ES2349124T3

ES2349124T3 - Composicion de membrana basal reconstituida modificada para sistemas de ensayo.

Info

Publication number: ES2349124T3
Application number: ES04018601T
Authority: ES
Inventors: Min Wu; Frank J. Mannuzza
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2003-08-20
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2010-12-28
Anticipated expiration: 2024-08-05

Abstract

Una composición de matriz extracelular para revestir una superficie en la que el pH de la composición se encuentra entre 7,8 y 8,5, comprendiendo la composición - una matriz extracelular; y - al menos un componente exógeno que se escoge en el grupo formado por fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición.

Description

Campo del invento

En general el presente invento se refiere a una composición de matriz extracelular y a un sistema de cultivo celular que permiten evaluar los efectos de estimuladores potenciales

o inhibidores sobre varios cultivos celulares.

Antecedentes del invento

La recogida de células procedentes de tejidos para su mantenimiento y propagación in vitro mediante cultivos celulares constituye una importante herramienta en investigación médica y bioquímica. El cultivo tisular es una técnica o proceso de proliferación y/o de apoyo del metabolismo de tejidos o células procedentes de organismos (plantas o animales) en un entorno nutritivo sometido a una formulación concreta. Una vez que se ha procedido al aislamiento mediante disociación discreta del tejido, se incuban las células en un medio nutritivo capaz de contribuir al desarrollo de las funciones vitales. Salvo pocas excepciones, es necesario que las células se unan a un substrato con el fin de desarrollar las funciones metabólicas normales, proliferar y dividirse. En el tejido, el substrato que proporciona el apoyo para la proliferación celular es bien la membrana basal o bien la matriz intersticial. Las membranas basales no sólo actúan como estructuras físicas de andamiaje y filtros moleculares, sino también como reguladores de fase sólida de varios procesos celulares, incluyendo la unión, motilidad y la diferenciación. Las membranas basales también pueden modular la proliferación celular actuando como reservas para los factores de crecimiento y prolongando su semivida in vivo.

La membrana basal es una tipo específico de matriz extracelular y está formada principalmente por laminina y colágeno de tipo IV. Los cuatro componentes principales de la matriz, característicos de las matrices basales, incluyen laminina, colágeno IV, entactina, nidógeno y proteoglucanos de sulfato de heparan (HSPG). Las membranas basales también contienen un número de factores de crecimiento, tales como EGF, IGF-1, PDGF, TGF-beta, VEGF y bFGF. Ejemplos de matrices extracelulares derivadas de membranas basales disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, gel de ECM de Sigma-Aldrich ó Matrigel® de Becton, Dickinson & Company, que se extrae del tumor de ratón EnglebrethHolm-Swarm (EHS). Este tumor de ratón es rico en proteínas de la membrana basal. A temperatura ambiente, la Matriz Matrigel® da lugar a la formación de gel con el fin de generar membrana basal reconstituida y resulta similar en estructura, composición, propiedades físicas y capacidad para retener las características funcionales típicas de las membranas basales in vivo.

La matriz Matrigel® contribuye a la diferenciación de muchos tipos celulares, incluyendo las células endoteliales, células epiteliales, neuronas y hepatocitos. Cuando se colocan células endoteliales sobre placas de Matrigel®, las células dejan de proliferar y exhiben elevada motilidad y comunicación célula-célula. Además, las células se alinean y forman una red tridimensional de estructuras en forma de tubo o de conducto. Se ha utilizado la formación de estas estructuras como modelo en la diferenciación de células endoteliales, así como también la etapa final de cascada angiogénica.

La utilización de Matrigel® en los ensayos de formación de tubos de células endoteliales es una de las principales aplicaciones in vivo de la matriz Matrigel®. En estos ensayos, se mide el alcance de la longitud del tubo de las células endoteliales y se emplea como indicador de la formación de tubo en las células endoteliales. Sobre la diferenciación típica de células de matriz extracelular, la formación de tubos celulares puede tener lugar incluso en ausencia de factores de crecimiento añadidos de forma exógena, debido a la presencia de factores de crecimiento en la matriz. Esto ha limitado la aplicación de la matriz extracelular a estudios que implican efectos inhibidores. En particular, ha resultado difícil estudiar efectos estimuladores ya que la formación de tubo de fondo es demasiado elevada. Como resultado de ello, de momento los ensayos de formación de tubo no han resultado suficientemente sensibles para los estudios de estimulación.

De este modo, es objeto del presente invento proporcionar una composición de matriz extracelular modificada procedente de membrana basal reconstituida para reducir la formación de tubo de fondo, en ausencia de factores de crecimiento añadidos, mediante alteración de la estructura de la matriz y/o mediante secuestro o bloqueo de la accesibilidad que los factores de crecimiento tienen a las células en el seno de la composición.

Otro objeto del presente invento es proporcionar un sistema de cultivo celular que permita la evaluación directa de estimuladores potenciales de angiogénesis, así como también de inhibidores de sus efectos sobre la formación de tubos celulares en células endoteliales y otros tipos de células. También resultaría beneficioso proporcionar un sistema de ensayo para estudiar los mecanismos de acción de estos agentes estimuladores e inhibidores.

De manera adicional, un objeto del presente invento es proporcionar un sistema de ensayo que sea rápido y rentable y que aumente de forma considerable el intervalo dinámico de señal.

Sumario del invento

El presente invento se refiere a una composición de matriz extracelular reconstituida y modificada y a un sistema de cultivo celular que permiten evaluar los efectos potenciales de estimuladores y/o inhibidores sobre varios cultivos celulares. En algunas realizaciones, la composición de matriz extracelular es una composición de membrana basal reconstituida y modificada. La composición del invento incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre: heparina, fibronectina y laminina. Se puede ajustar el pH de la composición a un pH básico. Las composiciones de matriz extracelular proporcionadas en la presente memoria resultan útiles para revestir superficies, tal como la superficie de un substrato de cultivo celular. Los substratos revestidos pueden emplearse, por ejemplo, en sistemas de ensayo de formación de tubos celulares endoteliales.

En algunas realizaciones, el presente invento proporciona una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular; y fibronectina exógena y heparina, presentando la composición un pH básico, en la que la matriz extracelular tiene una concentración de alrededor de 10 mg/ml, la fibronectina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 5 mg/ml a alrededor de 20 mg/ml y la heparina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 200 mg/ml a alrededor de 800 mg/ml.

Además, en algunas realizaciones, el presente invento proporciona una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular; y laminina exógena, presentando la composición un pH básico, en la que la matriz extracelular tiene una concentración de alrededor de 10 mg/ml y la laminina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml.

Otro aspecto del presente invento va destinado a sistemas de cultivo celular que emplean las composiciones del invento proporcionadas en la presente memoria en forma de composiciones de revestimiento para substrato. El sistema incluye un substrato; y un revestimiento que lo cubre de una composición de revestimiento que incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. El substrato puede ser un substrato de cultivo celular constituido por cualquier número de materiales poliméricos, vidrio, metal y filtros micro-porosos, por ejemplo.

Además, el presente invento proporciona un método de preparación de las composiciones del invento. El método incluye: proporcionar una matriz extracelular; y combinar la matriz extracelular proporcionada con al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. El método puede incluir además ajustar el pH de la composición a un pH básico y/o añadir cloruro sódico a la composición.

Otro aspecto del presente invento va destinado a un método de preparación del sistema de cultivo celular del invento. Este método incluye proporcionar una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina; y aplicar la composición al substrato. El método además incluye incubar la composición aplicada para permitir su polimerización.

Las composiciones y sistemas del presente invento permiten evaluar la capacidad de estimuladores potenciales, así como también de inhibidores que afectan a la formación de tubos celulares. Además, las composiciones del invento aumentan de forma importante el intervalo dinámico de señal en los sistemas de ensayo de formación de tubos celulares.

Breve descripción de los dibujos

La FIG.1 es una representación esquemática de un ensayo de formación de células endoteliales en un formato de 96 pocillos, en el que los pocillos están revestidos con la composición de matriz extracelular del presente invento (matriz modificada).

La FIG. 2 es un gráfico que muestra el efecto que tienen diferentes concentraciones de agentes estimuladores sobre la formación de tubos celulares en la matriz extracelular modificada del presente invento frente a una matriz extracelular estándar.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra la respuesta de dosificación de bFGF para inducir la formación de tubos HUVEC en la matriz extracelular modificada del presente invento.

La FIG 3B es un gráfico que muestra la respuesta de dosificación de esfinosina-1fosfato (S1P) para inducir la formación de tubos HUVEC en la matriz extracelular modificada del presente invento.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra la respuesta de dosificación de suramina en la formación de tubos HUVEC inducida por los estimuladores, bFGF y S1P, en la matriz extracelular modificada del presente invento.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra el efecto de inhibidores, SU5402 y suramina, sobre la formación de tubos HUVEC inducida por los estimuladores, bFGF y S1P, en la matriz extracelular modificada del presente invento.

Descripción detallada del invento

Los sistemas de ensayo rápidos y versátiles para la formación de tubos celulares endoteliales resultan muy deseables en investigación de angiogénesis y en el descubrimiento de medicamentos. Los actuales sistemas de ensayo resultan eficaces para el estudio de inhibidores de angiogénesis, pero no es eficaz para el estudio de estimuladores. El presente invento va destinado a una composición de matriz extracelular reconstituida y modificada que, cuando se emplea en un sistema de ensayo, resulta eficaz para el estudio tanto de la activación como de la inhibición de la angiogénesis. Cuando se emplean en un sistema de ensayo basado en células, se descubrió que las composiciones del invento aumentaban considerablemente el intervalo dinámico de señal y mejoraban la evaluación directa de la formación de estructuras de tipo capilar en células endoteliales. El presente invento proporciona un medio para la evaluación directa de estimuladores e inhibidores de la formación de tubos celulares en varios substratos revestidos.

En algunas realizaciones, el presente invento va destinado a una membrana basal reconstituida y modificada, que incluye componentes que alteran la estructura del gel solidificado y/o la accesibilidad que los factores de crecimiento tienen a las células en el seno de la composición, de forma que la formación de tubos celulares (diferenciación celular) sea mínima en ausencia de estimuladores exógenos.

El presente invento proporciona una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. En una realización, la matriz extracelular es un extracto de proteína de membrana basal.

En algunas realizaciones, la composición del invento tiene un pH básico. Preferiblemente, el pH de la composición están entre alrededor de 7,8 y alrededor de 8,5, más preferiblemente alrededor de 8,0. Se puede mantener el pH con un tampón de tris(hidroximetil) amino metano. No obstante, se contempla dentro del presente invento que cualquier componente de tampón capaz de mantener el pH de la composición dentro del intervalo de alrededor de 7,8 a 8,5 resulta apropiado. Los sistemas potenciales de tampón para pH 8,0 incluyen, pero no se limitan a, dietanolamina, trietanolamina, (1,3bis(tris[hidroximetil]metilamino)propano); ácido 3-[N,N-bis(2-hidroxietil)amino]-2hidroxipropanosulfónico: DIPSO; ácido (N-[2-hidroxietil]piperazin-N´-[4-butanosulfónico] HEPBS); (ácido N-(4-(2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico: HEPES); (ácido 3-(Nmorfolino)butano sulfónico: MOBS); (ácido piperazin-N,N´-bis[2-hidroxipropanosulfónico: POPSO); (ácido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico: TAPS); (ácido 3-(Ntris[hidroximetil]metilamino)-2-hidroxipropanosulfónico: TAPSO); (ácido Ntris[hidroximetil)metil-2-aminosulfónico: TES); N-tris(hidroximetil)metilglicina: Tricina; Netilmorfolina, dimetilleucilglicina, 5,5-dietil barbituato de sodio y 2-amino, 2metil-1,3 propanodiol.

En algunas realizaciones, la composición del invento puede incluir un tampón Tris en concentraciones suficientes para tamponar en el intervalo de pH básico. Cuando se encuentra presente, el tampón Tris preferiblemente está en una concentración de alrededor de 0,01 M a alrededor de 0,05 M de la composición total. La base Tris se encuentra disponible a nivel comercial en Fischer Scientific Co. (Hanover, IL) y en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), por ejemplo.

Además, en algunas realizaciones, la composición del invento incluye una sal, tal como cloruro sódico. Cuando se encuentra presente, preferiblemente el cloruro sódico está en una concentración de alrededor de 0,03 M a alrededor de 0,15 M. Sin pretender estar avalado por teoría, se cree que el pH y la concentración de sal pueden afectar a la densidad y resistencia del gel polimerizado de membrana basal.

En una realización, la composición del invento incluye una matriz extracelular, heparina exógena y fibronectina exógena, presentando la composición un pH básico. Esta composición además puede incluir cloruro sódico.

En otra realización, la composición incluye una matriz extracelular y laminina exógena, presentando la composición un pH básico. La composición además puede incluir cloruro sódico.

Según se define en la presente memoria, “matriz extracelular” (de la cual la membrana basal es un tipo específico), es cualquier material producido por células y segregado en el interior del medio que le rodea. Se aprecia que, en la presente memoria, la expresión “matriz extracelular” puede ser usada indistintamente con la expresión “membrana basal”. La matriz extracelular puede ser segregada por células para formar una membrana basal intersticial que forme un marco sobre el que se unen las células. La membrana basal separa células del tejido conectivo mesenquimal y proporciona la orientación espacial y la estabilidad que se necesitan para el crecimiento y la diferenciación celular. También se ha comprobado que las moléculas de la matriz extracelular o de las membranas basales se encuentran implicadas en el secuestro, almacenamiento y presentación de los factores de crecimiento a los tejidos.

La membrana basal incluye varios componentes. No obstante, su principal componente es laminina, seguido de colágeno IV, proteoglucanos de sulfato de heparan, entactina y nidógeno. Estos componentes polimerizan en proporciones constantes cuando se re-disuelven y se dejan reconstituir.

Las moléculas de la matriz extracelular o de las membranas basales son conocidas en la técnica y se encuentran disponibles a nivel comercial. Por ejemplo, la matriz extracelular de tumor de sarcoma de ratón EHS se encuentra disponible en Matrigel® (Becton Dickinson Corp., Medford, MA), gel de ECM (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) y CultrexTM (Trevigen, Gaithersburg, MD).

La expresión “matriz extracelular” se encuentra reconocida en la técnica. Sus componentes incluyen uno o más de las siguientes proteínas: fibronectina, laminina, vitronectina, tenascina, entactina, trombospondina, elastina, gelatina, colágeno, fibrilina, merosina, ancorina, condronectina, proteína de unión, sialoproteína ósea, osteocalcina, osteopontina, epinectina, hialuronectina, undulina, epiligrina y calinina. Kleinman y col., J. Biometer. Sci. Polymer Edn., 5:1-11 (1993), describen otras moléculas de matriz extracelular. Se pretende que la expresión “matriz extracelular” abarque una matriz extracelular desconocida hasta el momento que pueda ser descubierta en el futuro, ya que su caracterización como matriz extracelular podría ser determinada fácilmente por los expertos en la técnica.

Como se ha descrito anteriormente, las composiciones del presente invento incluyen un componente de matriz extracelular. En una realización deseada, se proporciona la matriz extracelular como extracto de proteína de membrana basal, tal como se describe en la patente de EE.UU. Nº. 4.829.000. El extracto de proteína es capaz de polimerizar mediante calentamiento para dar lugar a un gel rígido estable (es decir, una matriz tridimensional). En particular, cuando se produce la incubación a temperaturas de alrededor de 15-40ºC (preferiblemente de alrededor de 22-37ºC) durante el tiempo suficiente, se produce la polimerización de las proteínas de la matriz extracelular. Las proteínas pueden permanecer en forma soluble manteniendo la temperatura de la composición por debajo del este intervalo. Además, se pueden añadir a la composición cloruro sódico u otras sales con el fin de mantener las proteínas en forma soluble y/o para modificar la densidad y la resistencia del gel polimerizado de membrana basal. Preferiblemente, el componente de matriz extracelular se mantiene en una concentración de alrededor de 10 mg/ml de la composición total.

En algunas realizaciones, la composición incluye fibronectina, que se añade de forma exógena al componente de matriz extracelular. Preferiblemente, la fibronectina exógena es fibronectina de origen humano. La fibronectina exógena se encuentra presente en concentraciones de alrededor de 5 mg/ml a alrededor de 20 mg/ml de la composición total, preferiblemente en concentraciones de 8 mg/ml a 12 mg/ml de la composición total. Se sabe que la fibronectina se une al colágeno IV y posiblemente a otros componentes de la matriz extracelular. Por tanto, sin pretender que sea avalado por teoría, es probable que la fibronectina se introduzca en el interior de la matriz, alternado de este modo su estructura. La fibronectina de origen humano se encuentra disponible en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), por ejemplo.

Además, en algunas realizaciones, la heparina exógena se encuentra presente en las composiciones del invento. La heparina exógena se mantiene en una concentración de alrededor de 200 mg/ml a alrededor de 800 mg/ml de la composición total, preferiblemente a una concentración de alrededor de 300 mg/ml a alrededor de 600 mg/ml de la composición total. Se sabe que la heparina se une a varios factores crecimiento, tales como VEGF y bFGF. Además, se sabe que la heparina se une al colágeno IV y a la laminina. Por tanto, sin pretender que sea avalado por teoría, es probable que la heparina actúe por un lado perturbando la estructura de la matriz extracelular y por otro, secuestrando o bloqueando la accesibilidad de los factores de crecimiento a las células en el seno de la composición. Fuentes comerciales de heparina incluyen Calbiochem (La Jolla, CA) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Además, en algunas realizaciones, las composiciones del presente invento incluyen laminina exógena. La laminina exógena está presente en una concentración de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml de la composición total, preferiblemente en una concentración de alrededor de 2 mg/ml a alrededor de 4 mg/ml de la composición total. Se sabe que la laminina se une al colágeno IV. Además, se sabe que la laminina contiene sitios de enlace para la heparina. Por tanto, sin pretender estar avalado por teoría, es probable que la laminina perturbe la estructura del componente de matriz celular. En realizaciones deseadas, la laminina es laminina de origen humano. La laminina de origen humano se encuentra disponible en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), por ejemplo.

Además de los componentes descritos anteriormente, las composiciones del presente invento también pueden incluir otros componentes diferentes, que pueden afectar a la accesibilidad de los factores de crecimiento a las células en el seno de la matriz y/o que afectan a la estructura de la matriz. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, sales, diluyentes, proteoglucanos de sulfato de heparan y/o anti-cuerpos de neutralización. De manera adicional, los componentes apropiados de la composición pueden incluir los conocidos en la técnica que producen uno o más de los siguientes: afección sobre la densidad de la red y la resistencia cuando las proteínas de la composición polimerizan a temperaturas de alrededor de 22ºC a alrededor de 37ºC, secuestro o bloqueo de la accesibilidad de los factores de crecimiento a la células en el seno de la matriz, alteración de los estados de reticulación de la matriz polimerizada o contribución a la adhesión celular.

Los diluyentes pueden incluir cualquier medio de cultivo celular que proporcione la condición de que sea compatible con el cultivo celular. Diluyentes apropiados para el crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales pueden incluir, pero no se limitan a, Medio Dulbecco´s Modified Eagle (DMEM), MEM, M-199 y RPMI. Se pueden añadir suplementos, conocidos en la técnica, al medio de cultivo que incluyen suero (por ejemplo, FBS o suero (por ejemplo, FBS o suero de ternero), complementos que contienen suero (NU-SERUM) y suplementos que no contienen suero (MITO+). Se suplementa DNEM un medio de cultivo celular preferido para células epiteliales intestinales con Diluyente de Suero MITO+ (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Mass.) para proporcionar un entorno de cultivo celular libre de suero completamente definido. Además, se han utilizado muchos medios clásicos para cultivar hepatocitos epiteliales. Algunos ejemplos de estos son: Liebovitz L-15, DMEM/F-12, RPMI 1640, Waymouth´s MB 752/1 y Williams Medium E. Los hepatocitos también pueden someterse a cultivo en un medio que no contiene suero denominado Hepatocyte Medium, disponible en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Diluyentes apropiados para el crecimiento de células epiteliales incluyen, pero no se limitan a, DMEM, medio HUVEC y medio EGM2-MV. Por ejemplo, se pueden someter a cultivo células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) en medio de HUVEC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Además, se pueden someter a cultivo células endoteliales humanas de cordón umbilical (Cascade Biologics, Inc., Portland, OR) en medio EGM2-MV (Clonetics Corp., San Diego, CA., una división de Biowhittaker).

Los anti-cuerpos de neutralización que son apropiados incluyen aquellos compuestos que afectan al factor de crecimiento inherente en la matriz extracelular, mediante ajuste de la dosificación del factor de crecimiento o mediante bloqueo de su eficacia. Anti-cuerpos de neutralización apropiados pueden incluir, pero no se limitan a, anti-cuerpos que actúan frente a uno de los siguientes: TGF-beta, EGF, VEGF, PDGF, Bfgf y IGF-1.

Se puede copolimerizar una amplia variedad de otros materiales, incluyendo proteínas bioactivas, con la composición de matriz extracelular del presente invento. Estos incluyen, pero no se limitan a, células, anti-cuerpos, enzimas, receptores, factores de crecimiento, componentes adicionales de la matriz extracelular, citoquinas, hormonas y medicamentos. La polimerización de proteínas de la matriz extracelular puede provocar la unión de dichos materiales. Además, las proteínas de la matriz extracelular pueden copolimerizar con los materiales. Si se encuentran presentes, estos materiales biológicamente activos pueden estar fácilmente disponibles para las células del cultivo y ser utilizados para moderar o regular sus propiedades o comportamiento.

El presente invento proporciona un método de preparación de una composición de matriz extracelular, tal como una composición de membrana basal reconstituida. Las composiciones del invento resultan útiles para revestir una superficie, tal como la superficie del substrato de cultivo celular. El método de preparación incluye proporcionar una matriz extracelular; y combinar la matriz extracelular proporcionada con al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. El método además puede incluir ajustar el pH de la composición a un pH básico. Además, el método puede incluir la etapa de añadir una sal, tal como cloruro sódico, a la composición. Como se ha descrito anteriormente, se piensa que el pH y la concentración de sal pueden afectar a la densidad y resistencia del gel de membrana basal polimerizada.

Generalmente el método de preparación de las composiciones del invento se lleva a cabo tal y como sigue. Inicialmente, se derrite sobre hielo un extracto congelado de proteína de membrana basal, tal como Growth Factor Reduced Matrigel® (Becton Dickinson Corp., Medford, MA). Una vez que se ha derretido la composición basal, se añade al menos un componente exógeno que se escoge entre fibronectina, heparina y laminina. Se puede ajustar el pH de la composición a un pH básico. De manera deseable, se mantiene la membrana basal a una concentración de alrededor de 10 mg/ml del producto final. En algunas realizaciones, después de que se ha derretido la membrana basal, se añaden fibronectina y heparina. En otras realizaciones, después de haber derretido la membrana basal, se añade laminina. La composición se mantiene a una temperatura de alrededor de 4ºC para el revestimiento.

Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, la composición incluye un componente de matriz extracelular, fibronectina exógena y heparina exógena. La composición puede tener un pH básico. En algunas realizaciones, después de haber derretido el componente de la matriz extracelular (por ejemplo, el extracto de proteína de membrana basal), se añade fibronectina. A continuación, se somete a diálisis la composición que contiene la fibronectina exógena, frente a un tampón de diálisis frío apropiado, para ajustar a un pH básico. Por ejemplo, se puede someter la composición a diálisis frente al siguiente tampón de diálisis: DMEM (sin NaHCO3) que contiene NaCl 40 mM / 50 µg/ml de gentamicina plus Tris 10 mM adicional, con el pH ajustado a 8,0. En particular, se puede colocar la composición que contiene fibronectina en una bolsa de diálisis y someterla al proceso de diálisis durante 18-20 horas. Posteriormente, se retiran los componentes y se añade heparina. De manera alternativa, nótese que la heparina se puede añadir antes de la diálisis. De manera deseable, la concentración del componente de matriz extracelular en el producto final es de alrededor de 10 mg/ml, que de manera deseable la fibronectina es de alrededor de 5 mg/ml a alrededor de 20 mg/ml y que de manera deseable la heparina exógena es de alrededor de 200 mg/ml a alrededor de 800 mg/ml. La composición se mantiene a una temperatura de alrededor de 4ºC para revestimiento.

En otras realizaciones, la composición del invento incluye un componente de matriz extracelular y laminina exógena. La composición puede tener un pH básico. Una vez que el componente de la matriz extracelular se ha derretido como se ha descrito anteriormente, se añade laminina. Se puede añadir la laminina antes o después de la etapa de diálisis. Por ejemplo, en algunas realizaciones, en primer lugar se somete a diálisis el componente de matriz extracelular, tal como Growth Factor Reduced Matrigel® (Becton Dickinson Corp., Medford, MA) , frente al siguiente tampón de diálisis: DNEM (sin NaHCO3) que contiene NaCl 40 mM / 50 µg/ml de gentamicina plus Tris 10 mM adicional, con el pH ajustado a 8,0. Una vez que han transcurrido 18-20 horas de diálisis aséptica, a continuación se añade laminina, de manera que al concentración de laminina exógena en el producto final sea de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml. La composición se mantiene a una temperatura de alrededor de 4ºC para revestimiento.

El presente invento además proporciona un sistema de cultivo celular que incluye: un substrato; y una composición de revestimiento sobre el mismo. La composición de revestimiento incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. En algunas realizaciones, el componente de matriz extracelular sobre el que se añaden los componentes exógenos es un componente de membrana basal, de forma que la composición de revestimiento es una composición de membrana basal reconstituida y modificada. La composición de revestimiento puede tener un pH básico. Preferiblemente, el pH es de 8,0.

Los substratos para investigación convencional de cultivos celulares incluyen plástico, vidrio y filtros micro-porosos (por ejemplo, celulósicos, de nailon, fibra de vidrio, poliéster y policarbonato). Los substratos para bio-reactores empleados en cultivos celulares continuos o discontinuos o en ingeniería genética incluyen tubos de fibras huecas o perlas micro-portadoras. Substratos para injertos vasculares u óseos incluyen materiales tales como politetrafluoroetileno (Teflón®), materiales cerámicos y materiales poliméricos relacionados.

En algunas realizaciones, el substrato se escoge entre los siguientes: membranas de celulosa, policarbonato poroso, politetrafluoroetileno poroso, membranas de nailon, filtros de vidrio, polietilentereftalato poroso, polimetilpentano, polipropileno, polietileno y sus combinaciones.

Configuraciones preferidas de substrato contempladas en el presente invento incluyen placas multi-pocillo (tal como placas de 24 y 96 pocillos), placas (tal como placas de Petri), matraces para cultivo, etc.

El presente invento proporciona un método de preparación de sistemas de cultivo celular. El método incluye proporcionar una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina; y aplicar la composición al substrato. El método también incluye incubar la composición aplicada con el fin de permitir su polimerización. Se puede escoger el substrato apropiado para revestimiento entre los descritos anteriormente, por ejemplo. La composición aplicada al substrato puede tener un pH básico, que de manera deseable es de alrededor de 7,8 a alrededor de 8,5. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición de revestimiento incluye un tampón Tris, en una concentración suficiente para tamponar en el intervalo de pH básico. Además, en algunas realizaciones, la composición aplicada puede incluir cloruro sódico, de manera deseable a una concentración de alrededor de 0,03M a alrededor de 0,15M.

De manera general, el procedimiento de revestimiento se lleva a cabo como se muestra a continuación. Se aplica aproximadamente de 0,5 a 2,0 ml de la composición de revestimiento (de manera deseable a alrededor de 4ºC) a un pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos; se aplica alrededor de 0,25 a 1,0 ml a un pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos; y se aplica de alrededor de 50 µl a 100 µl a un pocillo de una placa de 96 pocillos. Además, se aplica de alrededor de 0,5 a 2,0 ml a una placa de 35 mm, se aplica de 0,5 a 4,0 ml a una placa de 60 mm y se aplica de 2,0 a 12,0 ml a una placa de 100 mm. Si se desea, se pueden congelar substratos revestidos y almacenarlos a -20ºC antes de utilizarlos, y posteriormente descongelarlos antes de someter a polimerización los componentes de la composición de revestimiento. En realizaciones en las que la configuración de substrato es la de una placa multi-pocillo, se puede emplear una cubierta mate para sellar cada placa antes de colocarla sobre la tapa con el fin de evitar el secado de la superficie. Cubiertas mate disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, las suministradas por SUN-SRI, Wilmington, N.C.

Después de la aplicación, se incuba la composición del invento para permitir la adsorción de la sustancia(s) de adhesión celular de la composición sobre la superficie del substrato y para permitir que tenga lugar la polimerización de las proteínas de la composición. En particular, de manera deseable, los substratos revestidos se incuban a temperaturas de alrededor de 22ºC a alrededor de 37ºC, y durante un período de tiempo de alrededor de 30 minutos a 4 horas, para que tenga lugar la polimerización de los componentes de la composición. Si se desea, se puede permitir la evaporación de la disolución de revestimiento mediante secado a una temperatura dentro de este intervalo y, de manera deseable, a una humedad relativa de 40-60%, y a continuación re-hidratar con un medio de cultivo celular u otro medio estéril (por ejemplo, agua estéril) durante alrededor de 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se puede retirar la disolución de rehidratación justo antes del ajuste del ensayo. El substrato final revestido resulta útil para evaluar efectos potenciales de estimuladores, así como también de inhibidores en la producción de un bajo fondo de formación de tubos celulares o de diferenciación celular.

Las composiciones y sistemas de cultivo celulares del presente invento se pueden utilizar en varias aplicaciones, incluyendo las conocidas en la técnica para matrices extracelulares y sistemas de ensayo. Estas incluyen aplicaciones in vitro y también in vivo. Por ejemplo, una de las principales aplicaciones in vitro incluye la utilización de las composiciones del invento en los ensayos de formación de tubos celulares endoteliales, como respuesta a estimuladores y/o inhibidores añadidos de forma exógena. La formación de tubos celulares endoteliales ha sido empleada como modelo de diferenciación de células endoteliales, así como también de etapa final de la cascada angiogénica. Previamente, la formación de tubos celulares de fondo fue demasiado elevada en los ensayos que empleaban las composiciones de matriz extracelular anteriores. Esto limitaba la aplicación de las composiciones anteriores a estudios que suponían la utilización de inhibidores potenciales de diferenciación celular y/o angiogénesis. Por el contrario, las composiciones de matriz extracelular del presente invento resultan útiles para los estudios de estimulación, así como también para los estudios de inhibición. Por ejemplo, con las composiciones presentes, en ausencia de un estimulador exógeno, la formación de tubos celulares de fondo resulta insignificante. De este modo, se puede controlar la formación de tubos celulares endoteliales y la formación de tubos con otros tipos celulares, como respuesta a los estimuladores añadidos de forma exógena, tal como bFGF y 1-fosfato de esfinosina. De manera adicional, se puede estudiar la diferenciación celular de la formación de ácinos en células efeliales mamarias o la excrecencia de axones empleando las composiciones del invento. Con respecto a los usos in vivo, se pueden mezclar las composiciones del presente invento con estimuladores de angiogénesis, inhibidores y/o células tumorales en un ensayo de obturación, pudiéndose utilizar éstos para inducir (por ejemplo con estimuladores) o para eliminar (por ejemplo con inhibidores) el crecimiento in vivo en recipiente de sangre.

Se puede utilizar el sistema de ensayo del presente invento para evaluar varios inhibidores o estimuladores con el fin de determinar su eficacia en un estudio celular. Los estimuladores pueden incluir factores de crecimiento que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, éstos pueden incluir uno o más de factores de crecimiento derivados de plaquetas

5 (PDGF), por ejemplo, PDGF AA, PDGF BB; factores de crecimiento de tipo insulina (IGF), por ejemplo, IGF-I, IGF-II; factores de crecimiento de fibroblasto (FGF), por ejemplo, FGF ácido, FGF básico, factores de crecimiento de células �-endoteliales, FGF 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8 y FGF 9; factores de crecimiento transformadores (TGF), por ejemplo, TGFP1, TGF �1,2, TGF-� 3, TGF-� 5; proteínas morfogénicas óseas (BMP), por ejemplo, BMP

10 1, BMP 2, BMP 3, BMP 4; factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGF), por ejemplo, VEGF, factor de crecimiento de placenta; factores de crecimiento epidérmicos (EGF), por ejemplo, EGF, anfiregulina, betacelulina, heparina que enlaza EGF; interleucinas, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14; factores estimuladores de colonia (CSF), por ejemplo, CSF-G, CSF-GM, CSF

15 M; factor de crecimiento de nervios (NGF); factor de hemocitoblasto, factor de crecimiento de hepatocito y factor neurotrófico ciliar. Sporn y Roberts describen factores de crecimiento adicionales en Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Springer-Verlag, New York (1990). Se pretende que la expresión “factores de crecimiento” abarque los factores de crecimiento desconocidos en la actualidad que puedan ser descubiertos en el futuro, ya

20 que su caracterización como factor de crecimiento resultará fácilmente determinable por los expertos en la técnica. Hay muchos factores de crecimiento disponibles comercialmente a partir de vendedores, tales como Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.; Collaborative Research, Los Altos, CA; Genzyme, Cambridge, MA; Boehringer, Alemania; R&D Systems, Minneapolis,

25 MN; Genetech, San Francisco, CA; y GIBCO, Gran Islan, NY. Los factores de crecimiento disponibles comercialmente se pueden obtener tanto en forma natural como en forma recombinante. Los siguientes ejemplos se aportan con fines ilustrativos y no se pretende, de ninguna manera, que limiten las realizaciones y utilizaciones del presente invento.

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EJEMPLOS Ejemplo 1 – Preparación de una composición de matriz extracelular modificada

Se preparó la composición de membrana basal reconstituida y modificada del presente invento como se muestra a continuación. Se derritió sobre hielo Growth Factor Reduced Matrigel® congelado (Becton Dickinson Corp., Medford, MA). Tras derretir, se añadió fibronectina de origen humano de forma que la concentración en el producto final fuera de alrededor de 8 mg/ml a alrededor de 12 mg/ml. Se sometió a diálisis la composición que contenía la fibronectina exógena frente al siguiente tampón de diálisis: DMEM (sin NaHCO3) que contenía NaCl 40 mM / 50 µg/ml de gentamicina Tris plus 10 mM, con el pH ajustado a 8,0. En particular, se colocó la composición que contenía la fibronectina en una bolsa de diálisis y se sometió a diálisis de forma aséptica durante alrededor de 18-20 horas. Posteriormente, se retiraron los contenidos y se añadió heparina. La concentración del componente de matriz extracelular en el producto final fue de alrededor de 10 mg/ml y la de heparina exógena fue de alrededor de 300 mg/ml a alrededor de 600 mg/ml. Se mantuvo la composición a una temperatura de alrededor de 4ºC antes de revestir los substratos de cultivo celular.

Ejemplo 2-Procedimiento general de revestimiento

Se prepararon placas multi-pocillo como se muestra a continuación. Se añadieron aproximadamente 50 µl de una disolución (a 4ºC) bien de la composición de membrana basal reconstituida y modificada descrita en el Ejemplo 1 o bien de Growth Factor Reduced Matrigel® (Becton Dickinson Corp., Medford, MA) sobre pocillos de unas micro-placas BD Falcon Black/clear de 95 pocillos. Se empleó una cubierta mate para sellar cada placa antes de colocar la tapa. Se congelaron las placas y se almacenaron a -20ºC antes de ser utilizadas.

Ejemplo 3 – Procedimiento general para el ensayo de formación de tubos celulares endoteliales

En referencia a la Figura 1, se puede evaluar la capacidad que tienen estimuladores de angiogénesis para mejorar la formación de tubos HUVEC, mediante el empleo de las composiciones y de los sistemas de cultivo celular del presente invento. En particular, la Figura 1 muestra los estimuladores objeto de evaluación sobre la superficie revestida de los pocillos de una placa de 96 pocillos. La superficie inferior de los pocillos se observa como revestida con la composición de matriz modificada del presente invento. En el día 1, se añadió un estimulador de angiogénesis potencial a la superficie revestida, junto con las células endoteliales en el medio celular. Como se muestra en la Figura 1, también se pueden emplear las composiciones y los sistemas de cultivo celular del presente invento en el estudio de inhibidores. En los estudios de inhibidores, se incluye el inhibidor potencial en un pocillo, además de al menos un estimulador conocido y las células endoteliales en el medio celular. Una vez transcurrido el período de incubación apropiado, típicamente 24 horas a 37ºC / 5% de CO2 (día 2), se toman imágenes de los pocillos y se cuantifica la longitud del tubo como medida de la formación de tubos celulares.

Ejemplo 4 – Estudios de estimulador

Se escogieron estimuladores conocidos para evaluar el rendimiento de una composición de membrana basal del invento frente a una composición de membrana basal anterior. Los estimuladores escogidos fueron bFGF y 1-fosfato de esfinosina (SIP). Se derritieron placas preparadas revestidas como las descritas en el Ejemplo 2 a alrededor de 4ºC durante un período de alrededor de 4 a 5 horas. A continuación se dejó polimerizar los componentes de la composición a 37ºC, 5% de CO2 durante aproximadamente 30 minutos inmediatamente antes de establecer la configuración del ensayo. Para los estudios de estimulador, se recolectó HUVEC (P3-P5) a alrededor de 70% de confluencia celular. Se sembraron alrededor de 50 µl de células a 4x 105/ml en medio de FBS/EBM-2 0,1% suplementado con o sin estimuladores de angiogénesis, sobre placas de 96 pocillos que contenían la composición (del invento) de membrana basal reconstituida y modificada (es decir, polimerizada) o una matriz Matrigel® (Matriz de BD Growth Factor Reduced Matrigel®). Se permitió la incubación de los ensayos montados en un incubador a 37ºC, con 5% de CO2 durante aproximadamente 16 a 18 horas. Se disolvieron los compuestos en DMF o agua de acuerdo con instrucciones del fabricante.

Al final de cada ensayo, se retiró el medio de ensayo y se lavaron las placas una vez con HBSS. Se añadieron 50 µl de Calcein AM a 8 µl/ml en HBSS a cada pocillo y se incubaron las placas en un incubador a 37ºC/5% de CO2 durante 35 minutos, seguido de lavado una vez en HBSS. Se tomaron imágenes con un lente de objetivo de 2 aumentos en un Sistema de Registro Celular Gen-1 (Universal Imaging CorporationTM). Se midió la longitud total del tubo para cada pocillo empleando un MetaMorph® Journal revisado (desde antes). Se importaron los datos a soporte excel y se analizaron empleando un programa de soporte lógico BD Gentest MPM/ADMET de BD Biosciences Discovery Labware.

Como se muestra en la Figura 2, se comparó la longitud del tubo de HUVEC (una medida de la formación de tubos celulares) empleando distintas matrices en presencia de los estimuladores, bFGF y S1P. Los resultados muestran que la composición del invento (matriz modificada) aumenta el intervalo dinámico de señal sobre una composición de membrana basal estándar (matriz estándar). Se incubaron los estimuladores, bFGF y S1P, con HUVEC a las concentraciones indicadas sobre las matrices. Cada una de las barras representa la media ± la Desviación estándar (n=4). La Figura 2 muestra que el intervalo dinámico de señal aumentó sobre todo empleando la matriz modificada del presente invento frente a la matriz estándar.

Como se observa en las Figuras 3A y 3B, el sistema de ensayo permitió a los solicitantes determinar los valores EC50 de bFGF (Figura 3A) y de S1P (Figura 3B) a la hora de inducir la formación de tubos HUVEC. Se obtuvo la respuesta de dosificación de los estimuladores a la hora de inducir la formación de tubos sobre la matriz modificada (del invento) a las concentraciones indicadas. Se añadieron los estimuladores, a las concentraciones indicadas, a cada pocillo. Cada punto de datos representa la media ± la Desviación Estándar (n=4). Los resultados muestran una estimulación dependiente de la dosificación de la formación de estructuras de tipo capilar por parte de bFGF (Figura 3A) y de S1P (Figura 3B). El sistema de cultivo celular del invento permitió a los solicitantes determinar el valor EC50 para bFGF de 1,5 ng/ml, y un valor de EC50 para S1P de 318,9 nM.

Ejemplo 5 – Estudios de inhibidor

De manera general, se llevaron a cabo los estudios de inhibidor descritos en el Ejemplo 4, exceptuando que para estos estudios, se incluyó un inhibidor en el ensayo, además de un estimulador conocido. Se obtuvieron datos sobre la matriz modificada (del invento). Como se muestra en la Figura 4, se midió la longitud total del tubo inducida por los estimuladores, bFGF ó S1P, en presencia de varias concentraciones de inhibidor (suramina). Se añadieron los estimuladores, bFGF ó S1P, a HUVECs a 20 ng/ml y 1 µM, respectivamente. Se añadieron las concentraciones indicadas de suramina a HUVEC en bFGF ó S1P, antes de añadir las mezclas a cada pocillo. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar (n=4). La Figura 4 muestra que suramina inhibió la formación de tubos HUVEC inducida mediante los mecanismos de activación de bFGF ó S1P con distintos valores de IC50. En particular, el valor de IC50 de la inhibición de suramina

de la formación de tubos estimulada mediante bFGF fue de 7,3 µM, y el valor IC50 de inhibición de suramina de la formación de tubos estimulada por S1P fue de 10,6 µM. Ahora con referencia a la Figura 5, se muestran los efectos de inhibidores (SU5402 y suramina) sobre la formación de tubos HUVEC inducida por medio de estimuladores (bFGF

5 y S1P). Se obtuvieron datos sobre la matriz modificada (del invento). Se añadieron los estimuladores, bFGF ó S1P, a HUVECs en EBM-2 que contenía 0,1% de FBS a una concentración final de 20 ng/ml y 1 µM, respectivamente. Se añadieron suramina a 15 µM (en medio) ó SU5402 a 25 µM (en DMF 0,1%) a HUVECs en FBS 0,1%, ó bFGF ó S1P, antes de añadir las mezclas a los pocillos. Como se muestra en la Figura 5, SU5402 (un

10 inhibidor de tirosina quinasa FGFR1) inhibió parcialmente la formación de tubos inducida por S1P, aumentando la posibilidad de que la inducción de bFGF pueda suponer un mecanismo de acción de S1P. Además, SU5402 inhibió completamente la formación de tubos estimulada por bFGF. Asimismo, la gráfica muestra que suramina inhibió la formación de tubos inducida tanto por S1P como por bFGF. Cada una de las barras representa la

15 media ± desviación estándar (n=4). La membrana basal reconstituida y modificada del presente invento aumentó el intervalo dinámico y permitió la evaluación del efecto tanto de estimuladores como de inhibidores. El sistema de ensayo permitió determinar los valores de EC50 de estimuladores a la hora de inducir la formación de tubos HUVEC y los valores de IC50 de inhibidores de la

20 formación de tubos estimulada por los agentes de estimulación. Este sistema de ensayo ofrece una oportunidad para estudiar los mecanismos de acción de los moduladores de angiogénesis en la formación de tubos celulares endoteliales.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de matriz extracelular para revestir una superficie en la que el

pH de la composición se encuentra entre 7,8 y 8,5, comprendiendo la composición -una matriz extracelular; y -al menos un componente exógeno que se escoge en el grupo formado por

fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición.
2.

La composición de la reivindicación 1, en la que la matriz extracelular comprende un extracto de proteína de membrana basal.
3.

La composición de la reivindicación 1, que además comprende un tampón Tris a una concentración suficiente para tamponar dentro de intervalo de pH básico.
4.

La composición de la reivindicación 3, en el que el tampón Tris se encuentra presente en una concentración de 0,01 M a 0,05 M de la composición.
5. La composición de la reivindicación 1, que además comprende cloruro sódico.
6.

La composición de la reivindicación 5, en el que el cloruro sódico se encuentra presente a una concentración de 0,03 M a 0,15 M de la composición.
7.

La composición de la reivindicación 1, en la que la matriz extracelular está presente en una concentración de 10 mg/ml de la composición.
8.

La composición de la reivindicación 1 que comprende una matriz extracelular; y fibronectina exógena y heparina, en la que la matriz extracelular presenta una concentración de 10 mg/ml, la fibronectina está presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml y la heparina está presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml.
9.

Un sistema de cultivo celular que comprende: un substrato; y un revestimiento sobre él de composición de matriz extracelular como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10.

El sistema de la reivindicación 9, en el que el substrato se escoge en el grupo formado por membranas de celulosa, policarbonato poroso, politetrafluoroetileno poroso, membranas de nailon, filtros de vidrio, polietilentereftalato poroso, polimetilpentano, polipropileno, polietileno y sus combinaciones.
11.

Un método para preparar la composición de matriz extracelular para revestir una superficie que comprende:

(a)

proporcionar una matriz extracelular; y

(b)

combinar la matriz extracelular proporcionada con al menos un componente

exógeno que se escoge en el grupo formado por fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición; y

(c)

ajustar el pH de la composición a un pH de entre 7,8 y 8,5.
12. El método de la reivindicación 11 que comprende además añadir cloruro sódico a la composición.
13. Un método de preparación de un sistema de cultivo celular que comprende:

(a)

proporcionar la composición de matriz extracelular como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(b)

aplicar la composición al substrato; y

(c)

incubar la composición aplicada para permitir su polimerización.
14.

El método de la reivindicación 13, en el que la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 22ºC a 37ºC.
15.

El método de la reivindicación 13, en el que la composición comprende además un tampón Tris a una concentración suficiente para tamponar dentro del intervalo de pH básico.
16.

El método de la reivindicación 13, en el que la composición comprende además cloruro sódico.
17.

El método de la reivindicación 13, en el que el substrato se escoge en el grupo formado por membranas de celulosa, policarbonato poroso, politetrafluoroetileno poroso, membranas de nailon, filtros de vidrio, polietilentereftalato poroso, polimetilpentano, polipropileno, polietileno y sus combinaciones.