ES2349458T3 - Derivados o-metilados de rapamicina para aliviar e inhibir trastornos. - Google Patents

Abstract

Uso de un derivado de rapamicina que tiene la estructura química en la que X es (H, H) u O; Y es (H, OH) u O; R 1 se selecciona de alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R 3 )3 Si; R 2 se selecciona de -H, alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R 3 )3 Si; cada R 3 se selecciona independientemente de -H, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo y fenilo; y bien R 4 es metilo o R 4 y R 1 juntos forman un resto alquileno C2-5 para la preparación de un medicamento para aliviar un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano o para inhibir un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano con riesgo de desarrollar tal trastorno, en el que dicho trastorno linfoproliferativo se selecciona de un trastorno caracterizado por proliferación de linfocitos que se han infectado con un virus de Epstein-Barr y un trastorno linfoproliferativo maligno seleccionado de un trastorno linfoproliferativo postrasplante, un linfoma de células B abiertamente maligno monoclonal, un linfoma de Hodgkin, un linfoma de Burkitt, un linfoma de células B de derrame peritoneal y un linfoma de células B VEB + .

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los trastornos linfoproliferativos postrasplante (TLPT) que normalmente implican la expansión de linfocitos B infectados por el virus de Epstein-Barr (VEB), son un agravante letal de la terapia inmunosupresora, necesaria para inhibir el rechazo de injerto (Morrison y col.,1994, Am. J. Med. 97: 14-24; Warnke y col., 1995, AFIP Fascicle 14: 531-535). Los TLPT comprenden un completo espectro de trastornos linfoproliferativos que varía desde una hiperplasia linfoide atípica a un linfoma monoclonal de células B claramente maligno (Morrison y col., 1994, Am. J. Med. 97: 14-24; Warnke y col., 1995, AFIP Fascicle 14: 531-535; Curtis y col., 1999, Blood 94:2208-2216; Harris y col., 1997, Semen. Diagn. Path. 14: 8-14). Las formas menos avanzadas de los TLPT responden a un ciclo de terapia inmunosupresora menos agresivo (Morrison y col., 1994, Am. J. Med. 97: 14-24; Sigal y col., 1992, Ann. Rev. Immunol. 10:519-60). Sin embargo, disminuyendo la dosis de fármacos inmunosupresores convencionales, que anulan la capacidad del organismo para rechazar y destruir el tejido extraño, se puede comprometer la supervivencia de un injerto. Además, esta modificación en el tratamiento con agentes convencionales no es eficaz contra los tumores malignos, los TLPT de tipo linfoma que normalmente son fatales para el receptor del injerto.

El linfoma ocasiona morbilidad y mortalidad significativas, siendo responsable de más de 50.000 nuevos diagnósticos anualmente sólo en los Estados Unidos. Muchos linfomas son Hodgkin o no Hodgkin, que pueden derivar de linfomas B, T o NK maduros, periféricos. En base a su ciclo natural, los linfomas no Hodgkin se clasifican en grado bajo, intermedio y alto. Los linfomas de grado bajo normalmente progresan lentamente, pero son esencialmente incurables. La tasa actual de supervivencia posterapia, sin enfermedad de 5 años para los linfomas de grado intermedio y alto es aproximadamente del 60%. Estos tipos de linfomas agresivos conducen, a los pacientes que no responden a la terapia, a una muerte rápida. El pronóstico de linfomas que se producen en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes con SIDA y postrasplantados, es particularmente malo. Por lo tanto, son necesarias nuevas modalidades de tratamiento para mejorar la tasa de curación del linfoma.

El SZ RAD (40-O-{2-hidroxietil}-rapamicina) pertenece a una clase de derivados de la rapamicina con actividad inmunosupresora (solicitud PCT WO 94/09010; Schuurman y col., 1997, transplantation 64: 32-5; Schuler y col., 1997, Transplantation 64: 36-42; Sedrani, y col., 1998, Transplant. Proc. 30:2192-2194; Schuurman y col., 1998, Transplant. Proc 30: 21982199; Hausen y col., 1999, J. Heart Lung Transplant 18: 150-159). Los compuestos de esta clase, incluyendo la rapamicina, tienen varios puntos de acción en linfocitos T normales. Principalmente inhiben sucesos de señalización corriente abajo mediados por el receptor de IL2 (Shegal, 1998, Clin. Biochem, 31:335-340) y otros receptores de citocinas (Sakata y col., 1999, immunology Letters 68:301-309), aunque también influyen en la progresión del ciclo celular en la fase G temprana (Terada y col.,1993, J. Cell Physiol. 154: 7-15; Flanagan y col., 1993, Ann. N. Y. Acad. Sci. 696:31-37). La actividad multifacética inmunosupresora mostrada por el SDZ RAD y otros compuestos derivados O-alquilados de la rapamicina hace a estos compuestos agentes inmunosupresores versátiles.

El documento WO 94/09010 desvela derivados de rapamicina, su síntesis y su uso en la terapia de rechazo de aloinjerto, en la enfermedad de injerto contra hospedador, en trastornos tumorales o hiperproliferativos.

Boehler, T. y col., (Transplantation Proceedings 30; (1998), págs. 2195-2197) desvelan el efecto in vivo del SDZ RAD, derivado de la rapamicina, sobre la proliferación de linfocitos T en seres humanos, así como la medicación conjunta con ciclosporina (CyA) o tracolimus (FK 506) y metilprednisolona.

Schuler, W. y col., (Transplantation 64; (1997), págs. 36-42) desvelan el SDZ RAD, derivado de la rapamicina, y sus efectos inhibidores sobre el factor de crecimiento que conduce a la proliferación celular y la inhibición de las reacciones del rechazo de aloinjerto en ratas.

Sedrani, R. y col., (Transplantation Proceedings 30; (1998), págs. 2192-2194) desvelan el efecto inmunosupresor de derivados de rapamicina adicionales incluyendo el SDZ RAD en un ensayo de reacción de linfocitos mezclados in vitro.

El documento US 5.525.610 desvela la síntesis de 42-epi-rapamicina y sus usos terapéuticos en el tratamiento de rechazo de trasplante, rechazos de injerto contra hospedador, tumores sólidos, leucemia/linfoma de linfocitos T adultos y trastornos vasculares hiperproliferativos así como para inducir la inmunosupresión.

Existe una necesidad significativa para conseguir nuevos procedimientos terapéuticos y profilácticos más eficaces para limitar la gravedad y frecuencia de los trastornos linfoproliferativos tales como linfomas y TLPT-La presente invención satisface esta necesidad. BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención incluye un procedimiento para aliviar un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano. El procedimiento consiste en administrar al paciente, en una cantidad suficiente para aliviar el trastorno, un derivado de rapamicina que tiene la estructura química mostrada en la Figura 8, Fórmula I. En una realización preferida, el derivado de rapamicina es 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina. En esta divulgación se describen diversos derivados útiles de rapamicina (incluyendo la propia rapamicina). Los trastornos linfoproliferativos que pueden aliviarse usando este procedimiento incluyen, por ejemplo, TLPT y cánceres linfáticos tales como linfomas. El procedimiento también puede usarse para aliviar trastornos linfoproliferativos ocasionados o asociados al tratamiento del paciente mediante terapia inmunosupresora (por ejemplo, terapia inmunosupresora asociada al trasplante de tejidos).

En otro procedimiento incluido en la presente invención, se inhibe o se previene un trastorno linfoproliferativo en un paciente con riesgo de desarrollar un trastorno (por ejemplo, un paciente inmunocomprometido o un paciente sometido a terapia inmunosupresora).

En estos procedimientos, el derivado de rapamicina puede administrase conjuntamente (en una sola composición o en composiciones administradas individualmente) con un segundo agente farmacológicamente activo, tal como un agente inmunosupresor. Se conocen agentes inmunosupresores para su uso en procedimientos de inhibición de rechazo de injerto y los procedimientos conocidos pueden mejorarse administrando a un paciente, que ha recibido un injerto, el agente inmunosupresor y un derivado de rapamicina desvelado en el presente documento.

La presente invención también incluye un procedimiento para inhibir la metástasis de un tumor linfático en un paciente humano que padece un cáncer linfático. Este procedimiento comprende administrar al paciente, en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación linfocítica, un derivado de rapamicina que tiene la estructura química mostrada en la Fórmula I.

En otro aspecto, la presente divulgación incluye un procedimiento para valorar si un agente es útil para aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano. Este procedimiento comprende transformar un linfocito B con un virus de Epstein-Barr, inyectar el linfocito a un ratón con inmunodeficiencia grave combinada, administrar el agente al ratón y controlar el crecimiento tumoral en el ratón durante al menos 21 días. Si en el ratón se observa uno o más de regresión del tumor, erradicación del tumor y ausencia de un segundo tumor, entonces es un indicio de que el agente es útil para aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo postrasplante en un mamífero. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un gráfico que ilustra la inhibición, mediada por SDZ RAD, de la

proliferación in vitro de células B VEB + de tipo TLPT. La BC-1 es una línea de células B

VEB+/HSV8+ derivada de linfoma de derrame primario (PEL). Las otras líneas celulares

son líneas de células B transformadas con VEB in vitro derivadas de un paciente con

linfoma de células B de grado bajo (15A o 20A), de un paciente con linfoma de linfocitos T

(LCL) o de un individuo sano (A1 o A2D6). Como líneas celulares de control, se incluyeron

las líneas de linfocitos T malignos VLTH-i+, HUT-102, C10MJ y ATL-2.

La Figura 2 es un gráfico que ilustra la inhibición, mediada por SDZ RAD, de la progresión

del ciclo celular en células B de tipo TLPT. Se cultivaron cuatro líneas de células B VEB+ durante 48 horas en presencia de SDZ RAD de 0-10 nanomolar, se marcaron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 3 es un gráfico que ilustra el aumento, mediado por SDZ RAD, de la tasa apoptótica de células B de tipo TLPT. Se cultivaron tres líneas de células B VEB+ durante 24 horas en presencia de SDZ RAD 0-10 nanomolar, se marcaron con yoduro de propidio y anticuerpo anti-anexina V y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 4, que comprende las Figuras 4A-4D, es un grupo de imágenes de fotomicrografías que representa la morfología y el fenotipo de tumores 20A xenotrasplantados en ratones EISC (enfermedad de inmunodeficiencia severa combinada). En la Figura 4A, la tinción con hematoxilina-eosina muestra un gran linfoma celular con elevada tasa mitótica. En la Figura 4B la tinción con inmunoperoxidasa, usando un anticuerpo que se une específicamente a CD20 de ser humano (es decir, un antígeno de células B), muestra la tinción de la membrana celular en todas las células del linfoma. En la Figura 4C, la tinción con inmunoperoxidasa usando un anticuerpo que se une específicamente a Ki67 (es decir, un antígeno relacionado con la proliferación celular), muestra tinción nuclear en el 50-80% de las células. En la Figura 4D, la hibridación in situ del ARN EBER-1, codificado por VEB, muestra positividad nuclear en todas las células del linfoma. La Figura 5 que comprende las Figuras 5A-5C, es un trío de gráficos que ilustra la inhibición, mediada por SDZ RAD, del crecimiento in vivo de células B de tipo TLPT; tratamiento de tumores estabilizados. Se implantaron fragmentos de tumores derivados de líneas de células B VEB+, 15A (Fig. 5C), 20A (Fig. 5B) y A1 (Fig. 5A) en ratones receptores EISC. Entre paréntesis se indica el número de ratones por grupo. El tratamiento con 5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día del fármaco, comenzó cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 0,4-0,5 cm. La Figura 6, que comprende las Figuras 6A-6C, es un trío de gráficos que ilustra la inhibición, mediada por SBZ-RAD, del crecimiento in vivo de células B malignas de tipo TLPT (es decir, inhibición del crecimiento tumoral). Se implantaron fragmentos de tumores derivados de líneas de células B VEB+, 15A (Fig. 6C), 20A (Fig. 6D) y A1 (Fig. 6A) en ratones receptores EISC. Entre paréntesis se indica el número de ratones por grupo. El tratamiento con 5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día del fármaco, comenzó tres días antes del implante del tumor. La Figura 7 representa la estructura química del SDZ RAD. La Figura 8 representa la fórmula química de los derivados de rapamicina O-metilados que pueden usarse en los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo,

Fórmula I). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para aliviar o inhibir trastornos linfoproliferativos tales como linfomas y trastornos linfoproliferativos postrasplante (TLPT) en un mamífero tal como un ser humano. El procedimiento comprende administrar al mamífero un derivado de rapamicina O-alquilado tal como SDZ RAD en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de linfocitos en el mamífero.

Se sabe que los derivados de rapamicina O-alquilados inhiben el rechazo de injerto. Por lo tanto, cuando se administra el derivado de rapamicina en un mamífero que ha sometido a un injerto de tejido o de órgano (por ejemplo, un xenoinjerto), la administración de uno de estos derivados puede inhibir tanto el rechazo de injerto como aliviar o prevenir un TLPT. Para el tratamiento o inhibición de un TLPT, la cantidad administrada puede ser suficiente para inhibir tanto el rechazo de injerto como la proliferación de linfocitos.

Anteriormente nadie ha reconocido el hecho de que los derivados de rapamicina O-alquilados, tales como los descritos en el presente documento, puedan usarse para aliviar o prevenir linfomas. Los derivados de rapamicina O-alquilados, tal como SDZ RAD, también pueden usarse para inhibir la proliferación de linfocitos, como ocurre en una diversidad de trastornos linfoproliferativos distintos al linfoma (por ejemplo leucemia linfocítica crónica). Los derivados de rapamicina O-alquilados, tales como SDZ RAD, también pueden usarse para inducir en una célula, in vitro o in vivo, la interrupción del ciclo celular o apoptosis y para inhibir el crecimiento y proliferación de linfocitos.

Otros autores han descrito los derivados de rapamicina O-alquilados que son útiles en los procedimientos descritos en el presente documento, así como procedimientos para prepararlos. En este aspecto, la solicitud de patente PCT con el número de publicación internacional WO 94/09010 se refiere a ello.

Los derivados de rapamicina O-alquilados que son útiles en los procedimientos descritos en esta divulgación incluyen los que tienen la estructura química mostrada en la Fórmula I en la Figura 8, en la que X es (H, H) u O; Y es (H, OH) u O; cada una de R1 y R2 se selecciona independientemente de H, alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanililalilo, carbalcoxialquilo y (R3)3 Si; cada R3 se selecciona independientemente de H, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, y fenilo; y

cada R4 es metilo o R4 y R1 forman juntos un resto alquileno C2-5.

En las descripciones de R1-R4, “alqu-“ o “alquilo” se refiere a un resto alquilo C1-6, siendo el resto ramificado o lineal y preferentemente siendo un resto alquilo C1-3, en el que la cadena de carbono puede, opcionalmente, estar interrumpida por un enlace éter (-O-) (por ejemplo, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-). En las descripciones de R1-R4, “ar-“ o “arilo” se refiere a un resto arilo C5-8, teniendo opcionalmente el resto arilo uno o dos átomos de nitrógeno en lugar de un átomo de carbono. En las descripciones de R1-R4, “alilo” significa –CH2-CH=CH2. En las descripciones de R1-R4, “acilo” se refiere a un resto alcanoilo C1-6 (es decir, un resto alquilo que tiene un resto carbonilo {y es decir –CO-} en lugar de un resto metileno {es decir –CH2-} del resto alquilo). En las descripciones de R1-R4, “alquileno” se refiere a un resto alquileno C1-6, siendo el resto ramificado lineal.

Los ejemplos de los derivados de rapamicina O-alquilados que son adecuados para su uso en los procedimientos descritos en esta divulgación incluyen

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40-O-bencil-rapamicina,

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40-O-(4’-hidroximetil)bencil-rapamicina

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40-O-[4’-(1,2-dihidroxietil)]bencil-rapamicina

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40-O-alil-rapamicina

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40-O-[3’-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)prop-2’-en-1’-il]-rapamicina

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(2’E, 4’S)-40-O-(4’-5’-dihidroxipent-2’-en-1’-il)-rapamicina,

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40-O-(2-hidroxi) etoxicarbonilmetil-rapamicina

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40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

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40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina,

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40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina

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40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina

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40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina

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40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina

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40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina

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40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina

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40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina

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40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina

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40-O-[2-(N-metil-N’-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina

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39-O-desmetil-39,40-O-O-etileno-rapamicina

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(26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

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28-O-metil-rapamicina

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40-O-(2-aminoetil)-2-rapamicina

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40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina

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40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina

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40-O-(2-(N-metil-imidazo-2’-ilcarbetoxamido)etil-rapamicina,

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40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina

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40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina y

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40-O-[2-(4’,5’-dicarboetoxi-1’,2’,3’-triazol-1’-il)-etil]-rapamicina.

Los compuestos preferidos para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento son rapamicinas 40-O-sustituidas en las X e Y son O; R2 es H; R4 es metilo y R1 se selecciona de hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo y aminoalquilo. Los ejemplos de compuestos preferidos incluyen 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina (es decir, SDZ RAD, cuya estructura se muestra en la Fig.7), 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-[2-(2hidroxi)etoxi]etil-rapamicina y 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina. La propia rapamicina (es decir, el compuesto que tiene la estructura de Fórmula I, en la que R1 y R2 son cada una –H;

R4

es metilo y cada una de X e Y son O) también pueden usarse en los procedimientos descritos en el presente documento. Definiciones

Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el de esta sección.

En este documento los artículos “uno” y “una” se usan para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

En una célula, una composición o procedimiento de tratamiento “inhibe” un proceso, tal como crecimiento celular, progresión del ciclo celular, proliferación o tumorigénesis, si después de administrar la composición a la célula o de emplear el procedimiento de tratamiento en la célula, el proceso se modifica en relación con el mismo proceso en una célula en la que no se ha administrado la composición o en la que no se ha empleado el procedimiento de tratamiento. Por ejemplo, si en una célula el nivel de proliferación disminuye después de la administración de una composición que comprende SDZ RAD, en comparación con el nivel de proliferación en una célula en la que no se administra la composición, entonces la composición inhibe la proliferación en la célula.

En un mamífero, una composición o procedimiento de tratamiento “inhibe” un proceso, tal como crecimiento tumoral, establecimiento de un tumor, una respuesta linfoproliferativa o rechazo de injerto, si después de administrar la composición al mamífero o emplear el procedimiento de tratamiento en el mamífero, el proceso disminuye en cantidad o magnitud en relación con el mismo proceso en un mamífero en el que no se administra la composición o en el que no se emplea el procedimiento de tratamiento. Por ejemplo, si el nivel de proliferación de linfocitos en un mamífero disminuye después de la administración de una composición que comprende SDZ RAD, en comparación con el nivel de proliferación de linfocitos en un mamífero al que no se administra la composición, entonces la composición inhibe una proliferación de linfocitos en el mamífero.

En una célula, una composición o procedimiento de tratamiento “induce” un proceso, tal como apoptosis o interrupción del ciclo celular, si después de administrar la composición a la célula o emplear el procedimiento de tratamiento en la célula, el nivel del proceso en la célula aumenta en relación con el proceso en una célula a la que no se administra la composición o en la que no se emplea el procedimiento del tratamiento. Por ejemplo, si el grado, nivel, o probabilidad de apoptosis en una célula aumenta después de la administración de una composición que comprende SDZ RAD, en comparación con el grado, nivel o probabilidad de apoptosis en una célula en la que no se administra la composición, entonces la composición induce la apoptosis en la célula.

Como se usa en el presente documento, la expresión “transportador farmacéuticamente aceptable” significa una composición química en la que puede combinarse un derivado de rapamicina O-alquilado y en el que, después de la combinación, puede usarse para administrar el derivado de rapamicina a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión, éster o sal “fisiológicamente aceptable” significa una forma de éster o de sal de un derivado de rapamicina O-alquilado que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica y que no es perjudicial para el sujeto al que se administra la composición.

Como se usa en el presente documento, la “administración parenteral” de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por el traspaso físico de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través del traspaso en el tejido. La administración parenteral por lo tanto incluye, pero sin limitación, la administración de una composición farmacéutica por inyección de la composición, por la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, por aplicación de la composición a través de una herida penetrante tisular no quirúrgica y similar. En particular, la administración parenteral puede incluir, pero sin limitación, inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal y técnicas de infusión de diálisis renal.

Un primer agente farmacológico y un segundo agente farmacológico se “administran conjuntamente” si los dos agentes se administran lo suficientemente próximos en el tiempo de manera que el periodo durante el cual el efecto farmacológico atribuible al primer agente que es al menos la mitad de su valor máximo se solapa con el periodo durante el cual el efecto farmacológico, atribuible al segundo agente, es al menos la mitad de su valor máximo. Los agentes administrados conjuntamente pueden administrarse en una sola composición que contiene los agentes o puede administrarse en composiciones separadas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “inducción de la apoptosis” significa un proceso que causa que una célula comience o acelere el proceso de muerte celular programada.

Un trastorno se “alivia” si se reduce la gravedad del trastorno o uno de sus síntomas o la frecuencia con la que el paciente experimenta el trastorno o uno de sus síntomas.

Un tratamiento “inhibe” un trastorno si la aparición del trastorno o uno de sus síntomas se retrasa o previene, con respecto a su aparición en ausencia del tratamiento. Descripción

La presente invención se refiere a un procedimiento para usar un derivado de rapamicina O-alquilado para aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo en un mamífero. Los trastornos linfoproliferativos que pueden aliviarse o inhibirse usando el procedimiento descrito en el presente documento incluyen trastornos linfoproliferativos postrasplante (TLPT), linfomas y otros trastornos. Este procedimiento comprende administrar a un mamífero una cantidad suficiente de un derivado de rapamicina O-alquilado para inhibir el trastorno. En pacientes que padecen trastorno linfoproliferativo y rechazo de injerto, puede administrarse una cantidad del derivado suficiente para aliviar o inhibir tanto el trastorno como el rechazo de injerto. Por ejemplo, tanto el rechazo de un injerto (es decir, un tejido u órgano trasplantado) como un TLPT pueden aliviarse simultáneamente.

Los TLPT incluyen un amplio espectro de trastornos linfoproliferativos, que varía desde una hiperplasia linfoide atípica policlonal a un linfoma monoclonal de células B claramente maligno. En la técnica se han descrito ejemplos de dichos trastornos (por ejemplo Morrison y col., 1994, Am. J. Med. 97: 14-24; Warnke y col., 1995, AFIP Fascicle 14: 531-535; Curtis y col., 1999, Blood 94: 2208-2216; Harris y col., 1997, Semin. Diagn. Path. 14: 8-14) y el experto en la materia puede identificarlos.

Una clase de trastornos linfoproliferativos para los que son útiles los procedimientos descritos en el presente documento, son aquellos trastornos que se caracterizan por la infección de linfocitos por el virus de Epstein-Barr (VEB). La proliferación de linfocitos infectados por el VEB es un agravante frecuente de la terapia inmunosupresora y por lo tanto algunas veces ocurre durante la inmunosupresión asociada con la prevención del rechazo de injerto, con quimioterapia relacionada con cáncer o con otras intervenciones médicas inmunosupresoras. Adicionalmente, la proliferación de linfocitos infectados por VEB puede acelerarse en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes que padecen SIDA u otros trastornos inmunes. Los derivados de rapamicina O-alquilados descritos en el presente documento pueden usarse antes, después o durante el tratamiento de uno de estos trastornos

o tratamientos que afectan al sistema inmune. Por ejemplo, para inhibir o prevenir la proliferación de linfocitos durante la terapia inmunosupresora, a un paciente que se somete a terapia inmunosupresora se le puede administrar, en primer lugar (es decir, minutos, horas, días o semanas de antemano) uno o más derivados de rapamicina O-alquilados (incluyendo rapamicina). Durante el ciclo de la terapia inmunosupresora, uno o más derivados de rapamicina O-alquilados (incluyendo rapamicina) pueden administrarse conjuntamente(es decir, administrarse estrechamente en el tiempo o de manera alternativa en una sola composición o en composiciones separadas) para disminuir o prevenir la proliferación de linfocitos durante la terapia. Antes de la terapia, no es necesario administrar el mismo el derivado (o derivados), si lo hubiere. De manera similar, a un paciente que se somete a terapia inmunosupresora, también se le puede administrar (o en lugar de eso) uno o más derivados de rapamicina O-alquilados (incluyendo rapamicina), para aliviar, inhibir o prevenir la proliferación de linfocitos posterapia y los síntomas asociados con la misma.

Un procedimiento particular, incluido dentro del ámbito de la invención, comprende administrar SDZ RAD a un ser humano antes del trasplante de un tejido (es decir, un aloinjerto

o un xenoinjerto) dentro o sobre el cuerpo del ser humano. Dicha administración puede ocurrir antes, durante o después del trasplante o en cualquier combinación de estos. Como ejemplo, SDZ RAD puede administrarse a un paciente humano antes, durante y después de recibir un trasplante alogénico renal. Otros ejemplos de trasplantes incluyen trasplantes alogénicos de corazón, riñón e hígado, válvulas cardiacas, injertos vasculares, injertos de piel, injertos de duramadre, injertos de pericardio, injertos de cartílago e implantes y trasplantes xenogénicos.

Otro tipo de trastorno linfoproliferativo que puede asociarse, pero frecuentemente no, con el trasplante de tejidos es el cáncer linfático, incluyendo linfomas y leucemias linfocíticas. Las leucemias linfocíticas incluyen trastornos tales como leucemias linfocíticas agudas y crónicas. Los linfomas abarcan una amplia diversidad de cánceres caracterizados por proliferación linfocítica. Los ejemplos de linfomas incluyen linfomas relacionados con el SIDA, linfoma de Hodgkin (denominado a veces enfermedad de Hodgkin), linfoma no Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma difuso de célula grande, linfoma de linfocitos T y linfoma cutáneo de linfocitos T.

Independientemente de si a un paciente se le ha diagnosticado una enfermedad o muestra síntomas de una enfermedad, puede ser deseable inhibir la proliferación linfocítica en un paciente portador de linfocitos infectados por el VEB, particularmente si se espera que el paciente se someta a terapia inmunosupresora o si el paciente corre el riesgo de desarrollar una enfermedad inmunocomprometedora particular. Dichos pacientes pueden identificarse aislando linfocitos procedentes del paciente y evaluando la presencia o ausencia de todo o parte del genoma del VEB en estos linfocitos. Si se detecta el VEB, puede indicarse la administración de rapamicina o de un derivado de rapamicina O-alquilado.

Los procedimientos descritos en el presente documento comprenden administrar a un mamífero rapamicina o un derivado de rapamicina O-alquilado, para inhibir o aliviar un trastorno linfoproliferativo. La forma exacta en la que se administra el compuesto no es crítica, en la técnica se conocen numerosas composiciones y formas farmacéuticas, transportadores y excipientes farmacéuticamente aceptables. Una formulación administrada a un mamífero puede contener, como único agente activo, el derivado de rapamicina o este puede mezclarse con uno o más de otros agentes activos (por ejemplo, un agente inmunosupresor tal como azatioprina, ácido micofenólico tal como mofetil micofenolato, inmunoglobulina Rho(D), ciclosporina, tracolimus, cisplatino, una ciclosfofamida y leflunomida).

La presente invención incluye la preparación y el uso de medicamentos y composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los derivados de rapamicina O-alquilados (incluyendo rapamicina) como un principio activo. Dicha composición farmacéutica puede comprender el principio activo solo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto o la composición farmacéutica puede comprender el principio activo y uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables, uno o mas ingredientes adicionales, o alguna combinación de estos. Como se ha descrito en alguna otra parte de la presente divulgación, la administración a un sujeto, de una de estas composiciones farmacéuticas, es útil para inhibir la proliferación de linfocitos en el sujeto. El principio activo puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un éster o una sal farmacéuticamente aceptable, tal como en combinación con un catión o anión fisiológicamente aceptable, como se conoce en la técnica.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado a partir de ahora en la técnica de la farmacología. En general, dichos procedimientos de preparación incluyen la etapa de asociar el principio activo con un transportador o con uno o más de otros ingredientes accesorios y después, si es necesario o deseable, dar forma o envasar el producto en una monodosis o multidosis deseada.

Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética en seres humanos, el experto en la materia entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para administrar a otros mamíferos.

Se conoce bien la modificación de las composiciones farmacéuticas, adecuadas para la administración en seres humanos, para hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración en animales y el farmacéutico veterinario, habitualmente cualificado, puede diseñar y realizar dicha modificación simplemente con experimentación, si la hubiere, habitual. Los sujetos para los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, seres humanos y otros primates y mamíferos que incluyen mamíferos importantes desde un punto de vista comercial tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos y perros.

Las composiciones farmacéuticas que son útiles en los procedimientos de la invención pueden prepararse, envasarse o comercializarse en formulaciones adecuadas para la administración oral rectal vaginal parenteral, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica u otra vía de administración, aunque la administración parenteral se contempla como el procedimiento eficaz para administrar más fácilmente los derivados de rapamicina con el fin de aliviar, inhibir o prevenir trastornos linfoproliferativos.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o comercializarse a granel, como una dosis unitaria individual o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad específica de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad de principio activo es generalmente igual a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del principio activo, del transportador farmacológicamente aceptable y de cualquiera de los ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, talla y afección del sujeto tratado y además dependiendo de la vía en la que se administre la composición. Como ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) del principio activo. Una dosis unitaria de una composición farmacéutica de la invención comprenderá generalmente de aproximadamente 50 microgramos a aproximadamente 50 miligramos del principio activo, y preferentemente comprende de aproximadamente 500 microgramos a aproximadamente 10 miligramos del principio activo. En general, los derivados de rapamicina O-alquilados pueden usarse en cantidades del mismo orden de magnitud al de las cantidades de rapamicina actualmente usadas (por ejemplo, 1-5 miligramos por dosis unitaria).

Además del principio activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender por otro lado uno o más agentes adicionales farmacéuticamente activos. Los agentes adicionales particularmente contemplados incluyen particularmente agentes inmunosupresores, tales como azatioprina, un ácido micofenólico tal como mofetil micofenolato, inmunoglobulina Rho(D), ciclosporina, tracolimus, cisplatino, una ciclofosfamida y leflunomida.

Las formulaciones de liberación controlada o prolongada de una composición farmacéutica de la invención pueden prepararse usando tecnología convencional.

Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral comprenden el principio activo combinado con un transportador farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para la administración en embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse o comercializarse en formas farmacéuticas unitarias, tales como en ampollas, en envases multidosis que contienen un conservante, o en dispositivos de un solo uso para la auto inyección o inyección realizada por un médico. Para la administración parenteral, las formulaciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones y emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación prolongada o biodegradables. Además dichas formulaciones pueden comprender uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una realización de una formulación para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir en polvos o gránulos) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo agua estéril sin pirógeno) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse, envasarse o comercializarse en forma de una suspensión o solución acuosa estéril inyectable u oleaginosa. Esta suspensión o solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Dichas formulaciones estériles inyectables pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no tóxico aceptable administrado por vía parenteral, tal como, por ejemplo, agua o 1,3-butano diol. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónica y aceites no volátiles tales como mono-o di-glicéridos. Otras formulaciones útiles que pueden administrase por vía parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación prolongada o implante pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero soluble en pequeñas cantidades o una sal soluble en pequeñas cantidades.

Como se usa en el presente documento, “ingredientes adicionales” incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes, diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes colorantes, conservantes, composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleaginosos; agentes de suspensión, agentes de dispersión o humectantes; agentes emulsionantes; demulcentes; tampones; sales, agentes espesantes; cargas; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Otros “ingredientes adicionales” que pueden incluirse en la composición farmacéutica de la presente invención se conocen y se describen en la técnica, por ejemplo en Genaro, ed., 1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse para suministrar a un sujeto una dosis de entre 10 microgramos por kilogramo de peso corporal por día y 1,5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día y, preferentemente para suministrar de entre 20 y 700 microgramos por kilogramo de peso corporal por día. En seres humanos adultos, se contempla la administración de 0,1 a 50 miligramos por día de rapamicina

o un derivado de rapamicina O-alquilado y preferentemente 1 a 10 miligramos por día del principio activo.

Se entiende que el médico o veterinario normalmente experto determinará y prescribirá fácilmente una cantidad eficaz del compuesto para aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo en el sujeto. Procediendo de esta manera, el médico o veterinario pueden, por ejemplo, prescribir en primer lugar una dosis relativamente baja, aumentando posteriormente la dosis hasta obtener una respuesta apropiada. Sin embargo, también se entenderá, que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular dependerá de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el tiempo de administración y la vía de administración, la velocidad de excreción cualquier combinación del fármaco y la gravedad del trastorno linfoproliferativo a tratar o inhibir.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención y un material didáctico. Como se usa en el presente documento, un “material didáctico” incluye una publicación, una nota, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que se use para comunicar la utilidad de la composición farmacéutica de la invención para inhibir la proliferación de linfocitos o aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo. El material didáctico también puede describir, por ejemplo, una dosis apropiada de la composición farmacéutica de la invención. El material didáctico del kit puede, por ejemplo, fijarse al envase que contiene una composición farmacéutica de la invención o embalarse junto con un envase que contiene la composición farmacéutica. Como alternativa, el material didáctico puede embalarse individualmente del envase con la intención de que el receptor use cooperativamente el material didáctico y la composición farmacéutica.

En otra realización, la invención incluye un procedimiento para usar un derivado de rapamicina O-alquilado tal como SDZ RAD o rapamicina para inhibir el establecimiento de un tumor en un mamífero. Este procedimiento implica administrar a un mamífero que presenta un primer tumor, una cantidad del derivado de rapamicina suficiente para inhibir el establecimiento de un segundo tumor derivado del primer tumor en el mamífero. Un mamífero a tratar con un derivado de rapamicina O-alquilado para este fin puede tener sustancialmente cualquier tipo de tumor primario tal como un tumor cerebral, renal, hepático, mamario o de ovario. Otras actividades antitumorales representativas que puede presentar un derivado de rapamicina O-alquilado tal como SDZ RAD incluye la inhibición de tumorigénesis, inhibición de metástasis, inhibición del crecimiento celular tumoral, inhibición de proliferación celular tumoral e inducción de muerte celular tumoral.

En realizaciones alternativas, la presente invención se refiere a procedimientos para usar un derivado de rapamicina O-alquilado tal como SDZ RAD para influir en procesos biológicos y provocar respuestas terapéuticas relacionadas con actividades antiproliferativas antitumorales e inmunosupresoras que muestra este compuesto. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, el uso del derivado para inducir apoptosis, inhibir la proliferación celular,

o para fines antitumorales, anti-TLPT o inmunosupresores. Por lo tanto, el derivado puede usarse para inhibir (es decir, mejorar, prevenir o reducir la gravedad, frecuencia, velocidad o grado) trastornos asociados con estos procesos. Como agentes antiproliferativos eficaces, los derivados de rapamicina O-alquilados pueden ser útiles para aliviar sustancialmente cualquier trastorno que se caracterice por una proliferación celular supra-normal o de otra manera inapropiada. Los ejemplos de trastornos incluyen trastornos autoinmunes, alergias, otros trastornos hiper-inmunes, ateroesclerosis.

La presente divulgación incluye un procedimiento para identificar un agente que es útil para aliviar o inhibir un trastorno linfoproliferativo en un mamífero. Este procedimiento comprende transformar un linfocito B exponiéndole al VEB. Dicha exposición puede realizarse usando reactivos y técnicas convencionales y empleando cualquier cepa del VEB disponible que pueda transformar linfocitos. Los linfocitos B útiles para este procedimiento pueden obtenerse, por ejemplo, de un donante humano. Los linfocitos B transformados se inyectan en un ratón que padece una inmunodeficiencia severa combinada, tal como un ratón EISC. Los linfocitos transformados pueden inyectarse en el ratón por vía intraperitoneal o subcutánea. Preferentemente, la inyección del linfocito B transformado es subcutánea. Al ratón también se le administra un agente que posiblemente muestra una actividad anti-linfoproliferativa. El crecimiento tumoral en el ratón se controla durante un periodo de tiempo seleccionado, tal como durante aproximadamente 21 días. La inhibición del desarrollo o crecimiento tumoral es una señal de que el agente muestra actividad anti-linfoproliferativa.

En una realización del procedimiento, a un ratón EISC se le administra un posible agente anti-linfoproliferativo antes de la inyección de un linfocito B transformado. Como ejemplo, puede administrarse un agente tal como SDZ RAD a un ratón EISC a una dosis de 5 miligramos por kilogramo por día durante al menos aproximadamente 10 días, y preferentemente, al menos aproximadamente 3 días antes de inyectar al ratón los linfocitos B transformados.

En otra realización del procedimiento, a un ratón EISC se le administra un posible agente anti-linfoproliferativo después de la inyección de un linfocito B transformado y el desarrollo del tumor resultante en el ratón. En esta realización la inyección de los linfocitos B transformados viene precedida de al menos aproximadamente 21 días de control del crecimiento del tumor resultante en el ratón y comenzado la administración de un posible agente anti-linfoproliferativo en el ratón aproximadamente después de 21 días. Como ejemplo, puede administrarse un agente tal como SDZ RAD a un ratón EISC a una dosis de 5 miligramos por kilogramo por día comenzando aproximadamente 21 días después de la inyección.

Usando los procedimientos descritos en el presente documento, la valoración de un agente que tiene una actividad anti-linfoproliferativa puede basarse en la evidencia de la regresión tumoral (es decir, una disminución del tamaño del tumor en relación con el inicio del tratamiento con el agente), erradicación del tumor y la ausencia de un segundo tumor en el ratón inyectado. Así mismo, un agente no tiente actividad anti-linfoproliferativa sustancial si el ratón inyectado muestra crecimiento tumoral (es decir, un aumento del tamaño del tumor) o el desarrollo de un segundo tumor o ambos.

En otras realizaciones, el procedimiento descrito en el presente documento para identificar un agente anti-linfoproliferativo también es útil para identificar un agente que puede inhibir el establecimiento de un tumor (por ejemplo, que pueda inhibir la dispersión o metástasis de un tumor linfático) en un mamífero. Por ejemplo, un agente que inhibe el establecimiento de un tumor en un mamífero puede identificarse exponiendo un linfocito B al VEB, de manera que se genera un linfocito B transformado, administrando el agente a un ratón que tiene una inmunodeficiencia combinada grave, tal como un ratón EISC, inyectar el linfocito B transformado al ratón y controlar el crecimiento tumoral en el ratón durante un periodo de tiempo seleccionado (por ejemplo, al menos aproximadamente 21 días). Un agente que puede inhibir el establecimiento de un tumor causará uno o más de regresión del tumor, erradicación del tumor y ausencia de un segundo tumor en el ratón inyectado. Un agente que no puede inhibir el establecimiento de un tumor no tendrá efectos observables en el ratón inyectado en términos de crecimiento del tumor y desarrollo de tumores secundarios.

En referencia a los procedimientos descritos anteriormente, los procedimientos para medir el crecimiento o la regresión tumoral, la inyección de los linfocitos B y la determinación de las dosificaciones apropiadas en las que se ensayan los posibles agentes anti-TLPT, se encuentran dentro de la habilidad de un experto en la materia de la inmunofarmacología. Tras la lectura de la presente divulgación y el examen de las particularidades del Ejemplo 1 proporcionado en el presente documento, para el experto habitual en la materia es una simple cuestión usar los procedimientos de la presente invención para identificar compuestos que muestren actividad anti-linfoproliferativa o que puedan inhibir el establecimiento de un tumor.

A continuación se describe la invención con referencia a los siguientes Ejemplos. Ejemplo 1 El SDZ RAD inhibe el crecimiento, in vitro e in vivo, de linfocitos B humanos transformados con el VEB

Los experimentos presentados en este ejemplo demuestran que el SDZ RAD es un potente agente anti-rechazo, anti-linfoproliferativo, y representa una nueva estrategia para la inhibición y el tratamiento de trastornos linfoproliferativos postrasplante (TLPT).

A continuación se describen los materiales y procedimientos usados en los experimentos presentados en este Ejemplo.

La mayoría de las líneas celulares usadas en este estudio eran líneas de células B linfoblastoides obtenidas por infección in vitro de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con VEB. Las líneas celulares A1 y A2D6 se obtuvieron de individuos normales, sanos. Las líneas celulares 15A y 20A se obtuvieron de dos pacientes diferentes con un linfoma de células B de grado bajo con aglutininas frías monoclonales (Silberstein y col., 1991, Blood 78: 2372-2386). Las dos líneas con aglutininas secretadas en frío se encontraron en el suero de pacientes con la misma especificidad que las aglutininas en frío (Silberstein y col., 1991, Blood

78: 2372-2386). Adicionalmente, la línea celular 20A mostró anomalías citogenéticas observadas en linfomas de grado bajo (48, XX, +3, +12, de acuerdo con Silberstein y col., 1991, Blood 78: 2372-2386). La línea de células B de LCL se obtuvo de un paciente con un trastorno cutáneo progresivo linfoproliferativo de células T (Zhang y col., 1996, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 93: 9148-9153). BC-1 deriva de un linfoma de células B de derrame peritoneal (PEL) y, además del VEB, contiene el virus HHSV8 (Cesarman y col., 1995, Blood 86: 27082714). Las otras 3 líneas celulares usadas como controles en el ensayo de inhibición del crecimiento in vitro eran líneas de linfocitos T VLTH-I (+), ATL-2 (Maeda y col., 1985, Exp. Med. 162: 2169-2174); C10MJ2 (Popovic y col., 1983, Science 219: 856-859); y HUT102B (Poiescz, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7415-7419; Bunn y col, 1996, J. Cell. Biochem. Supl 24: 12-23) derivadas de pacientes con leucemia/linfoma de linfocitos T adultos (LLTA). Se demostró que éstas no eran sensibles a SDZ RAD ni a la rapamicina, macrólido inmunosupresor relacionado (Zhang y col., 1999, Leukemia Res.23: 373-384). Todas las líneas celulares se mantuvieron en incubadoras con humedad a 37ºC en una atmósfera que contenía CO2 al 5% en medio convencional: Medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) complementado con suero bovino fetal termo-inactivado al 10% (v/v) (BioWhittaker, Walkersville, MD), mezcla de penicilina / estreptomicina / fungizona al 1% (Gibco BRL) y Lglutamina 2 milimolar (Gibco BRL).

Se realizó un ensayo para evaluar la inhibición del crecimiento celular in vitro por SDZ RAD como se describe (Zhang y col., 1999, Leukemia Res.23: 373-384; Zhang y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9148-9153). En resumen, se cultivaron líneas celulares durante 32 horas por triplicado a 2 x 104 células por pocillo en presencia de diversas concentraciones de SDZ RAD (Novartis Pharma, Basel). Después de estimular las células con 3H-timidina 0,5 microcurios (New England Nuclear, Boston, MA) y cultivar las células durante las siguientes 18 horas, se midió la incorporación del isótopo en las células. Los resultados de los ensayos de proliferación se expresaron como la radiactividad promedio de cultivos triplicados. La desviación típica en los triplicados fue <15%. Detección de la inhibición del ciclo celular y apoptosis.

Las líneas celulares a examinar se cultivaron con varias concentraciones de SDZ RAD (de 0 a 10 nanomolar) durante 24-48 horas. Las células se lavaron con DPBS y solución de tinción (pH 7,2) que contenía PEG 6000 al 3%, 50 microgramos por mililitro de ADN del fluorocromo yoduro de propidio (PI; Calbiochem, San Diego, CA), anexina V-FITC como se describe (Douglas y col., 1998, Cytometry 32: 57-65) TRITON™ X al 0,1% (v/v) (Sigma, St. Louis, MO), tampón de citrato 4 milimolar, pH 7,8 y 360 unidades por mililitro de RNasa A (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) durante 30 minutos a 37ºC. Después, se añadió una solución salina pH 7,2 (PEG 6000 al 3% p/v ,PI 50 microgramos por mililitro, TRITON™ X al 0,1 % v/v y NaCl 0,4 molar ) y las células incubaron a 4ºC en la oscuridad durante 1 hora antes de realizar el análisis de citometría de flujo, como se ha descrito (Douglas y col., 1998, Cytometry 32: 57-65; Kawamata y col., 1998, Blood 91: 561-569; Pepper y col., 1998, Leuk.

Res. 22: 439-444).

Se adquirieron ratones EISC inmunodeficientes de cinco a siete semanas de edad (C.B-17 e ICR) en Taconic (Germantown, NJ) y se alojaron en la University of Pennsylvania Animal Facility libres de patógenos en una unidad de flujo de aire laminar con alimento y agua estéril. En los estudios de toxicidad, además de los ratones EISC, se usaron ratones BALB/c endogámicos de 5-7 semanas de edad (Taconic).0

El establecimiento y la realización de pases de los tumores xenotrasplantados se realizó como se ha descrito (Douglas y col., 1998, Cytometry 32: 57-65; Kawamata y col., 1998, Blood 91: 561-569; Pepper y col., 1998, Leuk. Res. 22: 439-444). Para disminuir macrófagos y células NK y potenciar la implantación del tumor, los ratones EISC recibieron una inyección, por vía intraperitoneal, de 30-45 mg por kilogramo de etopósido (Bedford Laboratories, Bedford, OH) 4 días antes de realizar el implante de las líneas de células B VEB+ humanas (Visonneau y col., 1998, Am. J. Path. 152: 1299-1311). Diez millones de células de cada línea empleada (véanse los resultados) se inocularon en los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea en 200 microlitos de Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS; BioWhittaker, Walkersville, MD). Después de la inyección de las células, a las 3-5 semanas, se desarrollaron ascitis o tumores subcutáneos palpables.

Los experimentos de tratamiento tumoral e inhibición del crecimiento se realizaron usando fragmentos de los tumores subcutáneos establecidos (Pasqualucci y col., 1995, Blood

85: 2139-2146, Visonneau y col., 1998, Am. J. Path. 152: 1299-1311). Con este fin, se anestesió a los ratones con KETALAR™ (ketamina, Parke-Davis, Morris Plains, NJ) por inyección intraperitoneal de 100 mg por kilogramo. A continuación, el tumor primario se extirpó asépticamente y se liberó del tejido, graso y conectivo, necrótico y se dividió en trozos pequeños de tamaño aproximadamente igual y se inyectó de 3-4 trozos por ratón por vía subcutánea. El tratamiento de los tumores establecidos con SDZ RAD comenzó cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 5 milímetros. En los experimentos de inhibición del crecimiento, el tratamiento se inició 3 días antes de la implantación del tumor. En todos los experimentos, el volumen del tumor se determinó a partir de la ecuación: volumen = 0,4 ab2, en la que a y b indican diámetro del tumor grande y pequeño, respectivamente. Los ratones trasplantados se controlaron para determinar el crecimiento tumoral durante un periodo de hasta 2 meses. Mediante una sonda, se administraron cinco miligramos por kilogramo de SDZ RAD una vez al día como se ha descrito (Schuurman y col., 1997, Transplantation 64: 32-5; Schuler y col. 1997, Transplantation 64: 36-42).

Se sacrificaron los ratones por exposición a FORANE™ (isoflurano, Ohmeda, Liberty Place, NJ) el día 29 en el estudio de toxicidad del fármaco, el día 40-55 en el estudio de inhibición de crecimiento tumoral o cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 2 centímetros de diámetro, o cuando apareció ulceración de la piel, signos de distrés respiratorio grave, debilidad o letargo. Con independencia de su aspecto, al final del estudio, se realizó la autopsia completa en todos los ratones. Los tumores y los órganos internos (bazo, hígado, pulmón, corazón, riñón, intestino delgado y grueso, médula ósea del hueso femoral) se fijaron en formalina al 10% (v/v), se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 0,4 micrómetros, y se transfirieron a portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los fragmentos tumorales representativos se tiñeron inmunohistoquímicamente mediante la técnica convencional del complejo estreptavidina-biotina usando reactivos disponibles en el mercado (Research Genetics, Huntsville, AL), anticuerpos: anti-CD20 (L-26) y PML-1 (ambos procedentes de DAKO, Carpintería, CA) y Ki67 (mib1; Immunotech, Westbrook, ME). El ARN codificado por el VEB (EBER-1) se detectó usando reactivos disponibles en el mercado.

A continuación se describen los resultados de los experimentos presentados en este Ejemplo. El SDZ RAD inhibe el crecimiento de células B VEB+ in vitro

Para determinar si el SDZ RAD puede inhibir la proliferación de células que imitan los TLPT, se cultivaron 6 líneas de células B VEB+ diferentes in vitro en presencia del fármaco a diversas concentraciones. Como control se usaron tres líneas de linfocitos T VLTH-I+ resistentes a SDZ RAD (Zhang y col., 1999, Leukemia Res., 23: 373-384). Como se muestra en la Fig. 1, todas líneas de células B VEB+ de tipo TLPT eran muy sensibles a SDZ RAD. Una dosis de SDZ RAD tan pequeña como 1 nanomolar produjo el 60-95% de inhibición del crecimiento en todas las líneas celulares. Este resultado fue comparable con la inhibición de linfocitos T normales estimulados (Schuurman y col., 1997, Transplantation 64: 32-5; Bohler y col., 1998, Transplant. Proc. 30: 2195-2197). Se observaron algunas diferencias sutiles en el grado de respuesta entre las líneas de células B VEB+. Las líneas derivadas de pacientes con linfomas de células B (15A, 20A y BC-1; véase Materiales y Métodos) y por lo tanto más parecidas a las formas avanzadas de TLPT, tendieron a mostrar un menor grado de inhibición (80-90%). La líneas celulares obtenidas de células B normales (es decir, que imitan los tipos menos avanzados de TLPT) se inhibieron más profundamente (90-100%). Las líneas celulares se estimularon durante 18 horas con timidina tritiada después de 32 horas de cultivo con SDZ RAD 0-10 nanomolar. El SDZ RAD bloquea la progresión del ciclo celular en células B VEB+

La rapamicina y, presumiblemente, los derivados de rapamicina O-alquilados tales como SDZ RAD, bloquean la progresión del ciclo celular en la etapa temprana en linfocitos T normales (Terada y col., 1993, J. Cell Physiol. 154: 7-15; Flanagan y col., 1993, Ann. N.Y.

Acad. Sci. 696: 31-37). Los datos de inhibición del crecimiento celular, medidos por los inventores, incorporando timidina (Fig. 1), sugieren que el SDZ RAD inhibe la progresión del ciclo celular en células B de tipo TLPT. Como se muestra en la Fig. 2, el SDZ RAD inhibe notablemente la progresión del ciclo celular en la fase temprana G0/G1 en todas las líneas de las células B de tipo TLPT investigadas: 20A, A1, A2D6 y LCL. El efecto fue dependiente de la dosis del fármaco y del tipo de línea celular. Mientras que dosis bajas de SDZ RAD (1-2 nanomolar) aumentaron el porcentaje de células en G0/G1 por 5-25, la dosis ensayada más alta (10 nanomolar) dio como resultado un aumento del 10-70%. Los porcentajes de células en las fases tardías del ciclo celular (G2-M y S) fueron disminuyendo proporcionalmente. La línea celular A1 y, en un menor grado, A2D6 fue particularmente sensible a SDZ RAD. Se cultivaron cuatro líneas de células B VEB+ durante 48 horas con SDZ RAD 0-10 nanomolar, se marcaron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo. SDZ RAD aumenta la apoptosis en células B VEB+

Estudios previos habían demostrado que los macrólidos inmunosupresores representados por rapamicina pueden inducir o potenciar la apoptosis estimulada por otros agentes (Gottschalk y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7350-7354; Muthukkumar y col., 1995, Transplantation 60: 264-270; Shi y col., 1995, Cancer Res. 55: 1982-1988; Hosoi y col., 1999, Cancer Res.59: 886-894). Para determinar si el SDZ RAD influye en la tasa apoptótica en células de tipo TLPT, los inventores ensayaron la expresión superficial de anexina V inducida por apoptosis, por citometría de flujo, en las líneas celulares 20A, A1, A2D6 (Fig. 3). Incluso la dosis más baja de SDZ RAD (1 nanomolar) aumentó notablemente el porcentaje de células apoptóticas en todas las líneas celulares, con algunas diferencias, semejantes a los datos de crecimiento celular y de inhibición del ciclo celular. En la línea A 1 más sensible, SDZ RAD dio como resultado aproximadamente un aumento del 60% en el número de células apoptóticas del 10 al 16%. En la línea A2D6, esto condujo a un aumento del 11% y en la línea 20A al aumento del 12%. En la dosis más alta (10 nanomolar), SDZ RAD condujo a aproximadamente un aumento del 240% en la línea A1 y un aumento del 45% en las líneas A2D6 y 20A. Estudio de toxicidad

Estudios previos habían demostrado que una dosis eficaz mínima de SDZ RAD en ratas era de 5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día y >5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día en el modelo de trasplante de riñón y corazón, respectivamente, cuando se usó SDZ RAD como un solo agente inmunosupresor (Schuurman y col., 1997, Transplantation 64: 32-5; Schuler y col. 1997, Transplantation 64: 36-42). Para determinar si la exposición prolongada a SDZ RAD no es tóxica para los ratones, se trató un grupo de ratones BALB/c normales inmunocompetentes e inmunodeficientes con la dosis anterior de SDZ RAD durante 28 días. En este estudio se usaron diez ratones tratados y cinco de control, no tratados. Después se evaluó a los ratones EISC trasplantados con linfomas de tipo TLPT humano y tratados con SDZ RAD hasta un máximo de 55 días. En este experimento se evaluaron siete ratones EISC tratados y cinco de control no tratados. Después de recibir la dosis final del fármaco, se realizó la eutanasia de todos los ratones y se extirparon los siguientes órganos para la evaluación histopatológica con objeto de investigar los posibles efectos tóxicos: hígado, bazo, riñón, intestino delgado, intestino grueso, corazón, pulmón y médula ósea del hueso femoral.

Ninguno de los ratones tratados mostró ningún signo visible de toxicidad al fármaco. El aumento del crecimiento y del peso fue el mismo para el grupo tratado con SDZ RAD y el de control. La evaluación microscópica de los órganos de todos los ratones tratados y no tratados no reveló cambios patológicos que podrían atribuirse al fármaco. Se llega a la conclusión, por lo tanto, que la exposición prolongada a SDZ RAD a la dosis de 5 miligramos por kilogramo de peso corporal por día no tiene efectos adversos en los ratones tratados, independientemente de su estado inmune. Establecimiento del modelo de xenotrasplante de linfoma humano de tipo TLPT en ratones EISC.

En estos experimentos, a los ratones se les inyectó líneas de células B VEB+ mediante dos vías diferentes: intraperitoneal y subcutánea. En el modelo de tumor intraperitoneal, se inocularon, por vía intraperitoneal, a ratones EISC (5 por grupo) aproximadamente 107 células por línea procedentes de cuatro líneas celulares: 15A, 20A, A2D6 y BC-1. Después de 21-35 días, todos los ratones desarrollaron la enfermedad fatal con ascitis y síntomas de debilidad o letargo. La autopsia reveló abundantes infiltrados tumorales incorporándose en la pared peritoneal, hígado, bazo y riñones. El examen microscópico de los tumores mostró un gran linfoma celular con un modelo de crecimiento infiltrado, alta tasa mitótica, necrosis celular focal y simple y cierto grado de diferenciación plasmacitoide. Los focos del linfoma también estaban presentes en órganos distantes tales como pulmones y médula ósea indicando diseminación hematógena.

En el modelo subcutáneo, se inyectó a los ratones (también 5 por grupo) aproximadamente 107 células procedentes de las líneas 15A, 20A y A1. Después de 21-32 días, todos los ratones desarrollaron tumores en el sitio de implante. La autopsia reveló tumores subcutáneos que invadían el músculo esquelético adyacente y la piel. No hubo una gran evidencia de diseminación distante del tumor. El examen microscópico reveló el mismo tipo de linfoma de grado alto, como en el modelo realizado por vía intraperitoneal. Los órganos internos distantes principalmente el hígado y los pulmones mostraron ocasionalmente pequeños focos tumorales. Esto se produjo solamente cuando el linfoma subcutáneo alcanzó un tamaño relativamente grande de al menos 1,5 cm de diámetro. La tinción inmunohistoquímica confirmó que los tumores derivaban de linfocitos humanos B VEB+ implantados. Las imágenes de la línea 20A mostradas en la Figura 4A-D son representativas para todas las tres líneas celulares.

Prácticamente todas las células del linfoma fueron positivas para el marcador de células B humanas CD20. La mayoría (50-80%) fueron positivas para el antígeno Ki-67, relacionado con el ciclo celular, consecuente con su elevada tasa proliferativa. La tinción para el antígeno relacionado con VEB, EBER1 fue universalmente positiva (100% de las células). Del 20 al 50% de las células expresaron la proteína de membrana latente 1 (PML-1) asociada al VEB. Estos resultados confirman que el linfoma humano de células VEB+ representan tumores correspondientes al tipo monomórfico de TLPT.

El modelo de linfoma subcutáneo tenía algunas ventajas sobre el modelo peritoneal. En primer lugar, incluso pudieron identificarse fácilmente pequeños linfomas. En segundo lugar, los linfomas de hasta 1,5 centímetros de diámetro permanecieron localizados lo que permitió la determinación del volumen tumoral total con gran precisión (Wasik y col., 1994, Am. J. Path.

144: 1089-1097). Por último, el tumor subcutáneo pudo transferirse simultáneamente a diversos ratones, implantando fragmentos de tejido tumoral, en lugar de una sola suspensión celular (Wasik y col., 1994, Am. J. Path. 144: 1089-1097; Pasqualucci y col., 1995, Blood 85: 2139-2146; Visonneau y col., 1998, Am. J. Path. 152: 1299-1311). Dicho implante produjo un rápido establecimiento de tumores con características de crecimiento muy similares, prácticamente en todos los ratones receptores (Wasik y col., 1994, Am. J. Path. 144: 10891097; Pasqualucci y col., 1995, Blood 85: 2139-2146; Visonneau y col., 1998, Am. J. Path. 152: 1299-1311). Por estas razones, se seleccionó el modelo subcutáneo para estudios posteriores. Tratamiento de tumores establecidos de células B VEB+

Para determinar el efecto in vivo del SDZ RAD en células de tipo TLPT, se implantaron tumores de las líneas celulares 15A, 20A y A1 en 7-15 ratones EISC por línea celular. El tratamiento se inició una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 5 milímetros, lo cual se corresponde con un volumen de 50 milímetros cúbicos. El SDZ RAD se administró diariamente por sonda a 5 miligramos por kilogramo, lo que representaba una dosis inmunosupresora no tóxica y eficaz (Schuurman y col., 1997, Transplantation 64: 32-5; Schuler y col. 1997, Transplantation 64: 36-42).

Como se muestra en la Fig. 5, el SDZ RAD tenía un profundo efecto inhibidor en el crecimiento de los tumores xenotrasplantados de tipo TLPT, con visibles diferencias en el grado de respuesta entre los tres tumores. En ratones con tumores 15A implantados, hubo un notable retraso del crecimiento tumoral, inducido por el fármaco, pero ninguna inhibición o regresión total del crecimiento tumoral. El día 21, el volumen tumoral medio era de aproximadamente 240 milímetros cúbicos en los ratones tratados y de 2720 milímetros cúbicos en los ratones de control, no tratados. Tan tarde como el día 38, tumores 15A en los ratones tratados alcanzaron únicamente aproximadamente 1000 milímetros cúbicos. El efecto del SDZ RAD en los tumores 20A era incluso más sorprendente. Mientras que el día 19, los tumores de control 20A mostraron el volumen medio de 1440 milímetros cúbicos, el promedio del tumor tratado sólo midió 50 milímetros cúbicos, que era igual al tamaño del tumor inicial. Adicionalmente, en 6 de los 10 ratones tratados, se observó una regresión significativa en el volumen tumoral. Por consiguiente, para este grupo, el día 53, el volumen medio tumoral era sólo <5 milímetros cúbicos.

El SDZ RAD demostró ser el más eficaz contra la línea celular A1. El día 21, el volumen medio de los tumores tratados era de 50 milímetros cúbicos, no mostrando ninguno de los tumores (0/8) evidencia alguna de crecimiento. El volumen medio de los tumores no tratados ese día fue de aproximadamente 1800 milímetros cúbicos. El tratamiento adicional dio como resultado una regresión uniforme en los 8 ratones. El día 53, el volumen tumoral medio disminuyó a <5 milímetros cúbicos y no pudo detectarse linfoma en 4 ratones, indicando una erradicación total del tumor. Los otros 4 ratones tenían linfoma residual confirmado microscópicamente. Cabe destacar que las diferencias en la eficacia in vivo de SDZ RAD contra los tumores 15A, 20A y A1 son parejas a las diferencias observadas en la proliferación (Fig. 1) y los otros ensayos in vitro (Figs. 2 y 3). Esta observación sugiere que el análisis celular in vitro es predictivo de la respuesta a SDZ RAD in vivo. Inhibición del establecimiento del tumor

Como SDZ RAD, cuando se usa como un agente inmunosupresor, se administra crónicamente a pacientes trasplantados, su impacto terapéutico principal sobre los TLPT puede ser inhibir su desarrollo en lugar de aliviar los casos clínicamente sintomáticos. Para ensayar si SDZ RAD puede inhibir el establecimiento de linfomas de tipo TLPT, se inició un tratamiento diario con 5 miligramos por kilogramo de peso corporal del fármaco 3 días antes del implante del tumor. Como se muestra en la Fig. 6, el SDZ RAD demostró ser extremadamente eficaz en este modelo. En tumores 15A, que son los menos sensibles a SDZ RAD (Fig. 5), el tratamiento con SDZ RAD retrasó profundamente el crecimiento tumoral, pero fue incapaz de inhibir el establecimiento del tumor. El día 25, los tumores tratados midieron como promedio 38 milímetros cúbicos, los no tratados, aproximadamente 1940 milímetros cúbicos. El día 45, el volumen medio del tumor tratado fue de 480 milímetros cúbicos. En los tumores 20A, 6 de 11 tumores no eran detectables el día 25; el volumen medio de los 5 restantes fue de 20 milímetros cúbicos. El tumor no tratado promedio midió 210 milímetros cúbicos ese día. El día 45, ninguno de los tumores tratados superó los 150 milímetros cúbicos, el tumor no tratado promedio midió aproximadamente 4200 milímetros cúbicos. Cinco ratones tratados no mostraron signos de tumor; la evaluación microscópica del sitio del implante no reveló células malignas. Por último, en los ratones A1 no se pudo detectar ningún tumor aún el día 29 en ninguno de los 8 ratones tratados; el tumor promedio en los ratones no tratados midió 580 milímetros cúbicos. El día 53 solamente 3 ratones mostraron pequeños (<5 milímetros cúbicos) linfomas confirmados histológicamente. Los 5 ratones restantes no mostraron pruebas de tumor.

Mientras que los agentes inmunosupresores convencionales fomentan el desarrollo de TLPT, el impacto de SDZ RAD y otros macrólidos sobre estos trastornos permanece indeterminado. Se observó que el SDZ RAD suprimía profundamente la proliferación de linfocitos in vitro, bloqueaba la progresión del ciclo celular y aumentaba la tasa apoptótica en células B VEB+ de tipo TLPT. En el modelo de xenotrasplante de ratón EISC in vivo, el SDZ RAD disminuyó notablemente el crecimiento o indujo la regresión de tumores de células B VEB+ establecidos. El fármaco erradicó o inhibió completamente el establecimiento del tumor en un subconjunto de los ratones tratados. Estos hallazgos indican que los macrólidos tales como SDZ RAD pueden ser eficaces en la inhibición y tratamiento de TLPT.

El SDZ RAD suprimió profundamente la proliferación in vitro, detuvo la progresión del ciclo celular en la fase G0/G1 temprana y aumentó la tasa apoptótica en células B VEB+ de tipo TLPT. En los ratones EISC xenotrasplantados con tres tumores de células B de tipo TLPT diferentes, el SDZ RAD inhibió notablemente el crecimiento de estos tumores, particularmente si se administró antes del implante del tumor. En los tumores A1 se consiguió la erradicación total de los tumores ya establecidos en 4 de 8 (4/8) ratones. En dos de las tres líneas ensayadas (20A y A1), el SDZ RAD inhibió completamente el establecimiento de tumores en aproximadamente el 50% de los ratones (5/11 y 5/8, respectivamente). La propiedad anti-tumor de células B VEB+ de SDZ RAD contrasta con los agentes inmunosupresores convencionales ciclosporina y tacrolimus, que recientemente se han sugerido para mejorar el crecimiento de células B VEB+, no sólo indirectamente suprimiendo una respuesta inmune contra tales células, sino también directamente protegiéndolas de los efectos de señales pro-apoptóticas (Beatty y col., 1998, Transplantation 65: 1248-1255.).

Los resultados de estos experimentos son particularmente alentadores debido a que las líneas 15A y 20A procedían de células de linfoma (Silberstein y col., 1991, Blood 78: 23722386) y, como tales, parecen corresponderse con la forma clínicamente agresiva, avanzada de TLPT. Es plausible, por lo tanto, que otras formas menos malignas de TLPT que comprenden la mayoría de los casos, puedan ser incluso más sensibles a SDZ RAD. El hecho de que la línea celular A1 obtenida de un individuo normal fuese más sensible que 15A y 20A a SDZ RAD respalda esta hipótesis.

Los datos presentados en este Ejemplo también sugieren que la monoterapia con SDZ RAD puede no ser suficiente para erradicar algunos tumores TLPT abiertamente malignos, establecidos y que la terapia de combinación usando tanto SDZ RAD (u otro derivado de rapamicina O-alquilado o rapamicina) como uno o más fármacos quimioterapéuticos convencionales pueden considerarse en el entorno clínico (Shi y col., 1995, Res. 55: 19821988; Miki y col., 1998, Transplant. Proc. 30: 1091-1092).

Aunque la inhibición del crecimiento celular, medida por incorporación de timidina (Fig. 1) y la progresión del ciclo celular (Fig. 2), parece ser el principal modo de acción de SDZ RAD sobre células B VEB+, los resultados descritos en el presente documento de que SDZ RAD también aumenta la tasa apoptótica en tales células (Fig. 3), sugiere que la muerte celular programada también puede ser un componente importante de la actividad antitumoral del fármaco. Este efecto pro-apoptótico puede ser particularmente importante en el tratamiento de tumores TLPT establecidos, en los que solamente la inhibición del crecimiento tumoral podría no ser suficiente para conseguir la regresión completa del tumor. La observación en el presente documento de que únicamente la exposición prolongada a SDZ RAD condujo a una regresión marcada o eliminación de muchos tumores (Fig. 5) sugiere que un tratamiento prolongado similar puede ser deseable para erradicar los TLPT establecidos.

Aunque las líneas de células B de tipo TLPT sensibles a SDZ RAD eran todas VEB+, el potencial papel, si la hay, de los virus en la mediación de esta sensibilidad no se comprende del todo. El VEB codifica o induce en las células diana varias proteínas capaces de activar las rutas de señalización de citocina (Rochford, y col., 1997, Viral Immunol 10: 183-195). La proteína vírica anclada a membrana denominada PML-1 es la mejor caracterizada y usa la ruta de señalización TRAF de la familia del receptor TNF (Mosialos y col., 1995, Cell 80: 389-399; Devergne y col., 1998, J. Virol. 72: 7900-7908; Liebowitz y col., 1998, New Eng. J. Med. 338: 1413-1421). Es interesante en este contexto que la señalización mediante CD40 que pertenece a la familia y comparte varias características con PML-1 incluyendo la señalización mediante la proteína TRAF3 (Eliopoulos y col., 1996, Oncogene 13: 2243-2254; Pullen y col., 1998, Biochemistry 37: 11836-11845) ha demostrado recientemente inhibirse mediante rapamicina (Sakata y col., 1999, Immunology Letters 68: 301-309). El análisis inmunohistoquímico indica que la PML-1 se expresa solamente por un subconjunto de células B VEB+, lo que sugiere que la PML-1 puede ser no crítica para el crecimiento de las células de tipo TLPT y su sensibilidad al SDZ RAD. El VEB codifica también otras dos proteínas de membrana relacionadas, denominadas PML-2A y PML-2B. Estas proteínas no parecen ser esenciales para el crecimiento in vivo de células B VEB+ (Rochford y col., 1997, Arch Virol 142: 707-720). Alternativamente, SDZ RAD podría inhibir la señalización mediada por citocinas inducidas por el VEB en las células diana, tales como TNF-alfa y TNF-beta (Rochford, y col., 1997, Viral Immunol 10: 183-195).

El SDZ RAD muestra una actividad inhibidora potente sobre las líneas de células B linfoblastoides VEB+ de tipo TLPT tanto in vitro como in vivo. El SDZ RAD inhibe profundamente la proliferación in vitro de tales células y detuvo la progresión de su ciclo celular en la fase temprana G0/G1. Además, el fármaco aumenta la tasa apoptótica de células B VEB+. In vivo, retrasa notablemente o inhibe completamente el crecimiento de células B VEB+ xenotrasplantadas a ratones EISC, particularmente cuando se administra antes del implante celular. El SDZ RAD es capaz de erradicar un tumor establecido en algunos casos. Este efecto parece ser específico de la línea celular y proporcional al efecto del fármaco observado in vitro.

En resumen, los datos presentados en este Ejemplo demuestran que el SDZ RAD tiene un potente efecto inhibidor sobre linfocitos B VEB+ in vitro e in vivo. Por lo tanto, puede ser eficaz en el tratamiento e inhibición de TLPT en pacientes trasplantados o en el tratamiento e inhibición de otros trastornos linfoproliferativos.

Se necesitan nuevas modalidades de tratamiento para inhibir el desarrollo y mejorar la tasa de curación de TLPT. Un fármaco anti-TLPT ideal desempeñaría un papel doble de inhibición del rechazo de injerto y, al mismo tiempo, inhibición del desarrollo y crecimiento de TLPT. Si a pesar del tratamiento se desarrolla TLPT, podría ser eficaz un aumento, en lugar de una disminución de la dosis del fármaco como se realiza actualmente con los fármacos inmunosupresores convencionales. Este enfoque de aumentar la dosis del fármaco tendría una ventaja adicional de no comprometer la supervivencia del injerto. Este Ejemplo presenta datos in vitro e in vivo que indican que SDZ RAD, un agente inmunosupresor macrólido, tiene el doble papel de agente anti-rechazo y agente anti-linfoproliferativo.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de un derivado de rapamicina que tiene la estructura química

   imagen1

   5 en la que X es (H, H) u O; Y es (H, OH) u O;

   R1

   se selecciona de alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, 10 alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo,

   dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R3)3 Si; R2

   se selecciona de -H, alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo,

   15 dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R3)3 Si; cada R3 se selecciona independientemente de -H, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo y fenilo; y bien R4 es metilo o R4 y R1 juntos forman un resto alquileno C2-5 para la preparación de un medicamento para aliviar un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano o para inhibir un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano con riesgo de desarrollar tal trastorno, en el

   20 que dicho trastorno linfoproliferativo se selecciona de un trastorno caracterizado por proliferación de linfocitos que se han infectado con un virus de Epstein-Barr y un trastorno linfoproliferativo maligno seleccionado de un trastorno linfoproliferativo postrasplante, un linfoma de células B abiertamente maligno monoclonal, un linfoma de Hodgkin, un linfoma de Burkitt, un linfoma de células B de derrame peritoneal y un linfoma de células B VEB+.

2. 2.

   El uso de la reivindicación 1, en el que el derivado de rapamicina se selecciona de 40-O-bencil-rapamicina, 40-O-(4’-hidroximetil)bencil-rapamicina, 40-O-[4’-(1,2 dihidroxietil)]bencil-rapamicina, 40-O-alil-rapamicina, 40-O-[3’-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2’-en-1’-il]-rapamicina, (2’E, 4’S)-40-O-(4’,5’-dihidroxipent-2’-en-1’-il)-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina, 40-O-[2-(2hidroxi)etoxi]etil-rapamicina, 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina, 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina, 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-metil-N’-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etileno-rapamicina, (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 28-O-metil-rapamicina, 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2’-ilcarbetoxamido)etil)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina y 40-O-[2-(4’5’-dicarboetoxi-1’,2’,3’-triazol-1’-il)-etil]-rapamicina.

3. 3.

   El uso de la reivindicación 1, en el que el derivado de rapamicina se selecciona de 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina,

   40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina y 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina.

4. 4.

   El uso de la reivindicación 1, en el que el derivado de rapamicina es 40-O-(2-hidroxi)etilrapamicina.

5. 5.

   El uso de la reivindicación 1, en el que el derivado de rapamicina se co-administra con un segundo agente farmacológicamente activo.

6. 6.

   El uso de la reivindicación 5, en el que el segundo agente es un agente inmunosupresor.

7. 7.

   El uso de la reivindicación 6, en el que el segundo agente se selecciona de azatioprina, un ácido micofenólico, inmunoglobulina Rho (D), ciclosporina, tacrolimus, cisplatino, una ciclofosfamida y leflunomida.

8. 8.

   El uso de la reivindicación 5, en el que el derivado de rapamicina y el segundo agente se tienen que administrar al paciente en una composición que comprende tanto el derivado de rapamicina como el segundo agente.

9. 9.

   El uso de la reivindicación 5, en el que el derivado de rapamicina se tiene que administrar al paciente al menos una hora antes de que se tenga que administrar el segundo agente al paciente.

10. 10.

    El uso de la reivindicación 5, en el que el derivado de rapamicina se tiene que administrar al paciente al menos una hora después de que se tenga que administrar el segundo agente al paciente.

11. 11.

    El uso de la reivindicación 1, en el que el trastorno linfoproliferativo maligno es un trastorno linfoproliferativo postrasplante.

12. 12.

    El uso de la reivindicación 1, en el que el trastorno linfoproliferativo maligno se selecciona de un linfoma de Hodgkin, un linfoma de Burkitt, un linfoma de células B abiertamente maligno monoclonal, un linfoma de células B de derrame peritoneal y un linfoma

    de células B VEB+.

13. 13.

    El uso de la reivindicación 1, en el que el paciente se está sometiendo a terapia inmunosupresora y el trastorno linfoproliferativo es un linfoma.

14. 14.

    El uso de la reivindicación 11, en el que el trastorno linfoproliferativo postrasplante es hiperplasia linfoide atípica policlonal.

    5
15. 15. El uso de la reivindicación 1, en el que la cantidad a administrar es de 10 microgramos 10 por kilogramo de peso corporal a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal.
16. 16. El uso de la reivindicación 1, en el que el derivado de rapamicina se tiene que administrar por vía parenteral al paciente.

    15 17. Un derivado de rapamicina que tiene la estructura química

    imagen1

    en la que

    X es (H, H) u O;

    Y es (H, OH) u O;

    20

    R1 se selecciona de alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo,

    hidroxialquilarilalquilo,

    dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo,

    alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R3)3 Si; R2

    se selecciona de -H, alquilo, tioalquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R3)3 Si; cada R3 se selecciona independientemente de -H, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo y fenilo; y cada R4 es metilo o R4 y R1 juntos forman un resto alquileno C2-5 para su uso en el alivio de un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano o para inhibir un trastorno linfoproliferativo en un paciente humano con riesgo de desarrollar tal trastorno, en el que dicho trastorno linfoproliferativo se selecciona de un trastorno caracterizado por proliferación de linfocitos que se han infectado con un virus de Epstein-Barr y un trastorno linfoproliferativo maligno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno linfoproliferativo postrasplante, un linfoma de células B abiertamente maligno monoclonal, un linfoma de Hodgkin, un linfoma de Burkitt, un linfoma de células B de derrame peritoneal y un linfoma de células B VEB+.
17. 18. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el

    derivado de rapamicina se selecciona de 40-O-bencil-rapamicina, 40-O-(4’-hidroximetil)bencil-rapamicina, 40-O-[4’-(1,2 dihidroxietil)]bencil-rapamicina, 40-O-alil-rapamicina, 40-O-[3’-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2’-en-1’-il]-rapamicina, (2’E, 4’S)-40-O-(4’,5’-dihidroxipent-2’-en-1’-il)-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina, 40-O-[2-(2hidroxi)etoxi]etil-rapamicina, 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina, 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina,

    40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-metil-N’-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etileno-rapamicina, (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 28-O-metil-rapamicina, 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2’-ilcarbetoxamido)etil)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina y 40-O-[2-(4’5’-dicarboetoxi-1’,2’,3’-triazol-1’-il)-etil]-rapamicina,

    preferentemente, el derivado de rapamicina se selecciona del grupo que consiste en 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina y

    40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, más preferentemente, el derivado de rapamicina es 40-O

    (2-hidroxi)etil-rapamicina.

18. 19.

    El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el derivado de rapamicina es para la co-administración con un segundo agente farmacológicamente activo.

19. 20.

    El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el segundo agente es un agente inmunosupresor.

20. 21.

    El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el segundo agente se selecciona de azatioprina, un ácido micofenólico, inmunoglobulina Rh0 (D), ciclosporina, tacrolimus, cisplatino, una ciclofosfamida y leflunomida.

21. 22.

    El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el derivado de rapamicina y el segundo agente son para la administración al paciente en una composición que comprende tanto el derivado de rapamicina como el segundo agente.

22. 23.

    El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el

    derivado de rapamicina se tiene que administrar al paciente al menos una hora antes de que se tenga que administrar el segundo agente al paciente o al menos una hora después de que se tenga que administrar el segundo agente al paciente.

    5 24. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el trastorno linfoproliferativo maligno es un trastorno linfoproliferativo postrasplante.
23. 25. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el trastorno linfoproliferativo maligno se selecciona de un linfoma de Hodgkin, un linfoma de

    10 Burkitt, un linfoma de células B abiertamente maligno monoclonal, un linfoma de células B de derrame peritoneal y un linfoma de células B VEB+.
24. 26. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el

    paciente se está sometiendo a terapia inmunosupresora y el trastorno linfoproliferativo es un 15 linfoma.
25. 27. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el trastorno linfoproliferativo postrasplante es una hiperplasia linfoide atípica policlonal.

    20 28. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el derivado de rapamicina se tiene que administrar de 10 microgramos por kilogramo de peso corporal a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal.
26. 29. El derivado de rapamicina para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el 25 derivado de rapamicina es para administración parenteral al paciente.