ES2348573T3 - Uso de condiciones hiperbaricas para proporcionar neuroproteccion. - Google Patents

Abstract

El uso de un gas noble para la fabricación de un medicamento para la administración en condiciones hiperbáricas para proporcionar neuroprotección.

Description

Uso de condiciones hiperbáricas para proporcionar neuroprotección.

La presente invención se refiere al uso de condiciones hiperbáricas y, en particular, a la administración de gases nobles bajo condiciones hiperbáricas, para proporcionar neuroprotección, en particular neuroprotección contra daño neuronal resultante de un trauma por impacto en la cabeza o la columna vertebral.

El tratamiento satisfactorio de traumatismos craneoencefálicos (TCE) representa una gran necesidad clínica insatisfecha. Se ha estimado que cada año, sólo en Estados Unidos, aproximadamente 1,5 millones de personas sufrirán TCE. Por lo menos el 15% será hospitalizado y el 3% morirá. Para aproximadamente 80.000 de los que son hospitalizados y sobreviven, la lesión presagiará el comienzo de una incapacidad a largo plazo. Un número significativo de ésos lesionados pero que no son hospitalizados también es probable que sufran problemas significativos de asistencia médica.

Una de las dificultades en el desarrollo de estrategias para tratar traumatismos craneoencefálicos es la naturaleza sumamente heterogénea tanto de la lesión inicial como de su evolución patológica subsiguiente. Los traumatismos craneoencefálicos fuertes peligrosos para la vida implicarán inevitablemente mecanismos de evolución de lesiones que difieren de los que se producen como consecuencia de una contusión moderada. Sin embargo, se cree que están implicados varios mecanismos comunes neuronales y bioquímicos. Parece ser que generalmente se acepta que, aunque la lesión principal provocará un daño mecánico inmediato tanto al tejido de la vasculatura como al neuronal, detrás viene una compleja serie de propagación en cascada de daños que interactúan activados por, entre otras cosas, la isquemia, la axotomía y el edema cerebral. El hecho de que estos procesos lleven a una lesión "secundaria" en evolución ha dado alguna esperanza a que las intervenciones puedan ser ideadas para detener la evolución de la lesión o minimizar su impacto.

El xenón es un gas noble (y por tanto en general químicamente inerte) cuyas propiedades anestésicas se han conocido durante más de 50 años. Desde el descubrimiento de que el xenón es un antagonista efectivo de receptores de NMDA, ha habido un creciente interés en su uso potencial como neuroprotector. Se ha mostrado que el xenón reduce las lesiones neuronales en una variedad de modelos en vitro y en vivo, y tiene varias características atractivas, incluyendo el hecho de que puede introducirse rápidamente en el cerebro y no puede metabolizarse. Se ha mostrado que es efectivo en modelos que implican hipoxia y/o isquemia.

El documento WO-A-01/08692 describe el uso de xenón como un neuroprotector, inhibidor de la plasticidad sináptica y antagonista de receptor de NMDA. Se indica que la activación de receptores de NMDA es un resultado de la hipoxia e isquemia que sigue a un trauma craneoencefálico, golpe y paro cardíaco, y de que los antagonistas de receptor de NMDA son neuroprotectores bajo muchas circunstancias clínicamente pertinentes, inclusive la isquemia, el trauma cerebral, estados neuropáticos y determinados tipos de convulsiones.

El documento WO-A-03/092707 describe el uso de xenón para el control de déficits neurológicos asociados con baipás cardiopulmonar.

El documento WO-A-06/018655 describe el uso de xenón en la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar uno o varios déficits neurológicos anestésicos inducidos.

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un gas noble para el fabricación de un medicamento para la administración bajo condiciones hiperbáricas para proporcionar neuroprotección.

Sorprendentemente se ha encontrado que la administración de xenón bajo condiciones hiperbáricas moderadas proporciona efectos neuroprotectores significativamente aumentados. Además, se ha encontrado que la administración de otros gases nobles, tales como helio en particular, bajo condiciones hiperbáricas también tiene un efecto neuroprotector significativo. Hasta donde los inventores saben, ni el efecto neuroprotector de condiciones hiperbáricas, ni la capacidad de los gases nobles distintos al xenón para proporcionar neuroprotección bajo tales condiciones, se ha sugerido o predicho anteriormente.

Los gases nobles consisten en los elementos que se encuentran bajo el Grupo 18 de la tabla periódica, es decir los gases nobles actualmente conocidos son helio, neón, argón, criptón, xenón y radón.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "neuroprotección" significa proteger una entidad neural, tal como una neurona, en el lugar de la lesión, por ejemplo una lesión isquémica o traumática. El término "administración bajo condiciones hiperbáricas" significa la administración al paciente mientras está expuesto a un ambiente hiperbárico, tal como cuando el paciente está dentro de una cámara hiperbárica. Los términos "hiperbárico" y "normobárico" tienen su significado ordinario en la técnica, es decir normobárico significa una presión igual a aproximadamente 1 atm (presión atmosférica normal a nivel del mar; aproximadamente 0,1 MPa) e hiperbárico significa una presión por encima de la presión normobárica.

En una realización preferida, la neuroprotección es contra el daño neuronal resultante de un trauma por impacto.

En una realización preferida, las condiciones hiperbáricas constituyen una presión de no más de aproximadamente 3 atm (0,3 MPa). Más preferiblemente las condiciones hiperbáricas constituyen una presión de entre aproximadamente 1,5 atm (0,15 MPa) y aproximadamente 2,8 atm (0,28 MPa), todavía más preferiblemente de aproximadamente 2,0 atm (0,20 MPa) a aproximadamente 2,5 atm (0,25 MPa), y más preferiblemente de aproximadamente 2,2 atm (0,22 MPa) a aproximadamente 2,3 atm (0,23 MPa).

El medicamento es preferiblemente un medicamento gaseoso para la administración por inhalación o inhalación simulada. Como alternativa, cuando el gas noble es xenón se puede administrar vía parenteral mediante inyección o vía transdérmica como se conoce en la técnica. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "inhalación simulada" se refiere a esas situaciones en las que un paciente es o puede ser incapaz de respirar sin asistencia, y por lo tanto se coloca en una máquina de circulación extracorpórea (también conocida como máquina de baipás cardiopulmonar u bomba oxigenadora) o dispositivo semejante. En tales circunstancias, el medicamento gaseoso se administra al oxigenador de la máquina de circulación extracorpórea, que simula la función de los pulmones del paciente al permitir que el oxígeno (y el gas noble) se difundan dentro (y el dióxido de carbono se difunda fuera) de la sangre aspirada del paciente. La sangre enriquecida con oxígeno se bombea a continuación de nuevo al paciente.

En una realización preferida, el gas noble es xenón, helio o una mezcla de xenón y helio. Cuando el gas noble comprende xenón, la presión parcial de xenón en el medicamento administrado es preferiblemente no más de aproximadamente 0,8 atm (0,08 MPa). Preferiblemente la presión parcial de xenón en el medicamento administrado es de aproximadamente 0,1 atm (0,01 KPa) a aproximadamente 0,7 atm (0,07 MPa), más preferiblemente de aproximadamente 0,2 atm (0,02 MPa) a aproximadamente 0,6 atm (0,06 MPa), más preferiblemente aproximadamente 0,4 atm (0,04 MPa). Cuando el gas noble comprende helio, el helio a presión parcial en el medicamento administrado es preferiblemente tal como se necesita para llevar la presión total del medicamento administrado a presiones iguales a las condiciones hiperbáricas preferidas, tal como se ha explicado anteriormente.

En una realización, el gas noble se mezcla con aire con el fin de proporcionar un medicamento administrado con una presión parcial de aire de aproximadamente 1 atm (0,1 MPa). Esto se consigue añadiendo el gas noble al aire normobárico con el fin de proporcionar una mezcla hiperbárica. En las realizaciones en las que el gas noble es sólo xenón, se prefiere que el medicamento se administre a una presión de entre aproximadamente 1,2 atm (0,12 MPa) y aproximadamente 2 atm (0,2 MPa), más preferiblemente de aproximadamente 1,4 (0,14 MPa) a aproximadamente 1,8 atm (0,18 MPa). Mientras esto puede tener como resultado una presión parcial de xenón ligeramente por encima de las presiones parciales preferidas explicadas anteriormente, los inventores han encontrado que esto se compensa mediante los efectos beneficiosos de las condiciones hiperbáricas generales. Las condiciones hiperbáricas generales están, en este caso, preferiblemente ligeramente por debajo de las condiciones hiperbáricas generalmente más preferidas, de nuevo como se ha explicado anteriormente, ya que los inventores también han encontrado que si se utilizan niveles demasiado altos de xenón entonces, sorprendentemente, el xenón puede exhibir efectos
neurotóxicos.

En otra realización, el gas noble se mezcla con un gas o mezcla de gases que comprende oxígeno para proporcionar un medicamento administrado que tenga una presión parcial de nitrógeno igual o menor a aproximadamente 0,8 atm (0,08 MPa). Preferiblemente el medicamento administrado tiene una presión parcial de nitrógeno de menos de aproximadamente 0,4 atm (0,04 MPa), y más preferiblemente la mezcla de gases es en esencia sin nitrógeno. Los inventores encontraron que el nitrógeno parece exacerbar las lesiones neuronales, y por lo tanto se prefiere que la presencia de este gas se minimice.

Preferiblemente, la presión parcial de oxígeno en el medicamento administrado es aproximadamente 0,2 atm (aproximadamente 0,02 MPa, es decir igual que en el aire normobárico).

Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para proporcionar neuroprotección que comprende colocar a un paciente necesitado de neuroprotección en un ambiente hiperbárico.

Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto sorprendentemente que las condiciones hiperbáricas tienen de por sí un efecto neuroprotector. Además, se ha descubierto que este efecto neuroprotector es lo suficientemente fuerte como para, dentro de ciertos intervalos de presión, incluso si las condiciones hiperbáricas se logran sin agregar un gas noble y agregando en su lugar un gas que contiene nitrógeno (que, como se ha señalado anteriormente, se ha encontrado que exacerba el daño neuronal) las condiciones hiperbáricas serán suficientes para proporcionar un efecto neuroprotector mejorado a pesar el aumento de exposición al nitrógeno.

De este modo, en una realización el ambiente hiperbárico puede consistir en aire hiperbárico o una mezcla hiperbárica de aire y nitrógeno añadido. Cuando el ambiente hiperbárico consiste en una mezcla de aire normobárico y nitrógeno agregado, que es inhalado por el paciente, se prefiere que la presión del ambiente hiperbárico no sea más de aproximadamente 2,8 atm (0,28 MPa).

En una realización mucho más preferida, sin embargo, el método comprende además administrar un gas noble al paciente mientras el paciente está en el ambiente hiperbárico.

Otras características preferidas del segundo aspecto de la presente invención, tales como, pero no limitadas a, las condiciones hiperbáricas, las condiciones para ser tratadas y la composición y presión administrada del gas o la mezcla de gases que comprende el gas noble, son tal como se explican anteriormente en relación con el primer aspecto de la presente invención.

Según un tercer aspecto, la presente invención proporciona un aparato que comprende: una cámara hiperbárica adecuada para albergar un paciente humano o animal; un recipiente que contiene xenón; y medios para administrar el xenón a un paciente dentro de la cámara.

El aparato es, en particular, adecuado para llevar a cabo el método del segundo aspecto de la invención, en el que el método comprende administrar un gas noble que comprende xenón.

En una realización, los medios de suministro de xenón comprenden una mascarilla o boquilla en comunicación de flujo con una salida al recipiente, para permitir la inhalación de xenón por el paciente.

En otra realización, los medios de suministro de xenón comprenden un conducto que permite que el xenón del recipiente se mezcle con la atmósfera dentro de la cámara.

En una realización adicional, los medios de suministro de xenón comprenden una máquina de circulación extracorpórea. El funcionamiento de tal máquina se ha descrito brevemente anteriormente.

La invención se describe aún más a continuación mediante un ejemplo no limitativo, haciendo referencia a las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1 representa, en vista general (A) y en una vista de primer plano de parte de la misma (B), un aparato experimental utilizado para inducir lesiones focales reproducibles en explantes (rodajas) organotípicos de cerebro;

La Figura 2 es un gráfico que muestra la distribución de la intensidad fluorescente para dos explantes de hipocampo impregnados con yoduro de propidio (PI), uno con trauma focal y uno sin él, 72 horas después del trauma - también se muestran (adiciones) imágenes fluorescentes de un explante de hipocampo sin trauma (superior izquierda) y con trauma (inferior izquierda), y un gráfico (superior derecho) de yoduro de propidio impregnando células permeabilizadas con etanol al 70%;

Las Figuras 3A y B son gráficas de barras que muestran (A) la evolución de la lesión incluyendo el lugar de la lesión focal ("lesión total") y (B) la evolución de la lesión excluyendo el lugar de la lesión focal ("lesión Secundaria");

La Figura 4 es un gráfico que muestra los efectos de presiones agregadas de helio y nitrógeno en la evolución de la lesión total; y

La Figura 5 es un gráfico que muestra los efectos de presiones agregadas de xenón en la evolución de la lesión total.

Las propiedades del xenón y otros gases se investigaron en un modelo in vitro de lesión cerebral traumáticas (como se describe a continuación con mayor detalle, bajo el título "Ejemplo"). El modelo elegido implicó crear un trauma mecánico focal se centró en la región CA1 de explantes cultivados de cerebro de hipocampo, y valorar la lesión neurológica utilizando impregnación de yoduro de propidio. El aparato utilizado para inducir la lesión focal en los explantes cerebrales organotípicos se muestra en la Figura 1. Un pequeño solenoide retiene una aguja 5 mm encima de un explante de hipocampo cultivado que se coloca utilizando un micromanipulator. Una fuente de luz por fibra óptica ilumina la explante desde abajo. Como se muestra en (B) la aguja está restringida en un capilar de cristal y situada justo por encima de la zona CA1 del hipocampo.

Los explantes cerebrales de hipocampo después de dos semanas en cultivo, denominados explantes organotípicos, mantienen las poblaciones heterogéneas de células cuyos contactos sinápticos reflejan, por lo menos hasta cierto punto, el estado en vivo. Representan un compromiso útil entre modelos que utilizan cultivos de células disociadas y los que utilizan animales intactos. La naturaleza del traumatismo focal y la subsiguiente lesión secundaria de evolución lenta, soporta una relación suficientemente próxima con la situación en vivo para proporcionar un modelo útil en el que se pueden ensayar posibles tratamientos. Una limitación del modelo es que excluye cualquier recorrido de lesión que sea como resultado de isquemia y/o hipoxia, o sea como resultado de cambios en parámetros sistémicos (por ejemplo presión sanguínea) y se centra principalmente en el componente mecánico de la lesión. El xenón, sin embargo, ya se ha mostrado efectivo en modelos que implican hipoxia e isquemia, aunque no se sabía si el xenón mostraría alguna eficacia particular en el modelo actual de traumatismo cerebral.

La Figura 2 muestra la distribución de la intensidad fluorescente para dos explantes de hipocampo impregnados con yoduro de propidio (PI). Un explante se sometió a un traumatismo focal y otro no, las imágenes se tomaron 72 horas después del traumatismo. El PI es una tinta de membranas impermeables que sólo puede entrar en células con membranas celulares dañadas, que se vuelve sumamente fluorescente al unirse al ADN y que por tanto puede usarse para cuantificar el daño celular en términos de fluorescencia. Como se ilustra en la Figura 2, el trauma produjo un cambio marcado hacia la derecha en la distribución de intensidad.

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Las Figuras 3A y B trazan la evolución de lesiones en los explantes de hipocampo con el tiempo. La Figura 3A muestra la evolución de lesiones, incluyendo el lugar de la lesión focal ("lesión total"), y la Figura 3B muestra la evolución de la lesión excluyendo el lugar de la lesión focal ("Lesión secundaria"). Las barras continuas representan los datos obtenidos para explantes mantenidos a 37ºC, mientras que las barras abiertas representan los datos obtenidos para explantes mantenidos a 32ºC. Las barras con la etiqueta "sin trauma" representan datos de explantes cerebrales que no han sufrido una lesión traumática. La línea discontinua en la Figura 3A representa la lesión total en condiciones de control después de 72 h (a 37ºC), que se ha normalizado a la unidad (como se describe a continuación con más detalle). Las barras de error son SEM (error estándar de la media) y los datos son de un promedio de 12 explantes.

Al cabo de varias horas de haber inducido la impregnación brillante punteada de yoduro de propidio era evidente, un patrón de impregnación que ha resultado estar buena correlación con el daño neuronal evaluado mediante cambios morfológicos. La lesión aumentó lentamente con el tiempo y aproximadamente se duplicó entre las 24 h y 72 h (Figura 3A). Cuando la zona del explante centrada en el punto focal de la lesión se excluyó del análisis, la evolución de la lesión fue aún más dramática. Esta lesión secundaria lejana del lugar del trauma mecánico, que comienza desde niveles de referencia, aumentó progresivamente (Figura 3B).

La diferencia entre esta lesión secundaria y la lesión total que incluía la zona cercana al punto focal del trauma fue especialmente evidente cuando se investigaron los efectos de someter los explantes cerebrales a temperaturas equivalentes a moderada hipotermia. Cuando los explantes cerebrales se incubaron a 32ºC después del traumatismo, la lesión secundaria casi se eliminó por completo (Figura 3B). Por el contrario, este nivel de hipotermia redujo la lesión total en una cantidad más limitada (Figura 3A), presumiblemente debido a que la lesión inicial mecánica que fue causada por el trauma focal era irreversible.

Los efectos neuroprotectores de la hipotermia se conocen bien y se han mostrado en una variedad de modelos de laboratorio de lesiones. De hecho, una observación similar se ha hecho antes utilizando un modelo equivalente al empleado en esta memoria, aunque el hallazgo de que la hipotermia es mucho más eficaz contra lesiones secundarias que contra lesiones primarias va un paso más allá que los hallazgos de los estudios anteriores.

Una vez establecido un protocolo de ensayo que produjo una lesión consistente y reproducible, se investigaron los efectos de variar otros factores. Lo más sorprendente, fue encontrar que someter los explantes cerebrales a las presiones añadidas de helio (añadiendo helio al aire normobárico para proporcionar un ambiente hiperbárico) proporcionó neuroprotección potente (Figura 4). La Figura 4 muestra los efectos de las presiones añadidas (presión añadida a 1 atm (0,01 MPa) de aire) de helio y nitrógeno en la evolución de la lesión total. Los efectos del helio se muestran como símbolos circulares abiertos y los del nitrógeno se muestran como símbolos circulares llenos. Las líneas continuas se dibujan a ojo. Las barras de error son SEM para un promedio de 14 rebanadas.

Los efectos del helio añadido se consideran efectos de la presión añadida por sí misma por varias razones. Se acepta ampliamente que, incluso a altas presiones, el helio es poco probable que ejerza ningún efecto farmacológico directo, debido a su muy baja solubilidad en los tejidos biológicos. De hecho, cuando los efectos del helio se han comparado directamente con los de la presión hidrostática, casi siempre se ha llegado a la conclusión de que cualquier efecto observado se debe a la presión por sí misma. Los efectos excitables de las altas presiones (el denominado síndrome nervioso por alta presión) se conocen bien entre los buceadores, pero estos efectos generalmente se producen a presiones ligeramente superiores a las utilizadas en las actuales investigaciones. Sin embargo, los efectos significativos sobre la excitabilidad neuronal se han descrito utilizando sistemas in vitro en los intervalos de presión que se utilizan en esta memoria. Si bien los efectos de la presión son complejos, un hallazgo consistente es que las sinapsis excitadoras se reducen, muy probablemente debido a la supresión de la liberación de neurotransmisores. Las reducciones de los niveles de glutamato podrían ser un neuroprotector ya que tendería a mitigar la excitotoxicidad y, sin estar sujeto a ninguna teoría, esto puede ser la base de la neuroprotección observada en hasta un máximo de 2 atm (0,2 MPa) de presión añadida.

Puesto que el helio a estas bajas presiones es poco probable que ejerza ningún efecto por sí solo, el resultado de lesión significativamente peor que se produjo cuando el helio fue sustituido por nitrógeno (Figura 4) es probablemente debido a algún efecto perjudicial del nitrógeno por sí mismo. La línea discontinua de la Figura 4 se construye restando los efectos del helio (que se considera que son los efectos de la presión por sí misma) de los efectos del nitrógeno para dar el efecto teórico de aumentar los niveles de nitrógeno por sí mismos (es decir, excluyendo los efectos concurrentes del aumento de presión).

Como el nitrógeno tiene una solubilidad en grasa considerablemente mayor que el helio (lo que implica un reparto más elevado en el tejido cerebral), y como los efectos de la narcosis del nitrógeno son evidentes a sólo una pocas atmósferas, tal vez no sea sorprendente que incluso bajas presiones de nitrógeno ejerzan algunos efectos farmacológicos, aunque no se podía predecir si estos eran beneficiosos o perjudiciales. Si el nitrógeno es en efecto nocivo, entonces su sustitución por helio debe ser neuroprotectora incluso con presiones normobáricas, y en cierta medida inversa a los efectos nocivos que pueden predecirse a partir de la línea discontinua en la Figura 4 de la presión parcial normobárica del nitrógeno. Cuando este experimento se llevó a cabo el nivel observado de lesión (a las 72 horas) en un explante cerebral expuesto a aire normobárico con helio sustituido por nitrógeno (0,67 \pm 0,10) fue en realidad muy cercano a lo predicho teóricamente (0,75).

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También se investigaron los efectos de las presiones añadidas de xenón en la evolución de lesiones totales, los resultados se muestran en la Figura 5. La línea discontinua en la Figura 5 se construye restando los efectos, como se muestra en la Figura 4, del helio (que se supone serán los de la presión por sí misma) de los efectos del xenón para dar el efecto teórico de los niveles de xenón aumentados por sí mismos (es decir, excluyendo los efectos concurrentes del aumento de presión). Las barras de error son SEM para un promedio de 13 rebanadas. Como muestran los datos de la Figura 5, el xenón exhibió neuroprotección marcada a bajas presiones, pero luego mostró toxicidad a la máxima presión utilizada. Ambas características, neuroprotección y toxicidad, se deben al propio xenón como se muestra mediante la línea discontinua en la Figura 5. La toxicidad del xenón no se ha informado anteriormente, aunque en el conocimiento de los inventores, esos altos niveles de xenón no se habían probado anteriormente.

Detalles adicionales de las investigaciones anteriores se proporcionan a continuación.

Ejemplo Materiales y Métodos

A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Company Ltd. (Poole, Dorset, UK.)

Explantes organotípicos de hipocampo

Se prepararon cultivos organotípicos de explantes de hipocampo según lo informado por Stoppini L, y otros en "Un método simple para cultivos organotípicos del tejido nervioso" Métodos J Neurosci 1991; 37:173-82, con algunas modificaciones. En resumen, se extrajeron los cerebros de crías de ratones C57/BL6 de siete días de vida (Harlan UK Ltd., Bicester, Oxfordshire, Reino Unido) y se colocaron en un "preparado" en el punto de congelación. El medio preparado contenía solución salina equilibrada de Gey y 5 mg ml-1 D-glucosa (BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Reino Unido). El hipocampo se extrajo de los cerebros y se prepararon explantes transversales de 400\mum de espesor utilizando un troceador de tejido McIllwain. Los explantes se transfirieron a un medio de preparación en el punto de congelación, se separaron con cuidado y luego se colocaron sobre inserciones de cultivo de tejidos (Millicell-CM, Millipore Corporation, Billerica, MA), que se insertaron en una placa de seis pocillos de cultivo de tejidos. Los pocillos contenían un medio de "crecimiento" que consistía en 50% de Minimal Essential Media Eagle, 25% de solución salina equilibrada de Hank, 25% de suero de caballo inactivado, 2 mM de L-glutamina, 5 ml mg^{-1} D-glucosa (BDH) y 1% de suspensión antibiótica antimicótica. Los explantes se incubaron a 37ºC en una atmósfera húmeda 95% aire/5% CO_{2}. El medio de crecimiento se cambió cada tres días. Los experimentos se llevaron a cabo después de 14 días de cultivo.

Lesión traumática y cámara hiperbárica de gas

Después de que los explantes de hipocampo habían estado en el cultivo durante 14 días, el medio de crecimiento se cambió a medio "experimental". El medio experimental era sin suero y consistió en el 75% de Minimal Essential Eagle Media, el 25% de solución salina equilibrada de Hank, 2 mg de L-glutamina, 5 mg ml^{-1} D-glucosa, 1% de suspensión antibiótica antimicótica y 4,5 \muM yoduro de propidio.

El trauma de los explantes se produjo con un aparato especialmente diseñado (Figura 1), que se basó en memorias descriptivas publicadas (Adamchik Y, y otros "Métodos para inducir daño traumático principal y secundario en cultivos organotípicos de explantes de hipocampo" protocolo de investigación en cerebros (Brain Res Brain Res Protoc) de 2000; 5:153-8 y Adembri C, y otros "La eritropoyetina atenúa lesiones post-traumáticas en explantes organotípicos de hipocampo" J Neurotrauma 2004; 21:1103-1220,21). Bajo un microscopio estereoscópico se colocó una aguja de 5 mm por encima de la zona CA1 del hipocampo utilizando un micromanipulador de tres ejes. La aguja cayó sobre el explante con un impacto de 3,5 \muJ cuando se cortó la alimentación a un pequeño electroimán. Esta energía se seleccionó de manera que la aguja cayera sobre el tejido y no rebotara; esto produjo una lesión traumática focal consistente y reproducible. La parte distal de la aguja era suave y redondeada con el fin de evitar la perforación del explante y el impacto produjera una lesión focal con un diámetro de 750 \pm 17 \mum (media \pm DE).

Después de hacer el traumatismo en la zona CA1, las bandejas de cultivo se transfirieron a una pequeña cámara a presión que contenía un ventilador de alta velocidad para una rápida mezcla de gases. La cámara a presión fue capaz de mantener una presión constante de hasta seis atmósferas durante varios días. La cámara a presión se alojó en una incubadora que se ajustó a 37ºC para los experimentos normotérmicos ó 32ºC para los experimentos a hipotermia moderada. Posteriormente, la cámara a presión (0,925 litros de volumen de gas) se enjuagó con un gas de control humidificado (95% de aire y 5% CO_{2}) durante 5 min a 5 litros min^{-1} que asegura una sustitución de gas de más del 99,99%. Después del enjuague, la cámara a presión se cerró, y los explantes en estas condiciones se consideraron que eran los "controles de lesión" (75% de nitrógeno/20% de oxígeno/5% de CO_{2}).

Para los experimentos en condiciones hiperbáricas, la cámara se presurizó con gas experimental (xenón, helio o nitrógeno entre 0,25 atm (0,025 MPa) y 2 atm (0,2 MPa), agregado adicionalmente a la 1 atmósfera (0,1 MPa) de 95% de aire/5% de CO_{2} y a continuación se cerró. Para probar los efectos del helio y el xenón en condiciones normobáricas, la cámara a presión se enjuagó con mezclas de gases humidificados que contenían ya se 75% de helio/20% de oxígeno/5% de CO_{2} o 75% de xenón/20% de oxígeno/5% de CO_{2} durante cinco minutos y luego se cerró.

Después de 24 horas en la cámara, los explantes se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (como se describe con más detalle a continuación). Después de completar la toma de imágenes, los explantes se transfirieron de nuevo a la cámara a presión y se restablecieron la mezcla de gases y la presión adecuadas. Este procedimiento se repitió a las 48 h y 72 h tras el trauma. Cabe señalar que, para todas las mezclas de gases y todas las presiones, las presiones parciales de oxígeno y dióxido de carbono se fijaron en 0,2 atm (0,02 MPa) y 0,05 atm (0,005 MPa), respectivamente.

Cuantificación de la lesión celular

El yoduro de propidio (PI) es una tinta de membrana impermeable que sólo entra en células con las membranas celulares dañadas. Dentro de las células se une principalmente al ADN y se convierte en altamente fluorescente, con un espectro máximo de emisión en la zona roja del espectro visible. Se utilizó un microscopio de epi-iluminación (Nikon Eclipse 80, Kingston upon Thames, Surrey, Reino Unido), y un objetivo de baja potencia (x2) para visualizar la fluorescencia del PI. Se utilizaron una cámara de vídeo digital y software (cámara Micropublisher 3.3 RTV y software QCapture Pro, Burnaby, Columbia Británica, Canadá) para capturar las imágenes. Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov). Se registraron los canales rojo, verde y azul, pero sólo se utilizó el canal rojo y la distribución de intensidades se representó gráficamente en un histograma con 256 niveles de
intensidad.

Los explantes bajo condiciones de control estándar (incubados en la cámara durante 72 h a 37ºC con 95% de aire y 5% CO_{2}) mostraron un pico bien definido en la distribución de intensidad (Figura 2), que experimentó una fuerte caída a cero. Por el contrario, después del traumatismo, el pico de la distribución de la intensidad fue menor, más amplio y desviado a niveles de intensidad más altos (Figura 2).

Como medida del traumatismo, se integró el número de píxeles por encima de un umbral de intensidad de 150 (indicado mediante la flecha y la línea discontinua en la Figura 2), que en las condiciones experimentales utilizadas proporcionó una medición cuantitativa robusta de la fluorescencia del PI, y por tanto de lesión celular. La lesión se pudo expresar entonces en relación con la lesión total observada después de 72 horas bajo condiciones de control (75% de nitrógeno, 20% de oxígeno y el 5% de CO_{2}; 1 atm (0,1 MPa); y 37ºC), que se normalizó a la unidad. Así, por ejemplo, si bajo un determinado conjunto de condiciones de prueba el número integrado de píxeles por encima de un umbral de intensidad de 150 (calculado como anteriormente) es la mitad que el presente bajo condiciones de control, la lesión producida por las condiciones de prueba se caracterizó como el 0,5 de la lesión normalizada.

Se utilizaron dos medidas diferentes de lesión: La lesión "total", que se define como el incremento de la fluorescencia sobre el explante entero; y la lesión "secundaria", que fue el aumento de fluorescencia en el explante pero con exclusión de la zona que cubre la lesión focal. La zona que cubre la lesión focal se excluyó mediante el enmascaramiento de la zona de lesión focal en la imagen antes de la integración. La máscara era un círculo con un diámetro de 1000 mm (esquema representado mediante el círculo de puntos en la imagen inferior de la Figura 2), que era lo suficientemente grande para cubrir la zona de la lesión focal.

Debido a que la producción de luz de la lámpara de mercurio cambió con el tiempo, el tiempo de exposición se ajustó para tenerlo en cuenta. Esto se hizo mediante el registro de la fluorescencia de un portaobjetos de vidrio estándar (Fluor-Ref, Omega Optical, Brattleboro, VT) y ajustando el tiempo de exposición correspondientemente.

Resultados

A las tres horas de producir la lesión focal, el aumento de fluorescencia en el lugar de la lesión era evidente, lo que indicaba una lesión celular casi inmediata en esta zona. La intensidad de la fluorescencia siguió aumentando lentamente, sin embargo, tanto en la zona de lesión focal como sobre las zonas del explante cerebral distante del lugar de la lesión (lesión "secundaria"). El incremento de lenta evolución de la fluorescencia del PI fue debido al aumento de la lesión celular en lugar del aumento de unión del PI a las células que ya habían muerto. Esto puede deducirse de los datos en el recuadro de la Figura 2, que muestra que cuando las células se permeabilizan utilizando etanol, la unión de PI es muy rápida (con un tiempo medio de unos 7 minutos), y que el equilibrio se completa después de aproximadamente 30 minutos. Por el contrario, la lesión celular después del traumatismo progresa lentamente y sigue aumentando por lo menos durante 72 horas tras la lesión, el punto temporal más largo investigando.

Las barras llenas en la Figura 3A muestran el aumento de la lesión total a 37ºC con el tiempo, normalizado a la lesión observada a las 72 h, mientras que las barras llenas en la Figura 3B muestran una lesión para los mismos explantes, pero cuando la lesión focal se ha excluido del análisis. El daño en ausencia de lesión traumática (con la etiqueta "sin trauma") fue insignificante en todos los puntos temporales. Una comparación de los datos de las Figuras 3A y B muestra que la lesión secundaria constituye una proporción cada vez mayor de la lesión total a medida que pasa el tiempo.

Una hipotermia moderada (32ºC) reduce en gran medida la evolución de la lesión después de 24 horas. Las barras abiertas de la Figura 3A muestran que la evolución de una lesión total con el tiempo es bastante modesta a 32ºC y, por lo tanto, proporcionalmente, la protección por hipotermia se hizo más grande con el aumento del tiempo. Por ejemplo, a las 24 h, la hipotermia redujo la lesión total en cerca de aproximadamente un 46%, mientras que a las 72 h, la hipotermia redujo la lesión en un 62%. La Figura 3B muestra los efectos de la hipotermia en la lesión secundaria. Cuando el lugar focal de la lesión se excluye, se puede observar que los efectos de la hipotermia en la reducción de la lesión son aún más pronunciados. En 72 horas, por ejemplo, la lesión se reduce en más del 96%.

Una vez establecido un protocolo que produjo una lesión consistente y reproducible, se investigaron los efectos del gas noble helio en la evolución de las lesiones. Los resultados se presentan en la Figura 4, en la que los símbolos circulares abiertos muestran que para presiones de hasta aproximadamente 1 atm (0,1 MPa) de helio añadido, la lesión disminuyó, pero a medida que se añadieron mayores presiones de helio, la lesión empeoró y volvió cerca de niveles de control a una presión añadida de aproximadamente 2 atm (0,2 MPa; aproximadamente 3 atm (0.3 MPa) de presión total). Los experimentos se repitieron a continuación, excepto con nitrógeno sustituido por helio. Cualitativamente los efectos del nitrógeno fueron muy similares (símbolos circulares llenos en la Figura 4) a los observados con el helio, aunque en todas las presiones el resultado fue significativamente peor.

Debido a que el helio es más probable que ejerza un efecto farmacológico en estas bajas presiones, es razonable concluir que los efectos observados con el helio se deben a la presión por sí misma. Sobre esta base, el efecto teórico de niveles de nitrógeno en aumento (independiente de los efectos de la presión) se calculó (línea discontinua en la Figura 4) restando los efectos del helio (que constituyen los efectos de la presión añadida por sí misma) de los efectos de las presiones añadidas de nitrógeno. El nitrógeno por lo tanto se puede ver que es perjudicial de una manera que es más o menos lineal con cantidades cada vez mayores. De ello se deduce que si el helio sustituye al nitrógeno en el aire en condiciones normobáricas entonces se prevé que esto también sea neuroprotector, aunque sólo sea porque estaba reemplazando a los efectos nocivos del nitrógeno normalmente presente en el aire. Esta predicción fue evaluada utilizando una mezcla de 75% de helio/20% de oxígeno/5% de CO_{2}, de lo que se constató que el grado observado de lesiones normalizadas después de 72 horas (0,67 \pm 0,10) era de hecho cercano al previsto simplemente por la ausencia de nitrógeno (0,75).

A continuación, se investigaron los efectos del xenón, que como se ha señalado anteriormente se ha demostrado tener propiedades neuroprotectoras en una variedad de modelos in vitro y en vivo de lesiones neuronales. Los resultados se presentan en la Figura 5, y muestran que bajas presiones añadidas de xenón proporcionan neuroprotección marcada, pero que esta tendencia se invirtió en la presión más alta probada en la que se observó significativa neurotoxicidad.

Siguiendo la lógica destacada anteriormente, el efecto teórico de niveles de xenón aumentados (independiente de los efectos de la presión) también se puede calcular restando los efectos del helio (que se ha concluido que es el efecto de la presión por sí misma). El resultado de este cálculo se muestra como la línea discontinua en la Figura 5. La validez de este análisis también se puede probar mediante la medición de la neuroprotección ofrecida por el 75% de xenón en condiciones normobáricas. La protección que se prevería sería la que se esperaba de este nivel de xenón (calculada a partir de la línea discontinua en la Figura 5), además de las ventajas de eliminar el efecto nocivo del nitrógeno en el mismo nivel (calculado a partir de la línea discontinua de la Figura 4) ya que en este caso el xenón estaría sustituyendo al nitrógeno. El nivel previsto de lesión después de 72 horas se calcula que es 0,59 y el grado observado de lesión resultó ser 0,50 \pm 0,04, un acuerdo razonable entre los valores predichos y los experimentales.

Si bien la invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones concretas, se apreciará que pueden hacerse variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

Claims (15)

1. El uso de un gas noble para la fabricación de un medicamento para la administración en condiciones hiperbáricas para proporcionar neuroprotección.

2. Un uso según la reivindicación 1, en el que la neuroprotección es contra el daño neuronal resultante de un trauma por impacto.

3. Un uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que las condiciones hiperbáricas constituyen una presión no superior a 0,3 MPa.

4. Un uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el medicamento es un medicamento gaseoso para la administración por inhalación o inhalación simulada.

5. Un uso según la reivindicación 4, en el que el gas noble es xenón, helio o una mezcla de xenón y helio.

6. Un uso según la reivindicación 5, en el que el gas noble es xenón o una mezcla de xenón y helio, y la presión parcial del xenón en el medicamento administrado no es más de 0,08 MPa.

7. Un uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gas noble se mezcla con aire con el fin de proporcionar un medicamento administrado con una presión parcial de aire de aproximadamente 0,1 MPa.

8. Un uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gas noble se mezcla con un gas o una mezcla de gases que comprende oxígeno para proporcionar un medicamento administrado con una presión parcial de nitrógeno igual o inferior a 0,08 MPa.

9. Un uso según la reivindicación 8, en el que la mezcla de gases es esencialmente sin nitrógeno.

10. Un uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que la presión parcial de oxígeno en el medicamento administrado es aproximadamente 0,02 MPa.

11. Un gas noble para su uso en la prestación de neuroprotección mediante la administración en condiciones hiperbáricas.

12. El gas noble de la reivindicación 11, en el que la neuroprotección es contra el daño neuronal resultante de un traumatismo por impacto.

13. El gas noble de la reivindicación 11 ó 12, en el que las condiciones hiperbáricas constituyen una presión no superior a 0,3 MPa.

14. El gas noble según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gas noble es para la administración mediante inhalación o inhalación simulada.

15. El gas noble según la reivindicación 14, en el que el gas noble se define además en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.