MXPA00002269A - Un metodo de diagnostico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere generalmente a un método para diagnosticar o predecir el desarrollo del daño al pulmón y, más particularmente, a un método para diagnosticar o predecir el desarrollo del daño a la membrana alveolo-capilar. El método de la presente invención es otras cosas, para detectar el daño al pulmón o predecir el desarrollo del daño al pulmón, tal como el ocasionado por agentes nocivos o como un efecto lateral indeseable como resultado de la exposición a un agente terapéutico y para monitorear el progreso del daño al pulmón.

Description

UN M ÉTODO DE DIAGNOSTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general a un método jj 5 para diagnosticar o predecir el desarrollo de daño al pulmón y más particularmente, a un método para diagnosticar o predecir el desarrollo de daño de membrana alveolo-capilar. El método de la presente invención es útil inter alia para detectar el daño de pulmón o predecir el desarrollo de daño de pulmón tal como el ocasionado por agentes nocivos o como un 10 efecto lateral indeseable, resultando de la exposición a un agente terapéutico y para monitorear el progreso de daño al pulmón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por el autor 15 en la especificación se recolectan al final de la descripción . La interface gas/líquido del pulmón está delineada con una capa monomolecular comprendiendo fosfolípidos, lípidos neutrales y proteínas específicas (proteínas surfactantes A, B, C y D, referidas en la presente W como SP-A, -B, -C y -D, respectivamente). Colectivamente conocidos como "surfactante pulmonar", estos compuestos disminuyen la aflicción superficial, disminuyen el trabajo de la respiración y estabilizan el pulmón al variar la aflicción superficial, permitiendo que co-existan alveolos de diferentes tamaños. Los fosfolípidos surfactantes pulmonares son sintetizados por 25 células alveolares tipo I I , donde son almacenados en distintas vesícu las conocidas como cuerpos lamelares. En respuesta a una variedad de estímulos, en particular la distorción física de las células tipo I I , los contenidos de los cuerpos lamelares son liberados en la hipofase, donde se hidratan para formar una estructura de látex de 3-D conocida como mielina tubular. La mielina tubular suministra, a su vez, la capa monomolecular en la interface gas/líquido que posee la actividad biofísica. Los componentes de la capa monomolecular tienen una vida definida y son reemplazados constantemente. A los fosfolípidos disaturados (DSP) se les atribuye la aflicción superficial reducida a los valores muy bajos que se piensa que ocurren en volúmenes de pulmón bajos, mientras que el colesterol, el segundo lípido surfactante pulmonar más abundante, se piensa que afecta la velocidad de adsorción y la fluidez de material recién liberado. El sistema es extremadamente dinámico; en ratas, la dipalmitoilfosfatidilcolina, el principal componente de surfactante pulmonar de mamífero, tiene una vida media de -85 minutos en el alveolo con cerca del 85% captado nuevamente en células tipo I I y reutilizado (Nicholas et al. , 1 990). A la fecha, se han mostrado cuatro proteínas, SP-A, -B, -C y -D como asociadas únicamente con el surfactante pulmonar de mamífero. Existe un consenso general de que las proteínas extremadamente hidrofóbicas (SP-B y -C) son componentes funcionales de la capa monomolecular, mientras que la proteína más hidrofílica, SP-A parece estar más involucrada en la homeostasis de surfactante pulmonar y defensa del huésped, y SP-D está involucrada únicamente en la defensa del huésped.

El síndrome de aflicción respiratoria de adulto (ARDS) representa una lesión de pulmón difusa, severa, provocada ya sea por trauma directo, vía las vías respiratorias, o indirecto, vía la sangre. El sello distintivo de ARDS es un deterioro en el rendimiento de oxigenación de sangre y • 5 sistema respiratorio como una consecuencia de edema de permeabilidad. Mientras que una variedad de diferentes ataques pueden conducir a ARDS, una ruta común resulta probablemente en el daño al pulmón. La activación de leucocitos dentro del pulmón, junto con la liberación de radicales libres de oxígeno, metabolitos de ácido araquidónico y mediadores inflamatorios, tales como, interleucin-1 , proteasas y factor de necrosis de tumor, resulta É en un incremento en permeabilidad de membrana alveolo-capilar. Con la pérdida de esta barrera macromolecular, los alveolos eson inundados con proteínas de suero, que deterioran la función de surfactante pulmonar (Said et al. , 1965; Holm et al. , 1987). Esto crea fuerzas hidrostáticas que exacerban además la condición (Jefferies et al. , 1988), conduciendo a edema alveolar y un deterioro concomitante en el rendimiento de pulmón e intercam bio de gases. En la última década, se han valorado numerosos métodos para determinar la permeabilidad de pulmón (Staub et al . 1 990) . De manera general, éstos se basan en la detección de flujo de radiomarcas hacia, o fuera de, el pulmón. Sin embargo, pocos han sido aplicados clínicamente debido a problemas log ísticos con rastreadores adecuados, estabilidad y especificidad de Is marcas y la incertidumbre sobre el modelo matemático (Staub et al. 1 990). Además, el daño al pulmón, tal como aquél inducido por un agente nocivo, solo ha sido detectable clínicamente cuando ha ocurrido suficiente daño para que existan cambios en la resistencia de las vías respiratorias o intercambio de gases. Es bien aceptado que esto refleja una enfermedad de pulmón relativamente avanzada. Las proteínas surfactantes normalmente se encuentran solo en • 5 cantidades apreciables en el pulmón. En los espacios de aire, SP-A forma predominantemente oligómeros de alto peso molecular (-650 kDa) con radios de Stokes de -35 nm (Voss et al. , 1988). Aunque SP-B madura, la cual es asociada como un homo-dímero dependiente de tiol de Mr bajo (-18 kDa) (Johansson et al. , 1991 ), normalmente es íntimamente asociada con complejos de fosfolípido surfactante (logo et al. , 1992), en estudios in ^p vitro o in vivo en células tipo II aisladas, sugieren que al menos algo de la proteína es secretada en el alveolo como proproteína monomérica, hidrofílica e intermediario de procesamiento con Mr de -45 kDa y -25 kDa, respectivamente (Weaver y Whitsett, 1989; Doyle et al. , 1997). 15 En trabajo que conduce a la presente invención , los inventores han encontrado inesperadamente que los niveles de surfactante pulmonar en suero proporcionan un marcador diagnóstico extremadamente sensible ya sea de daño al pulmón y en particular daño al pulmón en etapa temprana, • o una predisposición al desarrollo del daño al pulmón. 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A lo largo de la especificación, a menos que el contexto lo requierea de otra manera, la palabra "comprender", o variaciones tales como, "comprende" o "comprendiendo" , se entenderá que implica la inclusión de un elemento o entero declarado o grupo de elementos o enteros, pero la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros . De acuerdo a esto, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, 5 comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero. En otro aspecto se proporciona un método para diagnosticar daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de uno o más de los niveles de SP-A, -B, -C o -D en la sangre 10 de dicho mamífero. (fe Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de los niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero. 15 Todavía en otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para diagnosticar daño al pulmón en etapa temprana en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero. • Todavía otro aspecto de la presente invención es un método para 20 detectar daño al pulmón en etapa temprana en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles SP-B en la sangre de dicho mamífero. Todavía en otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para diagnosticar daño de membrana alveolo-capilar en etapa temprana en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar un incremento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para monitorear los cambios en el grado de daño al pulmón en un • 5 mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero. Todavía en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para monitorear un incremento en el grado de daño de membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar un 10 incremento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero. Todavía otro aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para monitorear una disminución en el grado de daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar una disminución en los niveles de SP-B en el suero de dicho mamífero. De acuerdo a esto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero. 20 Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para monitorear cambios en el grado de daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero.

Todavía en otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero, en donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de una predisposición para desarrollar daño al pulmón adicional. Todavía otro aspecto más de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mamífero que ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de lesión de pulmón, una predisposición para desarrollar ARDS, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mamífero, en donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de una predisposición para desarrollar ARDS. Todavía en otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para determinar, en un mam ífero que ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de lesión al pulmón, una predisposición al desarrollo de ARDS, comprendiendo dicho método clasificar el nivel de SP-A y/o SP-B en la sangre de d icho mam ífero, en donde el nivel de dicha SP-A y/o SP-B es indicativo de una predisposición para desarrollar ARDS. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de lesión de pulmón , una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón , comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero, en donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método correlacionar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero, con el resultado de la medición de otro parámetro clínico de pulmón, en donde el resultado de dicha correlación es indicativo de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método correlacionar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mam ífero con el resultado de lesión de pulmón, en donde el resultado de dicha correlación es indicativa de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón . Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona un conjunto diagnóstico para ensayar muestras de suero, que comprende en forma de compartimentos, un primer compartimento adaptado para contener un agente para detectar surfactante pulmonar y un segundo compartimento adaptado para contener reactivos útiles para facilitar la detección por el agente en el primer compartimento. También pueden incluirse com partimentos adicionales , por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser un anticuerpo u otra molécula detectora adecuada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se basa, en parte en la identificación de una correlación entre niveles de surfactante pulmonar de suero y diagnóstico del desarrollo o predisposición para el desarrollo de daño al pulmón. De acuerdo a esto, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero. Se debería entender que la referencia a "fluido corporal" incluye la referencia a fluidos derivados del cuerpo de dicho mam ífero, tales como, pero no limitados a, sangre (incluyendo todos los componentes derivados de sangre, por ejemplo, suero y plasma), orina, lágrimas, secreciones bronquiales o mucosa y fluidos, los cuales han sido introducidos en el cuerpo de dicho mamífero y subsecuentemente son removidos, tales como, por ejemplo, la solución salina extraída del pulmón durante un lavado de pulmón. De preferencia, el fluido corporal es sang re u orina e incluso más preferiblemente, sangre. De aquí en adelante, la referencia a sangre debería leerse como que incluye la referencia a todos los demás fluidos corporales. El término "mam ífero" , como se usa en la presente, incluye humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, caballos, reses, borregos, cerdos, burros), animales de pruebas de laboratorio (por ejemplo, ratones , ratas, conejos, conejillos de Indias), animales de compañ ía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, canguros, venados, zorras). De preferencia, el mamífero es un humano o un animal de prueba de laboratorio. Aún más preferiblemente, el mamífero es un • 5 humano. El término "daño al pulmón" abarca, pero no está limitado a, daño al pulmón debido a, por ejemplo, anormalidad congénita o una anormalidad adquirida, tal como aquélla debida al ataque de una condición autoinmune, rechazo de pulmón post-transplante, infecciones que resultan en una respuesta inflamatoria, cambios en relaciones de presión/volumen en el pulmón, exposición de dicho mamífero a un agente extraño (por áfe ejemplo, humo de cigarrillos o polvo), un agente nocivo o tóxico (por ejemplo, solventes o humos) o es un efecto lateral indeseable, que resulta de la exposición a un agente terapéutico. Ejemplos de daño al pulmón incluyen, pero no están limitados a, daño morfológico/estructural y/o daño funcional al pulmón, tal como, por ejemplo, acumulación de proteínas (por ejemplo, surfactante) o fluidos debido a deterioro de la evacuación pulmonar o daño a los mecanismos de intercambio gaseoso pulmonar. En una modalidad particular de la presente invención, dicho daño al pulmón • es un daño a la membrana alveolo-capilar. 20 La referencia en la presente a "surfactante pulmonar" debería leerse como que incluye la referencia de todas las formas de surfactante pulmonar y derivados del mismo, incluyendo pero no limitando a fosfolípido pulmonar, lípidos neutrales pulmonares y proteínas surfactantes pulmonares, e incluye todas las moléculas de subunidades incluyendo, a manera de ejemplo, el precursor, preproproteínas, proproteina y formas intermediarias de SP-B. Ejemplos de proteínas surfactantes pulomonares incluyen SPA, -B, -C y -D. De preferencia, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o -D. La referencia en la presente a "SP-A", "SP-B", "SP-C" y "SP-D" debería entenderse que incluye referencia a todas las formas de • 5 estas moléculas incluyendo todas las formas de precursor, propoteína e intermediario de las mismas. De acuerdo a esto, se proporciona un método para diagnosticar daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de uno o más de los niveles de SP-A, -B, -C o -D en la sangre de dicho mamífero. fc Los niveles de SP-A y SP-B circulante dependen no solo de los tamaños relativos de las proteínas y la permeabilidad del pulmón sino también de la forma disponible para romper las barreras de la membrana. La SP-A se une a fosfolípido ávidamente al grado de que hay poco de ésta libre en el fluido de los alveolos. En contraste, la forma predominante de SP-B inmuno-reactiva alveolar, propoteína e intermediario de procesamiento no se unen a l ípidos de superficie, permitiendo posiblemente la entrada más libre a la circulación . Además, que la proporción de SP-B/SP-A de plasma varía con la función de pulmón sugiere que SP-B de plasma es un marcador más dinámico de cambios en la permeabilidad de pulmón que SP-A. En una modalidad muy preferida, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero.

En un aspecto particular, dicho daño al pulmón puede ser daño a la membrana alveolo-capilar. "Derivados" de dichos surfactantes incluyen fragmentos, partes, porciones, mutantes y análogos de los mismos. Los derivados pueden ser 5 derivados de inserción, supresión o substitución de un aminoácido. Los derivados de inserción de aminácido incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales, así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos simples o múltiples. Las variantes de secuencia de aminoácidos de inserción son aquéllas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos son introducidos en un sitio en la proteína. Las variantes de supresión están ^ caracterizadas por la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de amionácidos de substitución son aquéllas en las cuales al menos un residuo en la secuencia ha sido removido y un residuo diferente insertado en su lugar. 15 El método de la presente invención es particularmente útil para detectar daño al pulmón en etapa temprana. "Etapa temprana" es definida como el periodo durante el cual el inicio y desarrollo del daño al pulmón no es detectable o no puede confirmarse de otra manera sin la ayuda de uno • o más procedimientos invasivos. Por ejemplo, el método de esta invención tiene aplicación en la detección de cambios tempranos en la permeabilidad de pulmón en los fumadores. "Etapa temprana" también debería entenderse como que incluye bajos niveles de daño de pulmón, tal como, por ejemplo, daño al pulmón suave pero crónico. Cambios tempranos en permeabilidad de pulmón , la cual puede asociarse con reclutamiento de neutrófilos y la destrucción inicial de tejido conectivo de pulmón por elastasa y especies de oxígeno reactivo, pueden marcarse mediante un incremento en los niveles de SP-B en plasma a pesar de la ausencia aparentemente de cualquier síntoma visible de daño al pulmón. De acuerdo a éesto, se proporciona un método para diagnosticar • 5 daño al pulmón en etapa temprana en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero. De preferencia, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o -D y aún más preferiblemente SP-B. 10 En una modalidad muy preferida, se proporciona un método para detectar daño a pulmón en etapa temprana en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de SP-B en la sangre de dicho mamífero. En particular, dicho daño al pulmón puede ser daño a la membrana 15 alveolo-capilar. Aunque no se pretende limitar la invención a ninguna teoría o modo de acción , el daño a la membrana alveolo-capilar provoca un incremento en la permeabilidad alveolo-capilar. Aunque SP-A y SP-B inmuno- reactivas normalmente no están presentes en cantidades apreciables en la 20 circulación sistémica, se piensa que la aparición de proteínas surfactantes pulmonares adicionales en el suero de pacientes con daño al pulmón ocurre como el resultado de cambios en permeabilidad alveolo-capilar. De acuerdo a esto, el término "modulación" se refiere a incrementos y decrementos en los niveles de surfactantes pulmonares en suero en relación ya sea con u n nivel de referencia normal (o rango de nivel de referencia normal) o a un resultado de nivel de surfactante anterior determinado del fluido corporal de dicho mam ífero. Un nivel de referencia normal es el nivel de surfactante del fluido corporal de un mam ífero o grupo de mam íferos, que no tienen lesión de pulmón alguna. Dicho nivel • 5 de referencia puede ser una cifra discreta o puede ser un rango de cifras. Dicho nivel de referencia puede variar entre las calses individuales de moléculas de surfactante. Por ejemplo, el nivel normal de SP-A puede diferir del nivel normal de SP-B o una subunidad de SP-B particular. De preferencia, dicha modulación es un incremento en niveles de surfactantes 10 pulmonares en sangre. De acuerdo con esta modalidad preferida, se proporciona un método • para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar un incremento en niveles de surfactante pulmonares en la sangre de dicho mam ífero. 15 De preferencia, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o -D y aún más preferiblemente SP-B. En particular, el daño al pulmón puede ser daño al pulmón en etapa temprana y muy particularmente daño a la membrana alveolo-capilar. De acuerdo a esta modalidad muy preferida, se proporciona un 20 método para diagnosticar daño a la membrana alveolo-capilar en etapa temprana en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar un incremento en niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero. Aunque el método preferido es para detectar un incremento en los niveles de surfactante pulmonar en sangre, la detección de una dism inución en dichos niveles de surfactante puede ser conveniente bajo ciertas circunstancias. Por ejemplo, para monitorear el mejoramiento en la morfología de la membrana alveolo-capilar durante el curso del tratamiento terapéutico de pacientes que presentan daño de membrana alveolo-capilar o para monitorear la maduración de pulmón en infantes pretérmino con • 5 síndrome de aflicción respiratoria. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para monitorear cambios en el grado de daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero. De preferencia, dicho surfactante pulmonar es SP-A, -B, -C o -D y • aún más preferiblemente SP-B. En particular, el daño al pulmón puede ser daño a la membrana alveolo-capilar. 15 En una modalidad muy preferida, se proporciona un método para monitorear un incremento en el grado de daño a la membrana alveolo- capilar en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar un incremento en los niveles de SP-B en la sangre de dicho mam ífero.

• Todavía en otra modalidad muy preferida, se proporciona un método 20 para monitorear un decremento en el grado del daño a la membrana alveolo-capilar en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar una disminución en los niveles de SP-B en el suero de dicho mam ífero. Los niveles de surfactante pulmonar utilizados en el método de la presente invención , además del análisis de valores absolutos relativos a un nivel de referencia normal , tam bién pueden ser analizados en relación uno a otro. Por ejemplo, la lesión de pulmón resulta en un cambio diferencial en los niveles de SP-A y SP-B en sangre, de manera que la proporción de SP-B:SP-A está inversamente relacionada con las funciones pulmonares. Estas proporciones también pueden compararse con 5 proporciones de niveles de referencia normales. De acuerdo a esto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero. 10 La referencia a "proporciones de niveles de surfactantes ^k pulmonares" debería entenderse como la proporción del nivel de cualquiera de dos o más surfacantes pulmonares en un mam ífero. "Surfactante pulmonar" tiene el mismo significado como se definió anteriormente. La proporción, en un mamífero, de un nivel de surfactante pulmonar a otro nivel de surfactante pulmonar puede ser indicativo de daño al pulmón. De preferencia, dicha proporción de niveles de surfactantes pulmonares es una proporción de los niveles de SP-B:SP-A y más preferiblemente preproproteína de SP-B:SP-A. • Aún más preferiblemente, dicha modulación es un incremento en la 20 proporción. Todavía más preferiblemente, dicho incremento en la proporción de SP-B: SP-A o preproproteína SP-B:SP-A es indicativo de daño a la membrana alveolo-capilar. Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a un 25 método para monitorear cam bios en el grado de daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mam ífero. El método de la presente invención tiene aplicaciones diversificadas, • 5 incluyendo pero no limitando a, un monitor diagnóstico o clínico no invasivo de la función pulmonar o daño morfológico/estructural (tal como el inicio del daño a la membrana alveolo-capilar o retención de proteína) debido a, por ejemplo, una respuesta inflamatoria, exposición a un agente extraño, agente nocivo, agente tóxico, un efecto lateral de una exposición a un agente terapéutico, rechazo de pulmón post-transplante, inicio de autoinmunidad, experimento de evacuación pulmonar o deterioro de • intercambio gaseoso y el inicio del daño a la membrana alveolo-capilar de individuos expuestos a agentes extraños o un agente nocivo o tóxico, tales como, individuos que fuman o individuos que están involucrados en ocupaciones tales como, soldadura, pintura con atomizador, fabricación de fibra de vidrio o involucrados en la exposición a fumadores pasivos, los cuales pueden resultar potencialmente en daño al pulmón. El método de la presente invención también tiene aplicación en la valoración del estado de • salud del pulmón de cualquier individuo sin importar cualquier predisposición percibida o posibildad de haber adquirido un grado de daño al pulmón . El método de la presente invención se extiende a diagnosticar el grado de daño al pulmón en un mam ífero basado en un análisis de niveles de surfactantes pulmonares cuantificados en la sangre de dicho mamífero.

Por ejemplo, el grado de incremento en nivel de surfactante pulmonar en sangre se usa como un indicador del grado de daño al pulmón, que el mam ífero ha desarrollado. La lesión aguda al pulmón (referida en la presente como "ALI") puede desarrollarse siguiendo a la exposición a una variedad de factores, tales como, pero no limitados a, aspiración de contenidos gástricos, neumonía, sepsis, transfusión masiva, trauma múltiple y pancreatitis. Un número menor de pacientes desarrolla lesión al pulmón más severa, algunas veces referida como un síndrome de aflicción respiratoria de adulto (referida en la presente como "ARDS"), que es una forma más severa de ALI con una proporción de mortalidad de cerca del 50-60%. La predicción de pacientes que tiene alta probabilidad de desarrollar ARDS permitiría, por ejemplo, enfocar novedosas terapias y el uso de estrategias ventiladoras complejas, cuyo costo no podría justificarse de otra manera. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño al pulmón severo, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mamífero, en donde los niveles de dichos surfactantes pulmonares son indicativos de una predisposición para desarrollar daño adicional al pulmón. La frase "factor de lesión al pulmón" debería entenderse como una referencia a cualquier factor que pueda provocar directa o indirectamente nuevo daño al pulmón o exacerbar el daño existente al pulmón . Ejemplos de dicho factor incluyen , pero no están limitados a, ventilación mecánica , hiperoxia , aspiración de contenidos gástricos, neumon ía, sepsis, transfusión masiva, trauma múltiple y pancreatitis. El daño al pulmón provocado por exposición de un mam ífero a un factor de lesión al pulmón puede o no ser clínicamente aparente. El método de la presente invención es útil para predecir ya sea aquellos pacientes que han sido expuestos a un factor de lesión al pulmón, que probablemente desarrollarán lesión severa al pulmón (y no simplemente ALI) o aquellos pacientes, que han desarrollado ALI como un resultado de la exposición a un factor de lesión al pulmón, quienes probablemente van a desarrollar daño severo al pulmón. De acuerdo a esto, la frase "daño severo al pulmón" debería entenderse en su sentido más amplio e incluye la referencia ya sea al desarrollo de nuevo daño al pulmón o exacerbación de daño existente al pulmón, tal como, un incremento en su severidad. En una modalidad particularmente preferida, dicho mamífero ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de lesión al pulmón y dicho daño severo al pulmón es ARDS. Dicha ALI puede ser o no clínicamente aparente. De acuerdo con esta modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para determinar, en un mam ífero que ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar ARDS, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mam ífero, en donde los niveles de dicho surfactante pulmonar son indicativos de una predisposición para desarrollar ARDS . Muy preferiblemente dicho surfactante es S P-A y/o SP-B.

De acuerdo a esta modalidad muy preferida, la presente invención proporciona un método para determinar, en un mam ífero que ha desarrollado ALI debido a la exposición a un factor de lesión al pulmón, una predisposición al desarrollo de ARDS, comprendiendo dicho método clasificar el nivel de SP-A y/o SP-B en la sangre de dicho mamífero, en donde el nivel de dicho SP-A y/o SP-B es indicativo de una predisposición para desarrollar ARDS. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactantes pulmonares en la sangre de dicho mamífero, en donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón. Sin limitar la presente invención a cualquier teoría o modo de acción, se piensa que SP-A y SP-B son marcadores substitutos para severidad de la enfermedad que no pueden detectarse cl ínicamente. De acuerdo a esto, la referencia a clasificar una "predisposición" a daño al pulmón adicional debería entenderse en su sentido más amplio para incluir tanto clasificar aquellos mamíferos que probablemente desarrollarán daño adicional al pulmón y clasificar aquellos mam íferos que ya han desarrollado dicho daño adicional al pulmón, pero que todavía no exhiben sintomatolog ía cl ínica. En otro aspecto de la presente invención, la predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, tal como, ARDS , puede determinarse al correlacionar los resultados de medición de múltiples factores o parámetros clínicos de función pulmonar o morfolg ía (referidos en la presente como "parámetros clínicos del pulmón") , tales como, el resultado de lesión al pulmón con niveles de surfactantes. Por ejemplo, el riesgo para desarrollar ARDS puede determinarse utilizando un modelo que 5 correlaciona niveles de SP-A y SP-B. En una modalidad particular, dicho método correlaciona SP-A, SP-B y el resultado de lesión pulmonar donde P=0.012 y R2=46%. El resultado de lesión al pulmón se basa en parámetros clínicos y se usa para resumir la severidad clínica de la enfermedad. Aunque el resultado de lesión al pulmón en aislamiento no puede ser predictivo del desarrollo de ARDS, es útil cuando se combina ^ con el índice predictivo de nivel de surfactante. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de lesión de pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo ai pulmón, comprendiendo dicho método correlacionar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mamífero con el resultado de medición de otro parámetro clínico de pulmón , en donde el resultado de dicha correlación es indicativo de una • predisposición para desarrollar daño severo al pulmón. 20 De preferencia, la presente invención proporciona un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de lesión al pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método correlacionar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en la sangre de dicho mam ífero con el resultado de lesión al pulmón, en donde el resultado de dicha correlación es indicativo de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón. De preferencia, dicho mam ífero tiene ALI resultante de la exposición a un factor de lesión al pulmón y dicho daño severo al pulmón es ARDS. Aún más preferiblemente, dichos surfactantes son SP-A y/o SP-B. Se debería entender que aunque este aspecto de la presente invención es ejemplificado con respecto al resultado de lesión al pulmón, no se pretende limitar a una valoración del resultado de lesión al pulmón junto con el nivel de surfactante pulmonar. En su lugar, se debería entender que se extiende a la correlación de cualquier parámetro clínico pulmonar, del cual el resultado de lesión al pulmón es simplemente un ejemplo, junto con el nivel de surfactante pulmonar. La clasificación de niveles de surfactantes pulmonares en suero de un mam ífero puede lograrse vía una variedad de técnicas, tales como, purebas funcionales, pruebas enzimáticas o pruebas inmunológicas. Pruebas funcionales pueden incluir detectar SP-A o -B por su capacidad para afectar la liberación o re-captación de surfactante o al detectar propiedades de defensa del huésped. SP-C puede detectarse al medir los palmitatos asociados. Las pruebas inmunológicas pueden incluir poner en contacto una muestra de suero con un anticuerpo específico para un surfactante pulmonar (o grupo de surfactantes pulmonares) o sus derivados durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un complejo anticuerpo-surfactante pulmonar, y entonces detectar dicho complejo.

En un método preferido particular, las moléculas de surfactante objetivo en la muestra de suero se exponen en un anticuerpo específico, el cual puede o no ser marcado con una molécula reportadora. Dependiendo de la cantidad de objetivo y la fuerza de la señal de molécula reportadora, • 5 puede ser detectable un objetivo unido mediante marcado directo con un anticuerpo. De manera alternativa, un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo, se expone al complejo objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario objetivo-primer anticuerpo- segundo anticuerpo. El complejo es detectado mediante la señal emitida por la molécula reportadora. ^k Por "molécula reportadora", como se usa en la presente especificación, se quiere decir una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable, que permite la detección de antígeno-anticuerpo unido. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas reportadoras más comúnmente usadas en este tipo de ensayo son ya sea moléculas que contienen enzimas, fluoróforos o radionúclidos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes. En el caso de un inmunoensayo con enzimas, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o periodato. Sin embargo, como se reconocerá fácilmente, existe una amplia variedad de difetentes técnicas de conjugación , las cuales están fácilmente disponibles para el técnico experto. Las enzimas comúnmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otros. Los substratos a ser usados con las enzimas específicas generalmente son elegidas para la producción , sobre la hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible 5 emplear substratos fluorogénicos, los cuales producen un producto fluorescente en lugar de los substratos cromogénicos notados antes. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se agrega al complejo de primer anticuerpo hapteno, se permite que se una y entonces se lava el exceso de reactivo. Una solución conteniendo el substrato apropiado es agregada entonces al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El Jfc substrato reaccionará con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser cuantificada adicionalmente, usualmente de manera espectrofotométrica, para dar una indicación de la cantidad de hapteno que estuvo presente en la muestra. 15 De manera alternativa, compuestos fluorescentes, tales como, fluoresceína y rodamina, puede acoplarse químicamente a los anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activaron por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energ ía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz en un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en el ElA, se permite que el anticuerpo marcado fluorescente se una al complejo primer anticuerp-hapteno. Después de lavar el reactivo no unido, el complejo terciario restante es expuesto entonces a la luz de la longitud de onda apropiada; la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de interés. La inmunofluorescencia y técnicas de ElA están muy bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas reportadoras, tales como, radioisótopo, moléculas • 5 quimioluminiscentes o bioluminiscentes. Se debería entender que el método de la presente invención incluye tanto mediciones simples de niveles de surfactante en un mamífero como mediciones múltiples conducidas sobre un periodo (por ejemplo, según pueda requerirse para el monitoreo progresivo de un estado de daño al pulmón de un mamífero individual). Otro aspecto de la presente invención proporciona un conjunto diagnóstico para ensayar muestras de suero comprendiendo, en forma de compartimentos, un primer compartimento adaptado para contener un agente para detectar surfactante pulmonar y un segundo compartimento adaptado para contener reactivos útiles para facilitar la detección por el agente en el primer compartimento. También pueden incluirse compartimentos adicionales, por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser un anticuerpo o cualquier otra molécula detectora adecuada. 20 Características adicionales de la presente invención son descritas de manera más completa en los siguientes Ejemplos. Sin embargo, se entenderá que esta descripción detallada es incluida únicamente para los fines de ejemplificar la presente invención. No se debería entender de ninguna forma como una restricción en la amplia descripción de la invención como se expuso antes.

La referencia a SP-A y SP-B en los siguientes ejemplos debería entenderse como una referencia a SP-A y SP-B inmuno-reactivas.

EJEMPLO 1 5 Preparación de muestra y almacenamiento Se centrifugó inmediatamente la sangre en tubos (Disposable Products, Sidney, Australia) conteniendo litio heparina (plasma) o acelerador de retracción de coágulo (suero) a 5,000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente (Megafuge; Haeraeus-Christ, Osterode, Alemania).

Las muestras se almacenaron a -20°C para análisis por lotes.

• EJEMPLO 2 Preparación de anticuerpo primario SP-A y SP-B se purificaron del fluido de lavado de pacientes con proteinosis alveolar. Cada proteína fue emulsificada con auxiliar completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Ml) y se inyectó de manera subcutánea en 3 conejos blancos New Zealand. Las inmunizaciones fueron reforzadas con SP-A o SP-B emulsificadas en auxiliar incompleto de • Freund (Difco Laboratories). Los conejos fueron desangrados y se precipitó IgG del suero usando 50% (vol/vol) sulfato de amonio saturado. La IgG fue reconstituida al volumen de suero original en cloruro de sodio 1 36.8 mM, fosfato ácido disódico 8.1 mM, cloruro de potasio 2.6 mM, fosfato diácido de potasio 0.7 mM conteniendo 0.02% de azida de sodio y 0.05% (vol/vol) Tween 20 (PBST) se inmunoadsorbió durante la noche a 4°C contra 200 ml de suero humano normal, reticulado . Con el fin de remover cualquier especificidad contra los determinantes antigénicos solubles del grupo A de sangre, se preparó el suero reticulado a partir de sangre depositada comprendiendo porciones iguales de plasma de cinco sujetos con agrupamientos de sangre: A (+ve), A (+ve), AB (+ve), O (+ve) • 5 y O (-ve). Los componentes no adsorbidos fueron aislados siguiendo la centrifugación a 4°C a 8,000 x g (max) durante 1 h y el procedimiento de inmunoadsorción se repitió usando inmunoadsorbente de suero humano fresco. Finalmente, los anticuerpos se filtraron a través de un filtro Acrodysc de 0.2 µm (Sterile Acrodysc; Gelman Sciences; Ann Arbor, Ml ; 10 #41 92). ^ Ambos anticuerpos reaccionan fuertemente con sus antígenos tanto en sus estados naturales como reducidos. El anticuerpo contra SP-B también reacciona con su intermediario de procesamiento y su proproteína además del péptido maduro. 15 EJEMPLO 3 ELISA Se determinaron SP-A y -B mediante ensayos de inhibición de ELI SA usando SP-A y SP-B purificados a partir del fluido de lavado de proteinosis 20 alveolar como estándar. Las muestras fueron ensayadas en una manera aleatorizada ciega. Con el fin de liberar las SP-A y -B de cualquier componente de surfactante o plasma asociado, todas las muestras se trataron en la siguiente forma. Se diluyeron alícuotas de 1 25 µl en 500 µl de Tris 1 0 m M, EDTA 1 mM conteniendo 0.25% BSA (pH 7.4). Después de agitar vortiginosamente a temperatura ambiente durante 10 min, se agregaron 1 25 µl de solución conteniendo 3% SDS y 1 2% Tritón X-100 (v/v) a cada muestra. Las muestras se agitaron vortiginosamente otra vez durante 1 0 min y se determinó la concentración de roteína surfactante usando un ensayo de • 5 inhibición ELISA. Los ensayos de SP-A y SP-B fueron realizados en 2 partes. Se recubrieron placas ELISA de Costar (Costar, Cambridge, MA, #2595) durante la noche a 4°C con SP-A o -B purificadas (1 µg/ml) en una solución conteniendo carbonato de sodio 15 mM, bicarbonato de sodio 35 mM y 0.02% azida de sodio (pH 9.6). Las placas recubiertas se lavaron con PBST antes de usarse. • En una placa de ELISA separada se incubaron diluciones de las muestras y estándares (que se incluyeron rutinariamente en cada placa) con alícuotas del anticuerpo primario respectivo. Cada muestra tratada fue valorada en cuatro diluciones de 2 veces en PBST conteniendo 0.25% BSA (PBST/BSA). Se construyeron curvas estándares comprendiendo ocho diluciones seriales de 2 veces en PBST/BSA (SP-A: 1 .95 ng/ml a 250 ng/ml; SP-B: 7.8 ng/ml a 1 .0 µg/ml). Las muestras se ensayaron por duplicado mientras que los estándares se ensayaron por cuadruplicado. 20 Después de 90 min, se transfirieron alícuotas a las placas recubiertas con SP-A y SP-B y se incubaron a temperatura ambiente durante unos 90 min adicionales. Estas placas fueron lavadas entonces con PBST y se incubaron a temperatura ambiente durante 90 min con alícuotas de I gG policlonal anti-conejo de borrego conjugada con fosfatasa alcalina (Silenus Laboratories) diluida en PBST/BSA. Después de lavar con PBST, las placas se desarrollaron a temperatura ambiente con fosfato de p-nitrofenilo disódico 1 5 m M (tabletas de substrato de fosfatasa Sigma 104; Sigma Chemical Co. ; St. Louis, MO) en dietanolamina 1 .0 M y cloruro de magnesio 0.5 mM. A -1 h, se midió la absorbancia del substrato a 405 nm usando un lector Dynatech MR5000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Se usó un programa AssayZap (Biosoft, Ferguson, MO) para generar una curva estándar y calcular la concentración de la proteína surfactante en cada muestra con base en su inmuno-reactividad.

Estadísticas fc Los resultados se expresaron como promedio ± SE. Se usaron análisis no paramétricos debido a que no ten íamos razón para asumir que los datos están distribuidos normalmente. Se usó la Prueba U de Mann- Whitney o la Prueba Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank para todas las comparaciones.

EJEMPLO 4 Niveles de proteína surfactante de plasma normal y de fumadores Se ha implicado el fumar cigarrillos como un factor causante de daño 20 al pulmón. Esto incluye daño a las vías respiratorias y al parénquima pulmonar, y puede manifestarse como un am plio rango de condiciones incluyendo bronquitis, enfisema y algunos cánceres de pulmón. Sin embargo, muchos sujetos fumadores no tienen daño al pulmón clínicamente evidente y son asintomáticos. En consecuencia puede 25 necesitarse describir un "nivel de proteína surfactante de plasma normal" para fumadores y no fumadores, describiendo el "nivel de fumador normal" daño al pulmón asintomático. Debido a que fumar cigarrillos puede incrementar de manera aguda y reversible la permeabilidad epitelial al pulmón a través de la liberación • 5 mediada por humo de neuropéptidos vasoactivos (taquicininas) de nervios sensorios en las vías respiratorias (Germonpre et al. , 1995; Geppetti et al. , 1993; Lei et al. , 1993; Nadel & Borson, 1991 ), se solicita a los fumadores que se abstengan de fumar durante al menos 4 h antes de la clasificación. Se toman dos ml de sangre periférica de una vena antecubital y se 10 centrifuga en tubos de litio heparina a 5,000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente (Megafuge; Heracus-Christ; Osterode, Alemania) • siguiendo inmediantemente a la recolección. La sangre fue muestrada de 66 adultos asintomáticos que no se sabía que tuvieran enfermedad de pulmón alguna. Se anotaron la edad, 15 sexo e historial fumador de los sujetos. Los resultados se muestran en la Tabla 1 .

Tabla 1 • No fumadores Fumadores Valor P Edad (años) 30.4+1 .7 33.7±1 .3 NS Sexo (M/F) 16/1 9 1 6/1 5 NS SP-A (ng/ml) 248.4±14.1 242.3±29.8 NS SP-B (ng/ml) 2026.9±91 .8 3046.2±209.1 <0.001 (promedios±SE, prueba U de Mann-Whitney) 20 Treinta y un sujetos habían fumado 20.1 ±2.7 paquetes/años de cigarrillos, y esto se correlacionó con sus niveles de SP-B con una R2 de 33% y un valor P=0.0005. Los intervalos de confianza de 95% de estos datos para SP-A fueron 21 9.7-277.1 (ng/ml) para no fumadores y 1 81 .4- • 5 303.2 (ng/ml) para fumadores, y para SP-B 1 840-2213 (ng/ml) para no fumadores y 2169-2473 (ng/ml) para fumadores. El nivel de SP-B de plasma es elevado en fumadores asintomáticos comparado con no fumadores asintomáticos, consistente con la salud de pulmón deteriorada en fumadores. Esto soporta la reclamación de que el nivel de SP-B de plasma es un marcador extremadamente sensible de la fc salud del pulmón. Los intervalos de confianza de 95% pueden usarse para estimar un nivel de plasma de cada proteína surfactante que es elevado, indicando daño al pulmón, para ese grupo. Datos subsecuentes pueden referirse a niveles elevados en comparación con estos datos o una elevación del nivel de plasma de línea de base de estudios longitudinales en un sujeto individual.

EJ EMPLO 5 Deterioro inducido por ejercicio de la barrera alveolo-capilar en 20 humanos Dieciocho hombres (promedio±SE, edad: 1 8 a 29 años, 24.3±0.80 años; altura: 162 a 1 88 cm , 178.6±1 .72 cm; peso: 53 a 95 kg , 75.9±2.61 kg) , todos no fumadores, llegaron al laboratorio de función pulmonar entre las 7: 00 y 8: 00 am , después de ayunar desde media noche. Se tomaron muestras de sangre periférica simples de una vena antecubital de la mitad de los sujetos. Los nueve sujetos restantes fueron sometidos a un régimen de ejercicio y se muestreó su sangre inmediatamente después. Una semana después se invirtieron los grupos de sujetos. El procedimiento fue repetido en 13 de los sujetos -8 semanas después. • Procedimiento de ejercicio agudo Los sujetos fueron equipados con un oxímetro de pulso de oído (Criticare 504-USP, CSI-USA; Waukesha, Wl) para monitorear la velocidad del corazón. Los sujetos hicieron bicicleta a 60 rpm (Ergometry System Model 380B; Siemens-Elema AB, Sona, Suecia) y la carga fue incrementada para llevar la velocidad del corazón a aproximadamente 90% de la velocidad cardiaca máxima teórica, calculada como 21 0-(0.6 x edad), dentro de 10 min. Se continuó haciendo bicicleta durante unos 20 minutos adicionales, y la carga se ajustó continuamente con el fin de mantener la velocidad cardiaca tan cerca de este valor como fuera posible. En todos los casos esto involucró la reducción gradual de carga sobre el periodo.

Resultados Los niveles de SP-B en suero son significativamente elevados 20 (<0.01 , n=31 ; Prueba Wilcoxon Matched-Pairs signed-Rank) después del ejercicio (descanso: 1656.6 ng/ml ± 94.46; ejercicio: 1899.8 ng/ml ± 128.35; promedio±SE). En humanos, la presión capilar pulmonar puede tener su pico a 35 mmHg durante arduo ejercicio y esta es suficiente para deteriorar la integridad de la barrera sangre-gas. Aquellos hallazgos son consistentes con esto e ilustran que un rápido aumento en la presión capilar pulmonar puede producir falla por tensión en los capilares pulmonares e incrementar la permeabilidad alveolo-capilar. A manera de contraste, comparativamente los caballos tienen un ^m 5 rendimiento cardiaco mucho mayor, además, los de raza pura son criados selectivamente para maximizar el desempeño. En consecuencia, la presión capilar pulmonar puede alcanzar 200 mmHg en la base de sus pulmones durante arduo ejercicio. Aunque la barrera sangre-gas de cabellos es más resistente a la falla por tensión que aquélla de otros muchos mamíferos, confrontadas estas presiones, es difícilmente fc sorprendente que -90% de los de raza pura de 5 años de edad han sufrido al menos un episodio de hemorragia pulmonar grande, con un costo apreciable a la industria de la crianza. SP-A & -B circulantes son marcadores sensibles del daño al pulmón inducido por presión hidrostática.

Debido a que las presiones vasculares pulmonares se elevan durante el ejercicio pesado y que resultan en agua en el pulmón incrementada y permeabilidad alveolo-capilar incrementada en caballos de carreras, esto resulta en la ruptura de los vasos sanguíneos pulmonares, lo cual se manifiesta como sangre en los alveolos. Los niveles de proteína surfactante de sangre o producto sanguíneo son monitoreados durante el entrenamiento, la carrera y durante la recuperación del daño al pulmón inducido por ejercicio.

EJ EM PLO 6 25 Falla respiratoria ag uda La falla respiratoria aguda puede deberse a causas múltiples, tales como, edema cardiaco pulmonar, politrauma, transfusión múltiples, sepsis o infección seria, aspiración de contenidos gástrico, neumonía, coagulación intravascular diseminada y pancreatitis. 5 Se muestreó sangre de 83 pacientes en la Unidad de Cuidados Intensivos en Flinders Medical Centre, se aisló el plasma y se almacenó a -20°C antes del análisis. Su edad, sexo y resultado de lesión al pulmón (LIS)1 es derivada de un resultado de radiografía de pecho, se calculó la proporción de presión parcial de oxígeno a oxígeno aspirado (proporción PaO2/FiO2), la cantidad de presión de expiración final positiva y rendimiento de sistema respiratorio. Diez sujetos fueron ventilados • mecánicamente por razones diferentes a falla respiratoria y se pensó que tenían función pulmonar normal. Los 73 pacientes restantes tenían falla respiratoria aguda y se subdivideron dependiendo de la causa subyacente. 15 • Resultados Tabla 2 (promedios±SE) • • • Los sujetos de control ventilados tuvieron niveles de SP-A y SP-B de plasma normales (Tabla 2). Sin embargo, hay niveles de plasma elevados en una amplia variedad de causas de falla respiratoria ag uda. Los niveles de SP-A y SP-B más altos fueron encontrados de manera general en pacientes con falla respiratoria aguda debido a la neumon ía de aspiración o neumon ía, ambas causas directas de lesión al pulmón . Los niveles más bajos, pero todavía elevados de SP-A y SP-B fueron encontrados en pacientes con edema pulmonar cardiaco. Esto es consistente con niveles de plasma elevados de estas proteínas representando un incremento en la • 5 permeabilidad alveolo-capilar, y que esta elevación es generalmente más grande en causas directas de lesión al pulmón y una menor elevación en lesión al pulmón debido a una elevación en la presión hidrostática pulmonar, que es una causa indirecta de la lesión al pulmón.

EJEMPLO 7 Monitoreo de medicamentos terapéuticos, tóxicos al pulmón - por • ejemplo, metotrexato El metotrexato es un medicamento inmuno-supresivo comúnmente usado para el tratamiento de una variedad de condiciones incluyendo artritis reumatoide. Sin embargo, un efecto lateral del metotrexato es el daño al pulmón, el cual ha sido detectado, a la fecha, por síntomas tales como cambios en los gases sanguíneos o pruebas de función pulmonar sofisticadas. Dichos métodos solo detectan daño al pulmón avanzado. Los niveles de proteína surfactante de sangre o producto sanguíneo son usados para monitorear la seguridad de terapia de metotrexato al detectar cualquier incremento en la permeabilidad alveolo-capilar. El monitoreo comprende una prueba preliminar seguida por pruebas intermitentes (diarias, semanales o mensuales).

EJEMPLO 8 Monitoreo de pacientes tratados con bleomicina La bleomicina es un medicamento anti-cáncer o citotóxico conocido por provocar toxicidad pulmonar. Los factores de riesgo para lesión al 5 pulmón inducida por bleomicina incluyen dosis en incremento, uso concurrente de otros medicamentos citotóxicos, radioterapia y oxígeno complementario. Se piensa que tres mecanismos principales son considerados para lesión al pulmón. La citotoxicidad directa de especie de oxígeno reactivo provoca un edema pulmonar de permeabilidad, similar a la lesión aguda al pulmón (ALI). La lesión al pulmón también puede ocurrir debido a hipersensibilidad o reacciones idiosincráticas. Ninguno de los • demás medicamentos ci.totóxicos solos y usados en las dosis dadas a los pacientes descritos comúnmente provocan toxicidad pulmonar. En la Tabla 3 se listan cuatro pacientes que fueron tratados con bleomicina y otros medicamentos citotóxicos. Ninguno de los pacientes ten ía síntomas respiratorios, ninguno tenía complicación de pulmón con cáncer y todos eran no fumadores. Se muestreó sang re en descanso y el plasma se congeló a -20°C hasta que fue ensayado. • • Tabla 3 Datos de q u imioterapia Diagnóstico Edad Sexo Historia de PFT's1 Dosis de bleomicina Otros citotóxicos SP-A SP-B fumador (unidades) (ng/ml) (ng/ml) Cáncer 39 M Cesó hace 60 Cisplatina 450 mg 360.2 1547.9 testicular2 15 años Etopósido 2.2 g Linfoma de 23 M Nunca Normal 90 Doxorubidina 450 mg, 174.3 1730.0 Hodgkin3 vinblastina 110 mg, dacarbazina 6.8 g Linfoma de 74 M Nunca 15 Ciclofosfamida 1 g, 265.5 2598.2 no Hodgkin etopósido 100 mg, procarbazina 100 mg, oo predinisolona 75 mg Linfoma de 60 F Nunca 30 Ciclofosfamida 2.2 g, 413.6 1382.6 no Hodgkin etopósido 390 mg, procarbazina 1 g, predinisolona 1 g Las pruebas de función pulmonar incluyen volúmenes de pulmón , factor de transferencia y respuestas a bronq uiodilatador fueron norma les antes de iniciar la quimioterapia citotóxica. 2Una semana después, unas 30 unidades adicionales de bleomicina, sus niveles de SP-A y SP-B todavía fueron elevados pero calieron a 295.5 y 1 199.8 nmg/ml respectivamente. 3Dos semanas después de un ciclo adicional de quimioterapia, que incluyó unas 1 8 unidades adicionales de bleomicína, su nivel de SP-A se había elevado a 339.9ng/ml y su SP-B se había elevado a 551 2.8 ng/ml.

Resultados • El nivel de SP-B de plasma en el paciente 3 es elevado, pero los niveles de SP-B en los demás pacientes son normales. Esto es consistente con la variabilidad individual para los efectos tóxicos de pulmón de la bleomicina. • Paciente 2: La elevación de SP-A y SP-B con una dosis adicional de bleomicina (ver nota al pie 3) es consistente con el daño al pulmón inducido por bleomicina, conduciendo a un incremento en la permeabilidad alveolo-capilar y un incremento en los niveles de proteína surfactante de plasma. Esto indica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados para monitorear la administración de medicamentos tóxicos al • pulmón. • Paciente 1 : La caída en SP-A y SP-B después de la quimioterapia adicional es consistente con la reparación y resolución de daño al pulmón inducido por bleomicina. Esto indica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados para monitorear la resolución de daño al pulmón debido a un medicamento tóxico.

• EJ EM PLO 9 20 Daño a l pu lmón in d ucido por radiotera pia La terapia de radicación, que ya sea se enfoca o expone inadvertidamente al pulmón , puede resultar en daño al pulmón. Mientras que frecuentemente éste es relativamente asintomático, alg unos pacientes se vuelven sintomáticos y pueden desarrollar falla respiratoria. Esto ocurre en las semanas siguientes a la iniciación del tratamiento. Los niveles de proteína surfactante se usan para monitorear este daño al pulmón permitiendo la individualización de la dosis de radioterapia y/o frecuencia.

Caso 1 : Se muestreó sangre de un hombre no fumador de 1 9 años de edad, 2 semanas después de un curso de radioterapia para linfoma de Hodgkin. No tenía síntomas respiratorios y no se pensó que la quimioterapia anterior fuera tóxica para el pulmón. Su SP-A de plasma se elevó a 416.9 ng/ml como fue SP-B a 4020.6 ng/ml. Caso 2: Se muestreó sangre de una mujer de 57 años de edad, 3 semanas después de la radioterapia para carcinoma de células escamosas del pulmón. Ella había dejado de fumar recientemente y no tuvo cambios en sus síntomas respiratorios. No se pensó que la quimioterapia anterior fuera tóxica para el pulmón. Su SP-A de plasma fue marcadamente elevado a 963.6 ng/ml y su SP-B se elevó a 2742.2 ng/ml.

Los síntomas de toxicidad al pulmón inducida por radioterapia comúnmente ocurren algunas semanas después del tratamiento. La elevación en proteínas surfactantes en ambos pacientes es consistente con la elevación que se debe al daño al pulmón inducido por radioterapia y un incremento en la permeabilidad alveolo-capilar. En consecuencia, los niveles de proteína surfactante se usan para monitorear la radioterapia, para individualizar la terapia y para monitorear los tratamientos de rescate, tales como, factores de crecimiento.

EJEMPLO 10 Monitoreo del daño al pulmón inducido por herbicidas El paraquat es un herbicida ampliamente usado que destruye la membrana de células lipídicas a través de la producción de radicales 5 oxígeno. También se piensa que es el mecanismo de toxicidad, predominantemente pulmonar, en humanos. Normalmente la lesión aguda al pulmón se desarrolla algunos días después de ia ingestión y usualmente progresa a falla respiratoria fatal debido al desarrollo del síndrome de aflicción respiratoria aguda con fibrosis pulmonar marcada. 10 La sangre fue muestrada secuencialmente de un paciente siguiendo la ingestiónde paraquat para la medición de proteínas surfactantes ^^ circulantes y para la documentación de oxigenación sanguínea. En la figura, la proporción de oxigenación de sangre inicial a oxígeno aspirado (proporción PaO2/FiO2) es normal y permanece sin cambio hasta 64 horas siguiendo la presentación. La caída repentina en la proporción PaO2/FiO2 es evidencia del daño al pulmón. El nivel de SP-B de plasma también fue normal en la presentación pero se incrementó repentinamente a 54 horas siguiendo la ingestión , 1 0 horas antes del cambio en la oxigenación de la • sangre. 20 Estos datos demuestran que las proteínas surfactantes son marcadores tempranos del daño al pulmón, y que esto precede el diagnóstico clínico del daño al pulmón (Figura 1 ) .

EJEMPLO 1 1 25 Pred icción de daño severo al pulmón Siguiendo una causa de predisposición, los pacientes pueden desarrollar lesión aguda al pulmón (ALI) y requieren soporte respiratorio para falla respiratoria aguda. Cuando ésta progresa a daño al pulmón más severo, puede llamarse síndrome de aflicción respiratoria aguda (ARDS). • 5 La predicción de la cual el paciente desarrollará ARDS tiene muchas implicaciones terapéuticas. A 43 pacientes tratados en la Unidad de Cuidados Intensivos de Flinders Medical Centre se les muestreó su sangre dentro de 1 2 horas de desarrollar ALI , la cual fue definida como un resultado de lesión al pulmón 10 (LIS) < 2.5. Se documentaron su sexo, edad, LIS y el desarrollo de ARDS (LIS > 2.5). Se aisló el plasma y se congeló a -20°C hasta que se ensayó.

• Los datos se presentan como promedio±SE, y los datos se comparan con una prueba U de Mann-Whitney.

Resultados Tabla 4 Desarrolla ARDS Valor P Edad 60±4 61 ±3 NS • Hom bre/mujer 1 7/7 1 1 /8 NS LIS 1 .7±0.1 1 .9+0. 1 NS SP-A (ng/ml) 393±36 514±55 NS SP-B (ng/ml) 4162±502 8222±1 31 9 0.01 7 El nivel de plasma de SP-B es significativamente mayor en sujetos con ALI que desarrollarán ARDS que aq uéllos que no (Tabla 4) . Debido a que LI S no es diferente entre los dos grupos y que no existe diferencia en la distribución de edad o sexo, no puede predecirse en terrenos clínicos. Esto índica que los niveles de proteína surfactante pueden ser usados para predecir el desarrollo de lesión severa al pulmón. • 5 EJEMPLO 12 Proporciones de proteína surfactante La proporción de componentes surfactantes es útil para entender, diagnosticar y monitorear procesos de enfermedades. Como un ejemplo, 10 la Tabla 5 lista las proporciones SP-B/A para algunos grupos de pacientes estudiados.

Tabla 5 Número Hombre/mujer Edad Resultado Proporción de lesión al SP-B/A pulmón No fumadores 35 16/19 30.4±1.7 8.6±0.5 • Fumadores 31 16/15 33.7±1.3 15.2±1.6 Solo ALI 24 17/7 60±4 1.7±0.1 11.6±1.2 Pre-ARDS 19 11/8 61±3 1.9±0.1 16.8±2.7 Controles 10 7/3 63±8 0.3±0.2 9.9±1.1 ventilados Edema cardiaco 10 7/3 63+8 0.3±0.2 13.8+2.2 pulmonar Politrauma 4 4/0 66±4 1.3±0.2 9.4±1.6 Transfusión 9 8/1 70+3 2.1±0.2 10.4+1.5 múltiple Sepsis 14 9/5 65+3 2.3±0.3 9.9±1.3 Aspiración 13 9/4 70±3 2.3±0.1 17.5±2.6 Neumonía 12 8/4 58+5 2.2+0.3 21.6±4.0 Coagulación 2 1/1 36±18 2.5+0.5 15.9±2.0 intravascular diseminada Pancreatitis 6 4/2 49±4 2.1+0.2 11.5+1.8 Falla de hígado 3 1/2 31±6 3.4±0.3 1 1.8±7.3 La proporción SP-B/A para no fumadores es igual que aquélla para sujetos de control ventilados, sin embargo, la proporción de SP-B/A es mayor para fumadores. Esto es consistente con los niveles de SP-B que reflejan la fuga a través de poros más pequeños en la membrana alveolo- capilar. También existe una marcada elevación en la proporción SP-B/A en las causas directas de daño al pulmón , tales como, neumonía y aspiración comparadas con las causas indirectas, tales como, sepsis. Esto es consistente con un mayor incremento en la permeabilidad en este grupo. En consecuencia, la proporción SP-A/B puede ser usada además de los niveles de surfactantes absolutos. r 5 EJEMPLO 13 Monitoreo de niveles de SP-A y SP-B vasculares como marcadores substitutos de estado de surfactante pulmonar Los niveles no pulmonares vasculares y extravasculares de SP-A & - 10 B dependerán no solo de la permeabilidad alveolo-capilar, sino también de los niveles alveolares. • La proteinosis alveolar primaria es una enfermedad crónica de patogénesis desconocida caracterizada por la acumulación difusa de exceso de surfactante en los espacios de aire. Los pacientes usalmente tienen menos de 45 años de edad con una notable proporción de adolescentes e infantes. Aunque el lavado de pulmón completo se ha vuelto una terapia estándar. El curso clínico varía notamblemente. Se piensa que la síntesis y secreción de surfactante en pacientes con fl) proteinosis alveolar primaria es normal y que la acumulación de surfactante en el alveolo surge de un deterioro en su evacuación . La proteinosis alveolar congénita también está caracterizada por la acumulación difusa de exceso de surfactante en los espacios de aire. Distinta de la proteinosis alveolar primaria, existen ahora un número de causas establecidas para el fenotipo congénico. Estas incluyen, pero no están limitadas a, la carencia de expresión de la cadena beta-com ún de receptor GM-CSF y defectos moleculares en el gene de SP-B. Se tomaron muestras de sangre periférica simple de una vena antecubital de 12 pacientes (30 años ± 2.7; promedio + SE) diagnosticados con proteinosis alveolar primaría. Los pacientes fueron diagnosticados como idiopáticos tanto clínicamente como en la base de su biopsia transbronquial o de pulmón abierto. También se tomaron muestras de sangre periférica simple de una vena antecubital de 3 infantes (< 1 año) diagnosticados con proteinosis alveolar congénita. Los infantes expresaron componentes de receptor GM-CSF y no tuvieron el defecto de SP-B molecularmente o en inmunohistoquímica.

Resultados Los niveles de SP-A y SP-B en suero estaban enormemente elevados en pacientes con proteinosis alveolar primaría o congénita (todos los grupos p<0.001 ; prueba U de Mann-Whitne) comparados con los normales. (Tabla 6).

Tabla 6 Proteinosis alveolar primaria Proteinosis alveolar congénita SP-A 1440.5 ng/ml + 259.05 3096.2 ± 834.1 7 SP-B 1 7845.2 ng/ml ± 3065. 16 39928. 1 ± 5884.91 (promedio±SE) Los niveles de SP-A y -B circulantes están enormemente elevados en pacientes con proteinosis alveolar primaria o deficiente de no SP-B. Ya que la permeabilidd alveolo-capilar es normal en estos pacientes, esto ilustra que SP-A & B circulantes marcan cambios en los niveles de ^ 5 surfactante pulmonar. Aproximadamente 30% de los casos de proteinosis alveolar primaria se resuelven espontáneamente, algunos requieren de lavados múltiples sobre periodos prolongados, mientras que otros progresan a enfermedad de pulmón diseminada. Si se deja sin tratar 30% de pacientes progresa a dispnea, hioxemia y muerte. En la ausencia de transplante de pulmón, la prognosis para infantes con proteinosis alveolar congénita es pobre. • Actualmente, la severidad de la proteinosis alveolar se refleja solo pobremente por parámetros indirectos, tales como, oxigenación sanguínea. Los niveles de proteínas surfactantes circulantes ofrecen un método no invasivo directo para monitorear esta condición. La prueba también tiene utilidad particular en el diagnóstico de formas congénicas de la condición donde SP-B puede o no estar presente. Además. Los niveles de proteínas surfactantes circulantes ofrecen un método no invasivo directo para monitorear los niveles de surfactantes y la maduración de pulmón en infantes pre-término con síndrome de aflicción respiratoria.

EJEMPLO 14 Monitoreo de niveles de SP-A y -B en ambos fluidos vasculares y extravasculares Se recolectaron fluido pleural simple y sangre igualada de 88 pacientes que tenían dianóstico de toracentesis terapéutica (63 ± 14 años de edad; promedio ± SE). La población de estudio incluyó pacientes con neoplasia (carcinoma metastático, malignidad hematológica y mesotelioma), efusión pleural inflamatoria (enfermedad paraneumónica, postquirúrgica, enfisema, abseso sufrénico, de colágeno vascular, así como otras diversas causas), falla congestiva de corazón y pacientes con cirrosis e hidrotórax.

Resultados Los niveles de SP-A y SP-B pleurales son significativamente elevados (ambos p<0.001 , n=88; prueba Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank) comparada con las muestras de suero igualadas (Tabla 7) . Tanto SP-A como -B de suero se relacionan significtivamente con los niveles pleurales (SP-A; p<0.001 , r8=0.57, n=88; SP-B; p<0.001 , r8=0.4).

Tabla 7 Promedio ± SE SP-A de suero 290.5 ng/ml ± 22.36 SP-B de suero 255.9 ng/ml ± 165.6 SP-A de suero pleural 632.9 ng/ml ± 1 54.91 SP-B de suero pleural 4877.8 ng/ml ± 685.76 Aunque el epitelio y el endotelio generalmente restringen el movimiento de las moléculas más grandes que la albúm ina (Mr 67kD, radio hidrodinámico -3.5 nm), las proteínas se difunden hacia debajo de sus gradientes de concentración de la hipofase alveolar de pulmón y entre los compatimentos vascular y extravascular. Los niveles de ambos SP-A y -B vascular y extravascular son marcadores sensibles de la permeabilidad • alveolo-capilar y salud del pulmón. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a aquéllas descritas de manera específica. Se entenderá que la invención incluye todas esas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación, de manera individual o colectiva, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de dichos pasos o características.

BIBLIOGRAFÍA Doyle, I.R., Jones M.E., et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 149:1619- 1627 (1994) Doyle, I.R., Bersten, A.D. y Nicholas, T.E., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156:1217-1219 (1997) Geppetti, P., Bertrand, C, et al., Br. J. Pharm. 108:646-50 (1993) Germonpre, P.R., Jóos, G.F., et al., 329:185-203 (1995) Holm, B.A., y Notter, R.H., J. Appl. Physiol.63:1434-1442 (1987) Jefferies, A.L., Kawano, T., Mori, S., y Burger R., J. Appl. Physiol. 64:5620-5628 (1988) Johansson, J., Curstedt, T. y Jornvall, H., Biochemistry 30:6917-6921 (1991) Lei, Y.H., Barnes, P.J. et al., Eur. J. Pharmacol.239:257-9 (1993) Longo, M.L., Waring, A. y Zasadzinski, A.N., Biophys. J.63:760-773 (1992) Nadel, J.A. y Borson, D.B., Am. Rev. Respir. Dis. 143-S33-36 (1991) Nicholas, T.E, Bar, H.A., Power, J.H.T. y Jones, M.E., Amer. J. Physiol. 259:L238-L246 (1990) Nicholas, T.E., NIPS.8:12-8 (1993) Said, S.I., Avery, M.E., Davis, R.K., Banerjee, C.M., El-Gohary, M., J. Clin.

Invest.44:458-464 (1965) Staub, N.C. y Hyde, R.W. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 141:1071-1977 (1990) Voss, T., Eistetter, H., Scháfer, K.P. y Engel, J., J. Mol. Biol. 201:219-227 (1988) Weaver, T.E. y Whitsett, J.A., Am. J. Physiol.257:L100-L108 (1989) Yogalingman, G., Doyle, I.R., et al., Am. J. Physiol. 14:L320-L330 (1996)

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para diagnosticar daño al pulmón en un mamífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicha modulación es un incremento.
3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho daño al pulmón es daño al pulmón en etapa temprana.
4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho daño al pulmón en etapa temprana es daño a la membrana alveolo-capilar.
5. 5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho surfactante pulmonar es cualquiera de uno o más de SP-A, SP-B, SP-C o SP-D.
6. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho surfactante pulmonar es SP-B.
7. 7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho fluido corporal es sangre.
8. 8. Un método para monitorear los cambios en el grado del daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mam ífero.
9. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho daño al pulmón es daño a la mem brana alveolo-capilar.
10. 1 0. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde dicho surfactante pulmonar es cualquiera de uno o más de SP-A-, SP-B-, SP-C o SP-D.
11. 1 1 . Un método de acuerdo con la reivindicación 1 0, en donde dicho flj! 5 surfactante pulmonar es SP-B.
12. 12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 , en donde dicho fluido corporal es sangre.
13. 13. Un método para diagnosticar daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de 10 niveles de surfactantes pulmonares en el fluido corporal de dicho ^^ mam ífero.
14. 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha proporción de nivel de surfactante pulmonar es la proporción SP-B: SP-A.
15. 1 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha 15 modulación es un incremento.
16. 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 5, en donde dicho daño al pulmón es daño a la membrana alveolo-capilar.
17. 1 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho daño ^ a la membrana alveolo-capilar es daño a la membrana alveolo-capilar en 20 etapa temprana.
18. 18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 1 7, en donde dicho fluido corporal es sangre.
19. 19. Un método para monitorear cambios en el grado de daño al pulmón en un mam ífero, comprendiendo dicho método clasificar las modulaciones de proporciones de niveles de surfactantes pulmonares en el fluido corporal de dicho mam ífero.
20. 20. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 9, en donde dicha proporción de nivel de surfactante pulmonar es la proporción SP-B:SP-A. flj 5
21. 21 . Un método de acuerdo con la reivindicación 19 o 20, en donde dicho fluido corporal es sangre.
22. 22. Un método para determinar, en un mamífero expuesto a un factor de lesión de pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de niveles 10 de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero, en donde «. el nivel de dicho surfactante pulmonar es indicativo de una predisposición v para desarrollar daño severo al pulmón.
23. 23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha modulación es un incremento. 15
24. 24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho mam ífero ha desarrollado lesión aguda al pulmón debido a la exposición a un factor de lesión al pulmón y dicho daño severo al pulmón es síndrome de aflicción respiratoria aguda. ifl
25. 25. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, 20 en donde dicho surfactante pulmonar es SP-A, SP-B, SP-C o SP-D.
26. 26. Un método de acuerdo a la reivindicación 25, en donde dicho surfactante pulmonar es SP-B.
27. 27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde dicho fluido corporal es sangre.
28. 28. Un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de lesión de pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método clasificar la modulación de proporciones de niveles de surfactantes pulmonares en el fluido corporal fl| 5 de dicho mam ífero, en donde dichas proporciones son indicativas de una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón.
29. 29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho fluido corporal es sangre.
30. 30. Un método para determinar, en un mam ífero expuesto a un factor de 10 lesión de pulmón, una predisposición para desarrollar daño severo al pulmón, comprendiendo dicho método correlacionar la modulación de • niveles de surfactante pulmonar en el fluido corporal de dicho mamífero con el resultado de medición de otro parámetro clínico de pulmón, en donde el resultado de dicha correlación es indicativa de una predisposición 15 para desarrollar daño severo al pulmón.
31. 31 . Un método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho parámetro cl ínico de pulmón es el resultado de lesión de pu lmón.
32. 32. Un método de acuerdo con la reivindicación 30 o 31 , en donde dicho (fl surfactante pulmonar es uno o más de SP-A, SP-B, SP-C o SP-D. 20
33. 33. Un método de acuerdo con al reivindicación 32, en donde dicho surfactante pulmonar es SP-B.
34. 34. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33. en donde dicho fluido corporal es sangre.
35. 35. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, 25 en donde dicho mam ífero es un humano.
36. 36. Un conjunto diagnóstico para clasificar muestras de fluidos corporales, comprendiendo en forma de compartimentos , un primer compartimento adaptado para contener un agente para detectar surfactante pulmonar y un segundo compartimento adaptado para contener reactivos usados para facilitar la detección por el agente en el primer compartimento.