ES2347618B1 - Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos no marcados. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos no marcados y procedimiento para la detección y
cuantificación de sus anclas presentes en líquidos.
Comprende una matriz de electrodos (4.1.1)
interdigitados tapizados con antígeno para reaccionar con unos
anticuerpos no marcados que se aportan después de unas sustancias a
detectar y cuantificar, en un líquido, al sensor, siendo una parte
de los anticuerpos capturada por los electrodos y otra parte es
capturada por las moléculas a detectar y cuantificar reaccionando
competitivamente respecto al antígeno, con dichos anticuerpos no
marcados, incluyendo unos medios de detección de la variación en las
propiedades eléctricas de la matriz de electrodos, provocada por los
anticuerpos no marcados capturados por el antígeno.
El método comprende realizar una primera medida
de las propiedades eléctricas de los electrodos interdigitados con
antígeno, aplicar una solución de una sustancia a detectar y de
anticuerpos no marcados, realizar una segunda medida y comparar las
medidas.
Description
Dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos no marcados y procedimiento para la detección y
cuantificación de sustancias presentes en líquidos.
La presente solicitud de patente de invención
consiste conforme indica su enunciado, en un dispositivo sensor
interdigitado basado en anticuerpos no marcados para la detección y
cuantificación de sustancias presentes en líquidos, cuyas nuevas
características de construcción, conformación y diseño proporcionan
una seguridad y eficacia máximas para la función a la que va
destinado.
Más concretamente, la presente invención se
refiere a un dispositivo sensor para la detección de compuestos o
moléculas en líquidos, con aplicación en la detección de
contaminantes en suelos, aguas, al control de calidad de diversos
alimentos, y similares.
Otro de los fines de la invención es posibilitar
la fabricación de dispositivos sensores de bajo coste que permitan
la detección y/o cuantificación altamente selectiva de especies
químicas en bajas concentraciones. Además puede ser actuado y leído
automáticamente por medios electrónicos y automáticos.
Otro de los fines de la invención es brindar la
posibilidad de realizar las medidas a una sola frecuencia, lo que
permite una fuerte reducción de costes en la circuitería de control.
Así mismo, el dispositivo sensor puede también ser medido en un
espectro de frecuencias con lo que se obtiene mayor fiabilidad de la
respuesta y una mayor sensibilidad.
Las ventajas que incorpora el dispositivo sensor
objeto de la invención son las de combinar una alta sensibilidad con
una alta especificidad. El dispositivo sensor es altamente sensible,
pues se basa en la reacción competitiva entre un antígeno
inmovilizado en la superficie del dispositivo y las moléculas de la
sustancia a detectar, por la captura por parte de ambos (antígeno y
moléculas) de una parte de unos anticuerpos no marcados que se
aportan, tras la sustancia a detectar en un liquido (en la solución
de ensayo), al dispositivo, previamente funcionalizado con el
antígeno. Como resultado de esta reacción competitiva, una cantidad
de anticuerpo es capturado por el antígeno inmovilizado en la
superficie del dispositivo y es medida, y otra parte es evacuada del
dispositivo por acción de las moléculas a detectar, por lo que dicha
cantidad de anticuerpo capturado por el antígeno inmovilizado está
en relación con la concentración de moléculas a detectar presentes
en la solución de ensayo. El dispositivo sensor es altamente
selectivo gracias la especificidad de los anticuerpos. Es un
dispositivo de sencilla fabricación y por tanto de bajo coste, en el
que la medida es fácil de realizar, siendo sencillo automatizar su
uso. Es un dispositivo sensor muy adecuado para detección y
cuantificación en campo y cuando se requiere bajo coste del
sistema.
La invención también comprende un procedimiento
para la detección y cuantificación de sustancias presentes en
líquidos en el que se utiliza dicho dispositivo sensor basado en
anticuerpos no marcados y funcionalizado con el antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Existe variedad de diseños propuestos en la
literatura de dispositivos sensores de moléculas en líquidos. Muchos
de estos dispositivos sensores se basan en procesos electroquímicos
sobre células de detección. Estos dispositivos sensores usualmente
se basan en configuraciones de 3 electrodos, con uno de referencia y
otro que lleva una capa sensible que aporta selectividad al
dispositivo sensor, en recipientes con soluciones liquidas. En estos
dispositivos sensores las medidas se basan frecuentemente en la
interpretación de las curvas de histéresis de corriente en función
de la tensión aplicada en ciclos periódicos. La obtención de las
concentraciones de las moléculas objetivo es un proceso
relativamente complicado donde se requiere personal entrenado y/o
software de cierta complejidad. Las células de detección se pueden
reducir en tamaño, pero existen limites a esta miniaturización.
Los dispositivos sensores presentados en la
literatura muestran generalmente mayor complejidad, tanto para la
realización de la medida como para la interpretación. A continuación
mostramos algunos ejemplos de dispositivos sensores potenciométricos
y amperométricos:
Entre los dispositivos sensores potenciométricos
encontramos el Light-addressable potentiometric
sensor (LAPS), el cual es un dispositivo sensor químico basado
en un semiconductor con una estructura
electrolyte-insulator-semiconductor
(EIS). Si bien el uso de este dispositivo sensor ha sido muy
recurrente en la literatura para la detección de diferentes
especies, el sistema de detección implica inicialmente aplicar un
voltaje de a lo largo de la estructura EIS para conseguir un cambio
en la capacidad en la interfaz
aislante-semiconductor. Esta capacidad cambia con el
potencial de la superficie, el cual es una función de la
concentración de iones en la solución electrolito. Entonces, para
que esta capacidad pueda ser leída hará falta iluminar el substrato
semiconductor con una luz modulada y lo que se medirá será la
fotocorriente alterna, ac, generada. Finalmente, la medida se deberá
realizar mediante un circuito externo.
Como vemos, este sistema, a diferencia del que
presentamos en esta patente implica una estructura compleja y con
miniaturización limitada.
\newpage
Entre los dispositivos sensores amperométricos
encontramos el Microsens Amperometric Sensor de la firma
MICROSENS S.A., el cual es un dispositivo electroquímico
miniaturizado mediante tecnología microelectrónica. Este sensor
puede ser usado para determinar la concentración de una amplia gama
de especies químicas activas redox. Si bien este es un sensor de
pequeño tamaño, bajo consumo de analito y bajo coste, utiliza un
diseño de tres
electrodos.
electrodos.
El principio de amperometría está basado en la
medida de la corriente entre el electrodo de trabajo y el electrodo
auxiliar, la cual es inducida por una reacción redox en el electrodo
de trabajo. Las condiciones son escogidas de tal forma que la
corriente es directamente proporcional a la concentración de una
especie activa redox en la solución de analito. El potencial
eléctrico entre el electrodo de trabajo y la solución medida es
alcanzado gracias a un electrodo de referencia separado y es
controlado por un sistema potenciostato electrónico. El electrodo de
trabajo y el electrodo auxiliar se fabrican mediante capas de
película delgadas de platino sobre una oblea de Si mediante un
proceso de depósito específico. Además el electrodo de referencia
integra una capa delgada de Ag/AgCl el cual se fabrica por un
proceso similar. Adicionalmente, se fotopolimerizan membranas
orgánicas sobre el área de electrodo de trabajo para separar la
superficie de electrodo de la solución medida. La selectividad para
una especie química activa redox se obtiene mediante un potencial de
polarización conveniente y una membrana bien definida
fotopolimerizada.
Puede verse que este sistema consigue buenas
prestaciones, sin embargo, a diferencia del sistema que se presenta
en esta invención el proceso de fabricación del dispositivo sensor
requiere una elevada complejidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo sensor objeto de esta patente se
basa en la reacción competitiva entre el antígeno tapizado en la
superficie del dispositivo y la(s) sustancia(s) a
detectar, por los anticuerpos no marcados que se aportan tras la
solución de la muestra a detectar y cuantificar al dispositivo. Una
cantidad de estos anticuerpos, capturada por las moléculas a
detectar es evacuada del dispositivo juntamente con estas moléculas,
y otra parte es capturada por el dispositivo y puede medirse. En
efecto, esta cantidad de anticuerpo capturada por el dispositivo
está en relación con la concentración de moléculas a detectar
presentes en la solución de ensayo.
La presente invención está basada en una matriz
de electrodos interdigitados (IDE's), funcionalizada y en los
anticuerpos no marcados.
Para la fabricación de estos electrodos podemos
utilizar diferentes metales conductores (Ej.: oro, platino), así
como diferentes substratos (Ej.: pirex, plástico). Así mismo, la
geometría (Ej.: barra, zig-zag), las dimensiones de
los electrodo (Ej.: mm, sub-mm) y el grosor entre
dedos así como el espacio intersticial o gap (Ej.: \mum, nm)
también pueden ser escogidos.
Los IDE's serán funcionalizados previamente con
una capa de antígeno tapizado (Ej.: AT-BSA). Sobre
esta capa se realizará el ensayo competitivo para la captura del
anticuerpo específico (Ej.: IgG). La unión de la capa de antígeno
tapizado a la superficie del dispositivo puede realizarse mediante
diferentes tipos de absorción (Ej.: pasiva, covalente).
Al aportar las moléculas a detectar (en la
solución a medir) sobre el dispositivo sensor y seguidamente el
anticuerpo especifico, una fracción de dicho anticuerpo especifico
no será capturada por el antígeno siendo evacuada con dichas
moléculas. Está fracción menor de anticuerpo sobre el dispositivo
sensor implica directamente una menor variación de las propiedades
de la capa funcionalizada con antígeno de los electrodos, con
respecto a la situación anterior a la puesta en contacto de dichos
electrodos con la solución a medir.
Las moléculas a detectar estarán presentes en la
solución de ensayo. La reacción entre los anticuerpos y las
moléculas a detectar se produce al introducir los anticuerpos
después de que se haya depositado la solución sobre los electrodos,
los cuales disponen previamente de una capa de antígeno inmovilizado
sobre su superficie. Tras esperar un tiempo para la fijación de los
anticuerpos a la capa de antígeno, la solución depositada sobre el
dispositivo se limpia con agua Milli-Q, ésta se seca
y el dispositivo se sumerge en una solución tampón (buffer), Ej.:
phosphate buffered saline (PBS). Sin embargo, dependiendo de
las condiciones escogidas para la medida, es posible prescindir de
la solución buffer. Tras este pre-tratamiento se
procede a realizar la medida.
A mayor concentración de moléculas a detectar en
la solución, la cantidad de anticuerpo evacuado del dispositivo
sensor será mayor, como consecuencia, la cantidad de anticuerpos no
marcados sobre el dispositivo sensor será menor que en el caso en
que no se hubieran incluido moléculas a detectar. Debido a estas
variaciones en la concentración de anticuerpo sobre el dispositivo
sensor, la impedancia total de la capa será diferente según la
concentración presente de anticuerpo.
Dado el tamaño relativo y las propiedades
aislantes de los anticuerpos y de las moléculas a detectar, este
sistema ofrece sensibilidades muy superiores a otros que se basan en
la captura de las moléculas mediante anticuerpos prefijados en el
dispositivo sensor, gracias a que en el dispositivo sensor
presentado en esta patente, una cantidad de los anticuerpos no
marcados que está en relación con la concentración de moléculas a
detectar, es evacuada del dispositivo.
\newpage
Los terminales de los IDE's de los dispositivos
sensores estarán conectados al equipo de medida. Un sistema de
conexión fácilmente acoplable a los dispositivos sensores
presentados son los contactos del tipo
"clip-on". Este es un sistema muy
sencillo que permite contactar y dirigir las salidas de cada IDE,
aunque existen otros sistemas que también pueden ser utilizados
consiguiendo iguales prestaciones.
Los contactos de clip-on
son sencillos de fabricar y sobretodo de usar. Consisten en 2
piezas: i) la matriz de IDE's que incluyen unas salidas simétricas y
externas; y ii) el "espejo" de estas salidas externas las
cuales contactan los IDE's con el instrumento de medida. Este
sistema permite realizar fácilmente el cambio de las matrices de
electrodos interdigitados.
Estos dispositivos sensores tienen la ventaja
adicional de que pueden ser reutilizados. Tras cada proceso de
detección es posible limpiar completamente los electrodos de
todo agente biológico. Entonces se vuelve a inmovilizar el antígeno
sobre la superficie de los electrodos, para luego repetir el ensayo
competitivo con nuevas moléculas a detectar.
Para el depósito de las soluciones de
funcionalización, así como para el depósito de la solución a
analizar se podrá disponer de un sencillo sistema de
\mu-jeringas, o bien de un sistema fluídico que
puede estar integrado o no, a la matriz de electrodos
interdigitados.
En el caso del sistema de
\mu-jeringas, en una matriz de electrodos
interdigitados, cada electrodo contará con su propio grupo de
jeringas, de esta forma es posible inyectar diferentes soluciones a
cada electrodo, o diferentes réplicas de la misma solución y mostrar
el promedio de detección.
En el caso del sistema fluídico se dispondrá de
un único canal de entrada (inlet) y de un único canal de
salida (outlet) para todos los electrodos interdigitados de
la matriz. En este caso es posible introducir una solución cocktail
que contenga diferentes moléculas a detectar, lo que permitirá la
detección simultánea de diferentes sustancias. En esta solución
podrán haber tantas moléculas a detectar como electrodos en la
matriz.
Ya sea entre las \mu-jeringas
o en el sistema fluídico se incluirá el paso de flujo de un gas de
secado (Ej.: N_{2}) para el secado de los IDE's entre cada paso de
la funcionalización. Alternativamente, el depósito de las muestras,
de la solución buffer, el secado y el lavado pueden realizarse de
forma manual usando jeringas u otros elementos convencionales de
manipulación de líquidos en laboratorio.
Gracias a que la detección se realiza por
medidas de impedancia del dispositivo, el equipamiento de medida
puede ser muy sencillo, dependiendo de si solo se desea detectar la
presencia o no de un nivel mínimo de la(s) sustancia (s), o
si se desea cuantificar con precisión la concentración de dicha (s)
sustancia(s).
Para realizar la detección, se han previsto
varias alternativas de medida, entre ellas:
1. La medida de un componente de la impedancia
total del sistema (resistencia, capacidad) a una determinada
frecuencia. Las posibles frecuencias de trabajo del dispositivo
sensor estarán entre décimas o centésimas de Hz hasta los MHz. La
excitación con una señal alterna de baja amplitud y de frecuencia
fija permite el uso de electrónica muy sencilla y los resultados son
un valor de impedancia, que se puede convertir en el valor
correspondiente de concentración de la(s) sustancia (s) a
medir mediante el uso de tablas, gráficos o material electrónico
convencional por parte de personal sin preparación.
2. La medida de la impedancia total del sistema
en, un espectro de frecuencia. Las posibles frecuencias de trabajo
del dispositivo sensor estarán entre décimas o centésimas de Hz
hasta los MHz. A partir de estas medidas de impedancia es posible
obtener los valores de los elementos (resistencias y capacidades)
que modelan el sistema. La detección se puede realizar a partir de
la variación de sólo unos de estos elementos. Si la medida se hace
en un espectro de frecuencias se pueden obtener resultados más
precisos y fiables, con la posibilidad de hacer autoajuste del
dispositivo, ajustando la respuesta en el margen de frecuencias de
interés a la respuesta a alguna frecuencia referencia. La
electrónica requerida en el caso de excitación en barrido de
frecuencia es algo más compleja que en el caso de usarse una sola
frecuencia. Este caso el sistema también permite la automatización
de las medidas y la extracción de resultados y también puede ser
usado por personal sin preparación.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura nº 1 nos muestra el esquema de un
electrodo interdigitado (IDE).
La figura nº 2 ilustra esquemáticamente el
funcionamiento del dispositivo de la invención, así como el
procedimiento para detección y cuantificación de sustancias
presentes en líquidos.
La figura nº 3 muestra el esquema de un
electrodo interdigitado (3.1) con contactos
clip-on (3.2).
La figura nº 4 es un esquema de la disposición
de medida (set-up) del dispositivo sensor propuesto
a una sola frecuencia.
La figura nº 5 es un esquema de la disposición
de medida (set-up) del dispositivo sensor propuesto
en un espectro de frecuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura nº 2 ilustra la funcionalización de
los electrodos interdigitados, mostrando esquemáticamente 1.a
inmovilización de la capa de antígeno (2.6) sobre la superficie de
los electrodos, la captura (2.1) de la capa de anticuerpo específico
(2.7) no marcado, así como la evacuación (2.2) de una fracción de
estos anticuerpos (2.7) no marcados por acción de las moléculas a
detectar presentes en un líquido.
El set-up que se ilustra en la
figura nº 4 se compone principalmente de dos bloques: i) "bloque
de alimentación y detección química" (4.1); ii) "bloque de
captura y procesado de datos" (4.2).
La figura nº 5 es un esquema del
set-up de medida en un espectro de
frecuencias. Este set-up se compone
principalmente de tres bloques: i) "bloque de detección
química" (5.1); ii) "bloque de alimentación y captura de
datos" (5.2); iii) "bloque de procesado de datos" (5.3).
En la figura nº 1 se muestra un esquema de la
vista frontal (1.1), así como un esquema de la vista en alzado
lateral (1.2) de los electrodos interdigitados en una de las
realizaciones preferidas de la invención. Tal y como puede verse en
esta figura, los IDE's se fabricarán con forma de barra sobre un
substrato de pirex (2.3), se fabricarán en oro (2.4) como metal
principal, aunque se utilizará además cromo (2.5) como metal de
adhesión entre el oro y el substrato.
La figura nº 2, además de ilustrar acerca de la
funcionalización de los electrodos interdigitados y del ensayo
competitivo que ocurre sobre el dispositivo sensor, muestra de forma
esquemática el substrato del dispositivo sensor (2.3), el metal
principal de los electrodos (2.4), el metal de adhesión de los
electrodos (2.5), el antígeno tapizado (2.6) sobre los electrodos,
el anticuerpo (2.7), así como la molécula a detectar (2.8).
En el "bloque de alimentación y detección
química" (4.1) que se muestra en la figura nº 4 se muestra además
de la matriz de electrodos interdigitados (4.1.1) con contactos
clip-on (que pueden ser sustituidos por otro
tipo de contactos), el "espejo" de los contactos (4.1.2) para
la salida de la señal eléctrica, así como una serie de micro
jeringas denotadas \mu-jeringas (4.1.3), que
pueden ser sustituidas por un sistema fluídico, para la inyección de
los sistemas biológicos, las sustancias a detectar, la solución
buffer y una entrada de N_{2} para el secado de los IDE's. También
puede verse un generador de funciones (4.1.4) que excita el sistema
mediante una señal sinusoidal de baja amplitud a la frecuencia de
trabajo (4.1.5).
El "bloque de captura y procesado de datos"
(4.2) que se muestra en la figura nº 4 comprende un sencillo sistema
compuesto primeramente de un medidor de impedancias (4.2.1) para la
lectura de los componentes de la impedancia (resistencia, capacidad)
existente entre los electrodos interdigitados. Posteriormente estos
datos de impedancia son comparados en una tabla guardada por Ej.: en
un \mu-controlador, incluido en una circuitería
de control (4.2.2), para determinar la concentración de la(s)
sustancia(s) a detectar y finalmente estos datos pueden ser
presentados o transmitidos en un ordenador portátil, PDA y similares
(4.2.3).
El "bloque de detección química" (5.1) que
se muestra en la figura nº 5 incluye además de la matriz de
electrodos interdigitados(5.1.1) con contactos
clip-on (que pueden ser sustituidos por otro tipo de
contactos), el "espejo" de los contactos (5.1.2) para la salida
de la señal eléctrica, así como un sencillo sistema fluídico (que
pueden ser sustituido por un serie de
\mu-jeringas) compuesto de una única entrada
inlet (5.1.3) y una única salida outlet (5.1.4) para
la inyección de los sistemas biológicos, las sustancias a detectar,
la solución buffer y la entrada de N_{2} para el secado de los
IDE's.
En el "bloque de alimentación y captura de
datos" (5.2) que se muestra en la figura nº 5 se incluye un
analizador de impedancias (5.2.1) que excita el sistema mediante una
señal sinusoidal de baja amplitud en el espectro de frecuencias de
trabajo (5.2.2) y que además captura los datos de impedancia
resultantes de la medida (5.2.3).
En el "bloque de procesado de datos" (5.3)
que se muestra en la figura nº 5 los datos de impedancia son
comparados en una tabla guardada por Ej.: en un
\mu-controlador, incluido en una circuitería de
control (5.3.1), para determinar la concentración de la(s)
sustancia (s) a detectar y finalmente estos datos pueden ser
presentados o transmitidos en un ordenador portátil, PDA y similares
(5.3.2).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser
limitativos de su alcance.
\newpage
Procedimiento para la funcionalización de los
dispositivos sensores y la detección de residuos de pesticida en
vino, mediante medidas de impedancia a una sola frecuencia,
utilizando PBS como solución buffer y en donde la capa de antígeno
ha sido inmovilizada sobre la superficie del dispositivo sensor
mediante absorción pasiva.
1. Lavado de los electrodos interdigitados.
Lavamos los IDE1 s mediante una solución de etanol absoluto 70% y
agua Milli-Q 30%. A continuación, los dispositivos
son sumergidos en una solución de NaOH 2.5% en agua
Milli-Q. Después de 12 horas las muestras son
aclaradas en agua Milli-Q para neutralizar la acción
del NaOH. Se Secan los electrodos con etanol y N_{2}.
2. Inmovilización del antígeno. Se incuba la
solución de antígeno durante toda una noche a 25ºC. Después se
elimina el liquido sobrante en los electrodos interdigitados y se
seca con N_{2}.
3. Medidas de impedancia del estado inicial. Se
sumergen los electrodos en una solución de PBS. Se excita el sistema
con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Se
realizan las medidas de impedancia a la frecuencia escogida (Ej.: 1
MHz) a temperatura ambiente y los datos (Ej.: capacidad) se guardan
en la tabla 1 generada por la circuitería de control.
4. Ensayo competitivo. Se añade la muestra de
vino sobre los IDE's seguida de la solución de anticuerpo. Después
de 30 min de incubación a temperatura ambiente se lavan los
electrodos con PBST y con agua Milli-Q.
5. Medidas de impedancia del estado final. Se
sumergen los electrodos en una solución de PBS. Se excita el sistema
con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Se
realizan las medidas de impedancia a la frecuencia escogida (Ej.: 1
MHz) a temperatura ambiente y los datos (Ej.: capacidad) se guardan
en la tabla 2 generada por la circuitería de control.
6. Detección de pesticida. El sistema de control
calcula la variación de impedancia existente entre las tablas 1 y 2
para cada dispositivo y las compara con los datos almacenados en las
tablas de referencia para cada uno de los pesticidas que se
incluyen.
7. Muestra de resultados. El sistema de control
muestra los resultados mediante gráficas y tabla de resultados al
equipo de visualización (Ej.: ordenador portátil, PDA).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento para la funcionalización de los
dispositivos sensores ? y la detección de residuos de pesticida en
vino mediante medidas de impedancia en un espectro de frecuencias,
utilizando PBS como solución buffer y donde la capa de antígeno ha
sido inmovilizada sobre la superficie del dispositivo mediante
absorción pasiva.
1. Lavado de los electrodos interdigitados. Se
lavan los IDE's mediante una solución de etanol absoluto 70% y agua
Milli-Q 30%. A continuación, los dispositivos son
sumergidos en una solución de NaOH 2.5% en agua
Milli-Q. Después de 12 horas las muestras son
aclaradas en agua Milli-Q para neutralizar la acción
del NaOH. Se secan los electrodos con etanol y N_{2}.
2. Inmovilización del antígeno. Se incuba la
solución de antígeno durante toda una noche a 25ºC. Después se
elimina el liquido sobrante en los electrodos interdigitados y se
secan con N_{2}.
3. Medidas de impedancia del estado inicial. Se
sumergen los electrodos en una solución de PBS. Se excita el sistema
con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Se,
realizan las medidas de impedancia en el espectro de frecuencia
escogido (Ej.: 40 Hz-1 MHz) a temperatura ambiente y
se envían los datos (módulo y fase) a la circuitería de control. A
partir de estos datos la circuitería de control obtiene los
elementos del circuito (resistencias, capacidades) que modelan el
sistema y se guardan en la tabla 1 generada para este fin.
4. Ensayo competitivo. Se añade la muestra de
vino sobre los IDE's seguida de la solución de anticuerpo. Después
de 30 min de incubación a temperatura ambiente se lavan los
electrodos con PBST y con agua Milli-Q.
5. Medidas de impedancia del estado final. Se
sumergen los electrodos en una solución de PBS. Se excita el sistema
con una señal de voltaje ac de baja amplitud (por Ej.: 25 mV). Se
realizan las medidas de impedancia en el espectro de frecuencia
escogido (Ej.: 40 Hz-1 MHz) a temperatura ambiente y
se envían los datos (módulo y fase) a la circuitería de control. A
partir de estos datos la circuitería de control obtiene los
elementos del circuito (resistencias, capacidades) que modelan el
sistema y se guardan en la tabla 2 generada para este fin.
6. Detección de pesticida. El sistema de control
calcula la variación de los elementos del circuito que modela el
sistema existente entre las tablas 1 y 2 para cada dispositivo y las
compara con los datos almacenados en las tablas de referencia para
cada uno de los pesticidas que se incluyen.
7. Muestra de resultados. El sistema de control
muestra los resultados mediante gráficas y tabla de resultados al
equipo de visualización (Ej.: ordenador portátil, PDA).
\vskip1.000000\baselineskip
Descrita suficientemente la presente invención
en correspondencia con las figuras anexas, es fácil comprender que
podrán introducirse en la misma cualesquiera modificaciones de
detalle que se estimen convenientes siempre y cuando no se altere-
la esencia de la invención que queda resumida en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (20)
1. Dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos no marcados, para la detección y cuantificación de
sustancias presentes en líquidos, que comprende:
- una matriz de electrodos interdigitados
funcionalizados con una capa de antígeno tapizado en la superficie
de los electrodos, mediante una técnica de inmovilizado por
absorción, estando dicha capa de antígeno prevista para reaccionar
con unos anticuerpos no marcados que se aportan, después de dichas
sustancias a detectar y cuantificar contenidas en un líquido, al
dispositivo sensor, de manera que una parte de dichos anticuerpos no
marcados es capturada por dicha superficie de los electrodos
funcionalizada y otra parte es capturada por las moléculas de la
sustancia a detectar y cuantificar, que es evacuada, reaccionando
competitivamente dichas moléculas respecto a la reacción de dicha
capa de antígeno, con dichos anticuerpos no marcados; y
- unos medios de detección previstos para
detectar la variación en las propiedades eléctricas de dicha matriz
de electrodos interdigitados, provocada por dicha parte de
anticuerpos no marcados capturados por dicha capa de antígeno en
cada ensayo de una sustancia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un generador de funciones que
excita el sistema de electrodos interdigitados mediante una señal
sinusoidal de baja amplitud a una frecuencia de
trabajo.
trabajo.
3. Dispositivo según la reivindicación 2,
caracterizado porque dichos medios de detección comprenden un
medidor de impedancia para la lectura de la impedancia existente
entre los electrodos interdigitados de dicha matriz de electrodos
interdigitados, estando éstos sumergidos en una solución tampón,
antes y después de la captura, por parte de la capa de antígeno, de
dicha parte de anticuerpos no marcados.
4. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un analizador de impedancias
previsto para excitar el sistema de electrodos interdigitados
mediante una señal sinusoidal de baja amplitud en el espectro de
frecuencias de trabajo y que además captura los datos de impedancia
resultantes de la medida, estando dichos electrodos sumergidos en
una solución tampón antes y después de la captura, por parte de la
capa de antígeno, de dicha parte de anticuerpos no marcados.
5. Dispositivo según la reivindicación 3 ó 4,
caracterizado por comprender un bloque de procesado de datos
que incluye una tabla almacenada en un microcontrolador y una
circuitería de control para determinar la concentración de
la(s) sustancia(s) a detectar.
6. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un sistema de
micro-jeringas previsto para realizar el depósito
sobre los electrodos interdigitados de unas soluciones de dicha
capa de antígeno de funcionalización, y de una solución de una
sustancia a analizar.
7. Dispositivo según la reivindicación 6,
caracterizado porque cada electrodo de dicha matriz de
electrodos interdigitados integra un grupo propio de micro jeringas
permitiendo inyectar diferentes soluciones a cada electrodo, o
diferentes réplicas de la misma solución para mostrar un promedio de
detección.
8. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un sistema fluídico previsto
para realizar el depósito de unas soluciones de funcionalización de
dicha capa de antígeno sobre los electrodos interdigitados, y de una
solución de una sustancia a analizar.
9. Dispositivo según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho sistema fluídico dispone de un
único canal de entrada y un único canal de salida para todos los
electrodos interdigitados de la matriz, permitiendo introducir a
través de dicho canal de entrada una solución contenedora de una o
más moléculas a detectar.
10. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque dichos electrodos interdigitados tienen
forma de barra y están dispuestos sobre un substrato de pirex.
11. Dispositivo según la reivindicación 10,
caracterizado porque dichos electrodos interdigitados son de
oro.
12. Dispositivo según la reivindicación 11,
caracterizado porque comprende una capa de cromo como metal
de adhesión entre los electrodos de oro y dicho substrato de
pirex.
13. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por incorporar medios
para aportación de un gas de secado para el secado de los electrodos
interdigitados entre cada paso de su funciona-
lización.
lización.
\newpage
14. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque los terminales de los electrodos
interdigitados se encuentran conectados a un equipo de medida
mediante un sistema de conexión con contactos
"clip-on" formado por dos piezas:
i) una matriz de electrodos interdigitados que
incluyen unas salidas simétricas y externas, y
ii) un "espejo" de estas salidas externas,
las cuales conectan dichos IDE's con dicho equipo de medida).
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento para la detección y
cuantificación de sustancias presentes en líquidos, que
comprende:
a) funcionalizar con una capa de antígeno la
superficie de unos electrodos interdigitados, tapizando dicha
superficie;
b) realizar una primera medida de las
propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados,
c) aplicar una solución con unas moléculas a
detectar seguida de una solución con anticuerpos no marcados sobre
dichos electrodos interdigitados, para que dichos antígenos y dichas
moléculas de la sustancia a detectar, que luego es evacuada,
reaccionen competitivamente con dichos anticuerpos no marcados;
d) realizar una segunda medida de las
propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados, una vez
que una parte de los anticuerpos no marcados han sido capturados por
dicha capa de antígeno;
e) comparar dichas segundas medidas con dichas
primeras medidas; y
f) detectar, en función de la variación
detectada en dicha comparación, a qué sustancia pertenecen dichas
moléculas, por comparación con unas tablas de referencia para cada
sustancia analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque dicha etapa f) comprende además
cuantificar el número de moléculas incluidas en dicha solución de
moléculas a detectar.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, caracterizado porque dicha etapa f) comprende detectar
simultáneamente varias sustancias mediante la aplicación, en dicha
etapa c), de varias soluciones con anticuerpos específicos al
antígeno inmovilizado en dicha etapa a), y el uso de matrices de
electrodos integrables.
18. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque comprende, tras dicha etapa f), limpiar
a los electrodos de todo agente biológico, así como de las
nanopartículas conductoras, y reutilizar dichos electrodos
interdigitados realizando de nuevo dichas etapas a) a f).
19. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque dichas etapas b) y d) comprenden una
media de impedancia a una sola frecuencia, utilizando PBS como
solución tampón en la que están sumergidos los electrodos
interdigitados.
20. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque dichas etapas b) y d) comprenden una
media de impedancia en un espectro de frecuencias, utilizando PBS
como solución tampón en la que están sumergidos los electrodos
interdigitados.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700283A ES2347618B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos no marcados. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700283A ES2347618B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos no marcados. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2347618A1 ES2347618A1 (es) | 2010-11-02 |
| ES2347618B1 true ES2347618B1 (es) | 2011-09-22 |
Family
ID=42978776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200700283A Active ES2347618B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos no marcados. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2347618B1 (es) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4822566A (en) * | 1985-11-19 | 1989-04-18 | The Johns Hopkins University | Optimized capacitive sensor for chemical analysis and measurement |
| WO2002054052A1 (en) * | 2001-01-08 | 2002-07-11 | Leonard Fish | Diagnostic instruments and methods for detecting analytes |
| EP1888778B1 (en) * | 2005-05-06 | 2012-11-14 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Digital bio disc(dbd), dbd driver apparatus, and assay method using the same |
-
2007
- 2007-01-29 ES ES200700283A patent/ES2347618B1/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| COOPER, J.C. et al. The nature of biosensor technology. Journal of Biomedical Engineering. Vol. 10, N$^{o}$ 3, páginas 210-219, ISSN 0141-5425, <DOI:10.1016/0141-5425(88)90001-5> * |
| LASCHI, S. et al. Planar electrochemical sensors for biomedical applications. Medical, Engineering and Physics. Diciembre 2006, Vol. 28, N$^{o}$ 10, páginas 934-943, ISSN 1350-4533, <DOI: 10.1016/j.medengphy.2006.05.006> * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2347618A1 (es) | 2010-11-02 |
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