organismo.
En otra realización, la invención presenta
además un procedimiento para modular la expresión de más de un gen
en un organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de
la invención, que están modificadas químicamente, en las que una de
las cadenas del ANic comprende una secuencia complementaria al ARN
de los genes; y (b) introducir las moléculas de ANic en el
organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los
genes en el organismo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen dentro de una
célula que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que el ANic
comprende una secuencia monocatenaria que tienen complementariedad
con el ARN del gen; y (b) introducir la molécula de ANic en una
célula en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen
en la célula.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen dentro de
una célula que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la
invención, que están modificadas químicamente, en las que el ANic
comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad
con el ARN del gen; y (b) poner en contacto la molécula de ANic con
una célula in vitro o in vivo en condiciones adecuadas
para modular la expresión de los genes en la célula.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un explante de
tejido que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la
invención, que está modificada químicamente, en la que el ANic
comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad
con el ARN del gen; y (b) poner en contacto la molécula de ANic con
una célula del explante de tejido obtenido a partir de un organismo
particular en condiciones adecuadas para modular la expresión del
gen en el explante de tejido. En otra realización, el procedimiento
comprende además introducir el explante de tejido de nuevo en el
organismo a partir del cual se obtuvo el tejido o en otro organismo
en condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en ese
organismo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un
explante de tejido que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic
de la invención, que está modificada químicamente, en las que el
ANic comprende una secuencia monocatenaria que tiene
complementariedad con el ARN del gen; y (b) introducir las
moléculas del ANic en una célula del explante de tejido obtenido a
partir de un organismo particular en condiciones adecuadas para
modular la expresión de los genes en el explante de tejido. En otra
realización, el procedimiento comprende además introducir el
explante de tejido de nuevo en el organismo a partir del cual se
obtuvo el tejido o en otro organismo en condiciones adecuadas para
modular la expresión de los genes en ese organismo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo
que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANic de la invención,
que está modificada químicamente, en la que el ANic comprende una
secuencia monocatenaria que tiene complementariedad con el ARN del
gen; y (b) introducir la molécula de ANic en el organismo en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen en el
organismo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un
organismo que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANic de la
invención, que están modificadas químicamente, en las que el ANic
comprende una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad
con el ARN del gen; y (b) introducir las moléculas de ANic en el
organismo en condiciones adecuadas para modular la expresión de los
genes en el organismo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de un gen en un organismo
que comprende poner en contacto el organismo con una molécula de
ANic de la invención en condiciones adecuadas para modular la
expresión del gen en el organismo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para modular la expresión de más de un gen en un
organismo que comprende poner en contacto el organismo con una o más
moléculas de ANic de la invención en condiciones adecuadas para
modular la expresión de los genes en el organismo.
Las moléculas de ANic de la invención se pueden
diseñar para inhibir la expresión de un gen diana a través de la
dirección de la iARN de una diversidad de moléculas de ARN. En una
realización, las moléculas de ANic de la invención se usan para
dirigir diversos ARN correspondientes a un gen diana. Los ejemplos
no limitantes de tales ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), variantes
de corte y empalme alternativo del ARN de un gen o genes diana, ARN
modificado post-transcripcionalmente de un gen o
genes diana, pre-ARNm de un gen o genes diana y/o
moldes de ARN. Si el corte y empalme alternativo produce una familia
de transcritos que se distinguen por el uso de exones apropiados,
la presente invención se puede usar para inhibir la expresión génica
a través de los exones apropiados para inhibir específicamente o
distinguir entre las funciones de miembros de familias de genes.
Por ejemplo, una proteína que contiene un dominio transmembrana
sometido a corte y empalme alternativo se puede expresar en formas
tanto unida a membrana como secretada. El uso de la invención para
dirigirse al exón que contiene el dominio transmembrana se puede
usar para determinar las consecuencias funcionales de la dirección
farmacéutica de la forma unida a membrana a diferencia de la
secretada de la proteína. Los ejemplos no limitantes de
aplicaciones de la invención que se refieren a la dirección de estas
moléculas de ARN incluyen aplicaciones farmacéuticas terapéuticas,
aplicaciones de descubrimiento farmacéutico, aplicaciones de
diagnóstico molecular y función génica y mapeo de genes, por
ejemplo usando mapeo de polimorfismos de un solo nucleótido con
moléculas de ANic de la invención. Tales aplicaciones se pueden
poner en práctica usando secuencias génicas conocidas o a partir de
secuencias parciales disponibles a partir de una etiqueta de
secuencia expresada (EST).
En otra realización, las moléculas de ANic de la
invención se usan para dirigir secuencias conservadas
correspondientes a una familia de genes o familias de genes. Como
tal, las moléculas de ANic que se dirigen a múltiples dianas
génicas pueden proporcionar un efecto terapéutico aumentado.
Adicionalmente, se puede usar ANic para caracterizar rutas de
función génica en una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, la
presente invención se puede usar para inhibir la actividad de un
gen o genes diana en una ruta para determinar la función de un gen o
genes no caracterizados en el análisis de la función génica,
análisis de la función del ARNm o análisis traduccional. La
invención se puede usar para determinar rutas de genes diana
potenciales implicadas en diversas enfermedades y afecciones hacia
el desarrollo farmacéutico. La invención se puede usar para
comprender rutas de expresión génica implicadas en, por ejemplo, el
desarrollo, tal como el desarrollo prenatal y el desarrollo
postnatal y/o la progresión y/o el mantenimiento del cáncer,
enfermedades infecciosas, autoinmunidad, inflamación, trastornos
endocrinos, enfermedad renal, enfermedad pulmonar, enfermedad
cardiovascular, defectos de nacimiento, envejecimiento y otras
enfermedades o afecciones relacionadas con la expresión génica.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento que comprende: (a) generar una biblioteca de
construcciones de ANic con una complejidad predeterminada; y (b)
ensayar las construcciones de ANic de (a) mencionado anteriormente,
en condiciones adecuadas para determinar sitios diana de iARN dentro
de la secuencia de ARN diana. En otra realización, las moléculas de
ANic de (a) tienen cadenas de una longitud fija, por ejemplo,
aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra realización
más, las moléculas de ANic de (a) son de longitud diferente, por
ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente 19 a aproximadamente 25
(por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25)
nucleótidos de longitud. En una realización, el ensayo puede
comprender un ensayo de ANic in vitro reconstituido como se
describe en el presente documento. En otra realización, el ensayo
puede comprender un sistema de cultivo celular en el que se expresa
ARN diana. En otra realización, se analizan fragmentos de ARN diana
para determinar niveles detectables de escisión, por ejemplo,
mediante electroforesis en gel, análisis de transferencia de
Northern o ensayos de protección de ARNasa, para determinar el sitio
o los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN
diana. La secuencia de ARN diana se puede obtener como se conoce en
la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción para
sistemas in vitro y mediante expresión celular en sistemas
in vivo.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento que comprende: (a) generar una biblioteca aleatorizada
de construcciones de ANic que tienen una complejidad
predeterminada, tal como de 4^{N}, donde N representa el número
de nucleótidos formando pares de bases en cada una de las cadenas de
la construcción de ANic (por ejemplo, para una construcción de ANic
que tiene cadenas con sentido y antisentido de 21 nucleótidos con 19
pares de bases, la complejidad sería de 4^{19}) y (b) ensayar las
construcciones de ANic de (a) mencionado anteriormente, en
condiciones adecuadas para determinar sitios diana de iARN dentro de
la secuencia de ARN diana. En otra realización, las moléculas de
ANic de (a) tienen cadenas de una longitud fija, por ejemplo, de
aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra realización más,
las moléculas de ANic de (a) tienen una longitud diferente, por
ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente 19 a aproximadamente 25
(por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25)
nucleótidos de longitud. En una realización, el ensayo puede
comprender un ensayo de ANic in vitro reconstituido como se
ha descrito en el Ejemplo 7 en el presente documento. En otra
realización, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo
celular en el que se expresa ARN diana. En otra realización, se
analizan fragmentos de ARN diana para determinar niveles detectables
de escisión, por ejemplo mediante electroforesis en gel, análisis
de transferencia de Northern o ensayos de protección de ARNasa,
para determinar el sitio o los sitios diana más adecuados dentro de
la secuencia de ARN diana. En otra realización, la secuencia de ARN
diana se puede obtener como se conoce en la técnica, por ejemplo,
mediante clonación y/o transcripción para sistemas in vitro y
mediante expresión celular en sistemas in vivo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento que comprende: (a) analizar la secuencia de una diana
de ARN codificada por un gen diana; (b) sintetizar uno o más
conjuntos de moléculas de ANic que tienen una secuencia
complementaria a una o más regiones del ARN de (a); y (c) ensayar
las moléculas de ANic de (b) en condiciones adecuadas para
determinar dianas de iARN dentro de la secuencia de ARN diana. En
una realización, las moléculas de ANic de (b) tienen cadenas de una
longitud fija, por ejemplo de aproximadamente 23 nucleótidos de
longitud. En otra realización, las moléculas de ANic de (b) son de
longitud diferente, por ejemplo, tienen cadenas de aproximadamente
19 a aproximadamente 25 (por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21,
22, 23, 24 ó 25) nucleótidos de longitud. En una realización, el
ensayo puede comprender un ensayo de ANic in vitro
reconstituido como se ha descrito en el presente documento. En otra
realización, el ensayo puede comprender un sistema de cultivo
celular en el que se expresa ARN diana. Los fragmentos de ARN diana
se analizan para determinar niveles detectables de escisión, por
ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de transferencia
de Northern o ensayos de protección de ARNasa, para determinar el
sitio o los sitios diana más adecuados dentro de la secuencia de
ARN diana. La secuencia de ARN diana se puede obtener como se conoce
en la técnica, por ejemplo, mediante clonación y/o transcripción
para sistemas in vitro y mediante expresión en sistemas
in vivo.
Por "sitio diana" se quiere significar una
secuencia dentro de un ARN diana a la que se "dirige" la
escisión mediada por una construcción de ANic que contiene
secuencias dentro de su región antisentido que son complementarias
a la secuencia diana.
Por "nivel detectable de escisión" se
quiere significar la escisión de ARN diana (y formación de ARN de
producto escindidos) en una medida suficiente para diferenciar los
productos de escisión por encima del fondo de ARN producidos
mediante degradación aleatoria del ARN diana. La producción de
productos de escisión del 1-5% del ARN diana es
suficiente para detectarse por encima del fondo para la mayoría de
los procedimientos de detección.
En una realización, la invención presenta una
composición que comprende una molécula de ANic de la invención, que
está modificada químicamente, en un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la invención
presenta una composición farmacéutica que comprende moléculas de
ANic de la invención, que están modificadas químicamente, que se
dirigen a uno o más genes en un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. Los presentes inventores proporcionan
un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección en
un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de
la invención en condiciones adecuadas para el tratamiento o
prevención de la enfermedad o afección en el sujeto, sólo o junto
con uno o más compuestos terapéuticos distintos. Los presentes
inventores proporcionan un procedimiento para compuestos. Los
presentes inventores proporcionan un procedimiento para reducir o
evitar el rechazo de tejido en un sujeto que comprende administrar
al sujeto una composición de la invención en condiciones adecuadas
para la reducción o prevención del rechazo de tejido en el
sujeto.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para validar una diana génica, que comprende: (a)
sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está modificada
químicamente en la que una de las cadenas de ANic incluye una
secuencia complementaria a ARN de un gen diana; (b) introducir la
molécula de ANic en una célula, tejido u organismo en condiciones
adecuadas para modular la expresión del gen diana en la célula,
tejido u organismo, y (c) determinar la función del gen ensayando
cualquier cambio fenotípico en la célula, tejido u organismo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para validar un gen diana que comprende: (a)
sintetizar una molécula de ANic de la invención, que está
modificada químicamente, en la que una de las cadenas de ANic
incluye una secuencia complementaria al ARN de un gen diana; (b)
introducir la molécula de ANic en un sistema biológico en
condiciones adecuadas para modular la expresión del gen diana en el
sistema biológico; y (c) determinar la función del gen ensayando
cualquier cambio fenotípico en el sistema biológico.
"Sistema biológico" significa un material,
en una forma purificada o no purificada, a partir de fuentes
biológicas, incluyendo aunque sin limitación fuentes humanas,
animales, vegetales, de insecto, bacterianas, virales u otras, en
las que el sistema comprende los componentes necesarios para la
actividad de iARN. La expresión "sistema biológico" incluye,
por ejemplo, una célula, tejido u organismo o extracto de los
mismos. La expresión sistema biológico también incluye sistemas de
iARN reconstituidos que se pueden usar en un entorno in
vitro.
Por "cambio fenotípico" se quiere
significar cualquier cambio detectable en una célula que se produce
como respuesta al contacto o tratamiento con una molécula de ácido
nucleico de la invención (por ejemplo, ANic). Tales cambios
detectables incluyen, pero sin limitación, cambios en la forma,
tamaño, proliferación, motilidad, expresión de proteína o expresión
de ARN u otros cambios físicos o químicos según se pueden ensayar
mediante procedimientos conocidos en la técnica. El cambio
detectable también puede incluir expresión de genes/moléculas
indicadoras tales como Proteína Verde Fluorescente (GFP) o diversas
etiquetas que se usan para identificar una proteína expresada o
cualquier otro componente celular que se pueda ensayar.
En una realización, la invención ofrece un kit
que contiene una molécula de ANic de la invención, que está
modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión
de un gen en una célula, tejido u organismo. En otra realización,
la invención presenta un kit que contiene más de una molécula de
ANic de la invención, que está modificada químicamente, que se
puede usar para modular la expresión de más de un gen diana en una
célula, tejido u organismo.
En una realización, la invención ofrece un kit
que contiene una molécula de ANic de la invención, que está
modificada químicamente, que se puede usar para modular la expresión
de un gen diana en un sistema biológico. En otra realización, la
invención presenta un kit que contiene más de una molécula de ANic
de la invención, que está modificada químicamente, que se puede
usar para modular la expresión de más de un gen diana en un sistema
biológico.
En una realización, la invención presenta una
célula que contiene una o más moléculas de ANic de la invención,
que están modificadas químicamente. En otra realización, la célula
que contiene una molécula de ANic de la invención es una célula de
mamífero. En otra realización más, la célula que contiene una
molécula de ANic de la invención es una célula humana.
En una realización, la síntesis de una molécula
de ANic de la invención, que se puede modificar químicamente,
comprende: (a) síntesis de dos cadenas complementarias de la
molécula de ANic; (b) hibridación de dos cadenas complementarias
entre sí en condiciones adecuadas para obtener una molécula de ANic
bicatenaria. En otra realización, la síntesis de las dos cadenas
complementarias de la molécula de ANic es mediante síntesis de
oligonucleótidos en fase sólida. En otra realización más, la
síntesis de las dos cadenas complementarias de la molécula de ANic
es mediante síntesis de oligonucleótidos en tándem en fase
sólida.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para sintetizar una molécula de dúplex de ANic que
comprende: (a) sintetizar una primera cadena de secuencia
oligonucleotídica de la molécula de ANic, en la que la primera
cadena de secuencia oligonucleotídica comprende una molécula de
engarce escindible que se puede usar como un armazón para la
síntesis de la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica del
ANic; (b) sintetizar la segunda cadena de secuencia
oligonucleotídica de ANic en el armazón de la primera cadena de
secuencia oligonucleotídica, en la que la segunda cadena de
secuencia oligonucleotídica comprende además un resto químico que se
puede usar para purificar el dúplex de ANic; (c) escindir la
molécula de engarce de (a) en condiciones adecuadas para que las
dos cadenas oligonucleotídicas de ANic se hibriden y formen un
dúplex estable; y (d) purificar el dúplex de ANic utilizando el
resto químico de la segunda cadena de secuencia oligonucleotídica.
En una realización, la escisión de la molécula de engarce en (c)
mencionada anteriormente tiene lugar durante la desprotección del
oligonucleótido, por ejemplo en condiciones de hidrólisis usando una
base de alquilamina tal como metilamina. En una realización, el
procedimiento de síntesis comprende síntesis en fase sólida sobre
un soporte sólido tal como vidrio de tamaño de poro controlado (CPG)
o poliestireno, en el que la primera secuencia de (a) se sintetiza
en un engarce escindible, tal como un engarce de succinilo, usando
el soporte sólido como un armazón. El engarce escindible en (a)
usado como un armazón para sintetizar la segunda cadena puede
comprender reactividad similar a la del engarce derivatizado de
soporte sólido, de forma que la escisión del engarce derivatizado
de soporte sólido y el engarce escindible de (a) tiene lugar de
forma conjunta. En otra realización, el resto químico de (b) que se
puede usar para aislar la secuencia oligonucleotídica unida
comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dimetoxitritilo,
que se puede emplear en una estrategia de síntesis sobre tritilo
como se describe en el presente documento. En otra realización más,
el resto químico, tal como un grupo dimetoxitritilo, se elimina
durante la purificación, por ejemplo, usando condiciones ácidas.
En una realización adicional, el procedimiento
para la síntesis de ANic es una síntesis en fase de solución o
síntesis en fase híbrida en la que ambas cadenas del dúplex de ANic
se sintetizan en tándem usando un engarce escindible unido a la
primera secuencia que actúa como un armazón para la síntesis de la
segunda secuencia. La escisión del engarce en condiciones adecuadas
para la hibridación de las cadenas de la secuencia de ANic
separadas da como resultado la formación de la molécula de ANic
bicatenaria.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para sintetizar una molécula de dúplex de ANic que
comprende: (a) sintetizar una cadena de secuencia oligonucleotídica
de la molécula de ANic, en la que la secuencia comprende una
molécula de engarce escindible que se puede usar como un armazón
para la síntesis de otra secuencia oligonucleotídica; (b)
sintetizar una segunda secuencia oligonucleotídica que tiene
complementariedad con la primera cadena de secuencia en el armazón
de (a), en la que la segunda secuencia comprende la otra cadena de
la molécula de ANic bicatenaria y en la que la segunda secuencia
comprende además un resto químico que se puede usar para aislar la
secuencia oligonucleotídica unida; (c) purificar el producto de (b)
utilizando el resto químico de la segunda cadena de secuencia
oligonucleotídica en condiciones adecuadas para aislar la secuencia
de longitud completa, que comprende ambas cadenas oligonucleotídicas
de ANic conectadas mediante el engarce escindible y en condiciones
adecuadas para que las dos cadenas oligonucleotídicas de ANic se
hibriden y formen un dúplex estable. En una realización, la
escisión de la molécula de engarce en (c) mencionada anteriormente
tiene lugar durante la desprotección del oligonucleótido, por
ejemplo en condiciones de hidrólisis. En otra realización, la
escisión de la molécula de engarce en (c) mencionada anteriormente
tiene lugar después de la desprotección del oligonucleótido. En
otra realización, el procedimiento de síntesis comprende la síntesis
en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de tamaño de
poro controlado (CPG) o poliestireno, en la que la primera
secuencia de (a) se sintetiza sobre un engarce escindible, tal como
un engarce de succinilo, usando el soporte sólido como un armazón.
El engarce escindible en (a) usado como un armazón para sintetizar
la segunda cadena puede comprender una reactividad similar o una
reactividad diferente a la del engarce derivatizado del soporte
sólido, de forma que la escisión del engarce derivatizado del
soporte sólido y el engarce escindible de (a) tiene lugar de forma
conjunta o secuencial. En una realización, el resto químico de (b)
que se puede usar para aislar la secuencia oligonucleotídica unida
comprende un grupo tritilo, por ejemplo, un grupo
dimetoxitritilo.
dimetoxitritilo.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para preparar una molécula de ANic bicatenaria en un
procedimiento sintético único que comprende: (a) sintetizar un
oligonucleótido que tiene una primera y una segunda secuencia, en
el que la primera secuencia es complementaria a la segunda secuencia
y la primera secuencia oligonucleotídica está unida a la segunda
secuencia a través de un engarce escindible y en el que un grupo
protector 5'-terminal, por ejemplo, un grupo
5'-O-dimetoxitritilo
(5'-O-DMT) permanece en el
oligonucleótido que tiene la segunda secuencia; (b) desproteger el
oligonucleótido mediante lo cual la desprotección da como resultado
la escisión del engarce que une las dos secuencias
oligonucleotídicas, y (c) purificar el producto de (b) en
condiciones adecuadas para aislar la molécula de ANic bicatenaria,
por ejemplo, usando una estrategia de síntesis sobre tritilo, como
se describe en el presente documento.
En otra realización, el procedimiento de
síntesis de moléculas de ANic de la invención comprende las
enseñanzas de Scaringe y col., Patentes de los Estados Unidos Nº
5.889.136; 6.008.400; y 6.111.086.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que
median la iARN frente a un gen diana, en la que la construcción de
ANic comprende modificaciones químicas descritas en el presente
documento que modulan la afinidad de unión entre las cadenas con
sentido y antisentido de la construcción de ANic de la etapa (a) en
condiciones adecuadas para aislar moléculas de ANic que tienen una
afinidad de unión aumentada entre las cadenas con sentido y
antisentido de la molécula de ANic.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que
median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la
construcción de ANic comprende modificaciones químicas descritas en
el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la
cadena antisentido de la construcción de ANic y una secuencia de
ARN diana complementaria dentro de una célula.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que
median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la
construcción de ANic comprende modificaciones químicas descritas en
el presente documento que modulan la afinidad de unión entre la
cadena antisentido de la construcción de ANic y una secuencia de
ADN diana complementaria dentro de una célula.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que
median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la
construcción de ANic comprende modificaciones químicas descritas en
el presente documento que modulan la actividad polimerasa de una
polimerasa celular capaz de generar moléculas de ANic endógenas
adicionales que tienen homología de secuencia con la construcción
de ANic modificada químicamente.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic modificadas químicamente que median la iARN
en una célula o sistema reconstituido, en las que las modificaciones
químicas no afectan de forma significativa a la interacción de ANic
con una molécula de ARN, molécula de ADN y/o proteínas u otros
factores diana que son esenciales para la iARN de una manera que
disminuiría la eficacia de la iARN mediada por tales construcciones
de ANic.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic como se definen en las reivindicaciones, que
median la iARN en una célula o sistema reconstituido, en las que la
construcción de ANic comprende una o más modificaciones descritas
en el presente documento que modulan la captación celular de la
construcción de ANic.
En una realización, la invención ofrece
construcciones de ANic que median la iARN frente a un gen diana, en
las que la construcción de ANic comprende, como se define en las
reivindicaciones, modificaciones químicas descritas en el presente
documento que aumentan la biodisponibilidad de la construcción de
ANic, por ejemplo, uniendo conjugados poliméricos tales como
polietilenglicol o conjugados equivalentes que mejoran la
farmacocinética de la construcción de ANic, o uniendo conjugados
que se dirigen a tipos tisulares o tipos celulares específicos
in vivo. Se describen ejemplos no limitantes de tales
conjugados por Vargeese y col., Nº de Serie de los Estados Unidos
10/201.394 incorporado en el presente documento por referencia.
En una realización, la invención ofrece un
procedimiento para generar moléculas de ANic de la invención con
una biodisponibilidad mejorada, que comprende (a) introducir un
conjugado en la estructura de una molécula de ANic y (b) ensayar la
molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para
aislar moléculas de ANic que tienen una biodisponibilidad mejorada.
Tales conjugados pueden incluir ligandos para receptores celulares,
tales como péptidos obtenidos a partir de ligandos de proteínas de
origen natural; secuencias de localización de proteínas, incluyendo
secuencias de código postal celular; anticuerpos, aptámeros de ácido
nucleico; vitaminas y otros cofactores, tales como folato y
N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como
polietilenglicol (PEG), fosfolípidos, poliaminas, tales como
espermina o espermidina y otros.
En otra realización, la invención ofrece un
procedimiento para generar moléculas de ANic de la invención con
una biodisponibilidad mejorada que comprende (a) introducir una
formulación de excipiente en una molécula de ANic y (b) ensayar la
molécula de ANic de la etapa (a) en condiciones adecuadas para
aislar moléculas de ANic que tienen una biodisponibilidad mejorada.
Tales excipientes incluyen polímeros tales como ciclodextrinas,
lípidos, lípidos catiónicos, poliaminas, fosfolípidos y otros.
En otra realización, se puede unir
covalentemente polietilenglicol (PEG) a compuestos de ANic de la
presente invención. El PEG unido puede ser de cualquier peso
molecular, preferentemente de aproximadamente 2.000 a
aproximadamente 50.000 daltons (Da).
La presente invención se puede usar sola o como
un componente de un kit que tenga al menos uno de los reactivos
necesarios para llevar a cabo la introducción in vitro o
in vivo de ARN para ensayar muestras y/o sujetos. Por
ejemplo, los componentes preferidos del kit incluyen una molécula de
ANic de la invención y un vehículo que promueve la introducción del
ANic en células de interés como se describe en el presente documento
(por ejemplo, usando lípidos y otros procedimientos de transfección
conocidos en la técnica, véase por ejemplo Beigelman y col,
documento US 6.395.713). El kit se puede usar para validación de
diana, tal como para determinar la función y/o actividad génica o
en la optimización de fármacos y en descubrimiento de fármacos
(véase, por ejemplo Usman y col., USSN 60/402.996). Un kit de este
tipo también puede incluir instrucciones para permitir a un usuario
del kit poner en práctica la invención.
Las expresiones "ácido nucleico de
interferencia corto", "ANic", "ARN de interferencia
corto", "ARNic", "molécula de ácido nucleico de
interferencia corto", "molécula oligonucleotídica de
interferencia corta" o "molécula de ácido nucleico de
interferencia corto modificado químicamente", como se usan en el
presente documento, se refieren a cualquier molécula de ácido
nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión
génica o replicación viral, por ejemplo, por mediación de la
interferencia de ARN "iARN" o el silenciamiento génico de una
manera específica de secuencia; véase, por ejemplo Bass, 2001,
Nature, 411, 428-429; Elbashir y col., 2001,
Nature, 411, 494-498; y Kreutzer y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 00/44895; Zernicka-Goetz y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 01/36646; Fire,
Publicación Internacional PCT Nº WO 99/32619; Plaetinck y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 00/01846; Mello y Fire,
Publicación Internacional PCT Nº WO 01/29058;
Deschamps-Depaillette, Publicación Internacional PCT
Nº WO 99/07409; y Li y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819;
Volpe y col., 2002, Science, 297, 1833-1837;
Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall y
col., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y
Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus y col.,
2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart y col., 2002, Gene
& Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart y Bartel,
2002, Science, 297, 1831). Se muestran ejemplos no limitantes de
moléculas de ANic de la invención en las Figuras
4-6, y las Tablas II, III y IV en el presente
documento. Por ejemplo, el ANic puede ser una molécula
polinucleotídica bicatenaria que comprende regiones con sentido y
antisentido autocomplementarias, en la que la región antisentido
comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la
secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana o
una parte de la misma, y la región con sentido tiene una secuencia
de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico
diana o una parte de la misma. El ANic se puede ensamblar a partir
de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena
con sentido y la otra es la cadena antisentido, en el que las
cadenas antisentido y con sentido son autocomplementarias (es
decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es
complementaria a la secuencia de nucleótidos de la otra cadena; tal
como donde la cadena antisentido y la cadena con sentido forman un
dúplex o una estructura bicatenaria, por ejemplo, en la que la
región bicatenaria tiene aproximadamente 19 pares de bases); la
cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es
complementaria a la secuencia de nucleótidos de una molécula de
ácido nucleico diana o una parte de la misma, y la cadena con
sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la
secuencia de ácido nucleico diana o una parte de la misma. Como
alternativa, el ANic se ensambla a partir de un solo
oligonucleótido, donde las regiones con sentido y antisentido
autocomplementarias del ANic se unen por medio de un engarce o
engarces basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico.
El ANic puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria
de horquilla, que tiene regiones con sentido y antisentido
autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una
secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana separada o una
parte de la misma, y la región con sentido tiene una secuencia de
nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o
una parte de la misma. El ANic puede ser un polinucleótido
monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y
un tallo que comprende regiones con sentido y antisentido
autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una
secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana o una parte de
la misma, y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos
correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte
de la misma, y en la que el polinucleótido circular se puede
procesar in vivo o in vitro para generar una molécula
de ANic activa capaz de mediar la iARN. El ANic también puede
comprender un polinucleótido monocatenario que tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos en una
molécula de ácido nucleico diana o una parte de la misma (por
ejemplo, donde tal molécula de ANic no requiere la presencia dentro
de la molécula de ANic de una secuencia de nucleótidos
correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte
de la misma), en el que el polinucleótido monocatenario puede
comprender además un grupo fosfato terminal, tal como un
5'-fosfato (véase por ejemplo Martinez y col.,
2002, Cell., 110, 563-574 y Schwarz y col., 2002,
Molecular Cell, 10, 537-568), o un
5',3'-difosfato. En determinada realización, la
molécula de ANic de la invención comprende secuencias o regiones
con sentido y antisentido separadas, en la que las regiones con
sentido y antisentido están unidas covalentemente por moléculas de
engarce nucleotídicas o no nucleotídicas como se conocen en la
técnica o están unidas no covalentemente, y de manera alternativa,
mediante interacciones iónicas, puentes de hidrógeno, interacciones
de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de
apilamiento. En determinadas realizaciones, las moléculas de ANic
de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que es
complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En
otra realización, la molécula de ANic de la invención interacciona
con la secuencia de nucleótidos de un gen diana de una manera que
provoca la inhibición de la expresión del gen diana. Como se usan
en el presente documento, las moléculas de ANic no tienen que
limitarse a aquellas moléculas que contienen sólo ARN, sino que
además abarcan nucleótidos modificados químicamente y no
nucleótidos. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido
nucleico de interferencia corto de la invención carecen de
nucleótidos que contienen 2'-hidroxi
(2'-OH). El presentes solicitante describe en
determinadas realizaciones ácidos nucleicos de interferencia cortos
que no requieren la presencia de nucleótidos que tengan un grupo
2'-hidroxi para mediar la iARN y como tales, las
moléculas de ácido nucleico de interferencia corto de la invención
opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo,
nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Tales
moléculas de ANic que no requieren la presencia de ribonucleótidos
dentro de la molécula de ANic para apoyar la iARN pueden, sin
embargo, tener un engarce o engarces unidos u otros grupos, restos
o cadenas unidos o asociados que contengan uno o más nucleótidos con
grupos 2'-OH. Opcionalmente, las moléculas de ANic
pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20,
30, 40 o 50% de las posiciones de nucleótidos. Las moléculas de
ácido nucleico de interferencia corto modificadas de la invención
también se pueden denominar oligonucleótidos modificados de
interferencia cortos "OMic". Como se usa en el presente
documento, el término ANic tiene por objeto ser equivalente a otros
términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son
capaces de mediar la iARN específica de secuencia, por ejemplo ARN
de interferencia corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc),
micro-ARN (miARN), ARN de horquilla corto (ARNhc),
oligonucleótido de interferencia corto, ácido nucleico de
interferencia corto, oligonucleótido modificado de interferencia
corto, ARNic modificado químicamente, ARN de silenciamiento génico
postranscripcional (ARNsgpt) y otros. Adicionalmente, como se usa
en el presente documento, el término iARN tiene por objeto ser
equivalente a otros términos usados para describir interferencia de
ARN específica de secuencia, tales como silenciamiento génico
postranscripcional o epigenética. Por ejemplo, las moléculas de
ANic de la invención se pueden usar para silenciar epigenéticamente
genes a nivel tanto postranscripcional como a nivel
pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la regulación
epigenética de la expresión génica mediante moléculas de ANic de la
invención se puede obtener como resultado a partir de la
modificación mediada por ANic de la estructura de cromatina para
alterar la expresión génica (véase, por ejemplo, Allshire, 2002,
Science, 297, 1818-1819; Volpe y col., 2002,
Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science,
297, 2215-2218; y Hall y col., 2002, Science, 297,
2232-2237).
Por "nodular" se quiere significar que la
expresión del gen o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN
equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de
proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de
proteínas se regula positivamente o negativamente, de forma que la
expresión, el nivel o la actividad es mayor que o menor que el
observado en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término
"modular" puede significar "inhibir", pero el uso de la
palabra "modular" no está limitado a esta definición.
Por "inhibir" se quiere significar que la
actividad de un producto de expresión génica o nivel de ARN o ARN
equivalentes que codifican uno o más productos génicos se reduce por
debajo del observado en ausencia de la molécula de ácido nucleico
de la invención. En una realización, la inhibición con una molécula
de ANic preferentemente está por debajo de ese nivel observado en
presencia de una molécula inactiva o atenuada que no es capaz de
mediar una respuesta de iARN. En otra realización, la inhibición de
expresión génica con la molécula de ANic de la presente invención
es mayor en presencia de la molécula de ANic que en su ausencia.
Por "inhibir", "regular negativamente"
o "reducir", quieren significar que la expresión del gen o el
nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que
codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la
actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, está
reducida por debajo de la observada en ausencia de las moléculas de
ácido nucleico (por ejemplo, ANic) de la invención. En una
realización, la inhibición, regulación negativa o reducción con una
molécula de ANic es inferior a ese nivel observado en presencia de
una molécula inactiva o atenuada. En otra realización, la
inhibición, regulación negativa o reducción con moléculas de ANic
es inferior a ese nivel observado en presencia de, por ejemplo, una
molécula de ANic con secuencia desorganizada o con emparejamientos
erróneos. En otra realización, la inhibición, regulación negativa o
reducción de la expresión génica con una molécula de ácido nucleico
de la presente invención es mayor en presencia de la molécula de
ácido nucleico que en su ausencia.
Por "gen" o "gen diana" quieren
significar un ácido nucleico que codifica un ARN, por ejemplo,
secuencias de ácido nucleico que incluyen, pero sin limitación,
genes estructurales que codifican un polipéptido. El gen diana
puede ser un gen obtenido a partir de una célula, un gen endógeno,
un transgén o genes exógenos tales como genes de un patógeno, por
ejemplo, un virus, que está presente en la célula después de la
infección de la misma. La célula que contiene el gen diana se puede
obtener a partir de o estar contenida en cualquier organismo, por
ejemplo una planta, animal, protozoo, virus, bacteria u hongo. Los
ejemplos no limitantes de plantas incluyen monocotiledóneas,
dicotiledóneas o gimnospermas. Los ejemplos no limitantes de
animales incluyen vertebrados o invertebrados. Los ejemplos no
limitantes de hongos incluyen mohos o levaduras.
Por gen "endógeno" o "celular" quieren
significar un gen que se encuentra normalmente en una célula en su
localización natural en el genoma. Por ejemplo,
HER-2, VEGF, VEGF-R, EGFR,
BCL-2, c-MYC, RAS y similares se
considerarían un gen endógeno. Los genes expresados en una célula a
partir de un plásmido, vector viral u otros vectores o a partir de
virus, bacterias, hongos se considerarían genes "extraños" o
"heterólogos"; tales genes no se encuentran normalmente en la
célula huésped, sino que se introducen mediante técnicas de
transferencia génica convencionales o como resultado de una
infección por un virus, bacteria u otro agente infeccioso.
Por "familia de genes" se quiere significar
un grupo de más de una molécula de ácido nucleico que comparte al
menos una característica común, tal como homología de secuencia,
especificidad de diana, modo de acción, estructura secundaria o la
capacidad de modular un proceso o más de un proceso en un sistema
biológico. La familia de genes puede ser de origen viral o celular.
La familia de genes puede codificar, por ejemplo, grupos de
citocinas, receptores, factores de crecimiento, proteínas
adaptadoras, proteínas estructurales y otros epítopos de
proteína.
Por "familia de proteína" se quiere
significar un grupo de más de una proteína, péptido o polipéptido
que comparten al menos una característica común, tal como homología
de secuencia, especificidad de diana, modo de acción, estructura
secundaria o la capacidad de modular un proceso o más de un proceso
en un sistema biológico. La familia de proteínas puede ser de
origen viral o celular. La familia de proteínas puede codificar, por
ejemplo, grupos de citocinas, receptores, factores de crecimiento,
proteínas adaptadoras, proteínas estructurales y otros epítopos de
proteínas.
Por "región de secuencia altamente
conservada" se quiere significar una secuencia de nucleótidos de
una o más regiones en un gen diana que no varía significativamente
de una generación a la otra o de un sistema biológico al otro.
Por "cáncer" se quiere significar un grupo
de enfermedades caracterizadas por un crecimiento y propagación
descontrolada de células anormales.
"Región con sentido" significa una
secuencia de nucleótidos de una molécula de ANic que tiene
complementariedad con una región antisentido de la molécula de
ANic. Adicionalmente, la región con sentido de una molécula de ANic
puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene homología
con una secuencia de ácido nucleico diana.
Por "región antisentido" se quiere
significar una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANic que
tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico diana.
Adicionalmente, la región antisentido de una molécula de ANic puede
opcionalmente comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene
complementariedad con una región con sentido de la molécula de
ANic.
Por "ácido nucleico diana" se quiere
significar cualquier secuencia de ácido nucleico cuya expresión o
actividad se tiene que modular. El ácido nucleico diana puede ser
ADN o ARN.
Por "complementariedad" se quiere
significar que un ácido nucleico puede formar un enlace o enlaces de
hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante
Watson-Crick tradicional u otros tipos no
tradicionales. En referencia a las moléculas de ácido nucleico de
la presente invención, la energía libre de unión para una molécula
de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para
permitir que se desarrolle la función pertinente del ácido
nucleico, por ejemplo, la actividad de iARN. La determinación de las
energías libres de unión de moléculas de ácido nucleico se conoce
bien en la técnica (véase, por ejemplo, Turner y col., 1987, CSH
Symp. Quant. Biol. LII págs. 123-133; Frier y col.,
1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377;
Turner y col., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:
3783-3785). Un porcentaje de complementariedad
indica el porcentaje de restos contiguos en una molécula de ácido
nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo,
emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una
segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10
de 10 teniendo una complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y
100%). "Perfectamente complementario" significa que todos los
restos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán
mediante enlaces de hidrógeno con el mismo número de restos
contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico.
Las moléculas de ANic de la invención reofrecen
un enfoque terapéutico novedoso para una amplia variedad de
enfermedades y afecciones, incluyendo cáncer o enfermedad cancerosa,
enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular, enfermedad
neurológica, enfermedad priónica, enfermedad inflamatoria,
enfermedad autoinmune, enfermedad pulmonar, enfermedad renal,
enfermedad hepática, enfermedad mitocondrial, enfermedad endocrina,
enfermedades y afecciones relacionadas con la reproducción y
cualquier otro indicio que pueda responder al nivel de un producto
génico expresado en una célula u organismo.
En una realización de la presente invención,
cada secuencia de una molécula de ANic de la invención tiene
independientemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 24
nucleótidos de longitud, en realizaciones específicas
aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud.
En otra realización, los dúplex de ANic de la invención comprenden
independientemente de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 pares
de bases (por ejemplo, aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó
23). En otra realización más, las moléculas de ANic de la invención
que comprenden estructuras de horquilla o circulares tienen de
aproximadamente 35 a aproximadamente 55 (por ejemplo,
aproximadamente 35, 40, 45, 50 ó 55) nucleótidos de longitud o de
aproximadamente 38 a aproximadamente 44 (por ejemplo, 38, 39, 40,
41, 42, 43 ó 44) nucleótidos de longitud y comprenden de
aproximadamente 16 a aproximadamente 22 (por ejemplo,
aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22) pares de bases. Se
muestran moléculas de ANic ilustrativas de la invención en la Tabla
II. Se muestran moléculas de ANic sintéticas ilustrativas de la
invención en la Tabla I y/o en las Figuras
18-19.
Como se usa en el presente documento,
"célula" se usa en su sentido biológico habitual y no se
refiere a un organismo multicelular completo, por ejemplo, no se
refiere específicamente a un ser humano. La célula puede estar
presente como un organismo, por ejemplo, aves, plantas y mamíferos
tales como seres humanos, vacas, ovejas, simios, monos, cerdos,
perros y gatos. La célula puede ser procariota o eucariota (por
ejemplo, célula de mamífero o vegetal). La célula puede ser de
origen somático o de línea germinal no humana, totipotente o
pluripotente, con capacidad de división o sin capacidad de división.
La célula también se puede obtener a partir de o puede comprender
un gameto no humano o un embrión no humano, una célula madre excepto
una célula ES humana, o una célula completamente diferenciada.
Las moléculas de ANic de la invención se añaden
directamente, o pueden formar complejos con lípidos catiónicos,
empaquetarse dentro de liposomas o suministrarse de otra manera a
células o tejidos diana. El ácido nucleico o los complejos de ácido
nucleico se pueden administrar localmente a los tejidos pertinentes
ex vivo o in vivo a través de inyección, bomba de
infusión o endoprótesis vascular, con o sin su incorporación en
biopolímeros. En realizaciones particulares, las moléculas de ácido
nucleico de la invención comprenden secuencias mostradas en las
Tablas I-II y/o en las Figuras
18-19. Los ejemplos de tales moléculas de ácido
nucleico consisten básicamente en secuencias definidas en estas
tablas y figuras. Adicionalmente, las construcciones modificadas
químicamente descritas en la Tabla IV se pueden aplicar a cualquier
secuencia de ANic de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona
células de mamífero que contienen una o más moléculas de ANic de la
presente invención. La una o más moléculas de ANic pueden dirigirse
independientemente al mismo sitio o a sitios diferentes.
Por "ARN" se quiere significar una molécula
que comprende al menos un resto de ribonucleótido.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido con un grupo
hidroxilo en la posición 2' de un resto de
\beta-D-ribofuranosa. Los
términos incluyen ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado
tal como ARN purificado parcialmente, ARN esencialmente puro, ARN
sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN
alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición,
deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales
alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico,
tal como al extremo o extremos del ANic o internamente, por ejemplo
en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas
de ARN de la presente invención también pueden comprender
nucleótidos no convencionales, tales como nucleótidos de origen no
natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente.
Estos ARN alterados se pueden denominar análogos o análogos de ARN
de origen natural.
Por "sujeto" se quiere significar un
organismo, que es un donante o receptor de células explantadas o las
propias células. "Sujeto" también se refiere a un organismo al
que se pueden administrar las moléculas de ácido nucleico de la
invención. En una realización, un sujeto es un mamífero o células de
mamífero. En otra realización, un sujeto es un ser humano o células
humanas.
El término "fosforotioato", como se usa en
el presente documento, se refiere a enlaces internucleotídicos
tanto de fosforotioato como de fosforoditioato.
La expresión "base universal", como se usa
en el presente documento, se refiere a análogos de bases de
nucleótidos que forman pares de bases con cada una de las bases de
ADN/ARN naturales con escasa discriminación entre las mismas. Los
ejemplos no limitantes de bases universales incluyen
C-fenilo, C-naftilo y otros
derivados aromáticos, inosina, azol carboxamidas y derivados de
nitroazol tales como 3-nitropirrol,
4-nitroindol, 5-nitroindol y
6-nitroindol como se conocen en la técnica (véase,
por ejemplo, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29,
2437-2447).
La expresión "nucleótido acíclico" como se
usa en el presente documento, se refiere a cualquier nucleótido que
tiene un azúcar de ribosa acíclica, por ejemplo, donde cualquiera de
los carbonos de ribosa (C1, C2, C3, C4 o C5) están ausentes del
nucleótido independientemente o en combinación.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención, individualmente, o en combinación o junto con otros
fármacos, se pueden usar para tratar enfermedades o afecciones
analizadas en el presente documento. Por ejemplo, para tratar una
enfermedad o afección particular, las moléculas de ANic se pueden
administrar a un sujeto o se pueden administrar a otras células
apropiadas evidentes para los expertos en la materia,
individualmente o en combinación con uno o más fármacos en
condiciones adecuadas para el tratamiento.
En una realización adicional, las moléculas de
ANic se pueden usar en combinación con otros tratamientos conocidos
para tratar afecciones o enfermedades analizadas anteriormente. Por
ejemplo, las moléculas descritas se podrían usar en combinación con
uno o más agentes terapéuticos para tratar una enfermedad o
afección. Los ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticos
que se pueden combinar fácilmente con una molécula de ANic de la
invención son moléculas de ácido nucleico enzimáticas, moléculas de
ácido nucleico alostéricas, moléculas de ácido nucleico
antisentido, señuelo o aptámero, anticuerpos tales como anticuerpos
monoclonales, moléculas pequeñas y otros compuestos orgánicos y/o
inorgánicos incluyendo metales, sales e iones.
En otra realización, la invención presenta una
célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana, que incluye un
vector de expresión de la invención.
En otro aspecto de la invención, las moléculas
de ARNic que interaccionan con moléculas de ARN diana y regulan
negativamente moléculas de ARN diana que codifican genes (por
ejemplo, moléculas de ARN diana a las que se hace referencia
mediante el número de Acceso de Genbank en la Tabla III) se expresan
a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN
o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser vectores de ADN
plasmídicos o virales. Los vectores virales que expresan ANic se
pueden construir en base a, pero sin limitación, virus
adenoasociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Los vectores
recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANic se pueden
suministrar como se ha descrito en el presente documento y persistir
en células diana. Como alternativa, se pueden usar vectores virales
que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ANic.
Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea
necesario. Una vez expresadas, las moléculas de ANic se unen y
regulan negativamente la función génica o la expresión a través de
interferencia de ARN (iARN). El suministro de vectores de expresión
de ANic puede ser sistémico, tal como mediante administración
intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana
sometidas a explante a partir de un sujeto, seguida de la
reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que
permitiera la introducción en la célula diana deseada.
Por "vectores" quiere significar cualquier
técnica basada en ácido nucleico y/o en virus para suministrar un
ácido nucleico deseado.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas de la misma, y a partir de las
reivindicaciones.
La Figura 1 muestra un ejemplo no limitante de
un esquema para la síntesis de moléculas de ANic. Las cadenas de
secuencia de ANic complementarias, cadena 1 y cadena 2, se
sintetizan en tándem y están conectadas por un enlace escindible,
tal como un succinato de nucleótido o un succinato abásico, que
puede ser el mismo o diferente del engarce escindible usado para la
síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido. La síntesis puede
ser en fase sólida o en fase de solución, en el ejemplo mostrado, la
síntesis es una síntesis en fase sólida. La síntesis se realiza de
manera que un grupo protector, tal como un grupo dimetoxitritilo,
permanece intacto sobre el nucleótido terminal del oligonucleótido
en tándem. Después de la escisión y desprotección del
oligonucleótido, las dos cadenas de ANic hibridan espontáneamente
para formar un dúplex de ANic, que permite la purificación del
dúplex utilizando las propiedades del grupo protector terminal, por
ejemplo aplicando un procedimiento de purificación sobre tritilo en
el que solamente se aíslan los dúplex/oligonucleótidos con el grupo
protector terminal.
La Figura 2 muestra un espectro de masas
MALDI-TOV de un dúplex de ANic purificado
sintetizado por un procedimiento de la invención. Los dos picos
mostrados corresponden a la masa esperada de las cadenas de
secuencia de ANic separadas. Este resultado demuestra que el dúplex
de ANic generado a partir de la síntesis en tándem puede
purificarse como una sola entidad usando una metodología de
purificación sobre tritilo simple.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo
de estabilidad usado para determinar la estabilidad en suero de las
construcciones de ANic químicamente modificadas en comparación con
un control de ANic que consiste en todo el ARN con terminaciones
3'-TT. Se muestran los valores de T ½ para la
estabilidad del dúplex.
La Figura 4 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas con fosforotioato usando un sistema indicador de
luciferasa.
La Figura 5 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas con fosforotioato y una base universal usando un
sistema indicador de luciferasa.
La Figura 6 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas con 2'-O-metilo usando
un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 7 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas con 2'-O-metilo y
2'-desoxi-2'-fluoro
usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 8 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de una construcción de ANic
modificada con fosforotioato usando un sistema indicador de
luciferasa.
La Figura 9 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de una construcción de ANic con
modificaciones abásicas desoxi invertidas generada mediante síntesis
en tándem usando un sistema indicador de luciferasa.
La Figura 10 muestra el resultado de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas que incluyen construcciones de ANic
modificadas con 3'-glicerilo en comparación con una
construcción de ANic de control todo de ARN usando un sistema
indicador de luciferasa. Estos ANic químicamente modificados se
compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente
documento a una concentración 1 nM y 10 nM usando un control de
ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en
células HeLa se indica por la columna "células". Las cadenas
con sentido y antisentido de construcciones de ANic químicamente
modificadas se muestran mediante el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos
números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 11 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas. La exploración comparó diversas
combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y
modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic
químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de
luciferasa en las células HeLa se indica mediante la columna
"células". Las cadenas con sentido y antisentido de las
construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el
número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias
correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 12 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas. La exploración comparó diversas
combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y
modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic
químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de
luciferasa en las células HeLa se indica mediante la columna
"células". Las cadenas con sentido y antisentido de las
construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el
número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias
correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
Además, la cadena antisentido en solitario (RPI 30430) y un control
invertido (RPI 30227/30229, que tiene la misma química que RPI
30063/30224) se comparó con los dúplex de ANic descritos
anteriormente.
La Figura 13 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas. La exploración comparó diversas
combinaciones de modificaciones químicas de cadenas con sentido y
modificaciones químicas de cadenas antisentido. Estos ANic
químicamente modificados se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
control invertido (Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de
luciferasa en las células HeLa se indica por la columna
"células". Las cadenas con sentido y antisentido de las
construcciones de ANic químicamente modificadas se muestran por el
número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las secuencias
correspondientes a estos números RPI se muestran en la Tabla I.
Además, un control invertido (RPI 30226/30229, que tiene la misma
química que RPI 30222/30224) se comparó con los dúplex de ANic
descritos anteriormente.
La Figura 14 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas que incluyen diversas construcciones de
ANic modificadas en posición 3'-terminal en
comparación con una construcción de ANic de control toda de ARN
usando un sistema indicador de luciferasa. Estos ANic químicamente
modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el
presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un
control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las
células HeLa se indica mediante la columna "células". Las
cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic
químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a
estos números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 15 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
químicamente modificadas. La exploración comparó diversas
combinaciones de química de cadena con sentido en comparación con
una química de cadena antisentido fija. Estos ANic químicamente
modificados se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el
presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un
control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). El nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las
células HeLa se indica mediante la columna "células". Las
cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic
químicamente modificadas se muestran por el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos
números RPI se muestran en la Tabla I.
La Figura 16 muestra los resultados de un
estudio de titulación de ANic, en el que la actividad de iARN de
una construcción de ANic modificada con fosforotioato se compara con
la de una construcción de ANic que consiste en todo ribonucleótidos
excepto por dos restos timidina terminales usando un sistema
indicador de luciferasa.
La Figura 17 muestra una representación
mecanística propuesta no limitante de la degradación del ARN diana
implicado en la iARN. El ARN bicatenario (ARNbc), que se genera por
la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) a partir de ARN
monocatenario extraño, por ejemplo ARN viral, transponible u otro
ARN exógeno, activa la enzima DICER que a su vez genera dúplex de
ANic. De manera alternativa, el ANic sintético o expresado puede
introducirse directamente en una célula por medios apropiados. Se
forma un complejo de ANic activo que reconoce un ARN diana, dando
como resultado la degradación del ARN diana por el complejo de
endonucleasa RISC o en la síntesis de ARN adicional mediante la ARN
polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar DICER y dar
como resultado moléculas de ANic adicionales, amplificando por lo
tanto la respuesta de iARN.
La Figura 18A-F muestra ejemplos
no limitantes de construcciones de ANic químicamente modificadas de
la presente invención. En la Figura, N representa cualquier
nucleótido (adenosina, guanosina, citosina, uridina u opcionalmente
timidina, por ejemplo la timidina puede sustituirse en las regiones
salientes indicadas entre paréntesis (N N). Se muestran diversas
modificaciones para las cadenas con sentido y antisentido de las
construcciones de ANic.
Figura 18A: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos que tienen cuatro enlaces internucleotídicos
fosforotioato 5'- y 3'-terminales, en la que los
dos nucleótidos 3'-terminales están opcionalmente
formando pares de bases y en la que todos los nucleótidos de
pirimidina que puedan estar presentes son nucleótidos modificados
con 2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento. La
cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente
tienen un resto glicerilo 3'-terminal y en la que
los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente
complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace
internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal y
cuatro enlaces internucleotídicos de fosforotioato
5'-terminales, y en la que todos los nucleótidos de
pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados
con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones descritas en el presente documento.
Figura 18B: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos en los que los dos nucleótidos
3'-terminales están opcionalmente formando pares de
bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden
estar presentes son nucleótidos modificados con
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento. La
cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente
tienen un resto glicerilo 3'-terminal y en la que
los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente
complementarios a la secuencia de ARN diana, y en la que todos los
nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos
modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18C: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y
3'-terminales, en la que los dos nucleótidos
3'-terminales están opcionalmente formando pares de
bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden
estar presentes son nucleótidos modificados con
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento. La
cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que tiene
opcionalmente un resto glicerilo 3'-terminal y, en
la que los dos nucleótidos 3'-terminales son
opcionalmente complementarios con la secuencia de ARN diana, y que
tiene un enlace internucleotídico de fosforotioato
3'-terminal, y en la que todos los nucleótidos de
pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados
con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento.
Figura 18D: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y
3'-terminales, en la que los dos nucleótidos
3'-terminales están opcionalmente formando pares de
bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden
estar presentes son nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento, y en la
que todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son
2'-desoxi nucleótidos. La cadena antisentido
comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente tiene un resto
glicerilo 3'-terminal, y en la que los dos
nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente
complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace
internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal, y
en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar
presentes son nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son
nucleótidos modificados con
2'-O-metilo excepto por los (N N)
nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos,
desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones
químicas descritas en el presente documento.
Figura 18E: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y
3'-terminales en la que los dos nucleótidos
3'-terminales están opcionalmente formando pares de
bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden
estar presentes son nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento. La
cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente
tienen un resto glicerilo 3'-terminal y en la que
los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente
complementarios a la secuencia de ARN diana, y en la que todos los
nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son
nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son
nucleótidos modificados con
2'-O-metilo, excepto por los (N N)
nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos,
desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones químicas
descritas en el presente documento.
Figura 18F: La cadena con sentido comprende 21
nucleótidos que tienen restos protectores 5'- y
3'-terminales en la que los dos nucleótidos
3'-terminales están opcionalmente formando pares de
bases y en la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden
estar presente son nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
excepto por los (N N) nucleótidos, que pueden comprender
ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales u otras
modificaciones químicas descritas en el presente documento. La
cadena antisentido comprende 21 nucleótidos, que opcionalmente
tienen un resto glicerilo 3'-terminal, y en la que
los dos nucleótidos 3'-terminales son opcionalmente
complementarios a la secuencia de ARN diana, y que tienen un enlace
internucleotídico de fosforotioato 3'-terminal y en
la que todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar
presentes son nucleótidos modificados con
2'-desoxi-2'-fluoro
y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son
nucleótidos modificados con 2'-desoxi excepto por
los (N N) nucleótidos, que pueden comprender ribonucleótidos,
desoxinucleótidos, bases universales u otras modificaciones
químicas descritas en el presente documento. La cadena antisentido
de las construcciones A-F comprende
complementariedad de secuencia con la secuencia de ARN diana de la
presente invención.
La Figura 19 muestra ejemplos no limitantes de
secuencias de ANic específicas químicamente modificadas de la
presente invención. A-F aplica las modificaciones
químicas descritas en las Figuras 18A-F a una
secuencia de ANic representativa que se dirige a EGFR (HER1).
La Figura 20 muestra ejemplos no limitantes de
diferentes construcciones de ANic de la presente invención. Los
ejemplos mostrados (construcciones 1, 2 y 3) tienen 19 pares de
bases representativas, sin embargo, las diferentes realizaciones de
la invención incluyen cualquier número de pares de bases descrito en
el presente documento. Las regiones entre paréntesis representan
salientes de nucleótidos, que comprenden por ejemplo entre
aproximadamente 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud, preferentemente
aproximadamente 2 nucleótidos. Las construcciones 1 y 2 pueden
usarse independiente para la actividad de iARN. La construcción 2
puede comprender un engarce polinucleotídico o no nucleotídico, que
opcionalmente puede diseñarse como un engarce biodegradable. En una
realización, la estructura en bucle mostrada en la construcción 2
puede comprender un engarce biodegradable que da como resultado la
formación de la construcción 1 in vivo y/o in vitro.
En otro ejemplo, la construcción 3 puede usarse para generar la
construcción 2 de acuerdo con el mismo principio en el que se usa
un engarce para generar la construcción 2 de ANic activo in
vivo y/o in vitro, que opcionalmente puede utilizar otro
engarce biodegradable para generar la construcción 1 de ANic activo
in vivo y/o in vitro. Como tal, la estabilidad y/o
actividad de las construcciones de ANic puede modularse en base al
diseño de la construcción de ANic para su uso in vivo o
in vitro y/o in vitro.
La Figura 21 es una representación esquemática
de un procedimiento usado para determinar sitios diana para la iARN
mediada por ANic dentro de una secuencia de ácido nucleico diana
particular, tal como ARN mensajero. (A) Se sintetizan un conjunto
de oligonucleótidos de ANic en los que la región antisentido de las
construcciones de ANic tiene complementariedad con sitios diana en
la secuencia de ácido nucleico diana, y en los que la región con
sentido comprende una secuencia complementaria a la región
antisentido del ANic. (B) Las secuencias se usan para transfectar
células. (C) Las células se seleccionan en base a cambios
fenotípicos que están asociados con la modulación de la secuencia
de ácido nucleico diana. (D) El ANic se aísla a partir de las
células seleccionadas y se secuencia para identificar sitios diana
eficaces dentro de la secuencia de ácido nucleico diana.
Figura 22 muestra ejemplos no limitantes de
diferentes químicas de estabilización (1-10) que
pueden usarse, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de
secuencias de ANic de la presente invención, incluyendo (1)
desoxirribosa [3-3']-invertida; (2)
desoxirribonucleótido; (3)
[5'-3']-3'-desoxirribonucleótido;
(4) [5'-3']-ribonucleótido; (5)
[5'-3']-3'-O-metil
ribonucleótido; (6) 3'-glicerilo; (7)
[3'-5']-3'-desoxirribonucleótido;
(8) [3'-3']-desoxirribonucleótido;
(9) [5'-2']-desoxirribonucleótido; y
(10) [5-3]-desoxirribonucleótido.
Además de las químicas de cadena principal modificadas y no
modificadas indicadas en la Figura, estas químicas pueden combinarse
con diferentes modificaciones de cadena principal como se describe
en el presente documento. Además, el 2'-desoxi
nucleótido que se muestra 5' a las modificaciones terminales puede
ser otro nucleótido modificado o no modificado descrito en el
presente documento.
La Figura 23 muestra un ejemplo no limitante de
la inhibición mediada por ANic de la angiogénesis inducida por VEGF
usando el modelo de angiogénesis corneal de rata. El sitio de
dirección de ANic 2340 del ARN de VEGFR1 (mostrado como Nº RPI de
cadena con sentido/cadena antisentido) se comparó con controles
invertidos (mostrados como Nº RPI de cadena con sentido/cadena
antisentido) a tres concentraciones diferentes y se comparó con un
control de VEGF en el que no se administró ANic.
La Figura 24 muestra un ejemplo no limitante de
una estrategia usada para identificar construcciones de ANic
químicamente modificadas de la presente invención que sean
resistentes a nucleasa, conservando al mismo tiempo la capacidad
para mediar la actividad de iARN. Se introducen modificaciones
químicas en la construcción de ANic en base a parámetros de diseño
fundamentados (por ejemplo, introducción de modificaciones 2',
modificaciones de bases, modificaciones de cadena principal,
modificaciones de protección terminal, etc.). La construcción
modificada se ensaya en un sistema apropiado (por ejemplo, suero
humano para resistencia a nucleasa, mostrado, o un modelo animal
para parámetros de PK/suministro). En paralelo, la construcción de
ANic se ensaya para determinar la actividad de iARN, por ejemplo en
un sistema de cultivo celular tal como un ensayo de indicador de
luciferasa). Después se identifican las construcciones de ANic
candidatas que poseen una característica particular manteniendo al
mismo tiempo la actividad de iARN, y pueden modificarse
adicionalmente y ensayarse una vez más. Puede usarse este mismo
enfoque para identificar moléculas conjugadas con ANic con perfiles
farmacocinéticos, suministro y actividad de iARN mejorados.
La Figura 25 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de HER2 en células A549 mediada por ANic
modificados químicamente y basados en ARN que se dirigen a los
sitios 2344 y 3706 del ARNm de HER2. Se transfectaron células A549
con 4 \mug/ml de lípidos en complejo con ANic no modificados 25 nM
con una protección de ditimidina 3'-terminal (RPI
nº 28266/28267) o un control invertido correspondiente (RPI nº
28268/28269) para el sitio 2344 y (RPI nº 28262/28263) y un control
invertido correspondiente (RPI 28264/28265) para el sitio 3706.
Además, se transfectaron células A549 con 4 \mug/ml de lípido en
complejo con ANic modificado a 25 nM (RPI nº 30442/30443) y un
control emparejado correspondiente (RPI nº 30444/30445) para el
sitio 2344 y (RPI nº 30438/30439) y un control emparejado
correspondiente (RPI 30440/30441) para el sitio 3706. Como se
muestra en las Figuras, todas las construcciones modificadas y no
modificadas dirigidas a los sitios 2344 y 3706 demuestran una
inhibición significativa de la expresión del ARN de HER2.
La Figura 26 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de PKC-alfa en células A549
mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de
PKC-alfa. Se transfectaron células A549 con 0,25
\mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una
exploración de construcciones de ANic que comprendían
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales con células no tratadas,
construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y
Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, todas las
construcciones de ANic mostraron una reducción significativa de la
expresión de ARN de PKC-alfa.
La Figura 27 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de Myc (c-Myc) en células 293T
mediada por los ANic químicamente modificados que se dirigen al
ARNm de c-Myc. Se transfectaron células 293T con
0,25 \mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se
comparó una exploración de construcciones de ANic que comprendían
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales con células no tratadas,
construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y
Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, tres de las
construcciones de ANic (RPI 30993/31069; RPI 30995/31071 y RPI
30996/31072) mostraron una reducción significativa de la expresión
del ARN de c-Myc.
La Figura 28 muestra un ejemplo no limitante de
reducción del ARNm de BCL2 en células A549 mediada por ANic
químicamente modificados que se dirigen al ARNm de BCL2. Se
transfectaron células A549 con 0,25 \mug/pocillo de lípido en
complejo con ANic 25 nM. Se ensayó una construcción de ANic que
comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 30998/3031074) junto con una
construcción de ANic químicamente modificado que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, y en la que la cadena con
sentido del ANic se modifica adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprende un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31368/31369) que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31370/31371) y una construcción de ANic químicamente modificada
que comprende nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y
2'-desoxi-2'-fluoro
purina, en la que la cadena con sentido del ANic se modifica
adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y
3'-terminales y la cadena antisentido comprende un
enlace internucleotídico de fosforotioato
3'-terminal (RPI nº 31372/31373) que también se
comparó con un control invertido de la misma química (RPI nº
31374/31375). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg.
2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, las construcciones de
ANic muestran reducción significativa de la expresión del ARN de
BCL2 en comparación con controles desorganizados, no tratados y de
transfección.
La Figura 29 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de CHK-1 en células A549
mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de
CHK-1. Se transfectaron células A549 con 0,25
\mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una
construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones
de ditimidina 3'-terminales (RPI nº 31003/31079) y
una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con
sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y en
el que la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico
de fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31302/31303),
con un control invertido de la misma química (RPI nº 31314/31325).
Además, las construcciones de ANic también se compararon con
células no tratadas, células transfectadas con lípido y
construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y
células transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic mostraron
una reducción significativa de la expresión del ARN de
CHK-1 en comparación con controles apropiados.
La Figura 30 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de BACE en células A549 mediada por ANic que
se dirigen al ARNm de BACE. Se transfectaron células A549 con 0,25
\mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una
exploración de construcciones de ANic que comprendían
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales con células no tratadas,
construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y
Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, todas las
construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la
expresión del ARN de
BACE.
BACE.
La Figura 31 muestra un ejemplo no limitante de
reducción del ARNm de ciclina D1 en células A549 mediada por ANic
químicamente modificados que se dirigen al ARNm de la ciclina D1. Se
transfectaron células A549 con 0,25 \mug/pocillo de lípido en
complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que
comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 31009/31085) con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con
sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31304/31305) que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31316/31317). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg.
2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de
ANic muestran una reducción significativa de la expresión del ARN
de ciclina D1.
La Figura 32 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de PTP-1B en células A549
mediada por ANic químicamente modificados que se dirigen al ARNm de
PTP-1B. Se transfectaron células A549 con 0,25
\mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una
construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos y protecciones
de ditimidina 3'-terminales (RPI nº 31018/31307) con
una construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con
sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31306/31307), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31318/31319). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido
y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y
células transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic muestran
una reducción significativa de la expresión del ARN de
PTP-1B.
La Figura 33 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de ERG2 en células DLD1 mediada por ANic que
se dirigen al ARNm de ERG2. Se transfectaron células DLD1 con 0,25
\mug/pocillo de lípido en complejo con ANic 25 nM. Se comparó una
exploración de construcciones de ANic que comprendían
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales con células no tratadas,
construcciones de control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y
Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, todas las
construcciones de ANic muestran una reducción significativa de la
expresión del ARN de
ERG2.
ERG2.
La Figura 34 muestra un ejemplo no limitante de
la reducción del ARNm de PCNA en células A549 mediada por ANic
químicamente modificados que se dirigen al ARNm de PCNA. Se
transfectaron células A549 con 0,25 \mug/pocillo de lípido en
complejo con ANic 25 nM. Se comparó una construcción de ANic que
comprendía ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 31035/31111) con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con
sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31310/31311), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31322/31323). Además, también se compararon las construcciones
de ANic con células no tratadas, células transfectadas con lípido y
construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y
células transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic mostraron
una reducción significativa de la expresión del ARN de PCNA.
La siguiente discusión analiza el mecanismo
propuesto de interferencia de ARN mediada por ARN de interferencia
corto como se conoce actualmente, y no tiene por objeto ser
limitante ni es una admisión de técnica anterior. El solicitante
demuestra en el presente documento que los ácidos nucleicos de
interferencia cortos modificados químicamente poseen una capacidad
similar o mejorada para mediar la iARN que las moléculas de ARNic, y
se espera que posean una estabilidad y actividad mejoradas in
vivo; por lo tanto, esta discusión no tiene por objeto
limitarse únicamente al ARNic y se puede aplicar a los ANic en su
totalidad. "Capacidad mejorada para mediar la iARN" o
"actividad de iARN mejorada" tienen por objeto incluir la
actividad de iARN medida in vitro y/o in vivo, donde
la actividad de iARN es un reflejo tanto de la capacidad del ANic
para mediar la iARN como de la estabilidad de los ANic de la
invención. En la presente invención, el producto de estas
actividades puede estar aumentado in vitro y/o in vivo
en comparación con un ARNic todo de ARN o un ANic que contiene una
pluralidad de ribonucleótidos. En algunos casos, la actividad o
estabilidad de la molécula de ANic puede estar disminuida (es
decir, menos de diez veces), pero la actividad global de la
molécula de ANic está aumentada in vitro y/o in
vivo.
La interferencia de ARN se refiere al
procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional específico
de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia cortos
(ARNic) (Fire y col., 1998, Nature, 391, 806). El procedimiento
correspondiente en plantas se denomina comúnmente silenciamiento
génico postranscripcional o silenciamiento de ARN y también se hace
referencia al mismo como supresión en hongos. El procedimiento de
silenciamiento génico postranscripcional se cree que es un mecanismo
de defensa celular conservado de manera evolutiva usado para evitar
la expresión de genes extraños que comparten comúnmente flora y
filos diversos (Fire y col., 1999, Trends Genet., 15, 358).
Dicha protección frente a la expresión de genes extraños puede
haber evolucionado como respuesta a la producción de ARN
bicatenarios (ARNbc) derivados de una infección viral o de la
integración aleatoria de elementos transponibles en un genoma
huésped mediante una respuesta celular que destruye específicamente
ARN monocatenario homólogo o ARN genómico viral. La presencia de
ARNbc en células desencadena la respuesta de iARN a través de un
mecanismo que aún tiene que caracterizarse completamente. Este
mecanismo parece ser diferente de la respuesta de interferón que se
produce como resultado de la activación mediada por ARNbc de la
proteína quinasa PKR y 2',5'-oligoadenilato
sintetasa, dando como resultado una escisión inespecífica del ARNm
por la ribonucleasa L.
La presencia de ARNbc largos en células estimula
la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada Dicer. La
Dicer está implicada en el procesamiento de los ARNbc en trozos
cortos de ARNbc conocidos como ARN de interferencia cortos (ARNic)
(Berstein y col., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN de interferencia
cortos derivados de la actividad de Dicer típicamente tienen de
aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y
comprenden dúplex de aproximadamente 19 pares de bases. También se
ha implicado a Dicer en la escisión de ARN temporales pequeños
(ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos a partir de ARN precursor de
estructura conservada que están implicados en el control
traduccional (Hutvagner y col., 2001, Science, 293, 834). La
respuesta de iARN también presenta un complejo de endonucleasa,
denominado comúnmente complejo de silenciamiento inducido por ARN
(RISC), que media la escisión de ARN monocatenario que tiene una
secuencia homóloga a la del ARNic. La escisión del ARN diana tiene
lugar en el centro de la región complementaria a la secuencia de
guía del dúplex de ARNic (Elbashir y col., 2001, Genes Dev., 15,
188). Además, la interferencia de ARN también puede implicar
silenciamiento génico mediado por ARN pequeño (por ejemplo,
micro-ARN o miARN), presumiblemente a través de
mecanismos celulares que regulan la estructura de cromatina y de ese
modo evitan la transcripción de secuencias génicas diana (véase,
por ejemplo, Allshire, 2002, Science, 297,
1818-1819; Volpe y col., 2002, Science, 297,
1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297,
2215-2218; y Hall y col., 2002, Science, 297,
2232-2237). Como tal, las moléculas de ANic de la
presente invención se pueden usar para mediar el silenciamiento
génico a través de la interacción con transcritos de ARN o, como
alternativa, mediante la interacción con secuencias génicas
particulares, en las que tal interacción da como resultado el
silenciamiento génico a nivel transcripcional o a nivel
postranscrip-
cional.
cional.
La iARN se ha estudiado en una diversidad de
sistemas. Fire y col., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros
en observar la iARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999,
Nature Cell Biol., 2, 70, describen la iARN mediada por ARNbc en
embriones de ratón. Hammond y col., 2000, Nature, 404, 293,
describen la iARN en células de Drosophila transfectadas con
ARNbc. Elbashir y col., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN
inducida introduciendo dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos
en células de mamífero cultivadas incluyendo células embrionarias
de riñón humano y células HeLa. Trabajos recientes en lisados
embrionarios de Drosophila han revelado determinados requisitos de
longitud, estructura, composición química y secuencia de ARNic que
son esenciales para mediar una actividad de iARN eficaz. Estos
estudios han demostrado que los dúplex de ARNic de 21 nucleótidos
son más activos cuando contienen dos salientes dinucleotídicos
3'-terminales. Además, la sustitución completa de
una o ambas cadenas de ARNic con nucleótidos
2'-desoxi o
2'-O-metilo suprime la actividad de
iARN, mientras que se demostró que se toleraba la sustitución de
los nucleótidos de ARNic 3'-terminales con
nucleótidos desoxi. También se demostró que secuencias con un
emparejamiento erróneo en el centro del dúplex de ARNic suprimían
la actividad de iARN. Además, estos estudios también indican que la
posición del sitio de escisión en el ARN diana está definida por el
extremo 5' de la secuencia guía de ARNic en lugar del extremo 3' de
la secuencia guía (Elbashir y col., 2001, EMBO J., 20, 6877). Otros
estudios han indicado que es necesario un fosfato 5' en la cadena
complementaria diana de un dúplex de ARNic para la actividad del
ARNic y que, para mantener el resto fosfato 5' en el ARNic, se
utiliza ATP (Nykanen y col., 2001, Cell, 107, 309).); sin embargo,
las moléculas de ARNic que carecen de un fosfato 5' son activas
cuando se introducen de forma exógena, sugiriendo que la
fosforilación 5' de construcciones de ARNic puede ocurrir
in vivo.
in vivo.
La síntesis de ácidos nucleicos de una longitud
superior a 100 nucleótidos es difícil usando procedimientos
automáticos y el coste terapéutico de dichas moléculas es
prohibitivo. En la presente invención, en motivos de ácidos
nucleicos pequeños, "pequeños" se refiere a motivos de ácido
nucleico no superiores a 100 nucleótidos de longitud,
preferentemente no superiores a 80 nucleótidos de longitud y, más
preferentemente, no superiores a 50 nucleótidos de longitud; por
ejemplo, se usan preferentemente para suministro exógeno secuencias
oligonucleotídicas de ANic individuales o secuencias de ANic
sintetizados en tándem. La estructura simple de estas moléculas
aumenta la capacidad del ácido nucleico para invadir regiones diana
de estructura de ARN y/o proteína. Las moléculas ejemplares de la
presente invención se sintetizan químicamente y otras pueden
sintetizarse de manera similar.
Los oligonucleótidos (por ejemplo, determinados
oligonucleótidos modificados o partes de oligonucleótidos que
carecen de ribonucleótidos) se sintetizan usando protocolos
conocidos en la técnica, por ejemplo como describen Caruthers y
col., 1992, en Methods in Enzymology 211, 3-19,
Thompson y col., en la Publicación Internacional PCT Nº WO
99/54459, Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23,
2677-2684, Wincott y col., 1997, Methods Mol. Bio.,
74, 59, Brennan y col., 1998, Biotechnol Bioeng., 61,
33-45, y Brennan, Patente de Estados Unidos Nº
6.001.311. Todas estas referencias se incorporan en el presente
documento por referencia. Las síntesis de oligonucleótidos hace uso
de grupos de protección y acoplamiento de ácidos nucleicos comunes,
tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el
extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se realizan síntesis a
pequeña escala en un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc.
usando un protocolo a escala 0,2 \mumol con una etapa de
acoplamiento de 2,5 min para nucleótidos
2'-O-metilados y una etapa de
acoplamiento de 45 segundos para 2'-desoxi
nucleótidos o
2'-desoxi-2'-fluoro
nucleótidos. La Tabla II resume las cantidades y los tiempos de
contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. De manera
alternativa, pueden realizarse síntesis a escala 0,2 \mumol en un
sintetizador de placa de 96 pocillos, tal como el instrumento
producido por Protogene (Palo Alto, CA) con una modificación mínima
para el ciclo. Puede usarse un exceso de 33 veces (60 \mul de
0,11 M = 6,6 \mumol) de 2'-O-metil
fosforamidita y un exceso de 105 veces de S-etil
tetrazol (60 \mul de 0,25 M = 15 \mumol) en cada ciclo de
acoplamiento de restos 2'-O-metilo
con respecto al 5'-hidroxilo unido a polímero.
Puede usarse un exceso de 22 veces (40 \mul de 0,11 M = 4,4
\mumol) de desoxi fosforamidita y un exceso de 70 veces de
S-etil tetrazol (40 \mul de 0,25 M = 10 \mumol)
en cada ciclo de acoplamiento de restos desoxi con respecto al 5'
hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento
promedio en el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc.,
determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones de
tritilo, son típicamente del 97,5-99%. Otros
reactivos de síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394
Applied Biosystems, Inc. incluyen lo que se indica a continuación:
la solución de destritilación es TCA al 3% en cloruro de metileno
(ABI); la protección terminal se realiza con N-metil imidazol
al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético al
10%/2,6-lutidina al 10% en THF (ABI); y la solución
de oxidación es I_{2} 16,9 mM, piridina 49 mM, agua al 9% en THF
(PERSEPTIVE^{TM}). Se usa acetonitrilo de Calidad de Síntesis de
Burdick & Jackson directamente del frasco de reactivo. La
solución de S-Etiltetrazol (0,25 M en acetonitrilo)
se prepara a partir del sólido obtenido de American International
Chemical, Inc. De manera alternativa, para la introducción de
enlaces fosforotioato, se usa reactivo de Beaucage
(1,1-dióxido de
3H-1,2-Benzoditiol-3-ona,
0,05 M en acetonitrilo).
La desprotección de los oligonucleótidos basados
en ADN se realiza de la siguiente manera: el oligorribonucleótido
sobre tritilo unido a polímero se transfiere a un vial de vidrio con
tapa de rosca de 4 ml y se suspende en una solución de metilamina
acuosa al 40% (1 ml) a 65ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a
-20ºC, el sobrenadante se retira del soporte polimérico. El soporte
se lava tres veces con 1,0 ml de EtOH:MeCN:H_{2}O/3:1:1, se
somete a agitación vorticial y después el sobrenadante se añade al
primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contienen el
oligorribonucleótido, se secan para proporcionar un polvo
blanco.
El procedimiento de síntesis usado para el ARN,
incluyendo determinadas moléculas de ANic de la invención, sigue el
procedimiento que se describe en Usman y col., 1987, J. Am. Chem.
Soc, 109, 7845; Scaringe y col., 1990, Nucleic Acids Res., 18,
5433; y Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23,
2677-2684 Wincott y col., 1997, Methods Mol. Bio.,
74, 59, y hace uso de grupos de protección y acoplamiento de ácidos
nucleicos comunes tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y
fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, se
realizan síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 Applied
Biosystems, Inc. usando un protocolo a escala 0,2 \mumol con una
etapa de acoplamiento de 7,5 min para nucleótidos protegidos con
alquilsililo y una etapa de acoplamiento de 2,5 minutos para
nucleótidos 2'-O-metilados. La Tabla
II resume las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos
usados en el ciclo de síntesis. Como alternativa, la síntesis a
escala 0,2 \mumol puede realizarse en un sintetizador de placa de
96 pocillos, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo
Alto, CA) con una modificación mínima del ciclo. Puede usarse un
exceso de 33 veces (60 \mul de 0,11 M = 6,6 \mumol) de
2'-O-metil fosforamidita y un exceso
de 75 veces de S-etil tetrazol (60 \mul de 0,25 M
= 15 \mumol) en cada ciclo de acoplamiento de restos
2'-O-metilo con respecto al
5'-hidroxilo unido a polímero. Puede usarse un
exceso de 66 veces (120 \mul de 0,11 M = 13,2 \mumol) de
fosforamidita (ribo) protegida con alquilisilo y un exceso de 150
veces de S-etil tetrazol (120 \mul de 0,25 M = 30
\mumol) en cada ciclo de acoplamiento de
ribo-restos con respecto al
5'-hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de
acoplamiento promedio en el sintetizador 394 Applied Biosystems,
Inc., determinados por cuantificación colorimétrica de las
fracciones de tritilo, son típicamente del 97,5-99%.
Otros reactivos de síntesis de oligonucleótidos para el
sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. incluyen lo que se indica
a continuación: la solución de destritilación es TCA al 3% en
cloruro de metileno (ABI); la protección terminal se realiza con
N-metil imidazol al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético al
10%/2,6-lutidina al 10% en THF (ABI); y la solución
de oxidación es I_{2} 16,9 mM, piridina 49 mM, agua al 9% en THE
(PERSEPTIVE^{TM}). Se usa acetonitrilo de Calidad de Síntesis de
Burdick & Jackson directamente del frasco de reactivo. La
solución de S-Etiltetrazol (0,25 M en acetonitrilo)
se prepara a partir del sólido obtenido de American International
Chemical, Inc. De manera alternativa, para la introducción de
enlaces fosforotioato, se usa reactivo de Beaucage
(1,1-dióxido de
3H-1,2-Benzoditiol-3-ona,
0,05 M en acetonitrilo).
La desprotección del ARN se realiza usando un
protocolo de dos recipientes o de un recipiente. Para el protocolo
de dos recipientes, el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a
polímero se transfiere a un vial de vidrio con tapa de rosca de 4
ml y se suspende en una solución de metilamina acuosa al 40% (1 ml)
a 65ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a -20ºC, el
sobrenadante se retira del soporte polimérico. El soporte se lava
tres veces con 1,0 ml de EtOH:MeCN:H_{2}O/3:1:1, se somete a
agitación vorticial y después el sobrenadante se añade al primer
sobrenadante. Los sobrenadantes combinados, que contienen el
oligorribonucleótido, se secan para proporcionar un polvo blanco.
El oligorribonucleótido de base desprotegida se resuspende en
solución de TEA/HF/NMP anhidra (300 \mul de una solución de 1,5
ml de N-metilpirrolidinona, 750 \mul de TEA y 1
ml de TEA\cdot3HF para proporcionar una concentración de HF 1,4 M)
y se calienta a 65ºC. Después de 1,5 h, el oligómero se inactiva
con NH_{4}HCO_{3} 1,5 M.
De manera alternativa, para el protocolo de un
recipiente, el oligorribonucleótido sobre tritilo unido a polímero
se transfiere a un vial de vidrio con tapa de rosca de 4 ml y se
suspende en una solución de metilamina etanólica al 33%/DMSO: 1/1
(0,8 ml) a 65ºC durante 15 min. El vial se lleva a temperatura
ambiente (ta). Se añade TEA\cdot3HF (0,1 ml) y el vial se
calienta a 65ºC durante 15 minutos. La muestra se enfría a -20ºC y
después se inactiva con NH_{4}HCO_{3} 1,5 M.
Para la purificación de los oligómeros sobre
tritilo, la solución de NH_{4}HCO_{3} inactivada se carga sobre
un cartucho que contiene C-18 que se ha lavado
previamente con acetonitrilo, seguido de TEAA 50 mM. Después de
lavar con agua el cartucho cargado, el ARN se destritila con TFA al
0,5% durante 13 minutos. Después, se lava de nuevo el cartucho con
agua, se realiza el intercambio salino con NaCl 1 M y se lava de
nuevo con agua. Después, el oligonucleótido se eluye con
acetonitrilo al 30%.
Los rendimientos promedio de acoplamiento por
etapas son típicamente >98% (Wincott y col., 1995 Nucleic Acids
Res. 23, 2677-2684). Los expertos en la materia
reconocerán que la escala de síntesis puede adaptarse para ser
mayor o menor que el ejemplo descrito anteriormente incluyendo, pero
sin limitación, un formato de 96 pocillos.
Como alternativa, las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención pueden sintetizarse por separado
y unirse entre sí después de la síntesis, por ejemplo, por ligación
(Moore y col., 1992, Science 256, 9923; Draper y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 93/23569; Shabarova y col.,
1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon y col., 1997,
Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon y col., 1997,
Bioconjugate Chem. 8, 204), o por hibridación después de la
síntesis y/o desprotección.
Las moléculas de ANic de la invención también
pueden sintetizarse mediante una metodología de síntesis en tándem
como se describe en el Ejemplo 1 en el presente documento, en la que
las dos cadenas de ANic se sintetizan como una cadena o fragmento
oligonucleotídico contiguo sencillo separado mediante un engarce
escindible que se escinde posteriormente para proporcionar
fragmentos o cadenas de ANic distintos que hibridan y permiten la
purificación del dúplex de ANic. El engarce puede ser un engarce
polinucleotídico o un engarce no nucleotídico. Como se describe en
el presente documento, la síntesis en tándem del ANic, puede
adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis
multipocillo/multiplaca, tales como plataformas de 96 pocillos o
multipocillo de mayor tamaño, de manera similar. La síntesis en
tándem de ANic, que se describe en el presente documento, también
puede adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis a gran escala,
empleando reactores discontinuos, columnas de síntesis y
similares.
También puede ensamblarse una molécula de ANic a
partir de dos cadenas o fragmentos de ácido nucleico distintos, en
los que un fragmento incluye la región con sentido y el segundo
fragmento incluye la región antisentido de la molécula de ARN.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden modificarse ampliamente para aumentar la
estabilidad por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por
ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo,
2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-H
(para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman
y col., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163). Las construcciones
de ANic pueden purificarse por electroforesis en gel usando
procedimientos generales o pueden purificarse por cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC; véase Wincott y col.,
anteriormente, cuya totalidad se incorpora en el presente
documento por referencia) y resuspenderse en agua.
En otro aspecto de la invención, las moléculas
de ANic de la invención se expresan a partir de unidades de
transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores
recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Los
vectores virales que expresan ANic pueden construirse basándose,
pero sin limitación, en virus adenoasociados, retrovirus,
adenovirus o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de
expresar las moléculas de ANic pueden suministrarse como se
describe en el presente documento y persistir en células diana. De
manera alternativa, pueden usarse vectores virales que proporcionan
una expresión transitoria de moléculas de ANic.
La síntesis química de moléculas de ácido
nucleico con modificaciones (base, azúcar y/o fosfato) puede impedir
su degradación por ribonucleasas séricas, que puede aumentar su
potencia (véase por ejemplo Eckstein y col., Publicación
Internacional Nº WO 92/07065; Perrault y col., 1990 Nature 344, 565;
Pieken y col., 1991, Science 253, 314; Usman y Cedergren, 1992,
Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usman y col., Publicación
Internacional Nº WO 93/15187; y Rossi y col., Publicación
Internacional Nº WO 91/03162; Sproat, Patente de Estados Unidos Nº
5.334.711; Gold y col., Patente de Estados Unidos Nº 6.300.074; y
Burgin y col., anteriormente; incorporándose todas en
el presente documento por referencia). Todas las referencias
anteriores describen diversas modificaciones químicas que pueden
realizarse en los restos de base, fosfato y/o azúcar de las
moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Se
desean modificaciones que aumenten su eficacia en células y la
eliminación de bases de las moléculas de ácido nucleico para acortar
los tiempos de síntesis de oligonucleótidos y reducir los
requisitos químicos.
En la técnica existen diversos ejemplos que
describen modificaciones de azúcares, bases y fosfatos que pueden
introducirse en moléculas de ácidos nucleicos con un aumento
significativo de su eficacia y estabilidad a nucleasa. Por ejemplo,
los oligonucleótidos se modifican para aumentar la estabilidad y/o
aumentar la actividad biológica, por modificación con grupos
resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino,
2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-O-metilo,
2'-O-alilo, 2'-H,
modificaciones de las bases de nucleótidos (para una revisión véase
Usman y Cedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman y col., 1994, Nucleic
Acids Symp. Ser. 31, 163; Burgin y col., 1996, Biochemistry, 35,
14090). La modificación de los azúcares de las moléculas de ácido
nucleico se ha descrito ampliamente en la técnica (véase Eckstein y
col., Publicación Internacional PCT Nº WO 92/07065; Perrault y col.
Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken y col. Science,
1991, 253, 314-317; Usman y Cedergren, Trends in
Biochem. Sci., 1992, 17, 334-339; Usman y col.
Publicación Internacional PCT Nº WO 93/15187; Sproat, Patente de
Estados Unidos Nº 5.334.711 y Beigelman y col., 1995, J. Biol.
Chem., 270, 25702; Beigelman y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 97/26270; Beigelman y col., Patente de
Estados Unidos Nº 5.716.824; Usman y col., Patente de Estados
Unidos Nº 5.627.053; Woolf y col., Publicación Internacional PCT Nº
WO 98/13526; Thompson y col., USSN 60/082,404 que se presentó el 20
de abril de 1998; Karpeisky y col., 1998, Tetrahedron Lett., 39,
1131; Earnshaw y Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences),
48, 39-55; Verma y Eckstein, 1998, Annu. Rev.
Biochem., 67, 99-134; y Burlina y col., 1997,
Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010. Dichas
publicaciones describen procedimientos y estrategias generales para
determinar la localización de incorporación de las modificaciones
de los azúcares, bases y/o fosfatos y similares en las moléculas de
ácido nucleico sin modular la catálisis, y se incorporan en el
presente documento por referencia. A la vista de dichos contenidos,
pueden usarse modificaciones similares, como se describe en el
presente documento, para modificar las moléculas de ácido nucleico
ANic de la presente invención siempre que no se inhiba de manera
significativa la capacidad del ANic para promover la iARN en las
células.
Aunque la modificación química de enlaces
internucleotídicos de oligonucleótidos con enlaces fosforotioato,
fosforoditioato y/o 5'-metilfosfonato mejora la
estabilidad, excesivas modificaciones pueden causar cierta
toxicidad o disminuir la actividad. Por lo tanto, cuando se diseñan
moléculas de ácido nucleico, debería minimizarse la cantidad de
estos enlaces internucleotídicos. La reducción de la concentración
de estos enlaces debería disminuir la toxicidad, dando como
resultado una eficacia aumentada y una mayor especificidad de estas
moléculas.
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico de
interferencia corto (ANic) que tienen modificaciones químicas que
mantienen o aumentan la actividad. Generalmente, dicho ácido
nucleico también es más resistente a nucleasas que un ácido
nucleico no modificado. Por consiguiente, la actividad in
vitro y/o in vivo no debería disminuirse
significativamente. En los casos en los que el objetivo sea la
modulación, las moléculas de ácido nucleico terapéuticas
suministradas de manera exógena deberían ser óptimamente estables
dentro de las células hasta que la traducción del ARN diana se haya
modulado suficiente tiempo para reducir los niveles de la proteína
no deseable. Este periodo de tiempo varía de horas a días
dependiendo de la patología. Las mejoras en la síntesis química del
ARN y del ADN (Wincott y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677;
Caruthers y col., 1992, Methods in Enzymology
211,3-19) han ampliado la capacidad para modificar
moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones de
nucleótidos para aumentar su estabilidad frente a nucleasa, como se
ha descrito anteriormente.
En una realización, las moléculas de ácido
nucleico de la invención incluyen uno o más (por ejemplo,
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos
de fijación a G. Un nucleótido de fijación de G es un análogo de
citosina modificado en el que las modificaciones confieren la
capacidad de unir mediante enlaces de hidrógeno ambas caras de
Watson-Crick y Hoogsteen de una guanina
complementaria dentro de un dúplex, véase por ejemplo Lin y
Matteucci, 1998, J. Am Chem. Soc., 120, 8531-8532.
Una sola sustitución de análogo de fijación de G dentro de un
oligonucleótido puede dar como resultado una estabilidad térmica
helicoidal sustancialmente aumentada y una discriminación de
emparejamientos erróneos cuando hibrida con oligonucleótidos
complementarios. La inclusión de dichos nucleótidos en las
moléculas de ácido nucleico de la invención da como resultado tanto
una afinidad como una especificidad aumentadas hacia dianas de
ácido nucleico, secuencias complementarias o cadenas de molde. En
otra realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención
incluyen uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9,10, o más) nucleótidos de "ácido nucleico bloqueado"
LNA tales como un 2',4'-C-metileno
biciclo nucleótido (véase por ejemplo Wengel y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 00/66604 y WO 99/14226).
En otra realización, la invención presenta
conjugados y/o complejos de moléculas de ANic de la invención.
Dichos conjugados y/o complejos pueden usarse para facilitar el
suministro de moléculas de ANic en un sistema biológico, tal como
una célula. Los conjugados y complejos que proporciona la presente
invención pueden conferir actividad terapéutica transfiriendo
compuestos terapéuticos a través de membranas celulares, modificando
la farmacocinética y/o modulando la localización de las moléculas
de ácido nucleico de la invención. La presente invención incluye el
diseño y síntesis de nuevos conjugados y complejos para el
suministro de moléculas, incluyendo, pero sin limitación, pequeñas
moléculas, lípidos, fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos
nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente y
otros polímeros, por ejemplo, proteínas, péptidos, hormonas,
carbohidratos, polietilenglicoles o poliaminas, a través de
membranas celulares. En general, los transportadores descritos se
diseñan para su uso de manera individual o como parte de un sistema
multicomponente, con o sin engarces degradables. Se espera que
estos compuestos mejoren el suministro y/o la localización de las
moléculas de ácido nucleico de la invención en diversos tipos de
células obtenidas a partir de tejidos diferentes, en presencia o en
ausencia de suero (véase Sullenger y Cech, Patente de Estados Unidos
Nº 5.854.038). Los conjugados de las moléculas descritos en el
presente documento pueden unirse a moléculas biológicamente activas
mediante engarces que son biodegradables, tales como moléculas de
engarce de ácidos nucleicos biodegradables.
La expresión "engarce biodegradable", como
se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de
engarce de ácido nucleico o que no es de ácido nucleico diseñada
como un engarce biodegradable para unir una molécula a otra
molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa a una
molécula de ANic de la invención o las cadenas con sentido y
antisentido de una molécula de ANic de la invención. El engarce
biodegradable se diseña de manera que su estabilidad pueda
modularse para un fin particular, tal como el suministro a un tipo
de tejido o célula particular. La estabilidad de una molécula de
engarce biodegradable basada en ácido nucleico puede modularse
usando diversas químicas, por ejemplo combinaciones de
ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos químicamente
modificados, tales como 2'-O-metilo,
2'-fluoro, 2'-amino,
2'-O-amino,
2'-C-alilo,
2'-O-alilo y otros nucleótidos con
bases modificadas o modificaciones en la posición 2'. La molécula de
engarce de ácido nucleico biodegradable puede ser un dímero,
trímero, tetrámero o una molécula de ácido nucleico de mayor
tamaño, por ejemplo, un oligonucleótido de aproximadamente 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20
nucleótidos de longitud, o puede comprender un solo nucleótido con
un enlace basado en fósforo, por ejemplo, un enlace fosforamidato o
fosfodiéster. La molécula de engarce de ácido nucleico
biodegradable también puede comprender modificaciones de la cadena
principal del azúcar del ácido nucleico o de la base del ácido
nucleico.
El término "biodegradable", como se usa en
el presente documento, se refiere a la degradación en un sistema
biológico, por ejemplo degradación enzimática o degradación
química.
La expresión "molécula biológicamente
activa", como se usa en el presente documento, se refiere a
compuestos o moléculas que son capaces de generar o modificar una
respuesta biológica en un sistema. Los ejemplos no limitantes de
moléculas de ANic biológicamente activas en solitario o en
combinación con otras moléculas que contempla la presente invención
incluyen moléculas terapéuticamente activas tales como anticuerpos,
hormonas, antivirales, péptidos, proteínas, quimioterápicos,
moléculas pequeñas, vitaminas, cofactores, nucleósidos,
nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos
nucleicos antisentido, oligonucleótidos que forman tríplex,
quimeras 2,5-A, ANic, ARNbc, alozimas, aptámeros,
señuelos y análogos de los mismos. Las moléculas biológicamente
activas de la invención también incluyen moléculas capaces de
modular la farmacocinética y/o farmacodinámica de otras moléculas
biológicamente activas, por ejemplo, lípidos y polímeros tales como
poliaminas, poliamidas, polietilenglicol y otros poliéteres.
El término "fosfolípido", como se usa en el
presente documento, se refiere a una molécula hidrófoba que
comprende al menos un grupo de fósforo. Por ejemplo, un fosfolípido
puede comprender un grupo que contiene fósforo y un grupo alquilo
saturado o insaturado, opcionalmente sustituido con grupos OH, COOH,
oxo, amina, o grupos arilo sustituidos o no sustituidos.
Las moléculas de ácido nucleico terapéuticas
(por ejemplo moléculas de ANic) suministradas de manera exógena son
óptimamente estables dentro de las células hasta que la
transcripción inversa del ARN se haya modulado suficiente tiempo
para reducir los niveles del transcrito de ARN. Las moléculas de
ácido nucleico son resistentes a nucleasas para funcionar como
agentes terapéuticos intracelulares eficaces. Las mejoras en la
síntesis química de las moléculas de ácido nucleico descritas en la
presente invención y en la técnica han ampliado la capacidad de
modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo
modificaciones de nucleótidos para aumentar su estabilidad frente a
nucleasa como se ha descrito anteriormente.
En otra realización más, se proporcionan
moléculas de ANic que tienen modificaciones químicas que mantienen
o aumentan la actividad enzimática de las proteínas implicadas en la
iARN. Generalmente, dichos ácidos nucleicos también son más
resistentes a nucleasas que los ácidos nucleicos no modificados. Por
lo tanto, la actividad in vitro y/o in vivo no
debería disminuirse significativamente.
El uso de las moléculas basadas en ácido
nucleico de la invención conducirá a un mejor tratamiento del avance
de la enfermedad ofreciendo la posibilidad de terapias de
combinación (por ejemplo moléculas de ANic múltiples dirigidas a
genes diferentes; moléculas de ácido nucleico acopladas a
moduladores conocidos de moléculas pequeñas; o tratamiento
intermitente con combinaciones de moléculas, incluyendo diferentes
motivos y/u otras moléculas químicas o biológicas). El tratamiento
de sujetos con moléculas de ANic también puede incluir combinaciones
de diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico, tales como
moléculas de ácido nucleico enzimáticas (ribozimas), alozimas,
antisentido, 2,5-A oligoadenilato, señuelos y
aptámeros.
En otro aspecto, una molécula de ANic de la
invención comprende una o más estructuras de protección 5' y/o 3',
por ejemplo sólo en la cadena de ANic con sentido, en la cadena de
ANic antisentido o en ambas cadenas de ANic.
Por "estructura de protección" se quiere
significar modificaciones químicas, que se han incorporado en
cualquiera de los extremos terminales del oligonucleótido (véase,
por ejemplo, Adamic y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.998.203,
incorporada en el presente documento por referencia). Estas
modificaciones terminales protegen a la molécula de ácido nucleico
de la degradación por exonucleasa y pueden ayudar al suministro y/o
localización dentro de una célula. La protección puede estar
presente en el extremo 5' (protección 5') o en el extremo 3'
(protección 3') o puede estar presente en ambos extremos terminales.
En ejemplos no limitantes, la protección 5' se selecciona del grupo
que consiste en glicerilo, resto (residuo) abásico desoxi invertido;
4',5'-metileno nucleótido;
1-(beta-D-eritrofuranosil)
nucleótido; 4'-tio nucleótido; nucleótido
carbocíclico; 1,5-anhidrohexitol nucleótido;
L-nucleótidos; alfa-nucleótidos,
nucleótidos con base modificada; enlace fosforoditioato;
treo-pentofuranosil nucleótido; 3',4'-seco
nucleótido acíclico; 3,4-dihidroxibutil nucleótido
acíclico; 3,5-dihidroxipentil nucleótido acíclico,
resto nucleotídico 3'-3' invertido; resto abásico
3'-3' invertido; resto nucleotídico
3'-2' invertido; resto abásico
3'-2' invertido; 1,4-butanodiol
fosfato; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; aminohexil
fosfato; 3'-fosfato;
3'-fosforotioato; fosforoditioato o resto
metilfosfonato formador o no formador de enlaces.
En ejemplos no limitantes, la protección 3' se
selecciona del grupo que consiste en, glicerilo, resto (residuo)
abásico desoxi invertido, 4',5'-metileno nucleótido;
1-(beta-D-eritrofuranosil)
nucleótido; 4'-tio nucleótido; nucleótido
carbocíclico; 5'-amino-alquil
fosfato;
1,3-diamino-2-propil
fosfato; 3-aminopropil fosfato;
6-aminohexil fosfato;
1,2-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato;
1,5-anhidrohexitol nucleótido;
L-nucleótido; alfa-nucleótido;
nucleótido con base modificada; fosforoditioato;
treo-pentofuranosil nucleótido; 3',4'-seco
nucleótido acíclico; 3,4-dihidroxibutil nucleótido;
3,5-dihidroxipentil nucleótido; resto nucleotídico
5'-5'-invertido; resto abásico
5'-5';invertido; 5'-fosforamidato;
5'-fosforotioato; 1,4-butanodiol
fosfato; 5'-amino; 5'-fosforamidato,
fosforotioato y/o fosforoditioato formador y/o no formador de
enlaces, restos metilfosfonato y 5'-mercapto
formadores y/o no formadores de enlaces (para más detalles véase
Beaucage y Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; incorporado por
referencia en el presente documento).
La expresión "no nucleotídico" significa
cualquier grupo o compuesto que puede incorporarse en una cadena de
ácido nucleico en el lugar de una o más unidades de nucleótidos,
incluyendo sustituciones de azúcares y/o fosfato, y permite que el
resto de bases muestren su actividad enzimática. El grupo o
compuesto es abásico ya que no contiene una base nucleotídica
comúnmente reconocida, tal como adenosina, guanina, citosina,
uracilo o timina y por lo tanto carece de una base en la posición
1'.
Un grupo "alquilo" se refiere a un
hidrocarburo alifático saturado, incluyendo grupos alquilo de cadena
lineal, cadena ramificada y cíclicos. Preferentemente, el grupo
alquilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferentemente, es un
alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4
carbonos. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido.
Cuando está sustituido el grupo (o grupos) sustituido es
preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO_{2} o
N(CH_{3})_{2}, amino o SH. El término también
incluye grupos alquenilo que son grupos hidrocarburo insaturados
que contienen al menos un doble enlace
carbono-carbono, incluyendo grupos de cadena
lineal, cadena ramificada o cíclicos. Preferentemente, el grupo
alquenilo tiene de 1 a 12 carbonos. Más preferentemente, es un
alquenilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4
carbonos. El grupo alquenilo puede estar sustituido o no
sustituido. Cuando está sustituido, el grupo (o grupos) sustituido
es preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO_{2},
halógeno, N(CH_{3})_{2}, amino o SH. El término
"alquilo" también incluye grupos alquinilo que tienen un grupo
hidrocarburo insaturado que contiene al menos un triple enlace
carbono-carbono, incluyendo grupos de cadena lineal,
cadena ramificada o cíclicos. Preferentemente, el grupo alquinilo
tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Más preferentemente, es un
alquinilo inferior de 1 a 7 carbonos, más preferentemente de 1 a 4
carbonos. El grupo alquinilo puede estar sustituido o no
sustituido. Cuando está sustituido el grupo (o grupos) es
preferentemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, NO_{2} o
N(CH_{3})_{2}, amino o SH.
Dichos grupos alquilo también pueden incluir
grupos arillo, alquilarilo, arilo carbocíclico, arilo heterocíclico,
amida y éster. Un grupo "arilo" se refiere a un grupo
aromático que tiene al menos un anillo que tiene un sistema de
electrones pi conjugados e incluye grupos arilo carbocíclico, arilo
heterocíclico y biarilo, pudiendo todos estar opcionalmente
sustituidos. El sustituyente (o sustituyentes) preferido de grupos
arilo son grupos halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, ciano,
alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo y amino. Un grupo
"alquilarilo" se refiere a un grupo alquilo (como se ha
descrito anteriormente) unido covalentemente a un grupo arilo (como
se ha descrito anteriormente). Los grupos arilo carbocíclicos son
grupos en los que los átomos del anillo en el anillo aromático son
todos átomos de carbono. Los átomos de carbono están opcionalmente
sustituidos. Los grupos arilo heterocíclicos son grupos que tienen
de 1 a 3 heteroátomos como átomos del anillo en el anillo aromático
y el resto de los átomos del anillo son átomos de carbono. Los
heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno, e
incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo,
N-alquil inferior pirrolo, pirimidilo, pirazinilo,
imidazolilo y similares, opcionalmente todos sustituidos. Una
"amida" se refiere a un
-C(O)-NH-R, en el que R es
alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. Un "éster" se refiere
a un -C(O)-OR', en el que R es alquilo,
arilo, alquilarilo o hidrógeno.
"Nucleótido", como se usa en el presente
documento, debe incluir, como se reconoce en la técnica, bases
naturales (convencionales) y bases modificadas bien conocidas en la
técnica. Dichas bases se localizan generalmente en la posición 1'
de un resto de azúcar de nucleótido. Los nucleótidos generalmente
comprenden una base, un azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos
pueden tener el resto de azúcar, fosfato y/o base modificado o no
modificado (denominados también indistintamente análogos de
nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales,
nucleótidos no convencionales y otros; véase, por ejemplo, Usman y
McSwiggen, anteriormente; Eckstein y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 92/07065; Usman y col., Publicación
Internacional PCT Nº WO 93/15187; Uhlman y Peyman, anteriormente,
incorporándose todos en el presente documento por referencia).
Existen diversos ejemplos de bases de ácidos nucleicos modificadas
conocidos en la técnica, como se resumen por Limbach y col., 1994,
Nucleic Acids Res. 22, 2183. Algunos de los ejemplos no limitantes
de modificaciones de bases que pueden introducirse en las moléculas
de ácido nucleico incluyen inosina, purina,
piridin-4-ona,
piridin-2-ona, fenilo,
pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxi benceno,
3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo,
aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo,
5-metilcitidina), 5-alquiluridinas
(por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina
(por ejemplo, 5-bromouridina) o
6-azapirimidinas o
6-alquilpirimidinas (por ejemplo
6-metiluridina), propina y otras (Burgin y col., 1996,
Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, anteriormente). Por
"bases modificadas" en este aspecto se entienden bases de
nucleótidos distintas de adenina, guanina, citosina y uracilo en la
posición 1' o sus equivalentes.
En una realización, la invención ofrece
moléculas de ANic modificadas, con modificaciones de la cadena
principal de fosfato que comprenden una o más sustituciones de
fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster,
morfolino, amidato carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida,
sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal, y/o
alquilsililo. Para una revisión de las modificaciones de la cadena
principal de oligonucleótidos, véase Hunziker y Leumann, 1995,
Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern
Synthetic Methods, VCH, 331-417, y Mesmaeker y
col., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in
Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS,
24-39.
Por "abásico" se quiere significar restos
de azúcares que carecen de una base o que tienen otros grupos
químicos en lugar de una base en la posición 1', véase por ejemplo
Adamic y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.998.203.
Por "nucleósido no modificado" se quiere
significar una de las bases de adenina, citosina, guanina, timina o
uracilo unidas al carbono 1' de la
\beta-D-ribo-furanosa.
Por "nucleósido modificado" se quiere
significar cualquier base nucleotídica que contiene una modificación
en la estructura química de una base, azúcar y/o fosfato de
nucleótido no modificado. Las fórmulas I-VII
muestran ejemplos no limitantes de nucleótidos modificados y/u
otras modificaciones descritas en el presente documento.
Con referencia a los nucleótidos modificados en
posición 2', como se describe para la presente invención, por
"amino" se entiende 2'-NH_{2} o
2'-O-NH_{2}, que pueden estar modificados o no modificados.
Dichos grupos modificados se describen, por ejemplo, por Eckstein y
col., Patente de Estados Unidos Nº 5.672.695 y
Matulic-Adamic y col., Patente de Estados Unidos Nº
6.248.878, incorporándose ambas por referencia en el presente
documento en su totalidad.
Para aumentar la utilidad de estas moléculas,
pueden realizarse diversas modificaciones en la estructura de ácido
nucleico del ANic. Dichas modificaciones aumentarán la vida útil,
semivida in vitro, estabilidad y facilitará la introducción
de dichos oligonucleótidos en el sitio diana, por ejemplo, para
aumentar la penetración de membranas celulares y conferir la
capacidad de reconocer y unirse a células diana.
Una molécula de ANic de la invención puede
adaptarse para su uso para tratar cualquier enfermedad, infección o
afección asociada con la expresión génica y otras indicaciones que
pueden responder a nivel de producto génico en un tejido o célula,
en solitario o en combinación con otras terapias. Por ejemplo, una
molécula de ANic puede comprender un vehículo de suministro,
incluyendo liposomas, para su administración a un sujeto, vehículos
y diluyentes y sus sales y/o puede estar presente en formulaciones
farmacéuticamente aceptables. Se describen procedimientos para el
suministro de moléculas de ácido nucleico en Akhtar y col., 1992,
Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense
Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer y col.,
1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland y
Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192;
y Lee y col., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192,
incorporándose todas en el presente documento por referencia.
Beigelman y col., Patente de Estados Unidos Nº 6.395.713 y Sullivan
y col., documento PCT WO 94/02595 describen adicionalmente los
procedimientos generales para el suministro de moléculas de ácido
nucleico. Estos protocolos pueden utilizarse para el suministro de
prácticamente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas
de ácido nucleico pueden administrarse a células mediante una
diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la
materia, incluyendo, pero sin limitación, la encapsulación en
liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros
vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas (véase, por ejemplo
González y col., 1999, Bioconjugate Chem., 10,
1068-1074), nanocápsulas biodegradables y
microesferas bioadhesivas, o por vectores proteicos (O'Hare y
Normand, Publicación Internacional PCT Nº WO 00/53722). Como
alternativa, la combinación de ácido nucleico/vehículo se
suministra localmente por inyección directa o usando una bomba de
infusión. La inyección directa de las moléculas de ácido nucleico de
la invención, por vía subcutánea, intramuscular o intradérmica,
puede realizarse usando metodologías con aguja y jeringa
convencionales o tecnologías sin aguja tales como las descritas en
Conry y col., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337
y Barry y col., Publicación Internacional PCT Nº WO 99/31262.
Muchos ejemplos en la técnica describen procedimientos de suministro
de oligonucleótidos en el SNC por bomba osmótica (véase, Chun y
col., 1998, Neuroscience Letters, 257, 135-138,
D'Aldin y col., 1998, Mol. Brain Research, 55,
151-164, Dryden y col., 1998, J. Endocrinol., 157,
169-175, Ghirnikar y col., 1998, Neuroscience
Letters, 247, 21-24) o infusión directa (Broaddus y
col., 1997, Neurosurg. Focus, 3, artículo 4). Otras vías de
suministro incluyen, pero sin limitación, suministro oral (en forma
de comprimido o píldora) y/o suministro intratecal (Gold, 1997,
Neuroscience, 76, 1153-1158). Se proporcionan
descripciones más detalladas del suministro y administración de
ácidos nucleicos por Sullivan y col., anteriormente, Draper y col.,
PCT WO93/23569, Beigelman y col., PCT WO99/05094 y Klimuk y col.,
PCT WO99/04819, incroporándose todas por referencia en el presente
documento. Las moléculas de la presente invención pueden usarse como
agentes farmacéuticos. Los agentes farmacéuticos previenen, modulan
la aparición o tratan (alivio de un síntoma en cierta medida,
preferentemente todos los síntomas) de una patología en un
sujeto.
Además, la invención quiere presentar el uso de
procedimientos para suministrar las moléculas de ácido nucleico de
la presente invención a células hematopoyéticas, incluyendo
monocitos y linfocitos. Estos procedimientos se describen con
detalle por Hartmann y col., 1998, J. Phamacol. Exp. Ther.,
285(2), 920-928; Kronenwett y col., 1998,
Blood, 91(3), 852-862; Filion y Phillips,
1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2),
345-356; Ma y Wei, 1996, Leuk Res.,
20(11/12), 925-930; y Bongartz y col., 1994,
Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8.
Dichos procedimientos, como se ha descrito anteriormente, incluyen
el uso de oligonucleótidos libres, formulaciones de lípidos
catiónicos, formulaciones liposomales incluyendo liposomas e
inmunoliposomas sensibles al pH y bioconjugados incluyendo
oligonucleótidos conjugados con péptidos fusogénicos, para la
transfección de células hematopoyéticas con oligonucleótidos.
Por lo tanto, la invención presenta una
composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos
de la invención en un vehículo aceptable, tal como un estabilizante,
tampón y similar. Los polinucleótidos de la invención pueden
administrarse (por ejemplo, ARN, ADN o proteína) e introducirse en
un sujeto por cualquier medio convencional, con o sin
estabilizantes, tampones y similares, para formar una composición
farmacéutica. Cuando se desea usar un mecanismo de suministro
liposomal, pueden seguirse protocolos convencionales para la
formación de liposomas. Las composiciones de la presente invención
también pueden formularse y usarse como comprimidos, cápsulas o
elixires para administración oral, supositorios para administración
rectal, soluciones y suspensiones estériles para la administración
inyectable y las otras composiciones conocidas en la técnica.
La presente invención también incluye
formulaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos
descritos. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos
anteriores, por ejemplo, sales de adición de ácidos, por ejemplo,
sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y ácido benceno
sulfónico.
Una composición o formulación farmacológica se
refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para
la administración, por ejemplo, administración sistémica, en una
célula o sujeto, incluyendo por ejemplo un ser humano. Las formas
adecuadas dependen, en parte, del uso o la vía de entrada, por
ejemplo, oral, transdérmica o por inyección. Dichas formas no
deberían impedir que la composición o formulación alcance una célula
diana (es decir, una célula en la que sea deseable el suministro
del ácido nucleico cargado negativamente). Por ejemplo, las
composiciones farmacológicas inyectadas en el torrente sanguíneo
deberían ser solubles. En la técnica se conocen otros factores e
incluyen consideraciones tales como la toxicidad y formas que
impiden que la composición o formulación ejerza su efecto.
Por "administración sistémica" se quiere
significar la absorción o acumulación sistémica in vivo de
fármacos en el torrente sanguíneo, seguida de la distribución por
todo el cuerpo. Las vías de administración que conducen a la
absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa,
subcutánea, intraperitoneal, por inhalación, oral, intrapulmonar e
intramuscular. Cada una de estas vías de administración expone las
moléculas de ANic de la invención a un tejido enfermo accesible. Se
ha demostrado que la velocidad de entrada de un fármaco en la
circulación está en función del peso o tamaño molecular. El uso de
un liposoma u otro vehículo farmacológico que comprende los
compuestos de la presente invención posiblemente puede localizar el
fármaco, por ejemplo, en determinados tipos de tejidos, tales como
los tejidos del sistema reticuloendotelial (SRE). También es útil
una formulación liposomal que pueda facilitar la asociación del
fármaco con la superficie de las células, tales como linfocitos y
macrófagos. Esta estrategia puede proporcionar un suministro
aumentado del fármaco a células diana aprovechando la especificidad
del reconocimiento inmune por macrófagos y linfocitos de células
anómalas, tales como células que producen MDR en
exceso.
exceso.
Por "formulación farmacéuticamente
aceptable" se quiere significar una composición o formulación que
permite distribuir eficazmente las moléculas de ácido nucleico de
la presente invención en la localización física más adecuada para
su actividad deseada. Los ejemplos no limitantes de agentes
adecuados para la formulación con las moléculas de ácido nucleico
de la presente invención incluyen: inhibidores de glicoproteína P
(tales como Pluronic P85), que pueden aumentar la entrada de
fármacos en el SNC (Jolliet-Riant y Tillement, 1999,
Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); polímeros
biodegradables, tales como microesferas de poli
(DL-lactida-coglicolida) para el
suministro de liberación sostenida después de su implantación
intracerebral (Emerich, DF y col, 1999, Cell Transplant, 8,
47-58) (Alkermes, Inc. Cambridge, MA); y
nanopartículas cargadas, tales como las compuestas por
polibutilcianoacrilato, que pueden suministrar fármacos a través de
la barrera hematoencefálica y pueden modificar los mecanismos de
captación neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23,
941-949, 1999). Otros ejemplos no limitantes de
estrategias de suministro para las moléculas de ácido nucleico de la
presente invención incluyen material descrito por Boado y col.,
1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler y col.,
1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge y col.,
1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv.
Drug Delivery Rev., 15, 73-107;
Aldrian-Herrada y col., 1998, Nucleic Acids Res.,
26, 4910-4916; y Tyler y col., 1999, PNAS USA., 96,
7053-7058.
La invención también ofrece el uso de la
composición que comprende liposomas de superficie modificada que
contienen lípidos de poli(etilenglicol) (liposomas
modificados con PEG o de circulación prolongada o liposomas
sigilosos (Stealth)). Estas formulaciones ofrecen un procedimiento
para aumentar la acumulación de fármacos en tejidos diana. Esta
clase de vehículos farmacológicos son resistentes a la opsonización
y eliminación por el sistema mononuclear fagocítico (SMF o SRE),
permitiendo de esta manera tiempos de circulación en sangre más
prolongados y una exposición tisular aumentada para el fármaco
encapsulado (Lasic y col. Chem. Rev. 1995, 95,
2601-2627; Ishiwata y col., Chem. Pharm. Bull. 1995,
43, 1005-1011). Se ha demostrado que dichos
liposomas se acumulan selectivamente en tumores, supuestamente por
extravasación y captura en los tejidos diana neovascularizados
(Lasic y col., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku y
col., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90).
Los liposomas de circulación prolongada mejoran la farmacocinética
y farmacodinámica del ADN y ARN, particularmente en comparación con
liposomas catiónicos convencionales que se sabe que se acumulan en
tejidos del SMF (Liu y col., J. Biol. Chem. 1995, 42,
24864-24870; Choi y col., Publicación Internacional
PCT Nº WO 96/10391; Ansell y col., Publicación Internacional PCT Nº
WO 96/10390; Holland y col., Publicación Internacional PCT Nº WO
96/10392). También es probable que los liposomas de circulación
prolongada protejan a los fármacos de la degradación por nucleasa
en mayor medida en comparación con los liposomas catiónicos,
basándose en su capacidad para evitar su acumulación en tejidos del
SMF metabólicamente agresivos tales como el hígado y el bazo.
La presente invención también incluye
composiciones preparadas para el almacenamiento o administración que
incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos
deseados en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos o diluyentes aceptables para su uso terapéutico se
conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por
ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985), incorporado en el
presente documento por referencia. Por ejemplo, pueden
proporcionarse agentes conservantes, estabilizantes, colorantes y
saporíferos. Éstos incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres
del ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden usarse agentes
antioxidantes y de suspensión.
Una dosis farmacéuticamente eficaz es esa dosis
necesaria para prevenir, inhibir la aparición o tratar (aliviar un
síntoma en cierta medida, preferentemente todos los síntomas) de una
patología. La dosis farmacéuticamente eficaz depende del tipo de
enfermedad, de la composición usada, de la vía de administración,
del tipo de mamífero a tratar, de las características físicas del
mamífero específico en cuestión, de la medicación simultánea y
otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica.
Generalmente, dependiendo de la potencia del polímero cargado
negativamente, se administra una cantidad de entre 0,1 mg/kg y 100
mg/kg de peso corporal/día de los principios activos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
y las formulaciones de las mismas pueden administrarse por vía
oral, por vía tópica, por vía parenteral, por inhalación o
pulverización o por vía rectal en formulaciones unitarias de
dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. El término
parenteral, como se usa en el presente documento, incluye técnicas
de inyección o infusión percutánea, subcutánea, intravascular (por
ejemplo, intravenosa), intramuscular o intratecal y similares.
Además, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende
una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Una o más moléculas de ácido nucleico
de la presente invención pueden estar presentes en asociación con
uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente
aceptables no tóxicos y, si se desea, con otros principios activos.
Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de ácido
nucleico de la invención pueden estar en una forma adecuada para su
uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas,
suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables,
emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires.
Las composiciones destinadas a uso oral pueden
prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la
técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas
composiciones pueden contener uno o más de dichos agentes
edulcorantes, agentes saporíferos, agentes colorantes o agentes
conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente
elegantes y apetecibles. Los comprimidos contienen el principio
activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente
aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos.
Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales
como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de
calcio o fosfato de sodio; agentes disgregantes y de granulación,
por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes,
por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes
lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o
talco. Los comprimidos pueden no estar revestidos o pueden
revestirse mediante técnicas conocidas. En algunos casos dichos
revestimientos pueden prepararse por técnicas conocidas para
retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal
y proporcionar por lo tanto una acción sostenida durante un periodo
más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material retardante
tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden
presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el principio
activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo,
carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de
gelatina blandas en las que el principio activo se mezcla con agua o
con un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina
líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los
materiales activos en una mezcla con excipientes adecuados para la
fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes
de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica,
metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio,
polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes
dispersantes o humectantes que pueden ser una fosfatida de origen
natural, por ejemplo, lecitina o productos de condensación de un
óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de
polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con
alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo
heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de
etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un
hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitán o productos de
condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de
ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de
polietilen sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden
contener uno o más conservantes, por ejemplo, etilo o
p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno
o más agentes colorantes, uno o más agentes saporíferos y uno o más
agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas pueden formularse
suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por
ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o
aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida.
Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por
ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden
añadirse agentes edulcorantes y agentes saporíferos para
proporcionar preparaciones orales apetecibles. Estas composiciones
pueden conservarse añadiendo un antioxidante tal como ácido
ascórbico.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados
para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de
agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente
dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más
conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes o agentes de
suspensión adecuados se ilustran por los ya mencionados
anteriormente. También pueden estar presentes excipientes
adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saporíferos y
colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La
fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o
mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden
ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma de
tragacanto, fosfatidas de origen natural, por ejemplo, semilla de
soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos
grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo, monooleato de sorbitán,
y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido
de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán. Las
emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y
saporíferos.
Pueden formularse jarabes y elixires con agentes
edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol,
glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un
emoliente, un conservante y agentes saporíferos y colorantes. Las
composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión
acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión puede
formularse de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes de
dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se
han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril
también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un
diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por
ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre
los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están
agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica.
Adicionalmente, como un disolvente o medio de suspensión se emplean
de manera convencional aceites no volátiles estériles. Con este
fin, puede emplearse cualquier aceite no volátil suave incluyendo
mono- o diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, se usan ácidos
grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
también pueden administrarse en forma de supositorios, por ejemplo,
para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones
pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no
irritante adecuado que sea sólido a las temperaturas habituales pero
líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el
recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca
de cacao y polietilenglicoles.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden administrarse parenteralmente en un medio estéril.
Dependiendo del vehículo y de la concentración usada, el fármaco
puede suspenderse o disolverse en el vehículo. De manera ventajosa,
en el vehículo pueden disolverse adyuvantes tales como anestésicos
locales, conservantes y agentes de tamponantes.
Niveles de dosificación del orden de
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de
peso corporal por día son útiles en el tratamiento de las
afecciones indicadas anteriormente (de aproximadamente 0,5 mg a
aproximadamente 7 g por sujeto por día). La cantidad de principio
activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para
producir una sola forma de dosificación varía dependiendo del
huésped tratado y del modo de administración particular. Las formas
unitarias de dosificación generalmente contienen entre
aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un principio
activo.
Se entiende que el nivel de dosis específico
para cualquier sujeto particular depende de una diversidad de
factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado,
la edad, el peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de
administración, vía de administración y velocidad de excreción,
combinación de fármaco y gravedad de la enfermedad particular que
se esté sometiendo a terapia.
Para la administración a animales no humanos, la
composición también puede añadirse al pienso o agua de bebida del
animal. Puede ser conveniente formular las composiciones de pienso y
agua de bebida del animal de forma que el animal ingiera una
cantidad terapéuticamente apropiada de la composición junto con su
dieta. También puede ser conveniente presentar la composición como
una premezcla para adición al pienso o agua de bebida.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención también pueden administrarse a un sujeto en combinación
con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto
terapéutico global. El uso de múltiples compuestos para tratar una
indicación puede aumentar los efectos beneficiosos a la vez que
reduce la presencia de efectos secundarios.
En una realización, la invención comprende
composiciones adecuadas para administrar moléculas de ácido nucleico
de la invención a tipos celulares específicos. Por ejemplo, el
receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) (Wu y Wu, 1987, J. Biol.
Chem. 262, 4429-4432) es único para los hepatocitos
y se une a glicoproteínas con galactosa terminal ramificadas, tales
como asialoorosomucoide (ASOR). En otro ejemplo, el receptor de
folato se sobreexpresa en muchas células cancerosas. La unión de
tales glicoproteínas, glicoconjugados sintéticos o folatos al
receptor tiene lugar con una afinidad que depende claramente del
grado de ramificación de la cadena oligosacárida, por ejemplo, se
unen con mayor afinidad estructuras triantenarias que las cadenas
biantenarias o monoantenarias (Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22,
611-620; Connolly y col., 1982, J. Biol. Chem., 257,
939-945). Lee y Lee, 1987, Glycoconjugate J., 4,
317-328, obtuvieron esta elevada especificidad a
través del uso de
N-acetil-D-galactosamina
como el resto carbohidrato, que tiene una afinidad mayor por el
receptor, en comparación con la galactosa. Este "efecto de
agrupamiento" también se ha descrito para la unión y captación de
glicoproteínas o glicoconjugados que terminan en manosilo (Ponpipom
y col., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). El uso
de conjugados basados en galactosa, galactosamina o folato para
transportar compuestos exógenos a través de membranas celulares
puede proporcionar una estrategia de suministro dirigido para, por
ejemplo, el tratamiento de enfermedad hepática, cánceres hepáticos
u otros cánceres. El uso de bioconjugados también puede proporcionar
una reducción en la dosis necesaria de los compuestos terapéuticos
necesarios para el tratamiento. Además, puede modularse la
biodisponibilidad terapéutica, los parámetros farmacodinámicos y
farmacocinéticos a través del uso de bioconjugados de ácido
nucleico de la invención. Los ejemplos no limitantes de tales
bioconjugados se describen por Vargeese y col., documento USSN
10/201.394, presentado el 13 de agosto de 2001; y
Matulic-Adamic y col., documento USSN 60/362.016,
presentado el 6 marzo de 2002.
Como alternativa, determinadas moléculas de ANic
de la presente invención pueden expresarse dentro de células a
partir de promotores eucariotas (por ejemplo, Izant y Weintraub,
1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83, 399; Scanlon y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet y
col., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic y
col., 1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe y
col., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang y col.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen
y col., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9;
Sarver y col., 1990 Science, 247, 1222-1225;
Thompson y col., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good y col.,
1997, Gene Therapy, 4, 45. Los expertos en la materia comprenden que
cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas a
partir del vector de ADN/ARN apropiado. La actividad de tales
ácidos nucleicos puede aumentarse mediante su liberación a partir
del transcrito primario mediante un ácido nucleico enzimático
(Draper y col., PCT WO 93/23569, y Sullivan y col., PCT WO 94/02595;
Ohkawa y col., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27,
15-6; Taira y col., 1991, Nucleic Acids Res., 19,
5125-30; Ventura y col., 1993, Nucleic Acids Res.,
21, 3249-55; Chowrira y col., 1994, J. Biol. Chem.,
269, 25856.
En otro aspecto de la invención, pueden
expresarse moléculas de ARN de la presente invención a partir de
unidades de transcripción (véase, por ejemplo Couture y col., 1996,
TIG., 12, 510) insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores
recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden
construirse vectores virales de expresión del ANic basándose en,
pero sin limitación, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus o
alfavirus. En otra realización, se usan construcciones basadas en
pol III para expresar moléculas de ácido nucleico de la invención
(véase, por ejemplo Thompson, Patentes de Estados Unidos Nº
5.902.880 y 6.146.886). Los vectores recombinantes capaces de
expresar las moléculas de ANic pueden suministrarse como se ha
descrito anteriormente y persistir en células diana. Como
alternativa, pueden usarse vectores virales que proporcionen la
expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Tales vectores
pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez
expresada, la molécula de ANic interacciona con el ARNm diana y
genera una respuesta de iARN. El suministro de vectores de
expresión de la molécula de ANic puede ser sistémico, tal como
mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante
administración a células diana explantadas de un sujeto seguida de
la reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que
permitiría la introducción en la célula diana deseada (para una
revisión véase Couture y col., 1996, TIG., 12.510).
En un aspecto, la invención ofrece un vector de
expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica al menos una molécula de ANic de la presente invención. El
vector de expresión puede codificar una o ambas cadenas de un
dúplex de ANic o una sola cadena autocomplementaria que hibrida
consigo misma en un dúplex de ANic. Las secuencias de ácido
nucleico que codifican las moléculas de ANic de la presente
invención pueden unirse operativamente de una manera que permita la
expresión de la molécula de ANic (véase, por ejemplo Paul y col.,
2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature
Biotechnology, 19, 497; Lee y col., 2002, Nature Biotechnology, 19,
500; y Novina y col., 2002, Nature Medicine, avance de publicación
en línea doi: 10.1038/nm725).
En otro aspecto, la invención presenta un vector
de expresión que comprende: a) una región de inicio de la
transcripción (por ejemplo, región de inicio eucariota pol I, II o
III); b) una región de terminación de la transcripción (por
ejemplo, región de terminación eucariota pol I, II o III) y c) una
secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las
moléculas de ANic de la presente invención; en el que dicha
secuencia está unida operativamente a dicha región de inicio y
dicha región de terminación, de una manera que permite la expresión
y/o el suministro de la molécula de ANic. El vector puede incluir
opcionalmente una fase de lectura abierta (ORF) para una proteína
unida operativamente en el lado 5' o en el lado 3' de la secuencia
que codifica el ANic de la invención; y/o un intrón (secuencias
intermedias).
La transcripción de las secuencias de moléculas
de ANic puede dirigirse por un promotor para ARN polimerasa I (pol
I), ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III)
eucariota. Los transcritos de los promotores pol II o pol III se
expresan a niveles elevados en todas las células; los niveles de un
promotor pol II dado en un tipo de célula dado dependen de la
naturaleza de las secuencias reguladoras de genes (potenciadores,
silenciadores, etc.) presentes en las proximidades. También se usan
promotores de ARN polimerasa procariota, con la condición de que la
enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células
apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA-, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993,
Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber y col.,
1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou y col.,
1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Varios
investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico
expresadas a partir de tales promotores pueden funcionar en células
de mamífero (por ejemplo, Kashani-Sabet y col.,
1992, Antisense Res. Dev., 2,3-15; Ojwang y col.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 10802-6; Chen
y col., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu y
col., 1993, Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 6340-4;
L'Huillier y col., 1992, EMBO J., 11, 4411-8;
Lisziewicz y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90,
8000-4; Thompson y col., 1995, Nucleic Acids Res.,
23, 2259; Sullenger y Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más
específicamente, las unidades de transcripción tales como las
derivadas de genes que codifican ARN nuclear pequeño U6 (ARNnp), ARN
de transferencia (ARNt) y ARN VA de adenovirus son útiles para
generar concentraciones elevadas de moléculas de ARN deseadas tales
como ANic en células (Thompson y col., anteriormente; Couture y
Stinchcomb, 1996, anteriormente; Noonberg y col., 1994, Nucleic
Acid Res., 22, 2830; Noonberg y col., Patente de Estados Unidos Nº
5.624.803; Good y col., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman y col.,
Publicación Internacional PCT Nº WO 96/18736. Las unidades de
transcripción de ANic anteriores pueden incorporarse en una
diversidad de vectores para su introducción en células de mamífero,
incluyendo, pero sin limitación, vectores de ADN plasmídico,
vectores de ADN viral (tales como vectores de adenovirus o de virus
adenoasociados) o vectores de ARN viral (tales como vectores
retrovirales o de alfavirus) (para una revisión véase Couture y
Stinchcomb, 1996, anteriormente).
En otro aspecto, la invención presenta un vector
de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica al menos una de las moléculas de ANic de la invención de
una manera que permite la expresión de esa molécula de ANic. El
vector de expresión comprende en una realización; a) una región de
inicio de la transcripción; b) una región de terminación de la
transcripción; y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica al
menos una cadena de la molécula de ANic, en la que la secuencia está
unida operativamente a la región de inicio y la región de de
terminación de una manera que permite la expresión y/o el suministro
de la molécula de ANic.
En otra realización el vector de expresión
comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una
región de terminación de la transcripción; c) una fase de lectura
abierta; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos
una cadena de una molécula de ANic, en la que la secuencia está
unida operativamente al extremo 3' de la fase de lectura abierta y
en la que la secuencia está unida operativamente a la región de
inicio, la fase de lectura abierta y la región de terminación de una
manera que permite la expresión y/o el suministro de la molécula de
ANic. En otra realización más, el vector de expresión comprende: a)
una región de inicio de la transcripción; b) una región de
terminación de la transcripción; c) un intrón; y d) una secuencia
de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ANic, en la
que la secuencia está unida operativamente a la región de inicio,
el intrón y la región de terminación de una manera que permite la
expresión y/o el suministro de la molécula de ácido nucleico.
En otra realización, el vector de expresión
comprende: a) una región de inicio de la transcripción; b) una
región de terminación de la transcripción; c) un intrón; d) una fase
de lectura abierta; y e) una secuencia de ácido nucleico que
codifica al menos una cadena de una molécula de ANic, en la que la
secuencia está unida operativamente al extremo 3' de la fase de
lectura abierta y en la que la secuencia está unida operativamente
a la región de inicio, el intrón, la fase de lectura abierta y la
región de terminación de una manera que permite la expresión y/o el
suministro de la molécula de ANic.
Los siguientes son ejemplos no limitantes que
muestran la selección, aislamiento, síntesis y actividad de ácidos
nucleicos de la presente invención.
Ejemplo
1
Las moléculas de ANic ilustrativas de la
invención se sintetizan en tándem usando un engarce escindible, por
ejemplo, un engarce basado en succinilo. La síntesis en tándem como
se ha descrito en el presente documento viene seguida de un proceso
de purificación de una etapa que proporciona moléculas de iARN en
alto rendimiento. Esta estrategia es muy asequible para la síntesis
de ANic para respaldar la exploración de iARN de alto rendimiento y
puede adaptarse fácilmente a plataformas de síntesis multicolumna o
multipocillo.
Después de completar una síntesis en tándem de
un oligo de ANic y su complementario, en el que el grupo
dimetoxitrilo 5'-terminal
(5'-O-DMT) permanece intacto
(síntesis sobre tritilo), los oligonucleótidos se desprotegen como
se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección, se
permite que las cadenas de secuencia de ANic hibriden
espontáneamente. Esta hibridación produce un dúplex en el que una
cadena ha conservado el grupo
5'-O-DMT mientras que la cadena
complementaria comprende un 5'-hidroxilo terminal.
El dúplex recién formado se comporta como una molécula única
durante la purificación por extracción en fase sólida de rutina
(purificación sobre Tritilo) aunque sólo una molécula tiene un
grupo dimetoxitritilo. Debido a que las cadenas forman un dúplex
estable, este grupo dimetoxitritilo (o un grupo equivalente, tal
como otros grupos tritilo u otros restos hidrófobos) es todo lo que
se necesita para purificar el par de oligos, por ejemplo, usando un
cartucho C18.
Se usa química de síntesis de fosforamidita
convencional hasta el punto de introducir un engarce en tándem, tal
como un engarce de succinato abásico desoxi invertido o succinato de
glicerilo (véase la Figura 1) o un engarce escindible equivalente.
Un ejemplo no limitante de condiciones de acoplamiento de engarce
que pueden usarse incluye una base impedida estéricamente, tal como
diisopropiletilamina (DIPA) y/o DMPA en presencia de un reactivo
activador tal como Bromotripirrolidinofosfoniohexafluorurofosfato
(PyBrOP). Después de que se acople el engarce, se utiliza química
de síntesis convencional para completar la síntesis de la segunda
secuencia dejando el 5'-O-DMT
terminal intacto. Después de la síntesis, el oligonucleótido
resultante se desprotege de acuerdo con los procedimientos
descritos en el presente documento y se inactiva con un tampón
adecuado, por ejemplo con NaOAc 50 mM o NH_{4}H_{2}CO_{3} 1,5
M.
La purificación del dúplex de ANic puede
conseguirse fácilmente usando extracción en fase sólida, por ejemplo
usando un cartucho de 1 g Waters C18 SepPak acondicionado con 1
volumen de columna (VC) de acetonitrilo, 2 VC de H_{2}O y 2 VC de
NaOAc 50 mM. La muestra se carga y después se lava con 1 VC de
H_{2}O o NaOAc 50 mM. Las secuencias fallidas se eluyen con 1 VC
de ACN al 14% (solución acuosa con NaOAc 50 mM y NaCl 50 mM).
Después, la columna se lava, por ejemplo con 1 VC de H_{2}O,
seguido por detritilación en columna, por ejemplo pasando 1 VC de
ácido trifluoroacético acuoso (TFA) al 1% sobre la columna,
añadiendo después un segundo VC de TFA acuoso al 1% a la columna y
dejándolo en reposo durante aproximadamente 10 minutos. La solución
de TFA restante se retira y la columna se lava con H_{2}O seguido
por 1 VC de NaCl 1 M y H_{2}O adicional. Después, el producto de
dúplex de ANic se eluye, por ejemplo, usando 1 VC de CAN acuoso al
20%.
La Figura 2 proporciona un ejemplo de análisis
de espectrometría de masas de MALDI-TOV de una
construcción de ANic purificada en la que cada pico corresponde a
la masa calculada de una cadena de ANic individual del dúplex de
ANic. El mismo ANic purificado proporciona tres picos cuando se
analiza mediante electroforesis capilar en gel (CGE),
correspondiendo supuestamente un pico al ANic de dúplex, y
correspondiendo supuestamente dos picos a las cadenas de secuencia
de ANic separadas. El análisis de HPLC de intercambio iónico de la
misma construcción de ANic muestra únicamente un solo pico. El
ensayo de la construcción de ANic purificada usando un ensayo
indicador de luciferasa descrito más adelante demostró la misma
actividad de iARN en comparación con construcciones de ANic
generadas a partir de cadenas de secuencia de oligonucleótidos
sintetizados por separado.
Ejemplo
2
En construcciones de ANic se introdujeron
modificaciones químicas para determinar la estabilidad de estas
construcciones en comparación con oligonucleótidos de ANic nativos
(que contienen dos salientes de nucleótidos de timidina) en suero
humano. Una investigación de la estabilidad en suero de los dúplex
de ARN reveló que las construcciones de ANic consistentes en todos
los nucleótidos de ARN, que contienen dos salientes de nucleótidos
de timidina, tienen una semivida en suero de 15 segundos, mientras
que las construcciones de ANic modificadas químicamente permanecen
estables en suero durante 1 a 3 días dependiendo del grado de
modificación. Se realizaron ensayos de estabilidad de la iARN
marcando internamente una cadena (cadena 1) de ANic y formando
dúplex con 1,5 X la concentración de la cadena de ANic
complementaria (cadena 2) (para asegurar que todo el material
marcado estaba en forma de dúplex). Las construcciones de ANic en
forma de dúplex se ensayaron después para determinar la estabilidad
incubando a una concentración final de 2 \muM de ANic
(concentración de las 2 cadenas) en suero de ratón o humano al 90%
durante los puntos temporales de 30 s, 1 min, 5 min, 30 min, 90
min, 4 h 10 min, 16 h 24 min y 49 h. Los puntos temporales se
procesaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 15% y se
analizaron en un Phosphoimager.
El marcaje interno se realizó mediante
reacciones quinasa con polinucleótido quinasa (PNK) y
^{32}P-\gamma-ATP, con adición
de fosfato radiomarcado en el nucleótido 13 de la cadena 2, contando
desde el lado 3'. El ligamiento de los fragmentos de 8 unidades
restantes con ARN ligasa de T4 dio como resultado la cadena 2 de
longitud completa de 21 unidades. La formación de dúplex de iARN se
realizó añadiendo concentraciones apropiadas de los
oligonucleótidos de ANic y calentando a 95ºC durante 5 min seguido
de un lento enfriamiento a temperatura ambiente. Las reacciones se
realizaron añadiendo suero al 100% a los dúplex de ANic e incubando
a 37ºC, y después retirando alícuotas a los puntos temporales
deseados. Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 3.
Como se muestra en la Figura 3, las moléculas de ANic modificadas
químicamente (por ejemplo, las SEC ID Nº: 925/927, 925/928,
925/929, 925/930 y 925/931) tienen una estabilidad en suero
significativamente aumentada en comparación con una construcción de
ANic que tiene todo ribonucleótidos excepto una modificación
ditimidina (TT) 3'-terminal (por ejemplo, SEC ID Nº:
925/926).
Ejemplo
3
Se exploró la secuencia de una diana de ARN de
interés, tal como un transcrito de ARNm viral o humano, para
detectar sitios diana, por ejemplo usando un algoritmo de
plegamiento informatizado. En un ejemplo no limitante, se usa la
secuencia de un gen o un transcrito de un gen de ARN derivado de una
base de datos, tal como Genbank, para generar dianas de ANic que
tienen complementariedad con la diana. Dichas secuencias pueden
obtenerse a partir de una base de datos o pueden determinarse
experimentalmente como se conoce en la técnica. Los sitios diana
que se conocen, por ejemplo, los sitios diana que se ha determinado
que son eficaces basándose en estudios con otras moléculas de ácido
nucleico, por ejemplo, ribozimas o antisentido, o las dianas que se
sabe que están asociadas con una enfermedad o afección tal como los
sitios que contienen mutaciones o deleciones, pueden usarse para
diseñar moléculas de ANic que se dirijan a esos sitios. Pueden
usarse varios parámetros para determinar qué sitios son los sitios
diana más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. Esos
parámetros incluyen, pero sin limitación, la estructura secundaria
o terciaria del ARN, la composición de las bases de nucleótidos de
la secuencia diana, el grado de homología entre diversas regiones de
la secuencia diana o la posición relativa de la secuencia diana
dentro del transcrito de ARN. Basándose en estas determinaciones,
puede seleccionarse cualquier número de sitios diana dentro del
transcrito de ARN para explorar moléculas de ANic para determinar
su eficacia, por ejemplo, usando ensayos de escisión de ARN in
vitro, cultivos de células o modelos animales. En un ejemplo no
limitante, dentro del transcrito se seleccionan cualquiera de 1 a
1000 sitios diana basándose en el tamaño de la construcción de ANic
a usar. Usando procedimientos conocidos en la técnica, pueden
desarrollarse ensayos de exploración de alto rendimiento para
explorar moléculas de ANic, tales como ensayos multipocillo o
multiplaca o ensayos de exploración de bibliotecas
combinatorias/ANic para determinar la reducción eficaz en la
expresión del gen diana.
Ejemplo
4
Para realizar la selección de ANic que se
dirigen a una secuencia génica o transcrito dado pueden usarse las
siguientes etapas no limitantes.
La secuencia diana se descompone mediante
simulación por ordenador en una lista de todos los fragmentos o
subsecuencias de una longitud particular, por ejemplo, fragmentos de
23 nucleótidos, incluidos en la secuencia diana. Esta etapa se
realiza típicamente usando un lenguaje de programación Perl
habitual, aunque también pueden emplearse programas de análisis de
secuencia comerciales tales como Oligo, MacVector o el Paquete
Informático GCG de Wisconsin.
En algunos casos, los ANic corresponden a más de
una secuencia diana; como sería el caso, por ejemplo, de la
dirección a diferentes transcritos del mismo gen, la dirección a
diferentes transcritos de más de un gen o la dirección tanto a los
genes humanos como a un homólogo animal. En este caso, se genera una
lista de subsecuencias de una longitud particular para cada una de
las dianas y después las listas se comparan para encontrar las
secuencias coincidentes en cada lista. Después, las subsecuencias se
clasifican de acuerdo con el número de secuencias diana que
contienen la subsecuencia determinada; el objetivo es encontrar
subsecuencias que estén presentes en la mayoría o en todas las
secuencias diana. Como alternativa, la clasificación puede
identificar subsecuencias que sean únicas para una secuencia diana,
tal como una secuencia diana mutante. Dicho enfoque permitiría el
uso de un ANic para dirigirse específicamente a la secuencia mutante
y no efectuar la expresión de la secuencia normal.
En algunos casos, las subsecuencias de ANic
están ausentes en una o más secuencias aunque están presentes en la
secuencia diana deseada; éste sería el caso cuando el ANic se dirige
a un gen con un miembro de la familia parálogo que no debe ser
diana. Como en el caso 2 anterior, se genera una lista de
subsecuencias de una longitud particular para cada una de las
dianas, y después las listas se comparan para encontrar secuencias
que están presentes en el gen diana pero ausentes en el parálogo no
diana.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden
analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con el contenido
en GC. Puede proporcionarse una preferencia para sitios que
contienen el 30-70% de GC, con una preferencia
adicional para sitios que contienen el 40-60% de
GC.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden
analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con el
autoplegamiento y horquillas internas. Se prefieren los
plegamientos internos más débiles; deben evitarse estructuras en
horquilla fuertes.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden
analizarse y clasificarse adicionalmente según tengan series de GGG
o CCC en la secuencia. GGG (o incluso más G) en cualquier cadena
puede hacer problemática la síntesis de oligonucleótidos y
potencialmente puede interferir con la actividad de la iARN, de
manera que se evita siempre que se disponga de otras secuencias
apropiadamente adecuadas. En la cadena diana se busca CCC porque
esto situará a GGG en la cadena antisentido.
Las subsecuencias de ANic clasificadas pueden
analizarse y clasificarse adicionalmente de acuerdo con si tienen
el dinucleótido UU (dinucleótido de uridina) en el extremo 3' de la
secuencia y/o AA en el extremo 5' de la secuencia (para
proporcionar UU en 3' en la secuencia antisentido). Estas secuencias
permiten el diseño de moléculas de ANic con dinucleótidos de
timidina TT terminales.
De la lista de subsecuencias clasificada, como
se ha descrito anteriormente, se seleccionan cuatro o cinco sitios
diana. Por ejemplo, en subsecuencias que tienen 23 nucleótidos, los
21 nucleótidos a la derecha de cada subsecuencia de 23 unidades
seleccionada se diseñan y sintetizan para la cadena superior (con
sentido) del dúplex de ANic, mientras que el complementario inverso
de los 21 nucleótidos a la izquierda de cada subsecuencia de 23
unidades seleccionada se diseña y se sintetiza para la cadena
inferior (antisentido) del dúplex de ANic (véase la Tabla I). Si
para la secuencia se desean restos TT terminales (como se describe
en el párrafo 7), entonces los dos nucleótidos
3'-terminales de las cadenas con sentido y
antisentido se sustituyen por TT antes de realizar la síntesis de
los oligonucleótidos.
Las moléculas de ANic se exploran en un cultivo
celular in vitro o en un sistema de modelo animal para
identificar la molécula de ANic más activa o el sitio diana más
preferido dentro de la secuencia de ARN diana.
En un enfoque alternativo, se usa un conjunto de
construcciones de ANic específico para una secuencia diana para
explorar sitios diana en células que expresan ARN diana, tales como
células HeLa humanas. En la Figura 21 se muestra la estrategia
general usada en este enfoque. Un ejemplo no limitante de dicho
conjunto es un conjunto que comprende secuencias que tienen
secuencias antisentido complementarias a la secuencia de ARN diana
y secuencias con sentido complementarias a las secuencias
antisentido. Las células (por ejemplo, células HeLa) que expresan
el gen diana se transfectan con el conjunto de construcciones de
ANic y se clasifican las células que demuestran un fenotipo
asociado con silenciamiento génico. El conjunto de construcciones de
ANic puede modificarse químicamente como se ha descrito en el
presente documento y sintetizarse, por ejemplo, en un modo de alto
rendimiento. Se identifica el ANic de células que demuestran un
cambio fenotípico positivo (por ejemplo, niveles de ARNm diana o
expresión de la proteína diana reducidos), por ejemplo por análisis
posicional dentro del ensayo, y se usa para determinar el sitio (o
los sitios) diana más adecuado dentro de la secuencia de ARN diana
basándose en la secuencia complementaria a la cadena antisentido de
ANic correspondiente identificada en el ensayo.
Ejemplo
5
El ácido nucleico de interferencia corto (ANic)
está surgiendo como una poderosa herramienta para la regulación
génica. Los dúplex de ANic constituidos totalmente por ribosa
activan la ruta de la iARN pero tienen utilidad limitada como
compuestos terapéuticos debido a su sensibilidad a nucleasa y a la
corta semivida en suero, como se muestra en el Ejemplo 2 anterior.
Para desarrollar construcciones de ANic resistentes a nucleasa para
aplicaciones in vivo, se ensayaron los ANic que se dirigen al
ARNm de luciferasa y que contienen modificaciones químicas
estabilizantes para determinar la actividad en células HeLa. En la
Tabla I se muestran las secuencias para las secuencias de
oligonucleótidos de ANic usadas en este estudio. Las modificaciones
incluían enlaces fosforotioato (P=S), 2'O-metil nucleótidos
o 2'-fluoro (F) nucleótidos en una o en las dos
cadenas de ANic y diversas químicas de estabilización en el extremo
3', que incluyen 3'-glicerilo, abásico
3'-invertido, Timidina 3'-invertida
y/o Timidina. El ANic activo que contiene modificaciones
estabilizantes tales como las descritas en el presente documento
debe resultar útil para aplicaciones in vivo.
Se utilizó un sistema indicador de luciferasa
para ensayar la actividad de la iARN de las construcciones de ANic
modificadas químicamente en comparación con construcciones de ANic
constituidas por nucleótidos totalmente de ARN que contienen dos
salientes de nucleótidos de timidina. Las cadenas con sentido y
antisentido del ANic (20 \muM de cada una) se hibridaron por
incubación en tampón (acetato de potasio 100 mM,
HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM)
durante 1 min a 90ºC seguido de 1 hora a 37ºC. Los plásmidos que
codifican la luciferasa de luciérnaga (pGL2) y la luciferasa de
renilla (pRLSV40) se adquirieron en Promega Biotech.
Se cultivaron células S3 HeLa a 37ºC en DMEM con
FBS al 5% y 24 horas antes de la transfección se sembraron 15.300
células en 100 \mul de medio por pocillo de una placa de 96
pocillos. Para la transfección, se añadieron 4 \mul de
Lipofectamina 2000 (Life Technologies) a 96 \mul de
OPTI-MEM, se sometió a agitación vorticial y se
incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, se
añadieron 100 \mul de lípido diluido a un tubo de microtitulación
que contenía 5 \mul de pGL2 (200 ng/\mul), 5 \mul de pRLSV40
(8 ng/\mul), 6 \mul de ANic (25 nM o 10 nM final) y 84 \mul
de OPTI-MEM, la mezcla se sometió brevemente a
agitación vorticial y se incubó a temperatura ambiente durante 20
minutos. La mezcla de transfección se mezcló después brevemente y
se añadieron 50 \mul a cada uno de tres pocillos que contenían
células S3 HeLa en 100 \mul de medio. Las células se incubaron
durante 20 horas después de la transfección y se analizaron para
determinar la expresión de luciferasa usando el ensayo de
luciferasa Doble de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Promega Biotech). Los resultados de este estudio se resumen en las
Figuras 4-16. Las secuencias de las cadenas de ANic
usadas en este estudio se muestran en la Tabla I y en las figuras se
indican por Nº RPI. La actividad luciferasa normalizada se indica
como la proporción de la actividad luciferasa de luciérnaga con
respecto a la actividad de luciferasa de renilla en la misma
muestra. Las barras de error representan desviaciones típicas de
transfecciones por triplicado. Como se muestra en las Figuras
4-16, la actividad de la iARN de las construcciones
modificadas químicamente es comparable con la de las construcciones
de ANic de control, que consisten por completo en ribonucleótidos
en cada posición excepto el extremo 3' que comprende dos salientes
de nucleótidos de timidina. En algunos casos, la actividad de la
iARN de las construcciones modificadas químicamente es superior a
la construcción de ANic que consiste por completo en ribonucleótidos
en cada posición excepto el extremo 3' que comprende dos salientes
de nucleótidos de timidina. Por ejemplo, la Figura 4 muestra los
resultados obtenidos de una exploración usando construcciones de
ANic modificadas con fosforotioato; la construcción RPI 27654/27659
contiene sustituciones de fosforotioato para cada nucleótido de
pirimidina en ambas secuencias, la construcción RPI 27657/27662
contiene sustituciones de 3'-fosforotioato
5'-terminales en cada cadena, la construcción RPI
27649/27658 contiene todas las sustituciones de fosforotioato
solamente en la cadena antisentido, mientras que las construcciones
RPI 27649/27660 y RPI 27649/27661 tienen cadenas con sentido no
modificadas y grados de sustituciones de fosforotioato variables en
la cadena antisentido. Todas estas construcciones muestran una
actividad de iARN significativa cuando se comparan con un ANic
desorganizado.
La Figura 5 muestra los resultados obtenidos de
una exploración usando sustituciones con fosforotioato (RPI
28253/28255 y RPI 28254/28256) y sustituciones de bases universales
(RPI 28257/28259 y RPI 28258/28260) en comparación con los mismos
controles descritos anteriormente. Como se muestra, estas
combinaciones muestran una actividad de iARN equivalente o mejorada
cuando se compara con la construcción de ANic de control.
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos de
una exploración usando construcciones de ANic modificadas con
2'-O-metilo en las que la cadena con
sentido contiene 10 (RPI 28244/27650) o 5 (RPI 28245/27650)
sustituciones 2'-O-metilo, ambas
con actividad comparable con la construcción de ANic de control.
La Figura 7 muestra los resultados obtenidos de
una exploración usando construcciones de ANic modificadas con
2'-O-metilo o
2'-desoxi-2'-fluoro
en comparación con una construcción de control que consiste
completamente en ribonucleótidos en cada posición excepto en el
extremo 3' que comprende dos salientes de nucleótidos de
timi-
dina.
dina.
La Figura 8 compara una construcción de ANic que
contiene seis sustituciones de fosforotioato en cada cadena (RPI
28460/28461), en la que 5 fosforotioatos están presentes en el
extremo 3' y un solo fosforotioato está presente en el extremo 5'
de cada cadena. Este motivo muestra una actividad muy similar con
respecto a la construcción de ANic de control que consiste
completamente en ribonucleótidos en cada posición excepto en el
extremo 3', que comprende dos salientes de nucleótidos de
timidina.
La Figura 9 compara una construcción de ANic
sintetizada por el procedimiento de la invención descrito en el
Ejemplo 1, en el que se usó un engarce de succinato abásico desoxi
invertido para generar un ANic que tiene una protección abásica
desoxi invertida 3' en la cadena antisentido del ANic. Esta
construcción muestra actividad mejorada en comparación con la
construcción de ANic de control (siGL2) que consiste totalmente en
ribonucleótidos en cada posición excepto en el extremo 3' que
comprende dos salientes de nucleótidos de timidina.
La Figura 10 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de la iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente que incluyen construcciones de ANic
modificadas con 3'-glicerilo en comparación con una
construcción de ANic de control toda de ARN usando un sistema
indicador de luciferasa. Estos ANic modificados químicamente se
compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente
documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de
ANic todo de ARN (siGL2) que tenía ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). La columna "células" indica el nivel de fondo de
la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con
sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas
químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a
estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la
Figura, las construcciones de ANic modificadas en posición
3'-terminal conservan una actividad de iARN
significativa en comparación con la construcción de ANic de control
(siGL2).
La Figura 11 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente. La exploración comparaba diversas
combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y
modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic
modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal (TT) y su
correspondiente control invertido (Inv siGL2). La columna
"células" indica el nivel de fondo de la expresión de
luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con sentido y
antisentido de las construcciones de ANic modificadas químicamente
se muestran mediante el número RPI (cadena con sentido/cadena
antisentido). Las secuencias correspondientes a estos números RPI
se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la figura, las
construcciones RPI 30063/30430, RPI 30433/30430 y RPI 30063/30224
modificadas químicamente conservan una actividad de iARN
significativa en comparación con la construcción de ANic de
control. Debe observarse que la RPI 30433/30430 es una construcción
de ANic que no tiene ribonucleótidos que conserva una actividad de
iARN significativa en comparación con la construcción siGL2 de
control in vitro, por lo tanto, se espera que esta
construcción tenga una actividad de iARN similar y una estabilidad
mejorada en comparación con las construcciones de ANic que tienen
ribonucleótidos in vivo.
La Figura 12 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente. La exploración compara diversas
combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y
modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic
modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
control invertido (Inv siGL2). La columna "células" indica el
nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las "células
HeLa". Las cadenas con sentido y antisentido de las
construcciones de ANic modificadas químicamente se muestran mediante
el número RPI (cadena con sentido/cadena antisentido). Las
secuencias correspondientes a estos números RPI se muestran en la
Tabla I. Como se muestra en la figura, las construcciones RPI
30063/30224 y RPI 30063/30430 modificadas químicamente conservan
una actividad de iARN significativa en comparación con la
construcción de ANic de control (siGL2). Además, se compararon la
cadena antisentido en solitario (RPI 30430) y un control invertido
(RPI 30227/30229, que tiene la misma química que el RPI 30063/30224)
con los dúplex de ANic descritos anteriormente. La cadena
antisentido (RPI 30430) en solitario proporciona mucha menos
inhibición en comparación con los dúplex de ANic usando esta
secuencia.
La Figura 13 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente. La exploración comparó diversas
combinaciones de modificaciones químicas de la cadena con sentido y
modificaciones químicas de la cadena antisentido. Estos ANic
modificados químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa
descrito en el presente documento a una concentración de 1 nM y 10
nM usando un control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene
ditimidina (TT) 3'-terminal y su correspondiente
control invertido (Inv siGL2). La columna "células" indica el
nivel de fondo de la expresión de luciferasa en las células HeLa.
Las cadenas con sentido y antisentido de las construcciones de ANic
modificadas químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena
con sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a
estos números RPI se muestran en la Tabla I. Además, se comparó un
control invertido (RPI 30226/30229, que tenía la misma química que
el RPI 30222/30224) con los dúplex de ANic descritos anteriormente.
Como se muestra en la figura, las construcciones RPI 28251/30430,
RPI 28251/30224 y RPI 30222/30224 modificadas químicamente conservan
una actividad de iARN significativa en comparación con las
construcciones de ANic de control, y la construcción RPI 28251/30430
modificada químicamente demuestra una actividad mejorada en
comparación con la construcción de ANic de control
(siGL2).
(siGL2).
La Figura 14 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de la iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente que incluyen diversas construcciones de
ANic modificadas en posición 3'- terminal en comparación con una
construcción de ANic de control toda de ARN usando un sistema
indicador de luciferasa. Estos ANic modificados químicamente se
compararon en el ensayo de luciferasa descrito en el presente
documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un control de
ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). La columna "células" indica el nivel de fondo de
la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con
sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas
químicamente se muestran mediante el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a
estos números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la
figura, las construcciones RPI 30222/30546, 30222/30224,
30222/30551, 30222/30557 y 30222/30558 modificadas químicamente
conservan una actividad de iARN significativa en comparación con la
construcción de ANic de control.
La Figura 15 muestra los resultados de una
exploración de la actividad de iARN de construcciones de ANic
modificadas químicamente. La exploración comparó diversas
combinaciones de químicas de cadena con sentido en comparación con
una química de cadena antisentido fijada. Estos ANic modificados
químicamente se compararon en el ensayo de luciferasa descrito en
el presente documento a una concentración de 1 nM y 10 nM usando un
control de ANic todo de ARN (siGL2) que tiene ditimidina (TT)
3'-terminal y su correspondiente control invertido
(Inv siGL2). La columna "células" indica el nivel de fondo de
la expresión de luciferasa en las células HeLa. Las cadenas con
sentido y antisentido de las construcciones de ANic modificadas
químicamente se muestran por el número RPI (cadena con
sentido/cadena antisentido). Las secuencias correspondientes a estos
números RPI se muestran en la Tabla I. Como se muestra en la
figura, todas las construcciones RPI 30063/30430, 30434/30430 y
30435/30430 modificadas químicamente demuestran una mayor actividad
en comparación con la construcción de ANic de control
(siGL2).
(siGL2).
Ejemplo
6
Se realizó un ensayo de titulación para
determinar el intervalo inferior de la concentración de ANic
necesaria para la actividad de iARN en una construcción de ANic de
control que consiste en nucleótidos de ARN por completo que
contiene dos salientes del nucleótido timidina y una construcción de
ANic modificada químicamente que comprende 5 enlaces fosforotioato
internucleotídicos tanto en la cadena con sentido como en la
antisentido. El ensayo se realizó como se ha descrito
anteriormente, sin embargo, las construcciones de ANic se diluyeron
a concentraciones finales de entre 2,5 nM y 0,025 nM. Los resultados
se muestran en la Figura 16. Como se muestra en la Figura 16, la
construcción de ANic modificada químicamente muestra un perfil de la
actividad de iARN dependiente de la concentración muy similar al de
la construcción de ANic de control cuando se comparó con un control
de secuencia de ANic
invertida.
invertida.
Ejemplo
7
Se seleccionaron sitios diana del ANic
analizando secuencias del ARN diana y priorizando opcionalmente los
sitios diana basándose en el plegamiento (estructura de cualquier
secuencia determinada analizada para determinar la accesibilidad
del ANic a la diana), usando una biblioteca de moléculas de ANic
como se describe en el Ejemplo 4 o, de manera alternativa, usando
un sistema de ANic in vitro como se describe en el Ejemplo 9
en el presente documento. Se diseñaron moléculas de ANic que
pudieran unirse a cada diana y se analizaron de manera opcional
individualmente por plegamiento informatizado para evaluar si la
molécula de ANic podía interaccionar con la secuencia diana. Para
optimizar la actividad, puede seleccionarse la variación de la
longitud de las moléculas de ANic. Generalmente, se selecciona una
cantidad suficiente de bases de nucleótidos complementarias para
unirse a, o interaccionar de otra manera con, el ARN diana, pero el
grado de complementariedad puede modularse para acomodar dúplex de
ANic o longitudes o composiciones de bases variables. Usando dichas
metodologías, pueden diseñarse moléculas de ANic para sitios diana
dentro de cualquier secuencia de ARN conocida, por ejemplo las
secuencias de ARN correspondientes a cualquier trascripto
génico.
Se diseñan construcciones de ANic modificadas
químicamente para proporcionar estabilidad frente a nucleasas para
la administración sistémica in vivo y/o propiedades
farmacocinéticas, de localización y suministro mejoradas
conservando al mismo tiempo la capacidad de mediar la actividad de
iARN. Las modificaciones químicas como se describe en el presente
documento se introducen sintéticamente usando procedimientos
sintéticos descritos en el presente documento y los conocidos
generalmente en la técnica. Después, las construcciones de ANic
sintéticas se ensayan para determinar la estabilidad frente a
nucleasas en suero y/o en extractos celulares/tisulares (por
ejemplo, extractos de hígado). Las construcciones de ANic sintéticas
también se ensayan en paralelo para determinar la actividad de iARN
usando un ensayo apropiado, tal como un ensayo indicador de
luciferasa como se describe en el presente documento u otro ensayo
adecuado que pueda cuantificar la actividad de iARN. Las
construcciones de ANic sintéticas que poseen estabilidad a nucleasa
y actividad de iARN pueden modificarse adicionalmente y volverse a
evaluar en ensayos de estabilidad y actividad. Después, las
modificaciones químicas de las construcciones de ANic activas
estabilizadas pueden aplicarse a cualquier secuencia de ANic que se
dirija a cualquier ARN seleccionado y usarse, por ejemplo, en
ensayos de exploración de dianas para escoger compuestos de ANic
líderes para el desarrollo terapéutico (véase, por ejemplo, la
Figura 24).
Ejemplo
8
Pueden diseñarse moléculas de ANic para
interaccionar con diversos sitios en el ARN mensajero, por ejemplo,
secuencias diana dentro de las secuencias de ARN descritas en el
presente documento. La secuencia de una cadena de la molécula (o
moléculas) de ANic es complementaria a las secuencias del sitio
diana descritas anteriormente. Las moléculas de ANic pueden
sintetizarse químicamente usando procedimientos descritos en el
presente documento. Pueden sintetizarse moléculas de ANic inactivas
que se usan como secuencias de control desorganizando la secuencia
de las moléculas de ANic de tal manera que no sea complementaria a
la secuencia diana. Generalmente, pueden sintetizarse
construcciones de ANic usando procedimientos de síntesis de
oligonucleótidos en fase sólida como se describe en el presente
documento (véase por ejemplo Usman y col., Patentes de Estados
Unidos Nº 5.804.683; 5.831.071; 5.998.203; 6.117.657; 6.353.098;
6.362.323; 6.437.117; 6.469.158; Scaringe y col., Patentes de
Estados Unidos Nº 6.111.086; 6.008.400; 6.111.086 todos ellos
incorporados por referencia en el presente documento en su
totalidad).
totalidad).
En un ejemplo no limitante, los oligonucleótidos
de ARN se sintetizan por etapas usando la química de fosforamidita
como se conoce en la técnica. La química convencional de
fosforamidita implica el uso de nucleósidos que comprenden
cualquiera de los grupos
5'-O-dimetoxitritilo,
2'-O-terc-butildimetilsililo,
3'-O-2-cianoetil
N,N-diisopropilfosforamidita y grupos de protección
de amina exocíclicos (por ejemplo N6-benzoil
adenosina, N4 acetil citidina y N2-isobutiril
guanosina). De manera alternativa, pueden usarse éteres de
2'-O-sililo junto con grupos de
protección 2'-O-ortoéster lábil a
ácidos en la síntesis del ARN como describe Scaringe, citado
anteriormente. Diferentes químicas 2' pueden requerir diferentes
grupos de protección, por ejemplo los nucleósidos
2'-desoxi-2'amino pueden utilizar
la protección con N-ftaloílo como describen Usman y
col., en la Patente de Estados Unidos 5.631.360 incorporada por
referencia en el presente documento en su totalidad).
Durante la síntesis en fase sólida, cada
nucleótido se añade secuencialmente (en dirección 3' a 5') al
oligonucleótido unido al soporte sólido. El primer nucleósido en el
extremo 3' de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido
(por ejemplo, vidrio o poliestireno de tamaño de poro controlado)
usando diversos engarces. Se combinan el precursor del nucleótido,
una fosforamidita de ribonucleósido y un activador dando como
resultado el acoplamiento de la segunda fosforamidita de nucleósido
sobre el extremo 5' del primer nucleósido. Después, el soporte se
lava y todos los grupos 5'-hidroxilo que no han
reaccionado se protegen con un reactivo de protección tal como
anhídrido acético para proporcionar restos
5'-acetilo inactivos. Después, el enlace fosforoso
trivalente se oxida para proporcionar un enlace fosfato más
estable. Al final del ciclo de adición de nucleótidos, el grupo de
protección 5'-O se escinde en condiciones adecuadas
(por ejemplo, condiciones ácidas para grupos basados en tritilo y
fluoruro para grupos basados en sililo). El ciclo se repite para
cada nucleótido posterior.
La modificación de las condiciones de síntesis
puede usarse para optimizar la eficacia de acoplamiento usando, por
ejemplo, diferentes tiempos de acoplamiento, diferentes
concentraciones de reactivo/fosforamidita, diferentes tiempos de
contacto, diferentes soportes sólidos y químicas de engarces de
soporte sólido dependiendo de la composición química particular del
ANic a sintetizar. La desprotección y purificación del ANic puede
realizarse como describen generalmente Usman y col., en los
documentos US 5.831.071, US 6.353.098, US 6.437.117, y Bellon y
col., en los documentos US 6.054.576, US 6.162.909, US 6.303.773,
incorporados por referencia en el presente documento en su
totalidad o Scaringe citado anteriormente. Adicionalmente, las
condiciones de desprotección pueden modificarse para proporcionar
el mejor rendimiento y pureza posibles de las construcciones de
ANic. Por ejemplo, el solicitante ha observado que los
oligonucleótidos que comprenden
2'-desoxi-2'-fluoro
nucleótidos pueden degradarse en condiciones de desprotección
inadecuadas. Dichos oligonucleótidos se desprotegen usando
metilamina acuosa a aproximadamente 35ºC durante 30 minutos. Si el
oligonucleótido que contiene
2'-desoxi-2'-fluoro
también comprende ribonucleótidos, después de la desprotección con
metilamina acuosa a aproximadamente 35ºC durante 30 minutos, se
añade TEA-HF y la reacción se mantiene a
aproximadamente 65ºC durante 15 minutos adicionales.
Ejemplo
9
Se usó un ensayo in vitro que resume la
iARN en un sistema acelular para evaluar las construcciones de ANic
específicas para el ARN diana. El ensayo comprende el sistema
descrito por Tuschl y col., 1999, Genes and Development, 13,
3191-3197 y Zamore y col., 2000, Cell, 101,
25-33 adaptado para su uso con ARN diana. Se usó un
extracto de Drosophila derivado de blastodermo sincitial para
reconstituir la actividad de la iARN in vitro. El ARN diana
se generó mediante transcripción in vitro a partir de un
plásmido apropiado usando ARN polimerasa de T7 o mediante síntesis
química como se describe en el presente documento. Las cadenas de
ANic con sentido y antisentido (cada una, por ejemplo, a 20 uM) se
hibridaron por incubación en tampón (tal como acetato de potasio
100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio
2 mM) durante 1 minuto a 90ºC seguido de 1 hora a 37ºC, y después
se diluyeron en tampón de lisis (por ejemplo acetato de potasio 100
mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, acetato de magnesio 2
mM). La hibridación puede controlarse por electroforesis en gel
sobre un gel de agarosa en tampón de TBE y teñirse con bromuro de
etidio. El lisado de Drosophila se preparó usando embriones de cero
a dos horas de edad de moscas Oregon R recogidos sobre agar de
melaza fermentado que están desprovistos de corion y lisados. El
lisado se centrifugó y el sobrenadante se aisló. El ensayo
comprendía una mezcla de reacción que contenía lisado al 50%
[vol/vol], ARN (concentración final de 10-50 pM) y
tampón de lisis al 10% [vol/vol] que contenía ANic (concentración
final de 10 nM). La mezcla de reacción también contenía fosfato de
creatina 10 nM, creatina fosfoquinasa a 10 ug.ml, GTP 100 uM, UTP
100 uM, CTP 100 uM, ATP 500 uM, DTT 5 mM, RNasin 0,1 U/ul
(Promega), y 100 uM de cada aminoácido. La concentración final de
acetato potásico se ajustó a 100 mM. Las reacciones se
pre-ensamblaron en hielo y se preincubaron a 25ºC
durante 10 minutos antes de añadir ARN, después se incubaron a 25ºC
durante 60 minutos adicionales. Las reacciones se inactivaron con 4
volúmenes de 1,25 x de Tampón de Lisis Pasivo (Promega). La escisión
del ARN diana se ensayó mediante análisis RT-PCR u
otros procedimientos conocidos en la técnica y se comparó con las
reacciones de control en las que se excluyó el ANic de la
reacción.
Como alternativa, para el ensayo se preparó ARN
diana marcado internamente mediante transcripción in vitro
en presencia de [alfa-^{32}P]CTP, pasado
sobre una columna G50 Sephadex por cromatografía tipo spin y se usó
como ARN diana sin purificación adicional. Opcionalmente, el ARN
diana se marcó en el extremo 5' con ^{32}P usando la enzima
polinucleótido quinasa de T4. Los ensayos se realizaron como se ha
descrito anteriormente y el ARN diana y los productos de escisión
del ARN específicos generados por la iARN se visualizaron sobre una
autorradiografía de un gel. El porcentaje de escisión se determinó
por cuantificación mediante Phosphor Imager® de bandas que
representan ARN de control intacto o ARN de reacciones de control
sin ANic y los productos de escisión generados por el ensayo.
En una realización, este ensayo se usó para
determinar sitios diana del ARN diana para la escisión de iARN
mediada por ANic, en el que se exploró una pluralidad de
construcciones de ANic para la escisión del ARN diana mediada por
iARN, por ejemplo, analizando la reacción de ensayo por
electroforesis del ARN diana marcado o por transferencia de
Northern, así como por otra metodología bien conocida en la
técnica.
Ejemplo
10
Se diseñaron moléculas de ANic dirigidas al ARN
diana y se sintetizaron como se ha descrito anteriormente. Estas
moléculas de ácido nucleico pueden ensayarse para determinar la
actividad de escisión in vivo, usando, por ejemplo, el
siguiente procedimiento.
Se usaron dos formatos para ensayar la eficacia
de los ANic que se dirigen a un transcrito génico particular. En
primer lugar, se ensayaron los reactivos en células de expresión
diana (por ejemplo, HeLa), para determinar el grado de inhibición
del ARN y de la proteína. Se seleccionaron reactivos del ANic frente
a la diana de ARN. La inhibición del ARN se midió después de
administrar estos reactivos mediante un agente de transfección
adecuado a células. Las cantidades relativas del ARN diana se
midieron frente a actina usando PCR a tiempo real controlando la
amplificación (por ejemplo, ABI 7700 Taqman®). Se realizó una
comparación con una mezcla de secuencias de oligonucleótidos
fabricada para dianas no relacionadas o para un control de ANic
aleatorizado con la misma longitud y química global, pero
sustituidas aleatoriamente en cada posición. Se seleccionaron
reactivos primarios y secundarios líder para la diana y se realizó
la optimización. Después de seleccionar una concentración de agente
de transfección óptima, se realizó un transcurso de tiempo de
inhibición de ARN con la molécula de ANic líder. Además, para
determinar la inhibición del ARN, puede usarse un formato de siembra
de células en placa.
El día anterior a la transfección, se sembraron
células (por ejemplo HeLa), por ejemplo, a 1 x 10^{5} células por
pocillo de una placa de seis pocillos, en EGM-2
(BioWhittaker). Se formó un complejo de ANic (concentración final,
por ejemplo, 20 nM) y lípido catiónico (por ejemplo, concentración
final 2 \mug/ml) en medio basal EGM (BioWhittaker) a 37ºC durante
30 minutos en tubos de poliestireno. Después de someter a agitación
vorticial, el ANic que formaba complejos se añadió a cada pocillo y
se incubó durante los tiempos indicados. Para los experimentos de
optimización iniciales, las células se sembraron, por ejemplo, a 1 x
10^{3} en placas de 96 pocillos y se añadieron los complejos de
ANic como se describe. La eficacia del suministro de ANic a las
células se determinó usando un ANic fluorescente que formaba
complejos con lípido. Las células en placas de 6 pocillos se
incubaron con ANic durante 24 horas, se aclararon con PBS y se
fijaron en paraformaldehído al 2% durante 15 minutos a temperatura
ambiente. La captación de ANic se visualizó usando un microscopio
fluorescente.
Se preparó ARN total a partir de células después
de suministro del ANic, por ejemplo, usando kits de purificación de
ARN Qiagen para ensayos de 6 pocillos o kits de extracción Rneasy
para ensayos de 96 pocillos. Para el análisis Taqman, se
sintetizaron sondas doblemente marcadas con el colorante indicador,
FAM o JOE, unido covalentemente al extremo 5' y el colorante de
inactivación TAMRA conjugado al extremo 3'. Se realizaron
amplificaciones por RT-PCR de una etapa en, por
ejemplo, el Detector de Secuencia ABI PRISM 7700 usando reacciones
de 50 \mul que consistían en 10 \mul de ARN total, cebador
directo 100 nM, cebador inverso 900 nM, sonda 100 nM, tampón de
reacción de PCR TaqMan 1X (PE-Applied Biosystems),
MgCl_{2} 5,5 nM, 300 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP,
inhibidor de RNasa 10U (Promega), 1,25 U de AmpliTaq Gold
(PE-Applied Biosystems) y 10 U de Transcriptasa
Inversa M-MLV (Promega). Las condiciones de ciclado
térmico pueden consistir en 30 min a 48ºC, 10 min a 95ºC, seguido
por 40 ciclos de 15 s a 95ºC y 1 min a 60ºC. La cuantificación de
los niveles del ARNm se determina con respecto a los patrones
generados a partir de ARN celular total diluido en serie (300, 100,
33, 11 ng/rxn) y normalizados con respecto al ARNm de
\beta-actina o GAPDH en reacciones TaqMan en
paralelo. Para cada gen de interés se diseñó un cebador superior e
inferior y una sonda marcada con fluorescencia. La incorporación a
tiempo real del colorante SYBR Green I en un producto de PCR
específico puede medirse en tubos capilares de vidrio usando un
lightcyler. Se generó una curva patrón para cada par de cebadores
usando ARNc de control. Los valores se representaron como expresión
relativa con respecto a GAPDH en cada muestra.
Se pueden preparar extractos nucleares usando
una técnica de micropreparación convencional (véase, por ejemplo,
Andrews y Faller, 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2499). Se
prepararon extractos de proteínas a partir de sobrenadante usando,
por ejemplo, precipitación con TCA. Se añadió un volumen igual de
TCA al 20% al sobrenadante celular, se incubó sobre hielo durante 1
hora y se sedimentó por centrifugación durante 5 min. Los sedimentos
se lavaron en acetona, se secaron y se resuspendieron en agua. Los
extractos de proteína celular se procesaron sobre un gel de
poliacrilamida Bis-Tris NuPage al 10% (extractos
nucleares) o Tris-Glicina al 4-12%
(extractos de sobrenadante) y se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. La unión inespecífica se puede bloquear mediante
incubación, por ejemplo, con leche desnatada al 5% durante 1 hora
seguido por anticuerpo primario durante 16 horas a 4ºC. Después de
los lavados, se aplicó el anticuerpo secundario, por ejemplo
(dilución 1:10.000) durante 1 hora a temperatura ambiente y se
detectó la señal con el reactivo SuperSignal (Pierce).
Ejemplo
11
Pueden usarse diversos modelos animales para
explorar construcciones de ANic in vivo como se conoce en la
técnica, por ejemplo, los modelos animales que se usan para evaluar
otras tecnologías de ácido nucleico tales como moléculas de ácido
nucleico enzimáticas (ribozimas) y/o antisentido. Dichos modelos
animales se usan para ensayar la eficacia de las moléculas de ANic
descritas en este documento. En un ejemplo no limitante, las
moléculas de ANic que se diseñan como agentes antiangiogénicos
pueden explorarse en modelos animales. Existen varios modelos
animales en los que el efecto antiangiogénesis de los ácidos
nucleicos de la presente invención, tales como el ANic, se dirigía
contra genes asociados con la angiogénesis y/o metástasis, tales
como genes VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3). Típicamente
se ha usado un modelo de córnea para estudiar la angiogénesis en
rata y conejo, ya que en este tejido normalmente avascular se puede
seguir fácilmente el reclutamiento de vasos sanguíneos (Pandey y
col., 1995 Science 268: 567-569). En estos modelos,
un pequeño disco de Teflón o Hydron previamente tratado con un
factor de angiogénesis (por ejemplo bFGF o VEGF) se inserta dentro
de un bolsillo creado quirúrgicamente en la córnea. La angiogénesis
se controla de 3 a 5 días después. También se suministran en el
disco moléculas de ANic dirigidas contra los ARNm de VEGFR o se
administran gota a gota en el ojo durante el transcurso del
experimento. En otro modelo ocular, se ha demostrado que la hipoxia
produce tanto una expresión aumentada de VEGF como
neovascularización en la retina (Pierce y col., 1995 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 92: 905-909; Shweiki y col., 1992 J.
Clin. Invest. 91: 2235-2243).
Existen varios modelos animales para explorar
agentes antiangiogénicos. Éstos incluyen la formación de vasos en
la córnea después de una lesión de la córnea (Burger y col., 1985
Cornea 4: 35-41; Lepri, y col., 1994 J. Ocular
Pharmacol. 10: 273-280; Ormerod y col., 1990 Am. J.
Pathol. 137: 1243-1252) o el implante del factor de
crecimiento intracorneal (Grant y col., 1993 Diabetologia 36:
282-291; Pandey y col. 1995, mencionado
anteriormente; Zieche y col., 1992 Lab. Invest. 67:
711-715), o el crecimiento de vasos en la matriz de
Matrigel que contenía factores de crecimiento (Passaniti y
col., 1992 mencionado anteriormente), neovascularización de
los órganos reproductores femeninos después de manipulación
hormonal (Shweiki y col., 1993 Clin. Invest. 91:
2235-2243), implicando varios modelos la inhibición
del crecimiento tumoral en tumores sólidos muy vascularizados
(O'Reilly y col., 1994 Cell 79: 315-328; Senger y
col., 1993 Cancer and Metas. Rev. 12: 303-324;
Takahasi y col., 1994 Cancer Res. 54: 4233-4237;
Kim y col., 1993, mencionados anteriormente) y
neovascularización inducida por hipoxia transitoria en la retina de
ratón (Pierce y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:
905-909).
El modelo de córnea, descrito en Pandey y col.,
mencionado anteriormente, es el modelo de exploración de la
eficacia de agentes anti-angiogénicos más habitual y
está bien caracterizado. Este modelo implica un tejido avascular en
el que se reclutan vasos mediante un agente de estimulación (factor
de crecimiento, quemadura térmica o alcalina, endotoxina). El
modelo de córnea utilizaría el implante de córnea intraestromático
de un microgránulo de Teflón empapado en una solución de
VEGF-Hydron para reclutar vasos sanguíneos hacia el
microgránulo, lo cual puede cuantificarse usando técnicas
microscópicas convencionales y de análisis por imagen. Para evaluar
su eficacia anti-angiogénica, se aplican ribozimas
tópicamente en el ojo o unidas con Hydron en el propio microgránulo
de Teflón. Esta córnea avascular, así como el modelo Matrigel
proporcionan ensayos de bajo efecto de fondo. Aunque el modelo de
córnea se ha realizado ampliamente en el conejo, también se han
realizado estudios en rata.
El modelo de ratón (Passaniti y col., mencionado
anteriormente) es un modelo no tisular que utiliza Matrigel, un
extracto de membrana basal (Kleinman y col., 1986) o discos de
filtro Millipore®, que pueden impregnarse con factores de
crecimiento y agentes anti-angiogénicos en una forma
líquida antes de la inyección. Después de la administración
subcutánea a temperatura corporal, el Matrigel o los discos de
filtro Millipore® forman un implante sólido. El VEGF impregnado en
el Matrigel o disco de filtro Millipore® se usa para reclutar vasos
dentro de la matriz de Matrigel o disco de filtro Millipore®, que
puede procesarse histológicamente para inmunohistoquímica vWF
(antígeno del factor VIII) específica de células endoteliales,
tinción Trichrome-Masson o contenido de
hemoglobina. Del mismo modo que la córnea, el Matrigel o el disco de
filtro Millipore® son avasculares; sin embargo, no son tejidos. En
el modelo Matrigel o de disco de filtro Millipore®, las moléculas de
ANic se administran dentro de la matriz de Matrigel o del disco de
filtro Millipore® para ensayar su eficacia
anti-angiogénica. Por lo tanto, las cuestiones de
suministro en este modelo, así como con el suministro de moléculas
de ANic mediante microgránulos de Teflón revestidos con Hydron en
el modelo de córnea de rata, pueden ser menos problemáticas debido
a la presencia homogénea del ANic dentro de la matriz
respectiva.
Los modelos de carcinoma pulmonar de Lewis y de
melanoma murino B-16 son modelos bien aceptados de
cáncer primario y metastásico y se usan para la exploración inicial
de agentes anticancerosos. Estos modelos murinos no dependen del
uso de ratones inmunodeficientes, son relativamente económicos y
minimizan las preocupaciones de alojamiento. Los modelos tanto
pulmonar de Lewis como de melanoma B-16 implican el
implante subcutáneo de aproximadamente 10^{6} células tumorales
de líneas de células tumorales agresivas desde el punto de vista
metastásico (líneas pulmonares de Lewis 3LL o D122,
LLc-LN7; melanoma
B-16-BL6) en ratones C57BL/6J. Como
alternativa, el modelo pulmonar de Lewis puede producirse por
implante quirúrgico de esferas tumorales (aproximadamente 0,8 mm de
diámetro). La metástasis también puede configurarse inyectando
directamente las células tumorales i.v. En el modelo pulmonar de
Lewis, pueden observarse metástasis microscópicas aproximadamente 14
días después del implante con tumores metastásicos macroscópicos
cuantificables desarrollados a los 21-25 días. El
melanoma B-16 muestra una evolución temporal
similar con neovascularización tumoral comenzando 4 días después del
implante. Ya que en estos modelos existen tumores tanto primarios
como metastásicos después de 21-25 días en el mismo
animal, pueden tomarse múltiples mediciones como índices de
eficacia. Puede cuantificarse el volumen y la latencia de
crecimiento del tumor primario así como el número de focos
pulmonares metastásicos micro- y macroscópicos o número de animales
que muestran metástasis. También puede medirse el porcentaje de
aumento de duración de la vida. Por lo tanto, estos modelos
proporcionan ensayos primarios de eficacia adecuados para explorar
sistémicamente las moléculas de ANic y formulaciones de ANic
administradas.
En los modelos pulmonar de Lewis y de melanoma
B-16, normalmente la farmacoterapia sistémica con
una amplia diversidad de agentes comienza 1-7 días
después del implante/inoculación tumoral con regímenes de
administración continuos o múltiples. Pueden realizarse estudios
farmacocinéticos simultáneos para determinar si pueden conseguirse
niveles suficientes de ANic en tejido para esperar el efecto
farmacodinámico. Adicionalmente, pueden retirarse tumores primarios
y metástasis pulmonares secundarias y someterse a una diversidad de
estudios in vitro (es decir, reducción del ARN diana).
Utilizando estos modelos para evaluar la
actividad de ANic, pueden medirse niveles de proteína VEGFR1, VEGFR2
y/o VEGFR3 clínica o experimentalmente mediante análisis FACS. Los
niveles de ARNm que codifican VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 se
evaluarán mediante análisis de Northern, protección frente a RNasa,
análisis de extensión cebador y/o RT-PCR
cuantitativa. De esta manera, pueden identificarse moléculas de ANic
que bloquean los ARNm que codifican las proteínas VEGFR1, VEGFR2
y/o VEGFR3 y, por lo tanto, dan como resultado niveles disminuidos
de actividad VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3 en más del 20% in
vitro.
Ejemplo
12
El fin de este estudio era evaluar la actividad
antiangiogénica de ANic dirigida contra VEGFR1 en el modelo de
córnea de rata de angiogénesis inducida por VEGF (véase
anteriormente). Estas moléculas de ANic tienen controles invertidos
correspondientes que son inactivos ya que no son capaces de
interaccionar con la diana de ARN. Las moléculas de ANic y VEGF se
suministraron conjuntamente usando el procedimiento del disco de
filtro: discos de filtro de Nitrocelulosa (Millipore®) de 0,057 de
diámetro se sumergieron en soluciones apropiadas y se implantaron
quirúrgicamente en córneas de rata como describen Pandey y
col., mencionado anteriormente.
El estímulo para la angiogénesis en este estudio
fue el tratamiento del disco de filtro con VEGF 30 \muM que se
implantó dentro del estroma de la córnea. Esta dosis produce
neovascularización reproducible que parte del plexo vascular
pericorneal que crece hacia el disco en un estudio de respuesta a la
dosis 5 días después del implante. Los discos de filtro tratados
solamente con el vehículo para VEGF no muestran respuesta
angiogénica. El ANic se administró conjuntamente con VEGF en un
disco en dos concentraciones de ANic diferentes. Una preocupación
con la administración simultánea es que el ANic no sería capaz de
inhibir la angiogénesis, ya que los receptores del VEGF pueden
estimularse. Sin embargo, el Solicitante ha observado que a dosis
bajas de VEGF, la respuesta neovascular se vuelve normal, lo que
sugiere que el estímulo de VEGF es esencial para mantener la
respuesta angiogénica. El bloqueo de la producción de los
receptores de VEGF usando la administración simultánea de ANic de
ARNm anti-VEGFR atenuaría la neovascularización
normal inducida por el disco de filtro tratado con VEGF.
- VEGF de Systems R&D, sin vehículo a 75 \muM en Tris-Cl 82 mM, pH 6,9
- ANic, 1,67 \mug/\mul, SITIO 2340 (SEC ID Nº: 2; SEC ID Nº: 6) con sentido/antisentido
- ANic, 1,67 \mug/\mul, CONTROL INVERTIDO PARA EL SITIO 2340 (SEC ID Nº: 19; SEC ID Nº: 20) con sentido/antisentido
- ANic 1,67 \mug/\mul, Sitio 2340 (SEC ID Nº: 419; SEC ID Nº: 420) con sentido/antisentido.
- Ratas Harlan Sprague-Dawley, Aproximadamente 225-250 g
- 45 machos, 5 animales por grupo.
Los animales se alojan en grupos de dos. El
alimento, el agua, la temperatura y la humedad se determinan de
acuerdo con las normas de funcionamiento de Instalaciones de Ensayo
de Farmacología (SOP), que están de acuerdo con la Guía de 1996
para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NRC). Los animales
se aclimatan a la instalación durante al menos 7 días antes de la
experimentación. Durante este tiempo, los animales se observan para
determinar la salud global y se toman muestras de sangre de
centinelas para determinar la serología basal.
Cada solución (VEGF y ANic) se preparó como una
solución 1X para las concentraciones finales mostradas en los
grupos experimentales descritos en la Tabla III.
Las cadenas sentido y antisentido de ANic se
hibridan durante 1 minuto en H_{2}O a 1,67 mg/ml/cadena seguido
por 1 hora de incubación a 37ºC, produciendo 3,34 mg/ml de ANic en
dúplex. Para el tratamiento de 20 \mug/ojo, se inyectan 6 \mul
de los 3,34 mg/ml de dúplex en el ojo (véase mas adelante). Los 3,34
mg/ml de ANic dúplex después se pueden diluir en serie para ensayos
de dosis respuesta.
Para el implante corneal, discos de
nitrocelulosa de 0,57 mm de diámetro, preparados a partir de
membranas de filtro de nitrocelulosa con un diámetro de poro de
0,45 \mum (Millipore Corporation), se empaparon durante 30 min en
1 \mul de VEGF 75 \muM en Tris HCl 82 mM (pH 6,9) en placas de
petri revestidas en hielo. Los discos de filtro empapados sólo con
el vehículo para VEGF (Tris-Cl 83 mM pH 6,9) no
provocan respuesta angiogénica.
El modelo de córnea de rata usado en este
estudio fue uno modificado a partir de Koch y col.,
mencionado anteriormente, y Pandey y col., mencionado
anteriormente. En resumen, las córneas se irrigaron con
solución de povidona y yodo al 0,5% seguido por solución salina
normal y dos gotas de lidocaína al 2%. Bajo un microscopio de
disección (Leica MZ-6), se creó un bolsillo
estromático y se insertó un disco de filtro empapado previamente
(véase anteriormente) en el bolsillo de forma que su borde estuviera
a 1 mm del limbo corneal.
Inmediatamente después de la inserción del
disco, se insertó la punta de un inyector OD de
40-50 \mum (construido en el laboratorio de los
presentes inventores) dentro del tejido conjuntival a 1 mm del borde
del limbo corneal que era directamente adyacente al disco de filtro
empapado en VEGF. Se dosificaron seiscientos nanolitros de solución
de ensayo (ANic, control invertido o vehículo de agua estéril) a una
velocidad de 1,2 \mul/min usando una bomba de jeringa (Kd
Scientific). Después se retiró el inyector, se enjuagó en serie en
etanol al 70% y agua estéril y se sumergió en agua estéril entre
cada inyección. Una vez inyectada la solución de ensayo, se mantuvo
el párpado cerrado usando clips de microaneurisma hasta que el
animal comenzó a recuperar la actividad motora general. Después del
tratamiento, los animales se calentaron en una almohadilla
calefactora a 37ºC.
Cinco días después del implante del disco, los
animales se sometieron a eutanasia después de la administración im
de 0,4 mg/kg de atropina y se obtuvieron imágenes digitales de las
córneas. El área de superficie neovascular (ASN, expresada en
píxeles) se midió post mortem a partir de los vasos corneales
cargados de sangre usando morfometría computarizada (Image Pro
Plus, Media Cybernetics, v2.0). El ASN media individual se determinó
por triplicado a partir de tres regiones de tamaño idéntico en el
área de neovascularización máxima entre el disco de filtro y el
limbo. Se sumó el número de píxeles correspondiente a los vasos
corneales cargados de sangre en estas regiones para producir un
índice de ASN. Después se calculó un ASN media de grupo. Los datos
de cada grupo de tratamiento de normalizaron para ASN de control
tratado con vehículo de VEGF/ANic y finalmente se expresaron como
un porcentaje de inhibición de la angiogénesis inducida por
VEGF.
Después de determinar la normalidad de las
medias de grupo de tratamiento, el porcentaje de inhibición medio
de grupo de angiogénesis inducida por VEGF se sometió a un análisis
de varianza de una vía. Esto se siguió por dos ensayos
post-hoc para determinar el significado,
incluyendo el procedimiento de Dunnett (comparación con el control
de VEGF) y Tukey-Kramer (todas las comparaciones de
medias de grupo restantes) a alfa = 0,05. Se realizaron análisis
estadísticos usando JMP v.3.1.6 (SAS Institute).
Los resultados se representan gráficamente en la
Figura 23. Como se muestra en la Figura 23, ANic activos en el
sitio 4229 de VEGFR1 a tres concentraciones fueron eficaces para
inhibir la angiogénesis en comparación con el control de ANic
invertido y el control de VEGF. Una versión modificada químicamente
del ANic activo en el sitio 4229 de VEGFR1 que comprende una cadena
con sentido que tiene
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidinas y ribo purinas con restos abásicos desoxi invertidos
5'- y 3'-terminales (SEC ID Nº: 419) y una cadena
antisentido que tiene
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidinas y ribo purinas con un enlace internucleotídico de
3'-fosforotioato terminal (SEC ID Nº: 420),
mostraron una inhibición similar. Este resultado muestra que las
moléculas de ANic de composición modificada químicamente diferentes
de la invención son capaces de inhibir significativamente la
angiogénesis in vivo.
Ejemplo
13
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
EGFR (HER1) en células A549. Las células A549 se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de forma que en el momento de la transfección las
células tuvieran una confluencia del 70-90%. Para la
transfección, se mezclaron ANic hibridados con el reactivo de
transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células
para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de
150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3
pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se
incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de la mezcla de
transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada
pocillo de células tratadas. Primero se retiraron y se desecharon
los sobrenadantes con las mezclas de transfección, después las
células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. La
expresión de genes diana después del tratamiento se evaluó mediante
RT-PCR para el gen diana y para un gen de control
(36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se
calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron
las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos
normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción de ARNm diana mediante ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 25. Una construcción de ANic que comprende ribonucleótidos y
protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI nº
30988/31064) se comparó con una construcción de ANic modificada
químicamente que comprendía nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en los que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31300/31301), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31314/31325). Adicionalmente, las construcciones de ANic también
se compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg.
2), y células transfectadas únicamente con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, las dos construcciones
de ANic reducen significativamente la expresión del ARN de EGFR.
Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en
la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su
actividad.
Ejemplo
14
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
PKC-alfa en, por ejemplo, células A549. Se sembraron
células aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de
96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de forma que en el momento de la transfección las
células tenían una confluencia del 70-90%. Para la
transfección, ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de
transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continuada de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó ARN a partir de cada
pocillo. La expresión del gen diana después del tratamiento se
evaluó mediante RT-PCR para el gen diana y para un
gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción de ARNm diana mediante ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, construcciones de
ANic se exploraron para determinar su actividad (véase la Figura
26) y se compararon con células no tratadas, construcciones de
control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células
transfectadas únicamente con lípido (control de transfección). Como
se muestra en la Figura 26, las construcciones de ANic reducen
significativamente la expresión de ARN de PKC-alfa.
Los candidatos generados a partir de una selección de este tipo se
ensayaron después adicionalmente. En un ejemplo no limitante, se
ensayaron construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y
protecciones de ditimidina 3'-terminales junto con
una construcción de ANic modificada químicamente que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, en los que la cadena con
sentido de ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de
estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se
ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas
construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la
misma química apropiados. Adicionalmente, las construcciones de
ANic también se compararon con células no tratadas, células
transfectadas con lípido y construcciones de ANic desorganizado y
células transfectadas únicamente con lípido (control de
transfección).
Ejemplo
15
Se ensayaron las construcciones de ANic (Tabla
I) para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
Myc (c-Myc) en células 293T. Se sembraron células
293T aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 10
\mul/pocillo, de manera que en el momento de la transfección las
células tenían una confluencia del 70-90%. Para la
transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de
transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células
para dar una concentración final de ANic de 25 nM en un volumen de
150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3
pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se
incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de la mezcla de
transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a partir de cada
pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de
transfección se retiraron y desecharon primero, después las células
se lisaron y se preparó ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la
expresión del gen diana después del tratamiento mediante
RT-PCR para el gen diana y para un gen de control
(36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se
calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron
las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos
normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana mediante los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 27. Se comparó una exploración de construcciones de ANic con
células no tratadas, construcciones de control de ANic desorganizado
(Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo con lípido
(control de transfección). Como se muestra en la Figura, tres de las
construcciones de ANic (RPI 30993/31069; RPI 30995/31071; y RPI
30996/31072) redujeron significativamente la expresión del ARN de
c-Myc. Otras químicas de estabilización adicionales
como se describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para
determinar su actividad.
Ejemplo
16
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
BCL2 en, por ejemplo, células A549. Las células se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada
pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del
tratamiento por RT-PCR para el gen diana y un gen de
control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana por ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se transfectaron
células A549 con 0,25 \mug/pocillo de lípido formando complejo
con ANic 25 nM. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 30998/31074) junto con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con
sentido del ANic se modificó adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3' terminal (RPI nº 31368/31369), que también se
comparó con un control invertido de la misma química (RPI nº
31370/31371) y una construcción de ANic químicamente modificada que
comprendía nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y
2'-desoxi-2'-fluoro
purina en el que la cadena con sentido del ANic estaba modificada
adicionalmente con protecciones abásicas desoxi invertidas 5'- y
3'-terminales y la cadena antisentido comprendía un
enlace internucleotídico fosforotioato 3'-terminal
(RPI nº 31372/31373) que también se comparó con un control invertido
de la misma química (RPI nº 31374/31375). Además, las
construcciones de ANic también se compararon con células no
tratadas, células transfectadas con lípido y construcciones de ANic
desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células transfectadas sólo
con lípido (control de transfección). Como se muestra en la Figura
28, las construcciones de ANic reducen significativamente la
expresión del ARN de BCL2 en comparación con los controles
desorganizados, no tratados y de transfección. Otras químicas de
estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se
ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo
17
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión del ARN de
CHK-1 en células A549. Se sembraron células A549
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada
pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del
tratamiento por RT-PCR para el gen diana y para un
gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 29. Una construcción de ANic que comprendía ribonucleótidos
y protecciones de ditimidina 3'-terminales (RPI nº
31003/31079) y una construcción de ANic químicamente modificada que
comprendía nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y en
la que la cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico
de fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31302/31303),
se compararon con un control invertido de la misma química (RPI nº
31314/31325). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con lípido
y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y
células transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic redujeron
significativamente la expresión del ARN de CHK-1 en
comparación con controles apropiados. Otras químicas de
estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se
ensayaron de forma similar para determinar su actividad.
Ejemplo
18
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
BACE en, por ejemplo células A549. Las células se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada
pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del
tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para
un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron gráficamente y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se exploraron
construcciones de ANic para determinar su actividad (véase Figura
30) y se compararon con células no tratadas, construcciones de
control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células
transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se
muestra en la Figura 30, las construcciones de ANic redujeron
significativamente la expresión del ARN de BACE. Después se
ensayaron adicionalmente los candidatos generados a partir de dicha
exploración. En un ejemplo no limitante, las construcciones de ANic
que comprendían ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales se ensayaron junto con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de
estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se
ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas
construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la
misma química apropiados. Además, las construcciones de ANic también
se compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado y células
transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Ejemplo
19
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
ciclina D1 en células A549. Células A549 se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración final de ANic de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada
pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del
tratamiento por RT-PCR para el gen diana y para un
gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
las desviaciones típicas se determinaron para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó
el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 31. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 30988/31064) junto con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31300/3130), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31312131313). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg.
2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, las dos construcciones
de ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de
ciclina D1. Otras químicas de estabilización adicionales como se
describen en la Tabla IV se ensayaron de forma similar para
determinar su actividad.
\newpage
Ejemplo
20
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión del ARN de
PTP-1B en células A549. Células A549 se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a células
para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de
150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3
pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las células se
incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de la mezcla de
transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada
pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de
transfección se retiraron y desecharon primero, después las células
se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó
la expresión del gen diana después del tratamiento por
RT-PCR para el gen diana y para un gen de control
(36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se
calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron
las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos
normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 32. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 31018/31094) junto con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31306/31307), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31318/31319). Además, también se compararon las construcciones
de ANic con células no tratadas, células transfectadas con lípido y
construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y
células transfectadas sólo con lípido (control de transfección).
Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de ANic redujeron
significativamente la expresión del ARN de PTP-1B.
Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en
la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su
actividad.
Ejemplo
21
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
ERG2 en, por ejemplo células DLD1. Las células se sembraron
aproximadamente 24 h antes de la transfección en placas de 96
pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100
\mul/pocillo, de tal manera que en el momento de la transfección
las células tenían una confluencia del 70-90%. Para
la transfección, los ANic hibridados se mezclaron con el reactivo
de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50
\mul/pocillo y se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. Las mezclas de transfección de ANic se añadieron a las
células para dar una concentración de ANic final de 25 nM en un
volumen de 150 \mul. Cada mezcla de transfección de ANic se
añadió a 3 pocillos para tratamientos de ANic por triplicado. Las
células se incubaron a 37ºC durante 24 h en presencia continua de
la mezcla de transfección de ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a
partir de cada pocillo de células tratadas. Los sobrenadantes con
las mezclas de transfección se retiraron y desecharon primero,
después las células se lisaron y se preparó el ARN a partir de cada
pocillo. Se evaluó la expresión del gen diana después del
tratamiento mediante RT-PCR para el gen diana y para
un gen de control (36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su
normalización. Se calculó el promedio de los datos por triplicado y
se determinaron las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los
datos normalizados se representaron en una gráfica y se determinó
el porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
En un ejemplo no limitante, se exploraron
construcciones de ANic para determinar su actividad (véase la Figura
33) y se compararon con células no tratadas, construcciones de
control de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg. 2) y células
transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Como se
muestra en la Figura 33, las construcciones de ANic redujeron
significativamente la expresión del ARN de ERG2. Después, se
ensayaron adicionalmente los candidatos generados a partir una
exploración de este tipo. En un ejemplo no limitante, las
construcciones de ANic que comprendían ribonucleótidos y
protecciones de ditimidina 3'-terminales se
ensayaron junto con una construcción de ANic químicamente
modificada que comprendía nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina, en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal. Otras químicas de
estabilización adicionales como se describen en la Tabla IV se
ensayaron de forma similar para determinar su actividad. Estas
construcciones de ANic se compararon con controles invertidos de la
misma química. Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado y células
transfectadas sólo con lípido (control de transfección). Otras
químicas de estabilización adicionales como se describen en la
Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su
actividad.
Ejemplo
22
Se ensayaron construcciones de ANic (Tabla I)
para determinar su eficacia para reducir la expresión de ARN de
PCNA en células A549. Células A549 se sembraron aproximadamente 24 h
antes de la transfección en placas de 96 pocillos a
5.000-7.500 células/pocillo, 100 \mul/pocillo, de
manera que en el momento de la transfección las células tenían una
confluencia del 70-90%. Para la transfección, los
ANic hibridados se mezclaron con el reactivo de transfección
(Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 \mul/pocillo
y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas
de transfección de ANic se añadieron a las células para dar una
concentración de ANic final de 25 nM en un volumen de 150 \mul.
Cada mezcla de transfección de ANic se añadió a 3 pocillos para
tratamientos de ANic por triplicado. Las células se incubaron a 37ºC
durante 24 h en presencia continua de la mezcla de transfección de
ANic. A las 24 h, se preparó el ARN a partir de cada pocillo de
células tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfección
se retiraron y desecharon primero, después las células se lisaron y
se preparó el ARN a partir de cada pocillo. Se evaluó la expresión
del gen diana después del tratamiento mediante
RT-PCR para el gen diana y para un gen de control
(36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para su normalización. Se
calculó el promedio de los datos por triplicado y se determinaron
las desviaciones típicas para cada tratamiento. Los datos
normalizados se representaron en una gráfica y se determinó el
porcentaje de reducción del ARNm diana por los ANic activos en
comparación con sus ANic de control invertidos respectivos.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 34. Se ensayó una construcción de ANic que comprendía
ribonucleótidos y protecciones de ditimidina
3'-terminales (RPI nº 31035/31111) junto con una
construcción de ANic químicamente modificada que comprendía
nucleótidos de
2'-desoxi-2'-fluoro
pirimidina y ribonucleótidos de purina en la que la cadena con
sentido del ANic estaba modificada adicionalmente con protecciones
abásicas desoxi invertidas 5'- y 3'-terminales y la
cadena antisentido comprendía un enlace internucleotídico de
fosforotioato 3'-terminal (RPI nº 31310/31311), que
también se comparó con un control invertido de la misma química (RPI
nº 31322/31323). Además, las construcciones de ANic también se
compararon con células no tratadas, células transfectadas con
lípido y construcciones de ANic desorganizado (Desorg. 1 y Desorg.
2) y células transfectadas sólo con lípido (control de
transfección). Como se muestra en la Figura, ambas construcciones de
ANic redujeron significativamente la expresión del ARN de PCNA.
Otras químicas de estabilización adicionales como se describen en
la Tabla IV se ensayaron de forma similar para determinar su
actividad.
Ejemplo
23
Las moléculas de ANic de la invención pueden
usarse para tratar una diversidad de enfermedades y afecciones a
través de la modulación de la expresión génica. Usando los
procedimientos descritos en el presente documento, pueden diseñarse
moléculas de ANic modificadas químicamente para modular la expresión
de cualquier número de genes diana, incluyendo, pero sin
limitación, genes asociados con el cáncer, enfermedades metabólicas,
enfermedades infecciosas tales como infecciones virales,
bacterianas o fúngicas, enfermedades neurológicas, enfermedades
musculoesqueléticas, enfermedades del sistema inmune, enfermedades
asociadas con las rutas de señalización y mensajeros celulares, y
enfermedades asociadas con sistemas de transporte que incluyen
bombas y canales moleculares.
Los ejemplos no limitantes de diversos genes
virales que pueden dirigirse usando moléculas de ARNic de la
invención incluyen Virus de la Hepatitis C (VHC, por ejemplo, Nº de
Acceso de Genbank: D11168, D50483.1, L38318 y S82227), Virus de la
Hepatitis B (VHB, por ejemplo Nº de Acceso de Genbank AF100308.1),
Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1
(VIH-1, por ejemplo Nº de Acceso de Genbank U51188),
Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 2
(VIH-2, por ejemplo Nº de Acceso de Genbank X60667),
Virus del Nilo Occidental (VNO, por ejemplo Nº de Acceso de Genbank
NC_001563), citomegalovirus (CMV por ejemplo Nº de Acceso de Genbank
NC_001347), virus respiratorio sincitial (VRS por ejemplo Nº de
Acceso de Genbank NC_001781), virus de la gripe (por ejemplo, Nº de
Acceso de Genbank AF037412), rinovirus (por ejemplo, números de
acceso de Genbank: D00239, X02316, X01087, L24917, M16248, K02121,
X01087), papilomavirus (por ejemplo Nº de Acceso de Genbank
NC_001353), Virus del Herpes Simple (VHS por ejemplo Nº de Acceso
de Genbank NC_ 001345), y otros virus tales como VLTH (por ejemplo
Nº de Acceso de Genbank AJ430458). Debido a la elevada variabilidad
de secuencia de muchos genomas virales, la selección de moléculas
de ARNic para amplias aplicaciones terapéuticas probablemente
implicaría las regiones conservadas del genoma viral. Los ejemplos
no limitantes de regiones conservadas de los genomas virales
incluyen, pero sin limitación, Regiones No Codificantes (NCR) 5',
Regiones No Codificantes (NCR) 3' y/o sitios internos de entrada al
ribosoma (IRES). Las moléculas de ARNic diseñadas frente a regiones
conservadas de diversos genomas virales permitirán la inhibición
eficaz de la replicación viral en diversas poblaciones de pacientes
y pueden garantizar la eficacia de las moléculas de ARNic frente a
cuasiespecies virales que evolucionan debido a mutaciones en las
regiones no conservadas del genoma viral.
Los ejemplos no limitantes de genes humanos que
pueden dirigirse usando moléculas de ARNic de la invención usando
los procedimientos descritos en el presente documento incluyen
cualquier secuencia de ARN humana, por ejemplo las comúnmente
indicadas por el Número de Acceso de Genbank. Estas secuencias de
ARN pueden usarse para diseñar moléculas de ARNic que inhiban la
expresión génica y de este modo anulan enfermedades, afecciones o
infecciones asociadas con la expresión de esos genes. Dichos
ejemplos no limitantes de genes humanos que pueden dirigirse usando
moléculas de ARNic de la invención incluyen VEGFr
(VEGFr-1 por ejemplo, Nº de Acceso de Genbank
XM_067723, VEGFr-2, por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank AF063658), HER1, HER2, HER3 y HER4 (por ejemplo, Nº de
Acceso de Genbank: NM_005228, N_004448, NM_001982 y NM_005235,
respectivamente), telomerasa (TERT, por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank NM_003219), ARN de telomerasa (por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank U86046), NFkappaB, Rel-A (por ejemplo, Nº
de Acceso de Genbank NM_005228), NOGO (por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank AB020693), NOGOr (por ejemplo, Nº de Acceso de Genbank
XM_015620), RAS (por ejemplo, Nº de Acceso de Genbank NM_004283),
RAF (por ejemplo, Nº de Acceso de Genbank XM_033884), CD20 (por
ejemplo, Nº de Acceso de Genbank X07203), METAP2 (por ejemplo, Nº
de Acceso de Genbank N_003219), CLCA1 (por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank NM_001285), fosfolambán (por ejemplo, Nº de Acceso de
Genbank NM_002667), PTP1B (por ejemplo, Nº de Acceso de Genbank
M31724) y otros, por ejemplo, los mostrados en la Tabla III.
La molécula de ANic de la invención también
puede usarse en una diversidad de aplicaciones agrícolas que
implican la modulación de la expresión de genes endógenos o
exógenos en plantas usando ANic, que incluye su uso como agente
insecticida, antiviral y antifúngico o la modulación de rasgos en
plantas tales como perfiles de aceite y almidón y resistencia a
agresiones.
Ejemplo
24
Las moléculas de ANic de la invención pueden
usarse en una diversidad de aplicaciones de diagnóstico tales como
en la identificación de dianas moleculares (por ejemplo, ARN) en una
diversidad de aplicaciones, por ejemplo, en entornos clínicos,
industriales, ambientales, agrícolas y/o de investigación. Dicho uso
de diagnóstico de moléculas de ANic implica la utilización de
sistemas de iARN reconstituidos, usando, por ejemplo, lisados
celulares o lisados celulares parcialmente purificados. Las
moléculas de ANic de la presente invención pueden usarse como
herramientas de diagnóstico para examinar las mutaciones y la deriva
genética dentro de células enfermas, o para detectar la presencia
de ARN endógeno o exógeno, por ejemplo viral, en una célula. La
estrecha relación entre la actividad de ANic y la estructura del
ARN diana permite la detección de mutaciones en cualquier región de
la molécula, que modifica el emparejamiento de bases y la estructura
tridimensional del ARN diana. Usando múltiples moléculas de ANic
descritas en la presente invención, pueden mapearse cambios de
nucleótidos que son importantes para la estructura y función del
ARN in vitro, así como en células y tejidos. La escisión de
los ARN diana con moléculas de ANic puede usarse para inhibir la
expresión génica y definir el papel de los productos génicos
especificados en la progresión de la enfermedad o infección. De este
modo, pueden definirse otras dianas genéticas como mediadores
importantes de la enfermedad. Estos experimentos conducirán a un
mejor tratamiento de la progresión de la enfermedad permitiendo la
posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo, múltiples
moléculas de ANic dirigidas a genes diferentes, moléculas de ANic
acopladas con inhibidores de bajo peso molecular conocidos o
tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas de ANic y/u
otras moléculas químicas o biológicas). Otros usos in vitro
de las moléculas de ANic de la presente invención se conocen bien
en la técnica e incluyen la detección de la presencia de los ARNm
asociados con una enfermedad, infección o afección relacionada.
Dicho ARN se detecta determinando la presencia de un producto de
escisión después del tratamiento con un ANic usando metodologías
convencionales, por ejemplo, transferencia por resonancia de
emisión de fluorescencia (FRET).
En un ejemplo específico, se usan para el ensayo
moléculas de ANic que escinden solamente formas de tipo silvestre o
mutantes del ARN diana. Las primeras moléculas de ANic (es decir,
las que solo escinden formas de tipo silvestre del ARN diana) se
usan para identificar el ARN de tipo silvestre presente en la
muestra y las segundas moléculas de ANic (es decir, las que solo
escinden formas mutantes del ARN diana) se usan para identificar el
ARN mutante en la muestra. Como controles de reacción, sustratos
sintéticos de ARN tanto de tipo silvestre como mutante se escinden
por ambas moléculas de ANic para demostrar las eficacias relativas
de los ANic en las reacciones y la ausencia de escisión de las
especies de ARN "no diana". Los productos de escisión de los
sustratos sintéticos también sirven para generar marcadores de
tamaño para el análisis de los ARN de tipo silvestre y mutante en
la población de muestra. Por lo tanto, cada análisis requiere dos
moléculas de ANic, dos sustratos y una muestra desconocida, que se
combinan en seis reacciones. La presencia de productos de escisión
se determina usando un ensayo de protección RNasa de manera que los
fragmentos de longitud completa y de escisión de cada ARN pueden
analizarse en un carril de un gel de poliacrilamida. No se requiere
en absoluto cuantificar los resultados para hacerse una idea de la
expresión de los ARN mutantes y del supuesto riesgo de los cambios
fenotípicos deseados en las células diana. La expresión del ARNm
cuyo producto proteico está implicado en el desarrollo del fenotipo
(es decir relacionado con enfermedad o relacionado con infección) es
adecuada para establecer el riesgo. Si se usan sondas de actividad
específica comparable para ambos transcritos, entonces una
comparación cualitativa de los niveles de ARN es adecuada y
disminuye el coste del diagnóstico inicial. Proporciones más
elevadas de la forma mutante con respecto a la de tipo silvestre se
correlacionan con un mayor riesgo independientemente de que los
niveles de ARN se comparen cualitativa o cuantitativamente.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas
en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de
destreza de los expertos en la materia a la que pertenece la
invención. Todas las referencias citadas en esta divulgación se
incorporan por referencia en la misma medida que si cada referencia
se hubiera incorporado por referencia en su totalidad
individualmente.
Un experto en la materia apreciará fácilmente
que la presente invención se adapta bien a realizar los objetos y
obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a
la misma. Los procedimientos y composiciones descritos en el
presente documento, como actualmente representativos de
realizaciones preferidas, son ilustrativos y no pretenden limitar
el ámbito de la invención. A los expertos en la materia se les
ocurrirán cambios en la misma y otros usos, que se incluyen dentro
del espíritu de la invención y se definen por el ámbito de las
reivindicaciones.
Para un experto en la materia será fácilmente
evidente que pueden realizarse sustituciones y modificaciones
variables en la invención desvelada en el presente documento sin
alejarse del ámbito y espíritu de la invención. Por lo tanto,
dichas realizaciones adicionales se encuentran dentro del ámbito de
la presente invención y de las reivindicaciones siguientes. La
presente invención enseña a un experto en la materia a ensayar
diversas combinaciones y/o sustituciones de modificaciones químicas
descritas en el presente documento hacia la generación de
construcciones de ácidos nucleicos con una actividad mejorada para
mediar la actividad de iARN. Dicha actividad mejorada puede
comprender una estabilidad mejorada, una biodisponibilidad mejorada
y/o una activación mejorada de las respuestas celulares que median
la iARN. Por lo tanto, las realizaciones específicas descritas en el
presente documento no son limitantes y un experto en la materia
puede apreciar fácilmente que pueden ensayarse combinaciones
específicas de las modificaciones descritas en el presente documento
sin una experimentación excesiva hacia la identificación de
moléculas de ANic con una actividad de iARN mejorada.
La invención descrita de manera ilustrativa en
el presente documento puede llevarse a la práctica adecuadamente en
ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o
limitaciones que no se desvelan específicamente en el presente
documento Por lo tanto, por ejemplo, en cada caso en el presente
documento cualquiera de las expresiones "que comprende",
"que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede
sustituirse con cualquiera de las otras dos expresiones. Los
términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de
descripción y no de limitación, y no se pretende que en el uso de
dichos términos y expresiones se excluya ningún equivalente de las
características mostradas y descritas o partes de las mismas, aunque
se reconoce que, dentro del ámbito de la invención reivindicada,
son posibles diversas modificaciones. Por lo tanto, debe entenderse
que aunque se ha desvelado específicamente la presente invención
mediante realizaciones preferidas, los expertos en la materia
pueden recurrir a características opcionales, modificaciones o
variaciones de los conceptos desvelados en el presente documento, y
se considera que dichas modificaciones y variaciones están dentro
del ámbito de la presente invención como se define por la
descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Además, aunque las características o aspectos de
la invención se describen en términos de grupos de Markush u otro
agrupamiento de alternativas, los expertos en la materia reconocerán
que la invención también se describe de este modo en términos de
cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de
Markush u otro grupo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Claims (15)
-
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1. Una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ANic) modificada químicamente que regula negativamente la expresión de un gen diana por interferencia de ARN (iARN), en la que:- (a)
- el ANic comprende una cadena con sentido y una cadena antisentido distinta, en el que dicha cadena antisentido comprende una secuencia que es complementaria al ARN del gen diana, y en el que la cadena con sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la cadena antisentido;
- (b)
- cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene independientemente una longitud de 18 a 24 nucleótidos y el dúplex de ANic comprende de 17 a 23 pares de bases;
- (c)
- 10 o más nucleótidos de pirimidina de la cadena del ANic con sentido y/o antisentido se modifican químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro, estando presentes uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato y/o, una molécula de protección terminal en el extremo 3', el extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5', en la misma cadena o en una cadena diferente.
- 2. La molécula de ANic de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ANic comprende ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 30, 40 ó 50% de las posiciones de nucleótidos.
- 3. La molécula de ANic de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ANic se ensambla a partir de dos fragmentos oligonucleotídicos distintos, en la que un fragmento comprende la región con sentido y un segundo fragmento comprende la región antisentido, en la que el fragmento que comprende dicha región con sentido incluye un resto de protección terminal en el extremo 5', el extremo 3' o en ambos extremos 5' y 3'.
- 4. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos de purina en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina y en la que los nucleótidos de pirimidina en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina.
- 5. La molécula de ANic de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho resto de protección terminal es un resto abásico desoxi invertido.
- 6. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos de pirimidina de dicha región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina y en la que los nucleótidos de purina en la región antisentido son nucleótidos de 2'-O-metil purina.
- 7. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos de purina presentes en dicha región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi purina y en la que los nucleótidos de pirimidina presentes en dicha región antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina.
- 8. La molécula de ANic de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 6 y 7, en la que dicha región antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región antisentido.
- 9. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que cada uno de los dos fragmentos de dicha molécula de ANic comprende 21 nucleótidos.
- 10. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANic están formando pares de bases con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANic, y en la que al menos dos nucleótidos 3'-terminales de cada fragmento de la molécula de ANic no están formando pares de bases con los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de ANic.
- 11. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que 19 nucleótidos de la región antisentido están formando pares de bases con la secuencia de nucleótidos del ARN que codifica el gen diana o una parte del mismo.
- 12. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que 21 nucleótidos de la región antisentido están formando pares de bases con la secuencia de nucleótidos del ARN que codifica el gen diana o una parte del mismo.
- 13. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos de purina en la región con sentido son ribonucleótidos de purina y en la que los nucleótidos de pirimidina en la región con sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, y en la que el fragmento con sentido incluye un resto de protección terminal en los extremos 5' y 3'.
- 14. La molécula de ANic de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos de purina en la región con sentido son ribonucleótidos de purina, y en la que los nucleótidos de pirimidina en la región con sentido son nucleótidos de 2'-O-metil pirimidina, y en la que el fragmento con sentido incluye un resto de protección terminal en los extremos 5' y 3'.
- 15. Una composición que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquier reivindicación anterior y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
\global\parskip1.000000\baselineskip
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