ES2348573T3 - Uso de condiciones hiperbaricas para proporcionar neuroproteccion. - Google Patents
Uso de condiciones hiperbaricas para proporcionar neuroproteccion. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un gas noble para la fabricación de un medicamento para la administración en condiciones hiperbáricas para proporcionar neuroprotección.
Description
Uso de condiciones hiperbáricas para
proporcionar neuroprotección.
La presente invención se refiere al uso de
condiciones hiperbáricas y, en particular, a la administración de
gases nobles bajo condiciones hiperbáricas, para proporcionar
neuroprotección, en particular neuroprotección contra daño neuronal
resultante de un trauma por impacto en la cabeza o la columna
vertebral.
El tratamiento satisfactorio de traumatismos
craneoencefálicos (TCE) representa una gran necesidad clínica
insatisfecha. Se ha estimado que cada año, sólo en Estados Unidos,
aproximadamente 1,5 millones de personas sufrirán TCE. Por lo menos
el 15% será hospitalizado y el 3% morirá. Para aproximadamente
80.000 de los que son hospitalizados y sobreviven, la lesión
presagiará el comienzo de una incapacidad a largo plazo. Un número
significativo de ésos lesionados pero que no son hospitalizados
también es probable que sufran problemas significativos de
asistencia médica.
Una de las dificultades en el desarrollo de
estrategias para tratar traumatismos craneoencefálicos es la
naturaleza sumamente heterogénea tanto de la lesión inicial como de
su evolución patológica subsiguiente. Los traumatismos
craneoencefálicos fuertes peligrosos para la vida implicarán
inevitablemente mecanismos de evolución de lesiones que difieren de
los que se producen como consecuencia de una contusión moderada. Sin
embargo, se cree que están implicados varios mecanismos comunes
neuronales y bioquímicos. Parece ser que generalmente se acepta
que, aunque la lesión principal provocará un daño mecánico inmediato
tanto al tejido de la vasculatura como al neuronal, detrás viene
una compleja serie de propagación en cascada de daños que
interactúan activados por, entre otras cosas, la isquemia, la
axotomía y el edema cerebral. El hecho de que estos procesos lleven
a una lesión "secundaria" en evolución ha dado alguna esperanza
a que las intervenciones puedan ser ideadas para detener la
evolución de la lesión o minimizar su impacto.
El xenón es un gas noble (y por tanto en general
químicamente inerte) cuyas propiedades anestésicas se han conocido
durante más de 50 años. Desde el descubrimiento de que el xenón es
un antagonista efectivo de receptores de NMDA, ha habido un
creciente interés en su uso potencial como neuroprotector. Se ha
mostrado que el xenón reduce las lesiones neuronales en una
variedad de modelos en vitro y en vivo, y tiene varias
características atractivas, incluyendo el hecho de que puede
introducirse rápidamente en el cerebro y no puede metabolizarse. Se
ha mostrado que es efectivo en modelos que implican hipoxia y/o
isquemia.
El documento
WO-A-01/08692 describe el uso de
xenón como un neuroprotector, inhibidor de la plasticidad sináptica
y antagonista de receptor de NMDA. Se indica que la activación de
receptores de NMDA es un resultado de la hipoxia e isquemia que
sigue a un trauma craneoencefálico, golpe y paro cardíaco, y de que
los antagonistas de receptor de NMDA son neuroprotectores bajo
muchas circunstancias clínicamente pertinentes, inclusive la
isquemia, el trauma cerebral, estados neuropáticos y determinados
tipos de convulsiones.
El documento
WO-A-03/092707 describe el uso de
xenón para el control de déficits neurológicos asociados con baipás
cardiopulmonar.
El documento
WO-A-06/018655 describe el uso de
xenón en la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o
aliviar uno o varios déficits neurológicos anestésicos
inducidos.
Según un primer aspecto, la presente invención
proporciona el uso de un gas noble para el fabricación de un
medicamento para la administración bajo condiciones hiperbáricas
para proporcionar neuroprotección.
Sorprendentemente se ha encontrado que la
administración de xenón bajo condiciones hiperbáricas moderadas
proporciona efectos neuroprotectores significativamente aumentados.
Además, se ha encontrado que la administración de otros gases
nobles, tales como helio en particular, bajo condiciones
hiperbáricas también tiene un efecto neuroprotector significativo.
Hasta donde los inventores saben, ni el efecto neuroprotector de
condiciones hiperbáricas, ni la capacidad de los gases nobles
distintos al xenón para proporcionar neuroprotección bajo tales
condiciones, se ha sugerido o predicho anteriormente.
Los gases nobles consisten en los elementos que
se encuentran bajo el Grupo 18 de la tabla periódica, es decir los
gases nobles actualmente conocidos son helio, neón, argón, criptón,
xenón y radón.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"neuroprotección" significa proteger una entidad neural, tal
como una neurona, en el lugar de la lesión, por ejemplo una lesión
isquémica o traumática. El término "administración bajo
condiciones hiperbáricas" significa la administración al paciente
mientras está expuesto a un ambiente hiperbárico, tal como cuando
el paciente está dentro de una cámara hiperbárica. Los términos
"hiperbárico" y "normobárico" tienen su significado
ordinario en la técnica, es decir normobárico significa una presión
igual a aproximadamente 1 atm (presión atmosférica normal a nivel
del mar; aproximadamente 0,1 MPa) e hiperbárico significa una
presión por encima de la presión normobárica.
En una realización preferida, la neuroprotección
es contra el daño neuronal resultante de un trauma por impacto.
En una realización preferida, las condiciones
hiperbáricas constituyen una presión de no más de aproximadamente 3
atm (0,3 MPa). Más preferiblemente las condiciones hiperbáricas
constituyen una presión de entre aproximadamente 1,5 atm (0,15 MPa)
y aproximadamente 2,8 atm (0,28 MPa), todavía más preferiblemente de
aproximadamente 2,0 atm (0,20 MPa) a aproximadamente 2,5 atm (0,25
MPa), y más preferiblemente de aproximadamente 2,2 atm (0,22 MPa) a
aproximadamente 2,3 atm (0,23 MPa).
El medicamento es preferiblemente un medicamento
gaseoso para la administración por inhalación o inhalación
simulada. Como alternativa, cuando el gas noble es xenón se puede
administrar vía parenteral mediante inyección o vía transdérmica
como se conoce en la técnica. Tal como se utiliza en esta memoria,
el término "inhalación simulada" se refiere a esas situaciones
en las que un paciente es o puede ser incapaz de respirar sin
asistencia, y por lo tanto se coloca en una máquina de circulación
extracorpórea (también conocida como máquina de baipás
cardiopulmonar u bomba oxigenadora) o dispositivo semejante. En
tales circunstancias, el medicamento gaseoso se administra al
oxigenador de la máquina de circulación extracorpórea, que simula la
función de los pulmones del paciente al permitir que el oxígeno (y
el gas noble) se difundan dentro (y el dióxido de carbono se difunda
fuera) de la sangre aspirada del paciente. La sangre enriquecida
con oxígeno se bombea a continuación de nuevo al paciente.
En una realización preferida, el gas noble es
xenón, helio o una mezcla de xenón y helio. Cuando el gas noble
comprende xenón, la presión parcial de xenón en el medicamento
administrado es preferiblemente no más de aproximadamente 0,8 atm
(0,08 MPa). Preferiblemente la presión parcial de xenón en el
medicamento administrado es de aproximadamente 0,1 atm (0,01 KPa) a
aproximadamente 0,7 atm (0,07 MPa), más preferiblemente de
aproximadamente 0,2 atm (0,02 MPa) a aproximadamente 0,6 atm (0,06
MPa), más preferiblemente aproximadamente 0,4 atm (0,04 MPa). Cuando
el gas noble comprende helio, el helio a presión parcial en el
medicamento administrado es preferiblemente tal como se necesita
para llevar la presión total del medicamento administrado a
presiones iguales a las condiciones hiperbáricas preferidas, tal
como se ha explicado anteriormente.
En una realización, el gas noble se mezcla con
aire con el fin de proporcionar un medicamento administrado con una
presión parcial de aire de aproximadamente 1 atm (0,1 MPa). Esto se
consigue añadiendo el gas noble al aire normobárico con el fin de
proporcionar una mezcla hiperbárica. En las realizaciones en las que
el gas noble es sólo xenón, se prefiere que el medicamento se
administre a una presión de entre aproximadamente 1,2 atm (0,12
MPa) y aproximadamente 2 atm (0,2 MPa), más preferiblemente de
aproximadamente 1,4 (0,14 MPa) a aproximadamente 1,8 atm (0,18
MPa). Mientras esto puede tener como resultado una presión parcial
de xenón ligeramente por encima de las presiones parciales
preferidas explicadas anteriormente, los inventores han encontrado
que esto se compensa mediante los efectos beneficiosos de las
condiciones hiperbáricas generales. Las condiciones hiperbáricas
generales están, en este caso, preferiblemente ligeramente por
debajo de las condiciones hiperbáricas generalmente más preferidas,
de nuevo como se ha explicado anteriormente, ya que los inventores
también han encontrado que si se utilizan niveles demasiado altos de
xenón entonces, sorprendentemente, el xenón puede exhibir
efectos
neurotóxicos.
neurotóxicos.
En otra realización, el gas noble se mezcla con
un gas o mezcla de gases que comprende oxígeno para proporcionar un
medicamento administrado que tenga una presión parcial de nitrógeno
igual o menor a aproximadamente 0,8 atm (0,08 MPa). Preferiblemente
el medicamento administrado tiene una presión parcial de nitrógeno
de menos de aproximadamente 0,4 atm (0,04 MPa), y más
preferiblemente la mezcla de gases es en esencia sin nitrógeno. Los
inventores encontraron que el nitrógeno parece exacerbar las
lesiones neuronales, y por lo tanto se prefiere que la presencia de
este gas se minimice.
Preferiblemente, la presión parcial de oxígeno
en el medicamento administrado es aproximadamente 0,2 atm
(aproximadamente 0,02 MPa, es decir igual que en el aire
normobárico).
Según un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un método para proporcionar neuroprotección que
comprende colocar a un paciente necesitado de neuroprotección en un
ambiente hiperbárico.
Como se ha indicado anteriormente, se ha
descubierto sorprendentemente que las condiciones hiperbáricas
tienen de por sí un efecto neuroprotector. Además, se ha
descubierto que este efecto neuroprotector es lo suficientemente
fuerte como para, dentro de ciertos intervalos de presión, incluso
si las condiciones hiperbáricas se logran sin agregar un gas noble
y agregando en su lugar un gas que contiene nitrógeno (que, como se
ha señalado anteriormente, se ha encontrado que exacerba el daño
neuronal) las condiciones hiperbáricas serán suficientes para
proporcionar un efecto neuroprotector mejorado a pesar el aumento
de exposición al nitrógeno.
De este modo, en una realización el ambiente
hiperbárico puede consistir en aire hiperbárico o una mezcla
hiperbárica de aire y nitrógeno añadido. Cuando el ambiente
hiperbárico consiste en una mezcla de aire normobárico y nitrógeno
agregado, que es inhalado por el paciente, se prefiere que la
presión del ambiente hiperbárico no sea más de aproximadamente 2,8
atm (0,28 MPa).
En una realización mucho más preferida, sin
embargo, el método comprende además administrar un gas noble al
paciente mientras el paciente está en el ambiente hiperbárico.
Otras características preferidas del segundo
aspecto de la presente invención, tales como, pero no limitadas a,
las condiciones hiperbáricas, las condiciones para ser tratadas y la
composición y presión administrada del gas o la mezcla de gases que
comprende el gas noble, son tal como se explican anteriormente en
relación con el primer aspecto de la presente invención.
Según un tercer aspecto, la presente invención
proporciona un aparato que comprende: una cámara hiperbárica
adecuada para albergar un paciente humano o animal; un recipiente
que contiene xenón; y medios para administrar el xenón a un
paciente dentro de la cámara.
El aparato es, en particular, adecuado para
llevar a cabo el método del segundo aspecto de la invención, en el
que el método comprende administrar un gas noble que comprende
xenón.
En una realización, los medios de suministro de
xenón comprenden una mascarilla o boquilla en comunicación de flujo
con una salida al recipiente, para permitir la inhalación de xenón
por el paciente.
En otra realización, los medios de suministro de
xenón comprenden un conducto que permite que el xenón del
recipiente se mezcle con la atmósfera dentro de la cámara.
En una realización adicional, los medios de
suministro de xenón comprenden una máquina de circulación
extracorpórea. El funcionamiento de tal máquina se ha descrito
brevemente anteriormente.
La invención se describe aún más a continuación
mediante un ejemplo no limitativo, haciendo referencia a las
figuras adjuntas en las que:
La Figura 1 representa, en vista general (A) y
en una vista de primer plano de parte de la misma (B), un aparato
experimental utilizado para inducir lesiones focales reproducibles
en explantes (rodajas) organotípicos de cerebro;
La Figura 2 es un gráfico que muestra la
distribución de la intensidad fluorescente para dos explantes de
hipocampo impregnados con yoduro de propidio (PI), uno con trauma
focal y uno sin él, 72 horas después del trauma - también se
muestran (adiciones) imágenes fluorescentes de un explante de
hipocampo sin trauma (superior izquierda) y con trauma (inferior
izquierda), y un gráfico (superior derecho) de yoduro de propidio
impregnando células permeabilizadas con etanol al 70%;
Las Figuras 3A y B son gráficas de barras que
muestran (A) la evolución de la lesión incluyendo el lugar de la
lesión focal ("lesión total") y (B) la evolución de la lesión
excluyendo el lugar de la lesión focal ("lesión
Secundaria");
La Figura 4 es un gráfico que muestra los
efectos de presiones agregadas de helio y nitrógeno en la evolución
de la lesión total; y
La Figura 5 es un gráfico que muestra los
efectos de presiones agregadas de xenón en la evolución de la lesión
total.
Las propiedades del xenón y otros gases se
investigaron en un modelo in vitro de lesión cerebral
traumáticas (como se describe a continuación con mayor detalle,
bajo el título "Ejemplo"). El modelo elegido implicó crear un
trauma mecánico focal se centró en la región CA1 de explantes
cultivados de cerebro de hipocampo, y valorar la lesión neurológica
utilizando impregnación de yoduro de propidio. El aparato utilizado
para inducir la lesión focal en los explantes cerebrales
organotípicos se muestra en la Figura 1. Un pequeño solenoide
retiene una aguja 5 mm encima de un explante de hipocampo cultivado
que se coloca utilizando un micromanipulator. Una fuente de luz por
fibra óptica ilumina la explante desde abajo. Como se muestra en (B)
la aguja está restringida en un capilar de cristal y situada justo
por encima de la zona CA1 del hipocampo.
Los explantes cerebrales de hipocampo después de
dos semanas en cultivo, denominados explantes organotípicos,
mantienen las poblaciones heterogéneas de células cuyos contactos
sinápticos reflejan, por lo menos hasta cierto punto, el estado en
vivo. Representan un compromiso útil entre modelos que utilizan
cultivos de células disociadas y los que utilizan animales
intactos. La naturaleza del traumatismo focal y la subsiguiente
lesión secundaria de evolución lenta, soporta una relación
suficientemente próxima con la situación en vivo para proporcionar
un modelo útil en el que se pueden ensayar posibles tratamientos.
Una limitación del modelo es que excluye cualquier recorrido de
lesión que sea como resultado de isquemia y/o hipoxia, o sea como
resultado de cambios en parámetros sistémicos (por ejemplo presión
sanguínea) y se centra principalmente en el componente mecánico de
la lesión. El xenón, sin embargo, ya se ha mostrado efectivo en
modelos que implican hipoxia e isquemia, aunque no se sabía si el
xenón mostraría alguna eficacia particular en el modelo actual de
traumatismo cerebral.
La Figura 2 muestra la distribución de la
intensidad fluorescente para dos explantes de hipocampo impregnados
con yoduro de propidio (PI). Un explante se sometió a un traumatismo
focal y otro no, las imágenes se tomaron 72 horas después del
traumatismo. El PI es una tinta de membranas impermeables que sólo
puede entrar en células con membranas celulares dañadas, que se
vuelve sumamente fluorescente al unirse al ADN y que por tanto puede
usarse para cuantificar el daño celular en términos de
fluorescencia. Como se ilustra en la Figura 2, el trauma produjo un
cambio marcado hacia la derecha en la distribución de
intensidad.
\newpage
Las Figuras 3A y B trazan la evolución de
lesiones en los explantes de hipocampo con el tiempo. La Figura 3A
muestra la evolución de lesiones, incluyendo el lugar de la lesión
focal ("lesión total"), y la Figura 3B muestra la evolución de
la lesión excluyendo el lugar de la lesión focal ("Lesión
secundaria"). Las barras continuas representan los datos
obtenidos para explantes mantenidos a 37ºC, mientras que las barras
abiertas representan los datos obtenidos para explantes mantenidos
a 32ºC. Las barras con la etiqueta "sin trauma" representan
datos de explantes cerebrales que no han sufrido una lesión
traumática. La línea discontinua en la Figura 3A representa la
lesión total en condiciones de control después de 72 h (a 37ºC), que
se ha normalizado a la unidad (como se describe a continuación con
más detalle). Las barras de error son SEM (error estándar de la
media) y los datos son de un promedio de 12 explantes.
Al cabo de varias horas de haber inducido la
impregnación brillante punteada de yoduro de propidio era evidente,
un patrón de impregnación que ha resultado estar buena correlación
con el daño neuronal evaluado mediante cambios morfológicos. La
lesión aumentó lentamente con el tiempo y aproximadamente se duplicó
entre las 24 h y 72 h (Figura 3A). Cuando la zona del explante
centrada en el punto focal de la lesión se excluyó del análisis, la
evolución de la lesión fue aún más dramática. Esta lesión secundaria
lejana del lugar del trauma mecánico, que comienza desde niveles de
referencia, aumentó progresivamente (Figura 3B).
La diferencia entre esta lesión secundaria y la
lesión total que incluía la zona cercana al punto focal del trauma
fue especialmente evidente cuando se investigaron los efectos de
someter los explantes cerebrales a temperaturas equivalentes a
moderada hipotermia. Cuando los explantes cerebrales se incubaron a
32ºC después del traumatismo, la lesión secundaria casi se eliminó
por completo (Figura 3B). Por el contrario, este nivel de
hipotermia redujo la lesión total en una cantidad más limitada
(Figura 3A), presumiblemente debido a que la lesión inicial
mecánica que fue causada por el trauma focal era irreversible.
Los efectos neuroprotectores de la hipotermia se
conocen bien y se han mostrado en una variedad de modelos de
laboratorio de lesiones. De hecho, una observación similar se ha
hecho antes utilizando un modelo equivalente al empleado en esta
memoria, aunque el hallazgo de que la hipotermia es mucho más eficaz
contra lesiones secundarias que contra lesiones primarias va un
paso más allá que los hallazgos de los estudios anteriores.
Una vez establecido un protocolo de ensayo que
produjo una lesión consistente y reproducible, se investigaron los
efectos de variar otros factores. Lo más sorprendente, fue encontrar
que someter los explantes cerebrales a las presiones añadidas de
helio (añadiendo helio al aire normobárico para proporcionar un
ambiente hiperbárico) proporcionó neuroprotección potente (Figura
4). La Figura 4 muestra los efectos de las presiones añadidas
(presión añadida a 1 atm (0,01 MPa) de aire) de helio y nitrógeno en
la evolución de la lesión total. Los efectos del helio se muestran
como símbolos circulares abiertos y los del nitrógeno se muestran
como símbolos circulares llenos. Las líneas continuas se dibujan a
ojo. Las barras de error son SEM para un promedio de 14
rebanadas.
Los efectos del helio añadido se consideran
efectos de la presión añadida por sí misma por varias razones. Se
acepta ampliamente que, incluso a altas presiones, el helio es poco
probable que ejerza ningún efecto farmacológico directo, debido a
su muy baja solubilidad en los tejidos biológicos. De hecho, cuando
los efectos del helio se han comparado directamente con los de la
presión hidrostática, casi siempre se ha llegado a la conclusión de
que cualquier efecto observado se debe a la presión por sí misma.
Los efectos excitables de las altas presiones (el denominado
síndrome nervioso por alta presión) se conocen bien entre los
buceadores, pero estos efectos generalmente se producen a presiones
ligeramente superiores a las utilizadas en las actuales
investigaciones. Sin embargo, los efectos significativos sobre la
excitabilidad neuronal se han descrito utilizando sistemas in
vitro en los intervalos de presión que se utilizan en esta
memoria. Si bien los efectos de la presión son complejos, un
hallazgo consistente es que las sinapsis excitadoras se reducen, muy
probablemente debido a la supresión de la liberación de
neurotransmisores. Las reducciones de los niveles de glutamato
podrían ser un neuroprotector ya que tendería a mitigar la
excitotoxicidad y, sin estar sujeto a ninguna teoría, esto puede
ser la base de la neuroprotección observada en hasta un máximo de 2
atm (0,2 MPa) de presión añadida.
Puesto que el helio a estas bajas presiones es
poco probable que ejerza ningún efecto por sí solo, el resultado de
lesión significativamente peor que se produjo cuando el helio fue
sustituido por nitrógeno (Figura 4) es probablemente debido a algún
efecto perjudicial del nitrógeno por sí mismo. La línea discontinua
de la Figura 4 se construye restando los efectos del helio (que se
considera que son los efectos de la presión por sí misma) de los
efectos del nitrógeno para dar el efecto teórico de aumentar los
niveles de nitrógeno por sí mismos (es decir, excluyendo los
efectos concurrentes del aumento de presión).
Como el nitrógeno tiene una solubilidad en grasa
considerablemente mayor que el helio (lo que implica un reparto más
elevado en el tejido cerebral), y como los efectos de la narcosis
del nitrógeno son evidentes a sólo una pocas atmósferas, tal vez no
sea sorprendente que incluso bajas presiones de nitrógeno ejerzan
algunos efectos farmacológicos, aunque no se podía predecir si
estos eran beneficiosos o perjudiciales. Si el nitrógeno es en
efecto nocivo, entonces su sustitución por helio debe ser
neuroprotectora incluso con presiones normobáricas, y en cierta
medida inversa a los efectos nocivos que pueden predecirse a partir
de la línea discontinua en la Figura 4 de la presión parcial
normobárica del nitrógeno. Cuando este experimento se llevó a cabo
el nivel observado de lesión (a las 72 horas) en un explante
cerebral expuesto a aire normobárico con helio sustituido por
nitrógeno (0,67 \pm 0,10) fue en realidad muy cercano a lo
predicho teóricamente (0,75).
\newpage
También se investigaron los efectos de las
presiones añadidas de xenón en la evolución de lesiones totales,
los resultados se muestran en la Figura 5. La línea discontinua en
la Figura 5 se construye restando los efectos, como se muestra en
la Figura 4, del helio (que se supone serán los de la presión por sí
misma) de los efectos del xenón para dar el efecto teórico de los
niveles de xenón aumentados por sí mismos (es decir, excluyendo los
efectos concurrentes del aumento de presión). Las barras de error
son SEM para un promedio de 13 rebanadas. Como muestran los datos
de la Figura 5, el xenón exhibió neuroprotección marcada a bajas
presiones, pero luego mostró toxicidad a la máxima presión
utilizada. Ambas características, neuroprotección y toxicidad, se
deben al propio xenón como se muestra mediante la línea discontinua
en la Figura 5. La toxicidad del xenón no se ha informado
anteriormente, aunque en el conocimiento de los inventores, esos
altos niveles de xenón no se habían probado anteriormente.
Detalles adicionales de las investigaciones
anteriores se proporcionan a continuación.
A menos que se indique lo contrario, todos los
productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Company Ltd.
(Poole, Dorset, UK.)
Se prepararon cultivos organotípicos de
explantes de hipocampo según lo informado por Stoppini L, y otros
en "Un método simple para cultivos organotípicos del tejido
nervioso" Métodos J Neurosci 1991; 37:173-82,
con algunas modificaciones. En resumen, se extrajeron los cerebros
de crías de ratones C57/BL6 de siete días de vida (Harlan UK Ltd.,
Bicester, Oxfordshire, Reino Unido) y se colocaron en un
"preparado" en el punto de congelación. El medio preparado
contenía solución salina equilibrada de Gey y 5 mg
ml-1 D-glucosa (BDH Chemicals Ltd.,
Poole, Dorset, Reino Unido). El hipocampo se extrajo de los cerebros
y se prepararon explantes transversales de 400\mum de espesor
utilizando un troceador de tejido McIllwain. Los explantes se
transfirieron a un medio de preparación en el punto de congelación,
se separaron con cuidado y luego se colocaron sobre inserciones de
cultivo de tejidos (Millicell-CM, Millipore
Corporation, Billerica, MA), que se insertaron en una placa de seis
pocillos de cultivo de tejidos. Los pocillos contenían un medio de
"crecimiento" que consistía en 50% de Minimal Essential Media
Eagle, 25% de solución salina equilibrada de Hank, 25% de suero de
caballo inactivado, 2 mM de L-glutamina, 5 ml
mg^{-1} D-glucosa (BDH) y 1% de suspensión
antibiótica antimicótica. Los explantes se incubaron a 37ºC en una
atmósfera húmeda 95% aire/5% CO_{2}. El medio de crecimiento se
cambió cada tres días. Los experimentos se llevaron a cabo después
de 14 días de cultivo.
Después de que los explantes de hipocampo habían
estado en el cultivo durante 14 días, el medio de crecimiento se
cambió a medio "experimental". El medio experimental era sin
suero y consistió en el 75% de Minimal Essential Eagle Media, el
25% de solución salina equilibrada de Hank, 2 mg de
L-glutamina, 5 mg ml^{-1}
D-glucosa, 1% de suspensión antibiótica
antimicótica y 4,5 \muM yoduro de propidio.
El trauma de los explantes se produjo con un
aparato especialmente diseñado (Figura 1), que se basó en memorias
descriptivas publicadas (Adamchik Y, y otros "Métodos para inducir
daño traumático principal y secundario en cultivos organotípicos de
explantes de hipocampo" protocolo de investigación en cerebros
(Brain Res Brain Res Protoc) de 2000; 5:153-8 y
Adembri C, y otros "La eritropoyetina atenúa lesiones
post-traumáticas en explantes organotípicos de
hipocampo" J Neurotrauma 2004; 21:1103-1220,21).
Bajo un microscopio estereoscópico se colocó una aguja de 5 mm por
encima de la zona CA1 del hipocampo utilizando un micromanipulador
de tres ejes. La aguja cayó sobre el explante con un impacto de 3,5
\muJ cuando se cortó la alimentación a un pequeño electroimán.
Esta energía se seleccionó de manera que la aguja cayera sobre el
tejido y no rebotara; esto produjo una lesión traumática focal
consistente y reproducible. La parte distal de la aguja era suave y
redondeada con el fin de evitar la perforación del explante y el
impacto produjera una lesión focal con un diámetro de 750 \pm 17
\mum (media \pm DE).
Después de hacer el traumatismo en la zona CA1,
las bandejas de cultivo se transfirieron a una pequeña cámara a
presión que contenía un ventilador de alta velocidad para una rápida
mezcla de gases. La cámara a presión fue capaz de mantener una
presión constante de hasta seis atmósferas durante varios días. La
cámara a presión se alojó en una incubadora que se ajustó a 37ºC
para los experimentos normotérmicos ó 32ºC para los experimentos a
hipotermia moderada. Posteriormente, la cámara a presión (0,925
litros de volumen de gas) se enjuagó con un gas de control
humidificado (95% de aire y 5% CO_{2}) durante 5 min a 5 litros
min^{-1} que asegura una sustitución de gas de más del 99,99%.
Después del enjuague, la cámara a presión se cerró, y los explantes
en estas condiciones se consideraron que eran los "controles de
lesión" (75% de nitrógeno/20% de oxígeno/5% de CO_{2}).
Para los experimentos en condiciones
hiperbáricas, la cámara se presurizó con gas experimental (xenón,
helio o nitrógeno entre 0,25 atm (0,025 MPa) y 2 atm (0,2 MPa),
agregado adicionalmente a la 1 atmósfera (0,1 MPa) de 95% de
aire/5% de CO_{2} y a continuación se cerró. Para probar los
efectos del helio y el xenón en condiciones normobáricas, la cámara
a presión se enjuagó con mezclas de gases humidificados que
contenían ya se 75% de helio/20% de oxígeno/5% de CO_{2} o 75% de
xenón/20% de oxígeno/5% de CO_{2} durante cinco minutos y luego
se cerró.
Después de 24 horas en la cámara, los explantes
se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (como se
describe con más detalle a continuación). Después de completar la
toma de imágenes, los explantes se transfirieron de nuevo a la
cámara a presión y se restablecieron la mezcla de gases y la presión
adecuadas. Este procedimiento se repitió a las 48 h y 72 h tras el
trauma. Cabe señalar que, para todas las mezclas de gases y todas
las presiones, las presiones parciales de oxígeno y dióxido de
carbono se fijaron en 0,2 atm (0,02 MPa) y 0,05 atm (0,005 MPa),
respectivamente.
El yoduro de propidio (PI) es una tinta de
membrana impermeable que sólo entra en células con las membranas
celulares dañadas. Dentro de las células se une principalmente al
ADN y se convierte en altamente fluorescente, con un espectro
máximo de emisión en la zona roja del espectro visible. Se utilizó
un microscopio de epi-iluminación (Nikon Eclipse
80, Kingston upon Thames, Surrey, Reino Unido), y un objetivo de
baja potencia (x2) para visualizar la fluorescencia del PI. Se
utilizaron una cámara de vídeo digital y software (cámara
Micropublisher 3.3 RTV y software QCapture Pro, Burnaby, Columbia
Británica, Canadá) para capturar las imágenes. Las imágenes se
analizaron utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov).
Se registraron los canales rojo, verde y azul, pero sólo se utilizó
el canal rojo y la distribución de intensidades se representó
gráficamente en un histograma con 256 niveles de
intensidad.
intensidad.
Los explantes bajo condiciones de control
estándar (incubados en la cámara durante 72 h a 37ºC con 95% de aire
y 5% CO_{2}) mostraron un pico bien definido en la distribución
de intensidad (Figura 2), que experimentó una fuerte caída a cero.
Por el contrario, después del traumatismo, el pico de la
distribución de la intensidad fue menor, más amplio y desviado a
niveles de intensidad más altos (Figura 2).
Como medida del traumatismo, se integró el
número de píxeles por encima de un umbral de intensidad de 150
(indicado mediante la flecha y la línea discontinua en la Figura 2),
que en las condiciones experimentales utilizadas proporcionó una
medición cuantitativa robusta de la fluorescencia del PI, y por
tanto de lesión celular. La lesión se pudo expresar entonces en
relación con la lesión total observada después de 72 horas bajo
condiciones de control (75% de nitrógeno, 20% de oxígeno y el 5% de
CO_{2}; 1 atm (0,1 MPa); y 37ºC), que se normalizó a la unidad.
Así, por ejemplo, si bajo un determinado conjunto de condiciones de
prueba el número integrado de píxeles por encima de un umbral de
intensidad de 150 (calculado como anteriormente) es la mitad que el
presente bajo condiciones de control, la lesión producida por las
condiciones de prueba se caracterizó como el 0,5 de la lesión
normalizada.
Se utilizaron dos medidas diferentes de lesión:
La lesión "total", que se define como el incremento de la
fluorescencia sobre el explante entero; y la lesión
"secundaria", que fue el aumento de fluorescencia en el
explante pero con exclusión de la zona que cubre la lesión focal. La
zona que cubre la lesión focal se excluyó mediante el
enmascaramiento de la zona de lesión focal en la imagen antes de la
integración. La máscara era un círculo con un diámetro de 1000 mm
(esquema representado mediante el círculo de puntos en la imagen
inferior de la Figura 2), que era lo suficientemente grande para
cubrir la zona de la lesión focal.
Debido a que la producción de luz de la lámpara
de mercurio cambió con el tiempo, el tiempo de exposición se ajustó
para tenerlo en cuenta. Esto se hizo mediante el registro de la
fluorescencia de un portaobjetos de vidrio estándar
(Fluor-Ref, Omega Optical, Brattleboro, VT) y
ajustando el tiempo de exposición correspondientemente.
A las tres horas de producir la lesión focal, el
aumento de fluorescencia en el lugar de la lesión era evidente, lo
que indicaba una lesión celular casi inmediata en esta zona. La
intensidad de la fluorescencia siguió aumentando lentamente, sin
embargo, tanto en la zona de lesión focal como sobre las zonas del
explante cerebral distante del lugar de la lesión (lesión
"secundaria"). El incremento de lenta evolución de la
fluorescencia del PI fue debido al aumento de la lesión celular en
lugar del aumento de unión del PI a las células que ya habían
muerto. Esto puede deducirse de los datos en el recuadro de la
Figura 2, que muestra que cuando las células se permeabilizan
utilizando etanol, la unión de PI es muy rápida (con un tiempo medio
de unos 7 minutos), y que el equilibrio se completa después de
aproximadamente 30 minutos. Por el contrario, la lesión celular
después del traumatismo progresa lentamente y sigue aumentando por
lo menos durante 72 horas tras la lesión, el punto temporal más
largo investigando.
Las barras llenas en la Figura 3A muestran el
aumento de la lesión total a 37ºC con el tiempo, normalizado a la
lesión observada a las 72 h, mientras que las barras llenas en la
Figura 3B muestran una lesión para los mismos explantes, pero
cuando la lesión focal se ha excluido del análisis. El daño en
ausencia de lesión traumática (con la etiqueta "sin trauma")
fue insignificante en todos los puntos temporales. Una comparación
de los datos de las Figuras 3A y B muestra que la lesión secundaria
constituye una proporción cada vez mayor de la lesión total a
medida que pasa el tiempo.
Una hipotermia moderada (32ºC) reduce en gran
medida la evolución de la lesión después de 24 horas. Las barras
abiertas de la Figura 3A muestran que la evolución de una lesión
total con el tiempo es bastante modesta a 32ºC y, por lo tanto,
proporcionalmente, la protección por hipotermia se hizo más grande
con el aumento del tiempo. Por ejemplo, a las 24 h, la hipotermia
redujo la lesión total en cerca de aproximadamente un 46%, mientras
que a las 72 h, la hipotermia redujo la lesión en un 62%. La Figura
3B muestra los efectos de la hipotermia en la lesión secundaria.
Cuando el lugar focal de la lesión se excluye, se puede observar que
los efectos de la hipotermia en la reducción de la lesión son aún
más pronunciados. En 72 horas, por ejemplo, la lesión se reduce en
más del 96%.
Una vez establecido un protocolo que produjo una
lesión consistente y reproducible, se investigaron los efectos del
gas noble helio en la evolución de las lesiones. Los resultados se
presentan en la Figura 4, en la que los símbolos circulares
abiertos muestran que para presiones de hasta aproximadamente 1 atm
(0,1 MPa) de helio añadido, la lesión disminuyó, pero a medida que
se añadieron mayores presiones de helio, la lesión empeoró y volvió
cerca de niveles de control a una presión añadida de aproximadamente
2 atm (0,2 MPa; aproximadamente 3 atm (0.3 MPa) de presión total).
Los experimentos se repitieron a continuación, excepto con nitrógeno
sustituido por helio. Cualitativamente los efectos del nitrógeno
fueron muy similares (símbolos circulares llenos en la Figura 4) a
los observados con el helio, aunque en todas las presiones el
resultado fue significativamente peor.
Debido a que el helio es más probable que ejerza
un efecto farmacológico en estas bajas presiones, es razonable
concluir que los efectos observados con el helio se deben a la
presión por sí misma. Sobre esta base, el efecto teórico de niveles
de nitrógeno en aumento (independiente de los efectos de la presión)
se calculó (línea discontinua en la Figura 4) restando los efectos
del helio (que constituyen los efectos de la presión añadida por sí
misma) de los efectos de las presiones añadidas de nitrógeno. El
nitrógeno por lo tanto se puede ver que es perjudicial de una
manera que es más o menos lineal con cantidades cada vez mayores. De
ello se deduce que si el helio sustituye al nitrógeno en el aire en
condiciones normobáricas entonces se prevé que esto también sea
neuroprotector, aunque sólo sea porque estaba reemplazando a los
efectos nocivos del nitrógeno normalmente presente en el aire. Esta
predicción fue evaluada utilizando una mezcla de 75% de helio/20% de
oxígeno/5% de CO_{2}, de lo que se constató que el grado
observado de lesiones normalizadas después de 72 horas (0,67 \pm
0,10) era de hecho cercano al previsto simplemente por la ausencia
de nitrógeno (0,75).
A continuación, se investigaron los efectos del
xenón, que como se ha señalado anteriormente se ha demostrado tener
propiedades neuroprotectoras en una variedad de modelos in
vitro y en vivo de lesiones neuronales. Los resultados
se presentan en la Figura 5, y muestran que bajas presiones añadidas
de xenón proporcionan neuroprotección marcada, pero que esta
tendencia se invirtió en la presión más alta probada en la que se
observó significativa neurotoxicidad.
Siguiendo la lógica destacada anteriormente, el
efecto teórico de niveles de xenón aumentados (independiente de los
efectos de la presión) también se puede calcular restando los
efectos del helio (que se ha concluido que es el efecto de la
presión por sí misma). El resultado de este cálculo se muestra como
la línea discontinua en la Figura 5. La validez de este análisis
también se puede probar mediante la medición de la neuroprotección
ofrecida por el 75% de xenón en condiciones normobáricas. La
protección que se prevería sería la que se esperaba de este nivel
de xenón (calculada a partir de la línea discontinua en la Figura
5), además de las ventajas de eliminar el efecto nocivo del
nitrógeno en el mismo nivel (calculado a partir de la línea
discontinua de la Figura 4) ya que en este caso el xenón estaría
sustituyendo al nitrógeno. El nivel previsto de lesión después de
72 horas se calcula que es 0,59 y el grado observado de lesión
resultó ser 0,50 \pm 0,04, un acuerdo razonable entre los valores
predichos y los experimentales.
Si bien la invención se ha descrito con
referencia a diversas realizaciones concretas, se apreciará que
pueden hacerse variaciones y modificaciones sin apartarse del
espíritu y el alcance de la invención.
Claims (15)
1. El uso de un gas noble para la fabricación de
un medicamento para la administración en condiciones hiperbáricas
para proporcionar neuroprotección.
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
la neuroprotección es contra el daño neuronal resultante de un
trauma por impacto.
3. Un uso según la reivindicación 1 ó 2, en el
que las condiciones hiperbáricas constituyen una presión no superior
a 0,3 MPa.
4. Un uso según cualquier reivindicación
anterior, en el que el medicamento es un medicamento gaseoso para la
administración por inhalación o inhalación simulada.
5. Un uso según la reivindicación 4, en el que
el gas noble es xenón, helio o una mezcla de xenón y helio.
6. Un uso según la reivindicación 5, en el que
el gas noble es xenón o una mezcla de xenón y helio, y la presión
parcial del xenón en el medicamento administrado no es más de 0,08
MPa.
7. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que el gas noble se mezcla con aire
con el fin de proporcionar un medicamento administrado con una
presión parcial de aire de aproximadamente 0,1 MPa.
8. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que el gas noble se mezcla con un gas
o una mezcla de gases que comprende oxígeno para proporcionar un
medicamento administrado con una presión parcial de nitrógeno igual
o inferior a 0,08 MPa.
9. Un uso según la reivindicación 8, en el que
la mezcla de gases es esencialmente sin nitrógeno.
10. Un uso según la reivindicación 8 ó 9, en el
que la presión parcial de oxígeno en el medicamento administrado es
aproximadamente 0,02 MPa.
11. Un gas noble para su uso en la prestación de
neuroprotección mediante la administración en condiciones
hiperbáricas.
12. El gas noble de la reivindicación 11, en el
que la neuroprotección es contra el daño neuronal resultante de un
traumatismo por impacto.
13. El gas noble de la reivindicación 11 ó 12,
en el que las condiciones hiperbáricas constituyen una presión no
superior a 0,3 MPa.
14. El gas noble según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que el gas noble es para la
administración mediante inhalación o inhalación simulada.
15. El gas noble según la reivindicación 14, en
el que el gas noble se define además en cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 10.
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