ES2350389T3 - Método de diagnóstico. - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar el daño de la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método la exploración de un aumento en el nivel de SP-B en la sangre, suero o plasma de dicho mamífero o la exploración para la modulación de las proporciones de SP-B:SP-A en el fluido corporal de dicho mamífero.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con un método que diagnostica o que predice el desarrollo del daño a la membrana alveolo-capilar. El método de la presente invención es útil inter alia para detectar daño pulmonar o predecir el desarrollo de daño pulmonar tal como el causado por agentes nocivos o como un efecto secundario no deseable que resulta de la exposición a un agente terapéutico y para supervisar el progreso del daño pulmonar. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que el autor hace referencia en la especificación son recolectados al final de la descripción.

La interfase gaseosa/líquida del pulmón es cubierta con una capa mononuclear que comprende fosfolípidos, lípidos neutrales y proteínas especificas (proteínas surfactantes A, B, C y D, aquí se le hace referencia como SP-A, -B, -C y –D, respectivamente). Colectivamente conocido como “surfactante pulmonar”, estos compuestos disminuyen la tensión superficial, disminuyen el trabajo de respirar, y estabilizan el pulmón variando la tensión superficial permitiendo que coexistan alvéolos de diferente tamaño.

Los fosfolípidos surfactantes pulmonares son sintetizados por células Tipo Alveolar II donde son guardados en vesículas características conocidas como cuerpos lamelares. En respuesta a una variedad de estímulos, en particular la distorsión física de las células tipo II, los contenidos de los cuerpos lamelares son liberados en la hipofase, donde se hidratan para formar una estructura entramada en 3-D conocida como mielina tubular. La mielina tubular en su momento provee la capa monomolecular en la interfase gas/líquido que posee la actividad biofísica.

Los componentes de la capa monomolecular tienen una vida definida y son remplazados constantemente. A los fosfolípidos disaturados (DSP) se les atribuye la reducción de la tensión superficial a los valores muy bajos que se piensa ocurren a volúmenes pulmonares bajos, mientras que el colesterol, el segundo lípido surfactante pulmonar mas abundante, se piensa que afecta el índice de adsorción y la fluidez de material recientemente liberado. El sistema es extremadamente dinámico; en ratas, dipalmitoilfosfatidilcolina, el principal componente del surfactante pulmonar de mamíferos, tiene una vida media de ~85 minutos en los alvéolos con tanto como 85% tomado nuevamente en células tipo II y reutilizado (Nicholas et al., 1990).

Hasta la fecha, se ha demostrado que cuatro proteínas, SP-A, -B, -C y –D están únicamente asociadas con el surfactante pulmonar de mamíferos. Existe un consenso general que las proteínas extremadamente hidrofóbicas (SP-B y –C) son componentes funcionales de la capa monomolecular, mientras que la proteína mas hidrofílica, SP-A parece estar más involucrada en la homeostasis del surfactante pulmonar y la defensa del huésped, y SP-D está únicamente involucrada en la defensa del huésped.

El síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (SDRA) representa un daño severo, difuso del pulmón causado por trauma directo, por medio de las vías respiratorias, o indirecto, por medio de la sangre. El sello de SDRA es un deterioro en la oxigenación de la sangre y conformidad con el sistema respiratorio como una consecuencia de edema de permeabilidad. Mientras que una variedad de diferentes insultos puede llevar a SDRA, una trayectoria común probablemente resulta en daño del pulmón. La activación de leucocitos dentro del pulmón, junto con la liberación de radicales libres de oxígeno, metabolitos de ácido araquidónico, y mediadores inflamatorios tales como

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interleucina-1, proteasas, y factor de necrosis de pulmón resulta en un aumento en la permeabilidad de la membrana alveolo-capilar. Con la pérdida de esta barrera macromolecular, los alvéolos son inundados con proteínas séricas, que perjudican la función del surfactante pulmonar (Said et al., 1965; Holm et al., 1987). Esto crea fuerzas hidrostáticas que exacerban más la condición (Jefferies et al., 1988), que lleva a edema alveolar y una deterioración concomitante en intercambio de gases y conforme al pulmón.

En la ultima década, se han evaluado numerosos métodos para determinar la permeabilidad pulmonar (Staub et al. 1990). Generalmente, estos han dependido de la detección del flujo de radiomarcadores hacia adentro, o hacia afuera, del pulmón. Sin embargo, pocos han sido aplicados clínicamente debido a problemas logísticos con scanners adecuados, estabilidad, y especificidad de los marcadores, y duda sobre los modelos matemáticos (Staub et al. 1990). Además, el daño pulmonar, tal como el inducido por un agente nocivo, solo ha sido clínicamente detectable cuando ha ocurrido suficiente daño para que haya cambios en la resistencia de la vía respiratoria o intercambio de gases. Es bien aceptado que esto refleja enfermedad pulmonar relativamente avanzada.

Las proteínas surfactantes son normalmente solo encontradas en cantidades apreciables en el pulmón. En los espacios aéreos, la SP-A forma predominantemente oligómeros de alto peso molecular (~650 kDa) con radios de Stoke de ~35 nm (Voss et al., 1988). Aunque la SP-B madura, que se asocia como un Mr bajo (~18 kDa) tiol dependiente homo-dímero (Johansson et al., 1991), está normalmente asociada de forma íntima con complejos de fosfolípido surfactante, (Longo et al., 1992), estudios in vitro e in vivo en células tipo II aisladas que sugieren que por lo menos algo de la proteína es secretado en los alvéolos como una pro-proteína hidrofílica, monomérica e intermedio de procesamiento con un Mr de ~45 kDa y ~25kDa, respectivamente (Weaver y Whitsett, 1989; Doyle et al., 1997). Doyle et al (1995), Am J Respir Crit Care Med vol 152, pp 307-317, midieron los niveles de proteína A surfactante sérica en pacientes con edema pulmonar cardiogénico agudo y síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos.

Honda Y. (1996), Japanese Journal of Thoracic diseases, vol 34, pp 181-185 midió las concentraciones de SP-D y SP-A en el suero de pacientes con neumonía intersticial idiopática.

Abe et al. (1995) Japanese Journal of Thoracic diseases, vol 33(11), páginas 1219-1225 buscaron evaluar la utilidad de medir la proteína A surfactante en el suero de pacientes con varias enfermedades de pulmón.

Lewis et al. (1994) Am J Respir Crit Care Med vol 150, páginas 123-130 caracterizó los cambios en el sistema surfactante endógeno en ovejas adultas que se vuelven sépticas.

EP0602248 A1 divulga un anticuerpo monoclonal contra la apoproteína S surfactante de pulmón humano y uso del mismo.

En el trabajo que llevó a la presente invención, los inventores han encontrado de forma inesperada que los niveles de surfactante pulmonar en suero proveen un marcador diagnóstico extremadamente sensible de daño pulmonar, y en particular daño pulmonar de etapa temprana, o una predisposición al desarrollo de daño pulmonar. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

A lo largo de la especificación, a no ser que lo requiera el contexto, la palabra “ comprende”,

o variaciones como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado o número entero o grupo de elementos o números enteros pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Como corresponde, un aspecto de la presente invención se relaciona con un método que diagnostica daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, dicho método que comprende la

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exploración para un aumento en los niveles de la proteína B surfactante pulmonar (SP-B) en la sangre, suero o plasma de dicho mamífero.

Un aspecto adicional de la presente invención provee un método que supervisa cambios en el alcance del daño pulmonar en un mamífero dicho método que comprende la exploración de un aumento en el alcance del daño de la membrana alveolo-capilar en un mamífero basado en un aumento en los niveles de SP-B de dicho mamífero.

Otro aspecto adicional de la presente invención provee un método que supervisa la disminución en el alcance del daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero dicho método que comprende la exploración por una disminución en los niveles de SP-B en el suero de dicho mamífero.

Como corresponde, otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método que diagnostica el daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, dicho método que comprende la exploración de la modulación de la proporción del nivel del surfactante pulmonar SP-B:SP-A en la sangre de dicho mamífero.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método que supervisa cambios en el alcance del daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, dicho método que comprende la exploración de la modulación de la proporción del nivel de surfactante pulmonar SP-B : SP-A en la sangre de dicho mamífero.

En otro aspecto adicional de la presente invención se provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición para desarrollar daño pulmonar severo, dicho método que comprende la exploración de la modulación de niveles del surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de la predisposición para desarrollar daño pulmonar adicional.

Aún otro aspecto adicional de la presente invención provee un método para determinar, en un mamífero que ha desarrollado ALI debido a exposición a un factor de daño al pulmón, una predisposición para desarrollar SDRA dicho método comprende la exploración por un aumento en el nivel de SP-B pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero donde el nivel de SP-B es indicativo de una predisposición para desarrollar SDRA.

Aún otro aspecto de la presente invención provee un método que determina, en un mamífero expuesto a un factor de daño al pulmón, una predisposición para desarrollar SDRA dicho método comprende la exploración para la modulación de la proporción del nivel de surfactante pulmonar SP

B : SP-A en un fluido corporal de dicho mamífero donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición para desarrollar SDRA.

En otro aspecto la presente invención provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño al pulmón, una predisposición para desarrollar SDRA dicho método que comprende correlacionar un aumento en el nivel de SP-B en el fluido corporal de dicho mamífero con el puntaje de daño de pulmón donde el resultado de dicha correlación es indicativo de una predisposición a desarrollar SDRA. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS

La presente invención es predicada, en parte en la identificación de una correlación entre los niveles séricos de proteína B surfactante pulmonar y el diagnóstico del desarrollo o predisposición al desarrollo de daño a la membrana alveolo capilar.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se relaciona con un método para diagnosticar daño pulmonar en un mamífero, dicho método que comprende la exploración para la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero.

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La referencia al “fluido corporal” debe entenderse por incluir referencia a fluidos que provienen del cuerpo de dicho mamífero tales como, pero no limitados a, sangre (incluyendo todos los componentes derivados de la sangre, por ejemplo, suero y plasma), orina, lágrimas, secreciones bronquiales o mucosidad y fluidos que han sido introducidos en el cuerpo de dicho mamífero y han sido subsecuentemente retirados tales como, por ejemplo, la solución salina extraída del pulmón después de un lavado pulmonar. Preferiblemente, el fluido corporal es sangre u orina y aún mas preferible sangre.

El término “mamífero” tal como es usado aquí incluye humanos, primates, animales de ganadería (por ejemplo caballos, vacas, ovejas, cerdos, burros), animales de prueba de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas), animales de compañía (por ejemplo perros, gatos) y animales salvajes en cautiverio (por ejemplo canguros, venados, zorros). Preferiblemente, el mamífero es un humano o un animal de prueba de laboratorio. Aún mas preferible, el mamífero es un humano. El término “daño pulmonar” abarca, pero no está limitado a, daño pulmonar debido a, por ejemplo, una anormalidad congénita o una anormalidad adquirida tal como la causada por el inicio de una condición autoinmune, rechazo de pulmón post-transplante, infecciones que resultan en una respuesta inflamatoria, cambios en las relaciones presión/volumen en el pulmón, exposición de dicho mamífero a un agente extraño (por ejemplo humo de tabaco o polvo), un agente nocivo o tóxico (por ejemplo solventes o gases) o es un efecto secundario no deseado que resulta de la exposición a un agente terapéutico. Ejemplos de daño pulmonar incluyen, pero no están limitados a, daño morfológico/estructural y/o daño al funcionamiento del pulmón tal como, por ejemplo, acumulación de proteínas (por ejemplo surfactante) o fluidos debido al impedimento del despeje pulmonar o daño a los mecanismos de intercambio de gases pulmonares. En la presente invención dicho daño pulmonar es un daño a la membrana alveolo-capilar.

La referencia aquí de “surfactante pulmonar” debe entenderse como que incluye la referencia a todas las formas de surfactante pulmonar y derivadas del mismo que incluye pero no es limitado a fosfolípido pulmonar, lípidos neutrales pulmonares y proteínas surfactantes pulmonares, e incluye todas las subunidades moleculares que incluye, por medio de un ejemplo, el precursor, pre-proteínas, pro-proteínas y formas intermedias de SP-B. Ejemplos de proteínas surfactantes pulmonares incluyen SP-A, -B, -C y –D. Preferiblemente, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o –D. La referencia aquí a “SP-A” “SP-B”, “SP-C” y “SP-D” debe entenderse que incluye la referencia a todas las formas de estas moléculas que incluye todos los precursores, pro-proteínas y formas intermedias del mismo.

Como corresponde, se provee un método para diagnosticar daño pulmonar en un mamífero, dicho método comprende la exploración para la modulación de uno o mas niveles de SP-A, -B, -C o – D en la sangre de dicho mamífero.

Los niveles de SP-A y SP-B circulantes dependen no solo en los tamaños relativos de las proteínas y la permeabilidad pulmonar sino también la forma disponible para infringir las barreras de membrana. La SP-A enlaza con avidez los fosfolípidos al punto que queda poco de estos libre en el fluido alveolar. En contraste, la forma predominante de SP-B inmunorreactiva alveolar, pro-proteína e intermedio de procesamiento no son enlazados a los lípidos de superficie, posiblemente permitiendo una entrada mas libre en la circulación. Adicionalmente, el que la proporción en plasma de SP-B/SPA varíe con la función pulmonar sugiere que el SP-B del plasma es un marcador mas dinámico de cambios en la permeabilidad pulmonar que SP-A.

En una modalidad más preferida, las presente invención se relaciona con un método para diagnosticar daño pulmonar en un mamífero dicho método que comprende la exploración de un aumento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mamífero.

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Dicho daño pulmonar es un daño a la membrana alveolo-capilar.

Los “derivados” de dichos surfactantes incluyen fragmentos, partes, porciones, mutantes y análogos del mismo. Los derivados pueden ser derivados de inserción, supresión o sustitución de un amino ácido. Los derivados de inserción de amino ácido incluyen fusiones terminales de amino y/o carboxilo como también inserciones intrasecuencia de amino ácidos únicos o múltiples. Las variantes de secuencia de amino ácido de inserción son aquellas en las que uno o más residuos de amino ácido son introducidos en un sitio en la proteína. Las variantes de supresión se caracterizan por la extracción de uno o mas amino ácidos de la secuencia. Variantes de amino ácido de sustitución son aquellas en las que por lo menos un residuo en la secuencia ha sido retirado y un residuo diferente ha sido insertado en su lugar.

El método de la presente invención es particularmente útil en la detección de daño pulmonar de etapa temprana. “Etapa temprana” se define como el periodo durante el cual el inicio y desarrollo de daño pulmonar no es detectable o no puede ser confirmado sin la ayuda de uno o mas procedimientos invasivos. Por ejemplo, el método de ésta invención tiene aplicación en la detección de cambios tempranos en la permeabilidad pulmonar en fumadores. “Etapa temprana” debe también entenderse por incluir niveles bajos de daño pulmonar tales como por ejemplo, daño pulmonar crónico pero leve de pulmón. Cambios tempranos en la permeabilidad pulmonar que pueden ser asociados con reclutamiento de neutrófilos y destrucción inicial de tejidos conectivos pulmonares por especies de elastasa y oxígeno reactivos pueden ser marcados por un aumento en los niveles de plasma SP-B a pesar de la ausencia aparente de algún síntoma visible de daño pulmonar.

Como corresponde, se describe un método para diagnosticar daño pulmonar de etapa temprana en un mamífero, dicho método que comprende la exploración para la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero.

Preferiblemente dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o –D y aún mas preferible SP-B.

Un método para detectar daño pulmonar de etapa temprana en un mamífero es descrito, dicho método que comprende la exploración para la modulación de niveles de SP-B en la sangre de dicho mamífero.

Dicho daño pulmonar es daño a la membrana alveolo-capilar.

Aunque no se pretende limitar la invención a una sola teoría o modo de acción, el daño a la membrana alveolo-capilar causa un aumento en la permeabilidad alveolo-capilar. Aunque la SP-A y SP-B inmunorreactiva no están normalmente presentes en cantidades apreciables en la circulación sistémica, se cree que la aparición de proteínas surfactantes pulmonares adicionales en el suero de pacientes con daño pulmonar ocurre como resultado de cambios en la permeabilidad alveolo-capilar.

Como corresponde, el término “modulación” se refiere a aumentos o disminuciones en los niveles séricos de surfactantes pulmonares relativo a un nivel de referencia normal (o rango de nivel de referencia normal) o a un resultado mas temprano de nivel de surfactante determinado del fluido corporal de dicho mamífero. Un nivel de referencia normal es el nivel de surfactante del fluido corporal de un mamífero o grupo de mamíferos que no tienen ningún daño pulmonar. Dicho nivel de referencia puede ser una cifra discreta o puede ser un rango de cifras. Dicho nivel de referencia puede variar entre clases individuales o moléculas de surfactante. Por ejemplo, el nivel normal de SP-A puede ser diferente al nivel normal de SP-B o una subunidad SP-B particular. En el método de la presente invención, dicha modulación es un aumento en los niveles de surfactante pulmonar en la sangre.

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Se describe un método para diagnosticar daño pulmonar en un mamífero, comprendiendo dicho método la exploración de un aumento en niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero.

Preferiblemente, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o –D. En el método de la presente invención el surfactante pulmonar es SP-B.

En particular, el daño pulmonar puede ser daño pulmonar de etapa temprana. En el método de la presente invención el daño pulmonar es daño a la membrana alveolo-capilar.

De acuerdo con la modalidad mas preferida de la invención, se provee un método para diagnóstico de daño a la membrana alveolo-capilar de etapa temprana en un mamífero, dicho método que comprende la exploración de un aumento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mamífero.

Aunque el método preferido es detectar un aumento en los niveles de surfactante pulmonar en la sangre, la detección de una disminución en dichos niveles surfactantes puede ser deseada bajo ciertas circunstancias. Por ejemplo, para supervisar la mejora en la morfología de la membrana alveolo-capilar durante el curso de tratamiento terapéutico de pacientes que presentan daño de la membrana alveolo-capilar o para monitorear la maduración del pulmón en bebes prematuros con síndrome de insuficiencia respiratoria.

Como corresponde, otro aspecto de la presente invención provee un método para supervisar cambios en el alcance del daño pulmonar donde el daño pulmonar es daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero dicho método comprende la exploración para el aumento en los niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero.

Dicho surfactante pulmonar es SP-B.

El daño pulmonar es daño a la membrana alveolo-capilar.

En una modalidad más preferida se provee un método para supervisar el aumento en el alcance del daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero dicho método que comprende la exploración de un aumento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mamífero.

En aún otra modalidad mas preferida se provee un método para supervisar la disminución en el alcance del daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero dicho método que comprende la exploración para una disminución en los niveles de SP-B en el suero de dicho mamífero.

Los niveles de surfactante pulmonar utilizados en el método de la presente invención, en adición al análisis de los valores absolutos relativos a un nivel de referencia normal, también pueden ser analizados en relación del uno con el otro. Los resultados de daño pulmonar en un cambio diferencial de los niveles de SP-A y SP-B en la sangre tales que la proporción de SP-B : SP-A es inversamente relacionada a las funciones pulmonares. Estas proporciones también pueden ser comparadas a proporciones de nivel de referencia normal.

Como corresponde, otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de diagnóstico de daño pulmonar en un mamífero, dicho método que comprende la exploración de la modulación de dichas proporciones del nivel de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero.

La referencia a “proporciones del nivel de surfactante pulmonar” debe entenderse como la proporción de SP-B : SP-A en un mamífero. “Surfactante pulmonar” tiene el mismo significado como fue aquí anteriormente definido. La proporción, en un mamífero, de un nivel de surfactante pulmonar a otro nivel de surfactante pulmonar puede ser indicativo de daño pulmonar.

Dicha proporción del nivel de surfactante pulmonar es una proporción de los niveles de SP-B : SP-A y preferiblemente SP-B pre-proteína : SP-A.

Aún más preferible dicha modulación es un aumento en la proporción.

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Aún más preferible, dicho aumento en la proporción SP-B:SP-A o SP-B pre-proteína: SP-A es indicativo de daño a la membrana alveolo-capilar.

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para supervisar cambios en el alcance de daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método la exploración para la modulación de dichas proporciones del nivel de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero.

El método de la presente invención tiene usos extensos, que incluyen pero no se limitan a, como un monitor no invasivo clínico o de diagnóstico de la función pulmonar o daño morfológico/estructural (tal como el inicio de daño a la membrana alveolo-capilar o retención de proteína) debido a, por ejemplo, una respuesta inflamatoria, exposición a un agente externo, agente nocivo, agente tóxico, un efecto secundario de una exposición a un agente terapéutico, rechazo de pulmón post-transplante, inicio de auto inmunidad, experimento de evacuación pulmonar o impedimento de intercambio gaseoso y el inicio de daño a la membrana alveolo-capilar de individuos expuestos a un agente externo o un agente nocivo o tóxico tal como individuos que fuman o individuos que están involucrados en ocupaciones tales como soldadura, pintura en aerosol, fabricación de fibra de vidrio o que involucra exposición a fumadores pasivos, que puede resultar potencialmente en daño pulmonar. El método de la presente invención también tiene aplicación en la determinaron del estado de salud pulmonar de cualquier individuo independientemente de cualquier predisposición percibida o la posibilidad de tener un grado adquirido de daño pulmonar.

El método de la presente invención se extiende al diagnóstico del grado de daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero basado en el análisis cuantificado de dichos niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero. Por ejemplo, el grado de aumento en la sangre de dicho nivel de surfactante pulmonar es usado como un indicador del grado de daño de la membrana alveolo-capilar que el mamífero ha desarrollado.

Daño pulmonar agudo (que se denomina aquí “ALI”) puede desarrollarse después de exposición a un número de factores tales como, pero no limitados a, aspiración de contenidos gástricos, neumonía, sepsis, transfusión masiva, trauma múltiple y pancreatitis. Un número más pequeño de pacientes desarrollan daño pulmonar mas severo, que algunas veces se denomina síndrome de insuficiencia respiratoria aguda o de adulto (que se denomina aquí “SDRA”), que es una forma mas severa de ALI con un índice de mortalidad de aproximadamente 50-60%. La predicción de pacientes que tiene alta probabilidad de desarrollar SDRA permitiría, por ejemplo, tener como objetivo terapias novedosas, y usar un complejo de estrategias de ventilación, el costo de cual puede no ser justificado de otra forma.

Como corresponde, otro aspecto de la presente invención provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición a desarrollar SDRA, dicho método que comprende la exploración de un aumento del nivel de surfactante pulmonar SP-B en la sangre de dicho mamífero donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de una predisposición para desarrollar SDRA.

La frase “factor de daño pulmonar” debe entenderse como una referencia a cualquier factor que puede causar directa o indirectamente nuevo daño pulmonar o exacerbar el daño pulmonar existente. Ejemplos de dicho factor incluyen, pero no están limitados a, ventilación mecánica, hiperoxia, aspiración de contenidos gástricos, neumonía, sepsis, transfusión masiva, trauma múltiple y pancreatitis. El daño pulmonar causado por la exposición de un mamífero a un factor de daño pulmonar puede ser o no puede ser clínicamente aparente.

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El método es útil para predecir los pacientes, que han sido expuestos a un factor de daño pulmonar, que tienen mas probabilidad de desarrollar daño pulmonar severo (y no solamente ALI) o aquellos pacientes, que han desarrollado ALI como resultado de exposición a un factor de daño pulmonar, que tienen mas probabilidad de llegar a desarrollar daño pulmonar severo. Como corresponde, la frase “daño pulmonar severo” debe entenderse en su más amplio sentido e incluye referencia al desarrollo de un nuevo daño pulmonar o exacerbación de daño pulmonar existente, tal como un aumento en su severidad. En una modalidad preferida particularmente, dicho mamífero ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de daño pulmonar y tal daño pulmonar severo es SDRA. Dicho ALI puede ser o no ser clínicamente aparente.

Un método para determinar, en un mamífero que ha desarrollado ALI debido a exposición a un factor de daño al pulmón, se describe una predisposición de desarrollar SDRA comprendiendo dicho método la exploración para la modulación de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mamífero donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de una predisposición de desarrollar SDRA.

Mas preferiblemente dicho surfactante es SP-A y/o SP-B.

El método de determinar, en un mamífero que ha desarrollado ALI debido a exposición a un factor de daño al pulmón, una predisposición para el desarrollo de SDRA comprende la exploración para el nivel de SP-A y/o SP-B en la sangre de dicho mamífero donde el nivel de dicho SP-A y/o SPB es indicativo de una predisposición de desarrollar SDRA.

Aún otro aspecto de la presente invención se provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición a desarrollar SDRA dicho método que comprende la exploración para la modulación de la proporción del nivel de surfactante pulmonar SP-B:SP-A en la sangre de dicho mamífero donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición a desarrollar SDRA.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, se cree que SP-A y SPB son marcadores sustitutos de la severidad de la enfermedad que puede no ser detectada clínicamente. Como corresponde, la referencia de explorar para una “predisposición” a daño pulmonar adicional debe entenderse en su sentido mas amplio para incluir explorar aquellos mamíferos que tienen probabilidad de desarrollar daño pulmonar adicional y explorar aquellos mamíferos que ya han desarrollado dicho daño pulmonar adicional pero todavía no exhiben sintomatología clínica.

En otro aspecto de la presente invención, la predisposición para desarrollar SDRA puede ser determinada correlacionando los resultados de medición de múltiples factores o parámetros clínicos de función pulmonar o morfología (al que se hace referencia aquí como “parámetros clínicos pulmonares”), tales como el puntaje de daño pulmonar, con niveles de surfactante. Por ejemplo, el riesgo de desarrollar SDRA puede ser determinado utilizando un modelo que correlaciona niveles de SP-A y SP-B. En una modalidad particular dicho método correlaciona SP-A, SP-B y el puntaje de daño pulmonar donde P=0.012 y R2=46%. El puntaje de daño pulmonar aislado puede no ser predictivo del desarrollo de SDRA, es útil cuando se combina con el índice predictivo de nivel de surfactante.

Como corresponde, otro aspecto de la presente invención provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición para desarrollar SDRA dicho método que comprende correlacionar un aumento en el nivel de la proteína surfactante pulmonar SP-B en la sangre de dicho mamífero con el resultado de la medida de otro parámetro clínico pulmonar donde el resultado de dicha correlación es indicativa de una predisposición de desarrollar SDRA.

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Preferiblemente, la presente invención provee un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición a desarrollar SDRA comprendiendo dicho método correlacionar el aumento en niveles de SP-B en la sangre de dichos mamíferos con el puntaje de daño pulmonar donde el resultado de dicha correlación es indicativo de una predisposición a desarrollar SDRA.

La exploración de niveles de surfactante pulmonar en suero de un mamífero pueden ser logrados por medio de un número de técnicas tales como pruebas funcionales, pruebas enzimáticas o pruebas inmunológicas. Las pruebas funcionales pueden incluir detectar SP-A o –B por su capacidad de afectar la liberación o recaptación de surfactante o detectando las propiedades de defensa del huésped. SP-C puede ser detectado midiendo los palmitatos asociados. Las pruebas inmunológicas pueden incluir poner en contacto una muestra de suero con un anticuerpo específico para un surfactante pulmonar (o grupo de surfactantes pulmonares) o derivados del mismo por un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-surfactante pulmonar, y después detectar dicho complejo.

En un método particular preferido las moléculas surfactantes objetivo en la muestra de suero son expuestas a un anticuerpo específico que puede o no puede ser marcado con una molécula reportera. Dependiendo de la cantidad de objetivo y la fuerza de la señal de la molécula reportera, un objetivo enlazado puede ser detectable por marcado directo con un anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico al primer anticuerpo es expuesto al complejo de objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario anticuerpo de objetivo-primero anticuerpo-segundo. El complejo es detectado por la señal emitida por la molécula reportera.

Por “molécula reportera” como se usa en la presente especificación, se quiere decir una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal analíticamente identificable que permite la detección de anticuerpo enlazado a antígeno. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas reporteras mas comúnmente usadas en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radioelementos (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.

En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o periodato. Como será fácilmente reconocido, sin embargo, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación, que ya están fácilmente disponibles para el artesano experto. Enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que se usan con las enzimas específicas son generalmente escogidos para la producción, en cuanto hay hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible usar sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente en vez de los sustratos cromogénicos que se mencionaron arriba. En todos los casos, el anticuerpo marcado con la enzima es agregado al primer complejo de anticuerpo hapteno, al que se le permitió enlazarse, y después el reactivo sobrante es retirado por lavado. Una solución que contiene el sustrato apropiado es después agregada a un complejo de anticuerpo-antígeno. El sustrato va a reaccionar con la enzima vinculada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser posteriormente cuantificada, usualmente por espectrofotometría, para dar una indicación de la cantidad de hapteno que estaba presente en la muestra.

Alternativamente, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden ser emparejados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando son activados por iluminación con luz de una longitud de onda en particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, que induce un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz en un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en la EIA, al anticuerpo marcado con fluoresceína se le permite enlazarse al primer complejo anticuerpo-hapteno. Después de lavar el reactivo que no se enlazó, el complejo terciario que permanece es expuesto a la luz de la longitud de onda apropiada la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA son ambas muy bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, otras moléculas reporteras, tales como moléculas radioisótopo, quimioluminiscentes o bioluminiscentes, también pueden ser usadas.

Debe entenderse que el método de la presente invención incluye tanto una medida de los niveles de surfactante en un mamífero y múltiples medidas realizadas sobre un periodo de tiempo (por ejemplo como puede ser requerido para la supervisión constante del estado del daño del pulmón de un mamífero individual).

Un equipo diagnóstico para ensayar muestras de suero es descrito que comprende en forma de compartimento un primer compartimento adaptado para contener un agente para detectar surfactante pulmonar y un segundo compartimento adaptado para contener reactivos útiles para facilitar la detección por un agente en el primer compartimento. Compartimentos adicionales pueden también ser incluidos, por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser un anticuerpo u otra molécula adecuada para detectar.

Características adicionales de la presente invención se describen adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que ésta descripción detallada se incluye solamente con el propósito de ejemplificar la presente invención.

La referencia a SP-A y SP-B en los siguientes ejemplos debe entenderse como una referencia a SP-A y SP-B inmuno-reactiva. EJEMPLO 1 Preparación de la Muestra y Almacenamiento

Se centrifugó sangre inmediatamente en tubos (Disposable Products, Sydney, Australia) que contienen heparina de litio (plasma) o acelerador de reacción de coágulo (suero) a 5,000 rpm por 5 min a temperatura ambiente (Megafuge; Heraeus-Christ, Osterode, Alemania). Las muestras fueron almacenadas a -20 °C para análisis de lote. EJEMPLO 2 Preparación de Anticuerpo Primario La SP-A y SP-B fueron purificadas del fluido de lavado de pacientes con proteinosis alveolar. Cada proteína fue emulsificada con adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI) e inyectado subcutáneamente en 3 conejos blancos de Nueva Zelanda. Las inmunizaciones fueron reforzadas con SP-A o SP-B emulsificado en adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories). Los conejos fueron sangrados y el IgG fue precipitado del suero usando 50% (vol/vol) de sulfato de amonio saturado. El IgG fue reconstituido al volumen de suero original en 136.8 mM de cloruro de sodio, 8.1 mM de disodio fosfato de hidrógeno, 2.6 mM de cloruro de potasio, 0.7 mM de fosfato dihidrógeno de potasio que contiene 0.02% de azida de sodio y 0.05% (vol/vol) de Tween 20 (PBST) e inmuno adsorbido toda la noche a 4 °C contra 200 ml de suero humano degradado, normal. Para poder remover cualquier especificidad contra determinantes antigénicos de grupo A de sangre soluble, el suero degradado fue preparado de sangre mezclada que comprende porciones iguales de plasma de cinco sujetos con grupos de sangre: A (+va), A(-va), AB (+va), O (+va) y O (-va). Componentes no adsorbidos fueron aislados después de centrifugar a 4 °C a 8,000 x g (max) por 1 h y el procedimiento de inmunoadsorción fue repetido usando suero humano fresco inmunoadsorbente. Finalmente, los anticuerpos fueron filtrados a través de un filtro Acrodysc de 0.2 µm (Sterile Acrodysc; Gelman Sciences; Ann Harbor, MI; #4192).

Ambos anticuerpos reaccionan fuertemente con sus antígenos tanto en sus estados nativos como en sus estados reducidos. El anticuerpo contra SP-B también reacciona con su intermedio de procesamiento y su proproteína además del péptido maduro. EJEMPLO 3 ELISA

Se determinaron SP-A y –B por ensayos de inhibición ELISA usando SP-A y SP-B purificados del fluido de lavado de proteinosis alveolar como estándar.

Se ensayaron muestras de forma aleatoria ciega. Para poder liberar el SP-A y –B de cualquier componente de plasma o surfactante asociados, todas las muestras fueron tratadas de la siguiente forma. 125 µl de alicuotas fueron diluidos en 500 µl de 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA que contiene 0.25% de BSA (pH 7.4). Después de someter a vortex a temperatura ambiente por 10 min, 125 µl de solución que contiene 3% de SDS y 12% de Triton X-100 (v/v) fue agregado a cada muestra. Las muestras fueron nuevamente sometidas a vórtex por 10 min y la concentración de la proteína surfactante fue determinada usando un ensayo de inhibición de ELISA.

Los ensayos de SP-A y SP-B fueron realizados en 2 partes. Placas de ELISA Costar (Costar, Cambridge, MA; # 2595) fueron cubiertas toda la noche a 4 °C con SP-A o –B ( 1µg/ml) en una solución que contiene 15 mM de carbonato de sodio, 35 mM de bicarbonato de sodio y 0.02% de azida de sodio (pH 9.6). Las placas cubiertas fueron lavadas con PBST antes de ser usadas.

En una placa de ELISA separada se incubaron diluciones de las muestras y estándares (que fueron incluidos como rutina en cada placa) con alícuotas del anticuerpo primario respectivo. Cada muestra tratada fue ensayada a cuatro 2-veces la dilución en PBST que contiene 0.25% BSA (PBST/BSA). Curvas estándar que comprenden ocho 2-veces diluciones en serie en PBST/BSA (SP

A: 1.95 ng/ml a 250 ng/ml; SP-B: 7.8 ng/ml a 1.0 µg/ml) fueron construidas. Las muestras fueron ensayadas en duplicado mientras que los estándares fueron ensayados en cuadruplicado.

Después de 90 minutos las alícuotas fueron transferidas a las placas cubiertas con SP-A y SPB e incubadas a temperatura ambiente por 90 minutos adicionales. Estas placas fueron entonces lavadas con PBST e incubadas a temperatura ambiente por 90 minutos con alícuotas de IgG policlonal anti-conejo de oveja fosfatasa-conjugado (Silenus Laboratories) diluido en PBST/BSA. Después de lavar con PBST las placas fueron desarrolladas a temperatura ambiente con 15 mM de fosfato de disodio p-nitro-fenil (Sigma 104 tabletas de sustrato de fosfatasa; Sigma Chemical Co; St Louis, MO) en 1.0 M de dietanolamina y 0.5 mM de cloruro de magnesio. A ~ 1 h la absorbancia del sustrato fue medida a 405 nm usando un lector de Dynatech MR5000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Se usó un programa AssayZap (Biosoft, Ferguson, MO) para generar una curva estándar y para calcular la concentración de la proteína surfactante en cada muestra con base en su inmunorreactividad. Estadísticas

Los resultados fueron expresados como media + EE. Se usaron Análisis no-paramétricos ya que no tenemos razones para asumir que los datos no están normalmente distribuidos. La prueba de Mann-Whitney U o la Prueba de Wilcoxon Matched Pairs Sign Rank fue usada para todas las comparaciones. EJEMPLO 4 Niveles Normales de Proteína Surfactante en Plasma y Fumar

El fumar cigarrillos ha sido implicado como un factor que causa daño de pulmón. Esto incluye daño a las vías aéreas y al parénquima pulmonar, y puede manifestarse como un amplio rango

de condiciones incluyendo bronquitis, enfisema y algunos cánceres de pulmón. Sin embargo, varios sujetos fumadores no tienen daño de pulmón clínicamente evidente y son asintomáticos. Consecuentemente puede ser necesario describir un “nivel de proteína surfactante normal en plasma” para no fumadores y fumadores con el “nivel normal de fumadores” que describe daño pulmonar 5 asintomático. Ya que fumar cigarrillos puede aumentar aguda y reversiblemente la permeabilidad epitelial pulmonar a través de la liberación mediada por humo de neuropéptidos vasoactivos (taquiquininas) de nervios sensoriales en las vías aéreas (Germonpre et al, 1995; Geppetti et al, 1993; Lei et al, 1993; Nadel & Borson, 1991), se le pide a los fumadores abstenerse de fumar por al menos 4 h antes de a exploración. Se extraen Dos ml de sangre periférica de una vena antecubital y se

10 centrifuga en tubos con heparina de litio a 5,000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente (Megafuge; Heracus-Christ; Osterode, Alemania) inmediatamente después de la recolección. La sangre fue muestreada de 66 adultos asintomáticos de los que no se conoce que tengan ninguna enfermedad pulmonar. Se anotó la edad, sexo e historia de fumador de los sujetos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

15

Tabla 1

No-fumadores Fumadores Valor-P Edad (años) 30.4+1.7 33.7+1.3 NS Sexo (M/F) 16/19 16/15 NS SP-A (ng/ml) 248+14.1 242.3+29.8 NS SP-B (ng/ml) 2026.9+91.8 3046.2+209.1 <0.001 (media + EE, prueba-U Mann-Whitney)

31 sujetos habían fumado 20.1 + 2.7 paquetes/año de cigarrillos, y esto se correlacionó con sus niveles de SP-B con un R2 de 33% y un valor P = 0.0005. Los intervalos de confidencia de 95% 20 de estos datos para SP-A fueron 219.7 – 277.1 (ng/ml) para no fumadores y 181.4-303.2 (ng/ml) para

fumadores, y para SP-B 1840-2213 (ng/ml) para no fumadores y 2619-3473 (ng/ml) para fumadores.

El nivel de plasma SP-B es elevado en fumadores asintomáticos comparado a no-fumadores asintomáticos, consistente con salud pulmonar deficiente en fumadores. Esto respalda la reivindicación de que el nivel de SP-B en plasma es un marcador extremadamente sensible para salud

25 pulmonar. Los intervalos de confidencia de 95% pueden ser usados para estimar un nivel de plasma de cada proteína surfactante que es elevada, indicando daño pulmonar, para esa cohorte. Datos posteriores pueden referirse a niveles elevados en comparación con estos datos o una elevación del nivel en plasma de la línea de fondo de estudios longitudinales en un sujeto individual.

EJEMPLO 5 30 Discapacidad inducida por Ejercicio de la Barrera Alvéolocapilar en Humanos

Dieciocho sujetos macho (media +EE, edad: 18 a 29 años, 24.3+0.80 años; altura: 162 a 188 cm, 178+ 1.72 cm; peso: 53 a 95 kg, 75.9 + 2.61 kg), todos no fumadores, llegaron al laboratorio de función pulmonar entre las 7.00 y 8.00 am después de ayunar desde la media noche. Una sola muestra de sangre periférica fue retirada de una vena antecubital de la mitad de los sujetos. Los otros nueve

35 sujetos fueron sometidos a un régimen de ejercicio y la sangre fue muestreada inmediatamente después. Una semana después los grupos de sujetos fueron invertidos. El procedimiento fue repetido en 13 de los sujetos ~ 8 semanas después. Procedimiento de Ejercicio Agudo

Los sujetos fueron equipados con un oxímetro pulsatorio para la oreja (Criticare 504-USP, CSI-USA, Waukesha, WI) para supervisar el ritmo cardíaco. Los sujetos montaron bicicleta a 60 rpm (Ergometry System Model 380B; Siemens-Elema AB, Sona, Suiza) y la carga fue aumentada para llevar el ritmo cardíaco a aproximadamente 90% del ritmo cardíaco máximo teórico, calculado como 210-(0.6 x edad), en 10 min. Continuaron montando en bicicleta por 20 minutos adicionales, y la carga fue continuamente ajustada para mantener el ritmo cardíaco lo mas cerca posible a este valor. En todos los casos esto involucró la reducción gradual de la carga en ese periodo. Resultados

Los niveles de SP-B en suero son significativamente (<0.01, n=31; Prueba Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank) elevados después del ejercicio (descanso: 1656.5 ng/ml +94.46; ejercicio; 1899.8 ng/ml+128.35; media +EE).

En humanos la presión capilar pulmonar puede llegar al pico a 35mm Hg durante un ejercicio extenuante y esto es suficiente para perjudicar la integridad de la barrera sangre-gas. Esos descubrimientos son consistentes con esto e ilustran que una elevación rápida en la presión capilar pulmonar puede producir fallo por estrés en los capilares pulmonares y aumentar la permeabilidad alvéolo-capilar.

Como contraste, los caballos tienen comparativamente un rendimiento cardíaco mucho mayor, además, los pura sangre son reproducidos selectivamente para maximizar el rendimiento. Como consecuencia, la presión pulmonar capilar puede alcanzar 200 mm Hg en la base de los pulmones durante un ejercicio extenuante. Aunque la barrera de sangre-gas de los caballos es mucho mas resistente a fallos por estrés que la de muchos otros mamíferos, al ser sometidos a estas presiones no es sorprendente que ~90% de pura sangres de 5 años han sufrido por lo menos un episodio a gran escala de hemorragia pulmonar, con un costo apreciable a la industria de carreras. El SP-A & -B circulante son marcadores sensibles de daño pulmonar hidrostático inducido por presión.

Ya que durante un ejercicio extenuante, las presiones vasculares pulmonares son elevadas y dan como resultado agua pulmonar aumentada y permeabilidad alvéolo-capilar aumentada en caballos de carrera, esto da como resultado la ruptura de vasos sanguíneos pulmonares que se manifiesta como sangre en los alvéolos. Se vigilan la sangre o los niveles de proteína surfactante en producto sanguíneo durante el entrenamiento, la carrera y durante la recuperación de daño pulmonar inducido por ejercicio. EJEMPLO 6 Fallo Respiratorio Agudo

El fallo respiratorio agudo puede deberse a múltiples causas tales como edema cardiopulmonar, politrauma, transfusión múltiple, sepsis o infección seria, aspiración de contenidos gástricos, neumonía, coagulación intravascular diseminada y pancreatitis.

Se tomaron muestras de sangre de 83 pacientes en la Unidad de Cuidado Crítico en el Centro Médico Flinders, el plasma fue aislado y almacenado a -20 ºC antes del análisis. Se calculó la edad, sexo, y puntuación de daño pulmonar (LIS)1 derivado de una puntuación de radiografía de pecho, la presión parcial de oxígeno en proporción al oxígeno inspirado (proporción PaO2/FiO2), la cantidad de presión extremo-expiratorio positivo y la conformidad del sistema respiratorio. Diez sujetos fueron ventilados mecánicamente por otras razones diferentes a fallo respiratorio, y se pensó que tenían función pulmonar normal. Los 73 pacientes restantes tenían fallo respiratorio agudo y fueron subdivididos dependiendo de la causa subyacente. Resultados Tabla 2 (medias+EE)

Puntuación Plasma Plasma Número Masculino/Femenino Edad de daño de SP-A SP-B Pulmón (ng/ml) (ng/ml) Control

10 7/3 36+8 0.3+0.2 227+30 1998+169

Ventilados Edema cardio 10 7/3 36+8 0.3+0.2 268+22 3646+635 pulmonar Poli

4 4/0 33+4 1.3+0.2 444+108 4174+1197

traumatizado Transfusiones 9 8/1 70+3 2.1+0.2 368+41 3456+384 múltiples Sepsis 14 9/5 65+3 2.3+0.3 467+233 4373+819 Aspiración 13 9/4 70+3 2.3+0.1 500+67 8110+1338 Neumonía 12 8/4 58+5 2.2+0.3 528+86 9725+1735 Coagulación 2 1/1 36+18 2.5+0.5 452+232 6099+4312 intravascular diseminada Pancreatitis 6 4/2 49+4 2.1+0.2 414+119 4768+1696 Fallo hepático 3 1/2 31+6 3.4+0.3 531+106 7407+2627

Los sujetos control ventilados tenían niveles normales de SP-A y SP-B en plasma (Tabla 2). Sin embargo, hay niveles elevados de plasma en una amplia variedad de causas de fallo respiratorio agudo. Los niveles mas altos de SP-A y SP-B fueron generalmente encontrados en pacientes con fallo

5 respiratorio agudo debido a neumonía por aspiración o neumonía, ambos causas directas de daño pulmonar. Los niveles más bajos, pero aún elevados de SP-A y SP-B fueron encontrados en pacientes con edema cardiopulmonar. Esto es consistente con niveles en plasma elevados de estas proteínas que representan un aumento en la permeabilidad alveolo-capilar, y que ésta elevación es generalmente mayor en causas directas de daño pulmonar y una menor elevación en daño pulmonar debido a una

10 elevación en la presión hidrostática pulmonar, que es una causa indirecta de daño pulmonar.

EJEMPLO 7 Supervisión de fármacos terapéuticos, tóxicos para el pulmón -por ejemplo metotrexato

El metotrexato es un fármaco inmunosupresor comúnmente usado para el tratamiento de una variedad de condiciones incluyendo artritis reumatoidea, Sin embargo, un efecto secundario del 15 metotrexato es el daño pulmonar el que, hasta la fecha, ha sido detectado por síntomas tales como cambios en gases sanguíneos o pruebas de función pulmonar sofisticadas. Dichos métodos solo detectan daño pulmonar avanzado. Se usan los niveles de proteína surfactante en sangre o derivados de la sangre para supervisar la seguridad de la terapia con metotrexato detectando cualquier aumento en la permeabilidad alvéolo-capilar. La supervisión comprende una prueba preliminar seguida por

20 pruebas intermitentes (diarias, semanales o mensuales).

EJEMPLO 8 Supervisión de Pacientes Tratados con Bleomicina

La bleomicina es un fármaco anti-cáncer o citotóxico del que se sabe que causa toxicidad pulmonar. Los factores de riesgo de daño pulmonar inducido por bleomicina incluyen el aumento de 25 la dosis, uso junto con otros fármacos citotóxicos, radioterapia y oxígeno suplementario. Se cree que tres mecanismos principales son los causantes del daño pulmonar. La citotoxicidad directa de especies

15

reactivas de oxígeno causa un edema pulmonar permeable, similar a daño pulmonar agudo (ALI). El daño pulmonar también puede ocurrir debido a reacciones de hipersensibilidad o idiosincráticas. Ninguno de los otros fármacos por sí solos y usado en las dosis dadas a los pacientes descritos comúnmente causa toxicidad pulmonar.

5 Listado en la Tabla 3 hay cuatro pacientes que fueron tratados con bleomicina y otros fármacos citotóxicos. Ninguno de los pacientes tubo síntomas respiratorios, ninguno tenía implicación del pulmón con cáncer y todos eran no fumadores. Se tomaron muestras de sangre en descanso y el plasma fue congelado a -20 ºC hasta que la prueba.

10 Tabla 3

Datos de quimioterapia

Diagnóstico Edad Sexo Historia de fumador PFTs1 Dosis de Bleomicina (unidades) Otros citotóxicos SP-A (ng/ml) SP-B (ng/ml) Cáncer testicular2 39 M Suspendido hace 15 años 60 Cisplatino 450 mg etoposida 2.2 g 360.2 1547.9 Linfoma de Hodgkin3 23 M nunca normal 90 Doxorubicina 450mg vinblastina 110 mg dacarbazina 6.8 g 174.3 1730.0 Linfoma no-Hodgkin 74 M nunca 15 Ciclofosfamida 1g etoposida 100 mg procarbazina 100 mg prednisolona 75 mg 265.5 2598.2 Linfoma no-Hodgkin 60 F Nunca 30 Ciclofosfamida 2.2g etoposida 390 mg procarbazina 1 g prednisolona 1g 413.6 1382.6

1La prueba de funcionamiento pulmonar incluye volúmenes pulmonares, factores de transferencias y respuestas a broncodilatadores fueron normales antes de comenzar la quimioterapia citotóxica. 2Una semana después de otras 30 unidades de bleomicina su niveles de SP-A y SP-B todavía estaban elevadas pero habían bajado a 295.5 y 1199.8 ng/ml respectivamente. 3Dos semanas después de otro ciclo de quimioterapia la cual incluyó otras 18 unidades de bleomicina su nivel de SP-A se había elevado a 339.9 ng/ml y su SP-B se había elevado a 5512.8 ng/ml.

Resultados

• El nivel de SP-B en plasma en el paciente 3 es elevado, pero los niveles en los otros

pacientes son normales. Esto es consistente con la variabilidad individual a los efectos 15 tóxicos pulmonares de la bleomicina.

• El paciente 2: La elevación de SP-A y SP-B con una dosis adicional de bleomicina (véase la nota 3 a pie de pagina) es consistente con daño pulmonar inducido por bleomicina llevando a un aumento en la permeabilidad alveolo-capilar y un aumento en los niveles de proteína surfactante en plasma. Esto indica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados

20 para supervisar la administración de fármacos tóxicos para el pulmón.

• El paciente 1: La caída en SP-A SP-B después de quimioterapia adicional es consistente con la reparación y resolución de daño pulmonar inducido por la bleomicina. Esto indica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados para supervisar la resolución de daño pulmonar debido a un fármaco tóxico.

EJEMPLO 9 Daño Pulmonar Inducido por Radioterapia

La terapia de radiación que tiene como objetivo o expone involuntariamente el pulmón puede dar como resultado un daño pulmonar. Mientras esto es casi siempre relativamente asintomático, algunos pacientes se tornan sintomáticos y pueden desarrollar fallo respiratorio. Esto ocurre en las semanas que siguen el inicio del tratamiento. Los niveles de proteína surfactante son usados para supervisar este daño pulmonar permitiendo la individualización de la dosis de radioterapia y/o la frecuencia. Caso 1: Se tomo muestra de sangre de un hombre no fumador de 19 años de edad 2 semanas después

de un curso de radioterapia para linfoma de Hodgkins. No tenía síntomas respiratorios y la quimioterapia previa no se consideró tóxica para el pulmón. Sus niveles de SP-A en plasma estaban elevados a 416.9 ng/ml como también lo estaba la SP-B a 4020.6 ng/ml.

Caso 2: Se tomo muestra de sangre de una mujer de 57 años de edad 3 semanas después de radioterapia para un carcinoma de célula escamosa del pulmón. Hace poco había dejado de fumar y no presentó cambios en sus síntomas respiratorios. La quimioterapia previa no se consideró tóxica para el pulmón. Su SP-A plasmático estaba marcadamente elevado a 963.6 ng/ml y su SP-B estaba elevado a 2742.2 ng/ml. Los síntomas de toxicidad pulmonar inducida por radioterapia ocurren comúnmente algunas

semanas después del tratamiento. La elevación en las proteínas surfactantes en ambos pacientes es consistente con la elevación debida a daño pulmonar inducido por radioterapia y un aumento en la permeabilidad alveolo-capilar. Como consecuencia, los niveles de proteína surfactante son usados para supervisar la radioterapia, para individualizar la terapia y supervisar los tratamientos de rescate tales como factores de crecimiento.

EJEMPLO 10 Supervisión del daño pulmonar inducido por herbicidas

El paraquat es un herbicida ampliamente usado que destruye la membrana celular lipídica a través de la producción de radicales de oxígeno. También se cree que es el mecanismo de toxicidad, predominantemente pulmonar, en humanos. Típicamente el daño pulmonar agudo se desarrolla algunos días después de la ingestión y esto usualmente progresa hasta fallo respiratorio fatal debido al desarrollo del síndrome de insuficiencia respiratoria aguda con fibrosis pulmonar marcada.

Se tomó muestra de sangre secuencialmente de un paciente después de ingerir paraquat para medir las proteínas surfactantes circulantes y para documentar la oxigenación sanguínea. En la figura la proporción de oxigenación sanguínea inicial a oxígeno inspirado (proporción PaO2/FiO2) es normal y permanece sin cambios hasta 64 horas después de la presentación. La súbita caída en la proporción de PaO2/FiO2 es evidencia de daño pulmonar. El nivel de SP-B plasmático fue también normal en la presentación pero súbitamente aumentó a las 54 horas después de la ingestión, 10 horas antes del cambio en la oxigenación sanguínea.

Estos datos demuestran que las proteínas surfactantes son marcadores tempranos de daño pulmonar, y que esto precede el diagnóstico clínico de daño pulmonar (Figura 1).

EJEMPLO 11 Predicción de Daño Pulmonar Severo

Después de una causa predisponente los pacientes pueden desarrollar daño pulmonar agudo (ALI) y necesitar soporte respiratorio para fallo respiratorio agudo. Cuando esto progresa a daño

pulmonar más severo puede llamarse síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (SDRA). La predicción de que pacientes van a desarrollar SDRA tiene muchas implicaciones terapéuticas Se tomó muestra de sangre a 43 pacientes tratados en la Unidad de Cuidado Crítico y en el Centro Médico Flinders entre 12 horas de desarrollar ALI que fue definido como una puntuación de

5 daño pulmonar (LIS) < 2.5. Se documentaron su sexo, edad, LIS y el desarrollo de SDRA (LIS > 2.5). El plasma fue aislado y congelado a -20 ºC hasta que fue ensayado. Los datos presentados como media + EE, y los datos comparados con la prueba U Mann-Whitney.

Resultados

10

Tabla 4

No desarrolla SDRA Desarrolla SDRA Valor-P Edad 60+4 61+3 NS Masculino/Femenino 17/7 11/8 NS LIS 1.7+0.1 1.9+0.1 NS SP-A (ng/ml) 393+36 514+55 NS SP-B (ng/ml) 4162+502 8222+1319 0.017

El nivel en plasma de SP-B es significativamente más alto en sujetos con ALI que van a desarrollar SDRA que aquellos que no lo desarrollan (Tabla 4). Ya que el LIS no es diferente entre los

15 dos grupos, y no hay diferencia en la distribución de edad o sexo, esto no puede predecirse en ámbitos clínicos. Esto indica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados para predecir el desarrollo de daño pulmonar severo.

EJEMPLO 12 Proporciones de Proteína Surfactante

20 La proporción de componentes surfactantes es útil para entender, diagnosticar y supervisar los procesos de la enfermedad. Como un ejemplo la Tabla 5 lista las proporciones de SP-B/A para algunos de los grupos de pacientes estudiados.

Tabla 5 Puntuación

Proporción Número Masculino/Femenino Edad de daño de SP-B/A

pulmón No-fumadores 35 16/19 30.4+1.7 8.6+0.5 Fumadores 31 16/15 33.7+1.3 15.2+1.6 Solo ALI 24 17/7 60+4 1.7+0.1 11.6+1.2 Pre-SDRA 19 11/8 61+3 1.9+0.1 16.8+2.7 Control ventilados 10 7/3 36+8 0.3+0.2 9.9+1.1 Edema 10 7/3 36+8 0.3+0.2 13.8+2.2 cardiopulmonar Politrauma 4 4/0 33+4 1.3+0.2 9.4+1.6 Transfusiones 9 8/1 70+3 2.1+0.2 10.4+1.5 múltiples Sepsis 14 9/5 65+3 2.3+0.3 9.9+1.3 Aspiración 13 9/4 70+3 2.3+0.1 17.5+2.6

Neumonía 12 8/4 58+5 2.2+0.3 21.6+4.0 Coagulación 2 1/1 36+18 2.5+0.5 15.9+2.0 intravascular diseminada Pancreatitis 6 4/2 49+4 2.1+0.2 11.5+1.8 Fallo hepático 3 1/2 31+6 3.4+0.3 11.8+7.3

La proporción SP-B/A para no fumadores es la misma que aquella para sujetos control ventilados, sin embargo la proporción SP-B/A es más alta para fumadores. Esto es consistente con los niveles de SP-B que reflejan escapes a través de poros mas pequeños en la membrana alveolo-capilar.

5 También hay una elevación marcada en la proporción de SP-B/A en las causas directas de daño pulmonar tales como neumonía y aspiración comparado a las causas indirectas tales como sepsis. Esto es consistente con un mayor aumento en la permeabilidad en este grupo. Como consecuencia la proporción SP-A/B puede usarse además de los niveles absolutos de surfactante.

EJEMPLO 13

10 Supervisión de los Niveles Vasculares de SP-A y SP-B como Marcadores de Remplazo para el Estado del Surfactante Pulmonar Los niveles de SP-A & -B no pulmonares vasculares y extravasculares van a depender no solamente de la permeabilidad alveolo-capilar, pero también en los niveles alveolares. La proteinosis alveolar primaria es una enfermedad crónica de patogénesis no conocida

15 caracterizada por la acumulación difusa de exceso de surfactante en los espacios aéreos. Los pacientes son usualmente menores de 45 años de edad con una proporción apreciable de adolescentes y niños. Aunque el lavado completo pulmonar se ha convertido en una terapia estándar, el curso clínico varía marcadamente. Se cree que la síntesis de surfactante y secreción en pacientes con proteinosis alveolar primaria es normal y que la acumulación de surfactante en el alvéolo surge a través del impedimento

20 en su evacuación. La proteinosis alveolar congénita también es caracterizada por la acumulación difusa de exceso de surfactante en los espacios aéreos. Diferente de la proteinosis alveolar primaria, ahora hay un numero de causas establecidas para el fenotipo congénito. Estos incluyen, pero no están limitados a, la falta de expresión del Receptor GM-CSF cadena beta-común y defectos moleculares en el gen

25 SP-B. Se tomaron muestras únicas de sangre periférica de una vena antecubital de 12 pacientes (de 30 anos + 2.7; media +EE) diagnosticados con proteinosis alveolar primaria. Los pacientes fueron diagnosticados como idiopáticos tanto clínicamente como en base a biopsia transbronquial o de pulmón abierto. También se tomaron muestras únicas de sangre periférica de una vena antecubital de

30 3 niños (< 1 año) diagnosticados con proteinosis alveolar congénita. Los niños expresaron componentes normales de Receptor GM-CSF y no tenían el defecto SP-B molecularmente o en inmunohistoquímica. Resultados

El SP-A y SP-B en suero fueron grandemente elevados en pacientes con proteinosis alveolar 35 primaria o congénita (todos los grupos p < 0.001; Prueba U Mann-Whitney) comparado a lo normal. (Tabla 6).

Tabla 6

SP-A 1440.5 ng/ml + 259.05 3096.2 + 834.17

SP-B 17845.2 ng/ml + 3065.16 39928.1 + 5884.91

(media + EE)

El SP-A y –B circulantes son altamente elevados en pacientes con proteinosis alveolar primaria o no-SP-B deficiente-congénita. Ya que la permeabilidad alveolo-capilar es normal en estos pacientes esto ilustra que el SP-A & -B marcan cambios en los niveles de surfactante pulmonar.

5 Aproximadamente el 30% de los casos de proteinosis alveolar primaria se resuelven espontáneamente, algunos requieren lavados múltiples sobre periodos extensos, mientras que otros progresan a enfermedad pulmonar diseminada. Si se deja sin tratar ~30% de pacientes progresan a disnea, hipoxemia y muerte. En la ausencia de un transplante de pulmón, la prognosis para los niños con proteinosis alveolar pulmonar es pobre. Actualmente, la severidad de la proteinosis alveolar es

10 solo pobremente reflejada por parámetros indirectos tales como oxigenación sanguínea. Los niveles de proteína surfactante circulante ofrecen un método directo no-invasivo de supervisar esta condición. La prueba también tiene utilidad particular en el diagnostico de formas congénitas de la condición donde SP-B puede, o puede que no, este presente. Adicionalmente, los niveles de proteína surfactante circulante ofrecen un método directo no-invasivo para supervisar los niveles de surfactante y

15 maduración pulmonar en niños pre-término con síndrome de insuficiencia respiratoria.

EJEMPLO 14

La Supervisión de Niveles de SP-A y –B en los Fluidos Vasculares y Extravasculares

Se recolectaron sólo fluido pleural y sangres correspondientes de 88 pacientes que tuvieron diagnóstico de toracocentesis terapéutica (63 +14 años; media + EE). La población de estudio incluyó

20 pacientes con neoplasia (carcinoma metastático, malignidad hematológica, y mesotelioma), efusión pleural inflamatoria (paraneumónica, postquirúrgica, enfisema, abscesos subfrénicos, enfermedad vascular de colágeno, como también otras varias causas), fallo cardíaco congestivo, y pacientes con cirrosis e hidrotórax. Resultados

25 Los niveles de SP-A y SP-B pleurales son significativamente elevados (ambos p<0.001, n=88; Prueba de Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank) en comparación con las muestras de suero compatibles (Tabla 7). Tanto el SP-A y –B en suero significativamente se relacionan a los niveles pleurales (SP-A; p<0.001, r8 = 0.57, n = 88; SP-B; p<0.001 r8 = 0.4).

Tabla 7

media + EE Suero SP-A 290.5 ng/ml + 22.36 Suero SP-B 2599.9 ng/ml + 165.6 Suero Pleural SP-A 632.9 ng/ml + 154.91 Suero Pleural SP-B 4877.8 ng/ml + 685.76

30 Aunque el epitelio y el endotelio generalmente restringen el movimiento de moléculas más grandes que la albúmina ( Mr67kD), radio hidrodinámico ~3.5nm), las proteínas se difunden hacia debajo de sus gradientes de concentración de la hipofase alveolar pulmonar y entre los compartimentos vasculares y extravasculares. Los niveles de SP-A y –B vasculares, y extravasculares

35 son marcadores sensibles de permeabilidad alveolo-capilar en la salud pulmonar.

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20 Yogalingam, G., Doyle, I.R., et al., Am. J. Physiol. 14:L320-L330 (1996)

Claims (6)

1. Reivindicaciones

   1.

   Un método para diagnosticar el daño de la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método la exploración de un aumento en el nivel de SP-B en la sangre, suero o plasma de dicho mamífero o la exploración para la modulación de las proporciones de SP-B:SP-A en el fluido corporal de dicho mamífero.

2. 2.

   Un método de acuerdo a la reivindicación 1, donde dicho mamífero no tiene ningún síntoma aparentemente visible de daño pulmonar.

3. 3.

   Un método para supervisar cambios en el alcance de daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método:

   a.

   explorar un aumento en el nivel de SP-B en la sangre de dicho mamífero, donde un aumento en SP-B es indicativo de un aumento en el daño de la membrana alveolo-capilar;

   b.

   explorar la modulación de las proporciones de SP-B:SP-A en el fluido corporal de dicho mamífero; o

   c.

   explorar una disminución en el nivel de SP-B en la sangre, suero o plasma de dicho mamífero, donde una disminución en SP-B es indicativo de una disminución en el daño a la membrana alveolo-capilar.

4. 4.

   Un método de acuerdo a la reivindicación 3, donde dicho mamífero no tiene síntomas aparentemente visibles de daño pulmonar.

5. 5.

   Un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de daño pulmonar, una predisposición para desarrollar síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, comprendiendo dicho método

   a.

   la exploración de un aumento en el nivel de SP-B en el fluido corporal de dicho mamífero donde el nivel de SP-B es indicativo de una predisposición a desarrollar síndrome de insuficiencia respiratoria aguda;

   b.

   la exploración de la modulación de las proporciones entre SP-B:SP-A en el fluido corporal de dicho mamífero donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición para desarrollar síndrome de insuficiencia respiratoria aguda; o

   c.

   correlacionar un aumento en el nivel de SP-B en el fluido corporal de dicho mamífero con el puntaje de daño pulmonar, donde el resultado de dicha correlación es indicativa de una predisposición a desarrollar síndrome de insuficiencia respiratoria aguda.

6. 6.

   Un método de acuerdo a cualquiera de las anteriores reivindicaciones, donde dicho mamífero es un humano.