ES2347398A1

ES2347398A1 - Esterasa termofila de thermus thermophilus. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2347398A1
Application number: ES200801767A
Authority: ES
Inventors: Maria Isabel Gonzalez Siso; Maria Esperanza Cerdan Villanueva; Olalla Lopez Lopez; Maria Luisa Rua Rodriguez; Lorenzo Pastrana Castro; Juan Pablo Fuciños Gonzalez
Original assignee: Universidade da Coruna; Universidade de Vigo
Current assignee: Universidade da Coruna; Universidade de Vigo
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2008-06-11
Publication date: 2010-10-28
Anticipated expiration: 2028-06-11
Also published as: ES2347398B1; WO2009156532A1

Abstract

The invention relates to a thermophilic protein with esterase activity. Said protein, of the Thermus thermophilus organism, is expressed in recombinant yeasts and bacteria, in particular E.coli, K.lactis and S.cerevisiae. The esterase is expressed in fusion protein form with a signal sequence that enables secretion to the culture medium and, in addition, is operably linked to an inducible promoter. The recombinant strains are advantageous in that: (i) the cultivation thereof is much easier than that of the thermophilic organism that produces the enzyme, and (ii) they can be used to obtain a larger number of enzyme units per litre of culture than the original thermophilic strains.

Description

Esterasa termófila de Thermus thermophilus.Thermophilic esterase from Thermus thermophilus .

Technical Field of the Invention

La presente invención se refiere a enzimas termófilas, en particular a esterasas termófilas, de Thermus thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilos.The present invention relates to thermophilic enzymes, in particular thermophilic esterases, of Thermus thermophilus that can be expressed in mesophilic organisms.

Background of the invention

Las enzimas son catalizadores muy potentes, selectivos y muy específicos. El término esterasa es un término general para denotar una enzima de tipo hidrolasa que hidroliza enlaces de tipo éster para producir alcoholes y ácidos carboxílicos.Enzymes are very potent catalysts, Selective and very specific. The term esterase is a term general to denote a hydrolase type enzyme that hydrolyzes ester type bonds to produce alcohols and acids carboxylic.

Las aplicaciones que tienen las hidrolasas, y en particular las esterasas, en la industria actual son múltiples, por ejemplo, el ibuprofeno, un agente antiinflamatorio no esteroideo se ha sintetizado mediante una hidrólisis estereo-selectiva de su metil-éster mediante el empleo de una carboxiesterasa. La mayor aplicación industrial de las hidrolasas, en particular las esterasas, incluyen la industria de detergentes donde se emplean para descomponer materia grasa en sustancias hidrofílicas fácilmente eliminables.The applications that hydrolases have, and in particular esterases, in today's industry are multiple, for For example, ibuprofen, a non-steroidal anti-inflammatory agent has synthesized by hydrolysis stereo-selective of its methyl ester by use of a carboxylesterase. The largest industrial application of hydrolases, particularly esterases, include the industry of detergents where they are used to break down fat in easily removable hydrophilic substances.

El mayor requisito para una enzima comercial es su estabilidad térmica porque la desnaturalización térmica es una causa común de la inactivación enzimática. Adicionalmente, mediante el incremento en la termoestabilidad enzimática se podrían llevar a cabo reacciones enzimáticas a mayor temperatura, lo que podría ayudar para aumentar los ratios de conversión, la solubilidad del sustrato y reducir la posibilidad de crecimiento microbiano y la viscosidad en el medio de reacción. En el procesado de los alimentos, desde un punto de vista de higiene, las reacciones enzimáticas a altas temperaturas son menos peligrosas para la contaminación por bacterias. En la descomposición de grasas y aceites, actualmente se emplean métodos en los que las grasas y aceites se ponen en contacto con vapor a temperaturas de aproximadamente 250°C y a presiones de aproximadamente 50 atmósferas, lo que implica la necesidad de disponer de instalaciones adecuadas para llevar a cabo tales reacciones. Grasas como el ácido palmítico o el ácido esteárico son sólidas a temperatura ambiente y tienen puntos de fusión de aproximadamente 65°C. Por ello, las reacciones de hidrólisis deben llevarse a cabo a temperaturas por encima de dicho punto de fusión.The biggest requirement for a commercial enzyme is its thermal stability because thermal denaturation is a Common cause of enzymatic inactivation. Additionally, by the increase in enzymatic thermostability could lead to out enzymatic reactions at higher temperatures, which could help to increase conversion rates, the solubility of substrate and reduce the possibility of microbial growth and the viscosity in the reaction medium. In the processing of food, from a hygiene point of view, reactions High temperature enzymes are less dangerous for the bacteria contamination In the breakdown of fats and oils, methods are currently used in which fats and oils are contacted with steam at temperatures of approximately 250 ° C and at pressures of approximately 50 atmospheres, which implies the need for facilities suitable for carrying out such reactions. Fats like acid palmitic or stearic acid are solid at room temperature and they have melting points of approximately 65 ° C. Therefore, the hydrolysis reactions should be carried out at temperatures by above said melting point.

La disponibilidad de esterasas termofílicas permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas (p.ej. reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en agua).The availability of thermophilic esterases would allow to operate at high temperatures, with the logical increase of reaction rate and easier solubilization of substrates, an aspect that is often a limiting factor in some applications of this type of enzymes (eg reactions of synthesis in media with low water content).

Los microorganismos extremófilos han despertado un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente adecuadas para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a temperaturas superiores a 45°C, y en algunos casos (hipertermófílos) incluso por encima de 90°C.Extremophilic microorganisms have woken up a great interest during the last years, due to the high thermal stability, resistance to chemical denaturants and pHs ends of their enzymes, which make them especially suitable for its use in biotransformation processes in extreme conditions of pH, salinity and temperature. Thermophilic microorganisms grow to temperatures above 45 ° C, and in some cases (hyperthermophils) even above 90 ° C.

Aunque los organismos termófilos pueden ser buenos candidatos en producir enzimas termoestables, muchas veces no resulta práctico debido al bajo rendimiento y al equipo de fermentación de alta temperatura que sería necesario emplear.Although thermophilic organisms can be good candidates in producing thermostable enzymes, often not It is practical due to the low performance and equipment High temperature fermentation that would be necessary to use.

La producción de enzimas de interés biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente con aquel del que procede la enzima de interés.The production of enzymes of biotechnological interest from extreme thermophilic microorganisms is usually carried out by cloning and expression at a high level in an easily manipulated model bacterium or yeast, such as Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae . However, there are a large number of thermophilic enzymes whose synthesis complexity makes it impossible to obtain them actively in these model organisms (Hidalgo, A. et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839 -3844). This is the frequent case of hetero-oligomeric enzymes or that of those enzymes that require the incorporation of a cofactor in the synthesis process, which usually requires the help of specific chaperones that keep the enzyme structure in an open position for the entry of the mentioned cofactor. In such cases, which may constitute up to 50% of the enzymes encoded in any thermophile, the obvious alternative is to use a thermophilic microorganism evolutionarily related to that from which the enzyme of interest comes from.

Las bacterias del género Thermus spp. se caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos termófilos extremos. Las bacterias del género Thermus spp. tienen gran potencial de utilización como sistemas de obtención de enzimas termoestables mediante selección funcional a elevadas temperaturas, existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura científica (Fridjonsson y cols., 2002. J Bacteriol. Vol. 184:3385-3391; Brouns y cols., 2005. J Biol Chem. Vol. 280:11422-31). No obstante, la aplicación de estos métodos depende de la generación de una cepa de Thermus spp. mutante que requiera de la actividad funcional de la enzima a termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos mutantes.The bacteria of the genus Thermus spp. They are characterized by their ability to grow at high temperatures and by their ease of genetic manipulation, unique among extreme thermophilic organisms. The bacteria of the genus Thermus spp. they have great potential for use as systems for obtaining thermostable enzymes through functional selection at high temperatures, there are some examples of this in the scientific literature (Fridjonsson et al., 2002. J Bacteriol. Vol. 184: 3385-3391; Brouns et al. ., 2005. J Biol Chem. Vol. 280: 11422-31). However, the application of these methods depends on the generation of a strain of Thermus spp. mutant that requires the functional activity of the enzyme to be thermostabilized for its growth, currently existing methodologies for obtaining such mutants are very limited.

La solicitud de patente internacional WO9725058 describe el aislamiento, caracterización y purificación de esterasas de Thermus sp. T351 (ATCC 31674). Dichas enzimas pueden expresarse en organismos mesófilos tales como Escherichia coli a partir de la infección de dichas células con vector de expresión que codifica para dicha enzima, tal como el fago lambda. Por otro lado, el documento WO2006082059 describe la expresión de una enzima con actividad esterasa de Alicyclobacillus acidocaldarius en vectores de expresión que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifican dicha enzima en forma de proteína de fusión. Dicha esterasa es particularmente útil como marcador de actividad proteica en sistemas de síntesis de proteínas libres de células (cell-free translation system) o en sistemas in vivo, tales como E. coli o células de levadura.International patent application WO9725058 describes the isolation, characterization and purification of esterases from Thermus sp. T351 (ATCC 31674). Said enzymes can be expressed in mesophilic organisms such as Escherichia coli from the infection of said cells with expression vector encoding said enzyme, such as lambda phage. On the other hand, WO2006082059 describes the expression of an enzyme with Alicyclobacillus acidocaldarius esterase activity in expression vectors comprising the nucleotide sequence encoding said enzyme in the form of a fusion protein. Said esterase is particularly useful as a marker of protein activity in cell-free translation systems (cell-free translation system) or in vivo systems, such as E. coli or yeast cells.

Por otra parte, Fuciños P., et al (J Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describen la identificación de enzimas extracelulares con actividad lipasa/esterasa producidas en cultivos de Thermus thermophilus HB27. Dichos autores describen la purificación parcial y caracterización bioquímica preliminar de las mismas a nivel de actividad y estabilidad a altas temperaturas (80-90°C). Sin embargo, el grado de purificación de dichas enzimas es muy bajo (factor de purificación de 4 con respecto al homogeneizado celular) y por otra parte, dichos autores no describen la secuencia aminoacídica de dichas proteínas.On the other hand, Fuciños P., et al (J Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describe the identification of extracellular enzymes with lipase / esterase activity produced in Thermus thermophilus HB27 cultures. These authors describe the partial purification and preliminary biochemical characterization thereof at the level of activity and stability at high temperatures (80-90 ° C). However, the degree of purification of said enzymes is very low (purification factor of 4 with respect to the cell homogenate) and on the other hand, said authors do not describe the amino acid sequence of said proteins.

Por tanto, existe la necesidad de encontrar nuevas enzimas termófilas con actividad esterasa que presenten estabilidad a elevadas temperaturas y que puedan expresarse en organismos mesófilos.Therefore, there is a need to find new thermophilic enzymes with esterase activity that present stability at high temperatures and that can be expressed in mesophilic organisms.

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Compendium of the invention

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.In a first aspect, the invention relates to an isolated polypeptide with esterase activity comprising the amino acid sequence identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprendeIn a second aspect, the invention relates to a fusion protein comprising

i)i): un polipéptido según la invención; ya polypeptide according to the invention; Y

ii)ii): un péptido heterólogo.a heterologous peptide

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína de fusión según la invención.In a third aspect, the invention relates to with a nucleotide sequence encoding a polypeptide or a fusion protein according to the invention.

En otro aspecto, la invención también se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención.In another aspect, the invention is also relates to a gene construct that comprises a sequence of nucleotides according to the invention.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica según la invención.In a further aspect, the invention is relates to an expression vector comprising a sequence of nucleotides or a gene construct according to the invention.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende una secuencia de nucleótidos, una construcción génica o un vector de expresión según la invención.In another aspect, the invention relates to a cell comprising a nucleotide sequence, a construct gene or an expression vector according to the invention.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido según la invención o una proteína de fusión según la invención.In another aspect, the invention relates to a composition comprising a polypeptide according to the invention or a fusion protein according to the invention.

En otro aspecto, la invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad esterasa que comprende cultivar una célula según la invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido.In another aspect, the invention also relates to to a procedure for obtaining a polypeptide with activity esterase comprising culturing a cell according to the invention under conditions that allow the production of said polypeptide and, if If desired, recover said polypeptide.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido según la invención o una proteína de fusión según la invención en la elaboración de una composición detergente.In a further aspect, the invention is relates to the use of a polypeptide according to the invention or a fusion protein according to the invention in the preparation of a detergent composition

Finalmente, la invención se refiere a un método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la invención con una grasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.Finally, the invention relates to a method for the modification of fats or oils that includes putting in contact a polypeptide or a fusion protein according to the invention with a fat or oil in conditions where said polypeptide or fusion protein can hydrolyze said fat or oil.

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Brief description of the figures

Figura 1 muestra unas curvas de actividad esterasa y biomasa en el medio de cultivo para el fragmento del polipéptido de la invención que carece de los aminoácidos 1-16 del extremo N-terminal (Figura 1 A) y del fragmento del polipéptido de la invención que carece de los aminoácidos 1-26 del extremo N-terminal (Figura IB), ambos expresados en la levadura Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 junto con la señal de secreción alfa-mating factor de K. lactis. Figure 1 shows some esterase and biomass activity curves in the culture medium for the polypeptide fragment of the invention that lacks amino acids 1-16 of the N-terminal end (Figure 1 A) and the polypeptide fragment of the invention that It lacks amino acids 1-26 of the N-terminal end (Figure IB), both expressed in the yeast Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 together with the alpha-mating secretion signal of K. lactis factor .

La Figura 2 muestra unas curvas de actividad esterasa y biomasa en el medio de cultivo para el fragmento del polipéptido de la invención que carece de los aminoácidos 1-16 del extremo N-terminal expresado en la levadura Saccharomyces cerevisiae BJ3505 junto con la secuencia de la señal de secreción del alfa-mating factor de S. cerevisiae. Figure 2 shows curves of esterase and biomass activity in the culture medium for the fragment of the polypeptide of the invention that lacks amino acids 1-16 of the N-terminal end expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae BJ3505 together with the sequence of the secretion signal of the alpha-mating factor of S. cerevisiae.

En la Figura 3 se muestra una electroforesis en gel SDS-PAGE del medio de cultivo postincubado (carril 2), concentrado por ultrafiltración (carril 3) y el eluído de la cromatografía de afinidad (carril 4). El carril 1 es el marcador de Pm (Da). El tratamiento con la glicosidasa EndoH resulta en una única banda (carril 5).Figure 3 shows an electrophoresis in SDS-PAGE gel of post-incubated culture medium (lane 2), concentrated by ultrafiltration (lane 3) and eluted of affinity chromatography (lane 4). Lane 1 is the Pm marker (Da). EndoH glycosidase treatment results in a single band (lane 5).

Detailed description of the invention

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido aislado, de aquí en adelante polipéptido de la invención, con actividad esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.In a first aspect, the invention relates to with an isolated polypeptide, hereinafter polypeptide of the invention, with esterase activity comprising the sequence of amino acids identified in SEQ ID NO: 1 or a variant functionally equivalent thereof.

El término "esterasa", tal como aquí se emplea se refiere a una enzima de tipo hidrolasa que hidroliza enlaces de tipo éster.The term "esterase", as it is here employs refers to a hydrolase type enzyme that hydrolyzes ester type links.

Tal como aquí se utiliza, la expresión "variante funcionalmente equivalente" de una secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que (i) es sustancialmente homologa a dicha secuencia de aminoácidos y (ii) ejerce la misma función (e.g. que tiene actividad esterasa).As used herein, the expression "functionally equivalent variant" of a sequence of amino acids refers to an amino acid sequence that (i) is substantially homologous to said amino acid sequence and (ii) It has the same function (e.g., it has esterase activity).

Una secuencia de aminoácidos es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 75%, típicamente de, al menos, un 80%, preferentemente de, al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún más preferentemente de, al menos, un 95%, 97%, 98% ó 99%, respecto a dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10). El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc. Así, la expresión "variante funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el polipéptido o proteína en cuestión mantiene, al menos, una de las funciones del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, preferentemente, al menos, una función relacionada con la hidrólisis, en particular, que mantiene la actividad esterasa. La actividad esterasa del polipéptido de la invención puede ser determinada mediante el empleo de métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, por ejemplo, a modo simplemente ilustrativo, la actividad esterasa de dicho polipéptido se puede determinar mediante métodos tales como los ensayos descritos en los Ejemplos 1-3 donde se describe que para la medida de actividad lipolítica, se emplea el método descrito por Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117:233-241).An amino acid sequence is substantially homologous to a given amino acid sequence when it has a degree of identity of at least 70%, advantageously of at least 75%, typically at least 80%, preferably of at least 85%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, 97%, 98% or 99%, with respect to said determined amino acid sequence. The degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as, for example, BLAST (Altschul SF et al. Basic local alignment search tool J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10). The person skilled in the art will understand that the amino acid sequences referred to in this description can be chemically modified, for example, by chemical modifications that are physiologically relevant, such as phosphorylations, acetylations, etc. Thus, the term "functionally equivalent variant", as used herein, means that the polypeptide or protein in question maintains at least one of the functions of the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably, at least, a function related to hydrolysis, in particular, which maintains esterase activity. The esterase activity of the polypeptide of the invention can be determined by the use of conventional methods known to those skilled in the art, for example, by way of illustration only, the esterase activity of said polypeptide can be determined by methods such as the assays described in Examples 1-3 where it is described that for the measurement of lipolytic activity, the method described by Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117: 233-241) is employed.

En una realización particular, el polipéptido de la invención es una variante que presenta una o más inserciones, deleciones y/o modificaciones de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y mantiene la capacidad esterasa.In a particular embodiment, the polypeptide of The invention is a variant that has one or more inserts, deletions and / or modifications of one or more amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and maintains the esterase capacity.

En otra realización particular, dicha variante es un fragmento del polipéptido de la invención. El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un polipéptido que comprende una porción de dicho polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, una secuencia de aminoácidos contiguos comprendida dentro de dicha SEQ ID NO: 1. Para su empleo en la presente invención dicho fragmento debe ser funcionalmente equivalente a dicho polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, debe tener actividad esterasa. En una realización particular de la invención, dicha esterasa es una esterasa termófila. En una realización concreta, dicho fragmento comprende las secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en la que se han eliminado los 16 ó 26 aminoácidos del extremo N-terminal, es decir, las putativas señal de secreción (aminoácidos 1-16) y hélice transmembrana (aminoácidos 6-26), respecto a la secuencia aminoacídica previamente mencionada.In another particular embodiment, said variant It is a fragment of the polypeptide of the invention. The term "fragment" as used in the present description is refers to a polypeptide comprising a portion of said polypeptide comprising the amino acid sequence shown in the SEQ ID NO: 1, that is, a sequence of contiguous amino acids included in said SEQ ID NO: 1. For use in the present invention said fragment must be functionally equivalent to said polypeptide comprising the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 1, that is, must have esterase activity. In a particular embodiment of the invention, said esterase is a thermophilic esterase. In one embodiment specifically, said fragment comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which all 16 or 26 have been removed amino acids of the N-terminal end, that is, the putative secretion signal (amino acids 1-16) and transmembrane helix (amino acids 6-26), with respect to the aforementioned amino acid sequence.

El término "termófilo" tal como aquí se emplea se refiere a una enzima, en particular, una esterasa que puede soportar condiciones de temperatura relativamente altas, es decir, que es estable y es capaz de realizar su actividad en condiciones de temperatura elevadas, en particular a una temperatura igual o superior a 50°C, más preferiblemente a una temperatura comprendida entre 60 y 90°C. En una realización particular, dicha enzima proviene de un organismo termófilo, en particular de Thermus thermophilus HB27. The term "thermophilic" as used herein refers to an enzyme, in particular, an esterase that can withstand relatively high temperature conditions, that is, it is stable and capable of carrying out its activity under elevated temperature conditions, in particularly at a temperature equal to or greater than 50 ° C, more preferably at a temperature between 60 and 90 ° C. In a particular embodiment, said enzyme comes from a thermophilic organism, in particular from Thermus thermophilus HB27.

Adicionalmente, el polipéptido de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, a modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión puede contener una región A constituida por un primer polipéptido que comprende el polipéptido de la invención unido a una región B que comprende un segundo péptido. Dicho segundo péptido puede ser cualquier péptido apropiado, por ejemplo, un péptido señal de secreción extracelular.Additionally, the polypeptide of the invention It can be part of a fusion protein. In this sense, to illustrative, not limiting, said fusion protein can contain a region A consisting of a first polypeptide that comprises the polypeptide of the invention bound to a region B that It comprises a second peptide. Said second peptide may be any appropriate peptide, for example, a signal peptide of extracellular secretion

Dicha región B puede estar unida a la región amino-terminal de dicha región A, o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región carboxilo- terminal de dicha región A. Ambas regiones A y B pueden estar unidas directamente o a través de un péptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína de fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas.Said region B may be linked to the region amino terminal of said region A, or, alternatively, said region B may be linked to the region carboxyl-terminal of said region A. Both regions A and B can be attached directly or through a spacer peptide (linker) between said regions A and B. The fusion protein can Obtained by conventional methods known to experts in matter, for example, by gene expression of the nucleotide sequence encoding said fusion protein in appropriate host cells.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprendeTherefore, in another aspect, the invention is refers to a fusion protein that comprises

ii)ii): un péptido heterólogo.a heterologous peptide

En una realización particular de la invención, dicho péptido heterólogo es un péptido señal de secreción extracelular, es decir, una secuencia que permita la secreción de dicha proteína de fusión al medio extracelular. Por péptido señal de secreción extracelular, según se usa en el contexto de la presente invención, se entiende todo péptido que comprende o que consiste en una secuencia señal que se encuentra de forma natural asociada a una proteína distinta al polipéptido según la invención que se desea expresar. Así, la presente invención contempla el uso de secuencias señal derivadas de cualquier péptido secretado, incluyendo tanto aquellas secuencias señal pertenecientes al mismo organismo cuyo polipéptido queremos expresar pero cuya función es promover la secreción al medio de proteínas distintas al polipéptido de la invención, así como de secuencias señal que derivan de otros microorganismos y que se encargan de promover la secreción al medio de cualquier enzima. Así, ejemplos ilustrativos pero no limitativos de secuencias señal que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que contienen o que consisten en la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae y de otras especies de los géneros Kluyveromyces, Pichia, y Hansenula, la secuencia señal de la toxina killer de K. lactis, la secuencia señal de la glucoamilasa II de S. diastaticus, la secuencia señal de la glucoamilasa de C. albicans, la secuencia señal de la fosfatasa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la toxina killer de 128 kDa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la invertasa de S. cerevisiae, así como secuencias aleatorias que son conocidas por su capacidad por reemplazar funcionalmente secuencias señales nativas de E. coli, tal y como han sido descritas por Kaiser, C. et al. (Science, 1987, 235:312-317). Así, ejemplos ilustrativos, no limitativos de secuencias señal de E. coli, incluyen la proteína MBP (maltose-binding protein), la proteína de unión a ribosa RBP (ribose-binding protein), la fosfatasa alcalina y el péptido señal OmpA así como otras secuencias señal que pueden ser identificadas usando los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo por Gallicioti, G. et al. J. Membrane Biology, 183:175-182). En una forma de realización preferida, cuando la célula a transformar es S. cerevisiae, la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia que codifica para la secuencia señal alfa-mating factor de S. cerevisiae fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo marco de lectura con la secuencia que codifica para el polipéptido de la invención. En otra realización preferida, cuando la célula a transformar es K. lactis, la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia que codifica para la secuencia señal alfa-mating factor domain de K. lactis fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo marco de lectura con la secuencia que codifica para el polipéptido de la invención.In a particular embodiment of the invention, said heterologous peptide is an extracellular secretion signal peptide, that is, a sequence that allows the secretion of said fusion protein into the extracellular medium. By "extracellular secretion signal peptide," as used in the context of the present invention, is meant any peptide comprising or consisting of a signal sequence that is naturally associated with a protein other than the polypeptide according to the invention that is desired. express. Thus, the present invention contemplates the use of signal sequences derived from any secreted peptide, including both those signal sequences belonging to the same organism whose polypeptide we want to express but whose function is to promote secretion to the medium of proteins other than the polypeptide of the invention, as well as of signal sequences that derive from other microorganisms and that are responsible for promoting secretion into the environment of any enzyme. Thus, illustrative but non-limiting examples of signal sequences that may be used in the context of the present invention include polypeptides that contain or consist of the signal sequence of the S. cerevisiae ? Preproofactor and other species of the genus Kluyveromyces, Pichia , and Hansenula , the killer toxin signal sequence of K. lactis , the glucoamylase II signal sequence of S. diastaticus , the glucoamylase signal sequence of C. albicans , the phosphatase signal sequence of S. cerevisiae , the signal sequence of killer toxin of S. cerevisiae 128 kDa, the signal sequence of S. cerevisiae invertase and random sequences are known for their ability to functionally replace native signal sequences of E. coli, as have been described by Kaiser, C. et al. (Science, 1987, 235: 312-317). Thus, illustrative, non-limiting examples of E. coli signal sequences include MBP protein (maltose-binding protein), ribose-binding protein RBP (ribose-binding protein), alkaline phosphatase and OmpA signal peptide as well as other signal sequences that can be identified using methods known in the art (for example by Gallicioti, G. et al. J. Membrane Biology, 183: 175-182). In a preferred embodiment, when the cell to be transformed is S. cerevisiae , the fusion protein of the invention comprises a sequence coding for the alpha-mating signal sequence of S. cerevisiae factor fused through its 3 'end and in the same reading frame with the sequence encoding the polypeptide of the invention. In another preferred embodiment, when the cell to be transformed is K. lactis , the fusion protein of the invention comprises a sequence encoding the alpha-mating signal domain sequence of K. lactis fused through its 3 'end and in the same reading frame with the sequence encoding the polypeptide of the invention.

El polipéptido de la invención o la proteína de fusión de la invención puede incluir, además, una secuencia aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia estará situada en una región de la proteína de fusión de la invención que no afecte adversamente a la funcionalidad del polipéptido de la invención. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser utilizada para aislar o purificar una proteína de fusión (denominadas genéricamente péptidos etiqueta o "tag") puede estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia aminoacídica útil para aislar o purificar una pro teína de fusión puede ser, por ejemplo, una cola de argininas (Arg-tag), una cola de histidinas (His-tag), FLAG-tag, Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo, tal como c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), \beta-galactosidasa, VSV-glicoproteína, etc. En una realización preferida de la invención, dicho péptido de purificación se selecciona entre un péptido Flag o una cola de polihistidinas.The polypeptide of the invention or the protein of fusion of the invention may further include a sequence amino acid useful for protein isolation or purification of fusion of the invention. Said sequence will be located in a fusion protein region of the invention that does not affect adversely to the functionality of the polypeptide of the invention. Virtually any amino acid sequence that may be used to isolate or purify a fusion protein (generically referred to as tag or "tag" peptides) can being present in said fusion protein of the invention. By way illustrative, not limiting, said amino acid sequence useful for isolating or purifying a fusion protein may be, for example, a tail of arginines (Arg-tag), a tail of histidines (His-tag), FLAG-tag, Strep-tag, an epitope capable of being recognized by an antibody, such as c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, calmodulin binding peptide, domain of cellulose binding, chitin binding domain, glutathione S-transferase-tag binding protein to maltose, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol Biotechnol (2003), 60: 523-525), β-galactosidase, VSV-glycoprotein, etc. In a preferred embodiment of the invention, said purification peptide is selected from a Flag peptide or a polyhistidine tail.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos, de aquí en adelante secuencia de nucleótidos de la invención, que codifica un polipéptido o una proteína de fusión según la invención. Por razones de simplicidad, bajo la denominación "secuencia de nucleótidos de la invención" se incluyen la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención, es decir, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, así como una secuencia de nucleótidos que codifica una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.In another aspect, the invention relates to a nucleotide sequence, hereinafter sequence of nucleotides of the invention, which encodes a polypeptide or a fusion protein according to the invention. For reasons of simplicity, under the name "nucleotide sequence of the invention" the nucleotide sequence encoding the polypeptide is included of the invention, that is, the polypeptide comprising the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 1, as well as a sequence nucleotide encoding a variant or fragment functionally equivalent of said polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención. En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica según la reivindicación.In another aspect, the invention relates to a gene construct comprising a nucleotide sequence according to the invention. In a further aspect, the invention relates to an expression vector comprising a nucleotide sequence or a gene construct according to claim.

El término "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN replicativo utilizado para expresar ADN que codifica el polipéptido de la invención o la proteína de fusión de la invención y que incluye una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de (1) elemento/s genético/s que tienen un papel regulatorio en la expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores o "enhancers" (aumentadores), operativamente unidos a (2) una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o la proteína de fusión de la invención que es transcrito a ARN mensajero y traducido a proteína y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de latranscripción y traducción.The term "expression vector" refers to a replicative DNA construct used to express DNA that encodes the polypeptide of the invention or the fusion protein of the invention and that includes a transcriptional unit comprising an assembly of (1) element / Genetic / s that have a regulatory role in gene expression, for example, promoters, operators or enhancers , operably linked to (2) a DNA sequence encoding the polypeptide or fusion protein of the invention which is transcribed to messenger RNA and translated into protein and (3) appropriate transcription and translation initiation and termination sequences.

Preferentemente, la invención contempla el uso de vectores que puedan ser propagados tanto en bacteria como en levadura.Preferably, the invention contemplates the use of vectors that can be propagated both in bacteria and in yeast.

En una realización particular de la invención, cuando la célula es una célula procariota, tal como una bacteria, vectores adecuados según la invención son, por ejemplo, los vectores pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (Messing, 1983. Meth. in Enzymology 101:20-77; Vieira y Messing, 1982. Gene 19:259-268), Bluescript (Stratagene, La Jolla, California) y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, pNH8A, pNH16a, pNH18a. En una realización particular de la invención, cuando dicha bacteria es E. coli, dicho vector es el plásmido pET, en particular, el plásmido pET21d. Los genes clonados en dicho plásmido se transcriben bajo el control del promotor del bacteriófago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés.In a particular embodiment of the invention, when the cell is a prokaryotic cell, such as a bacterium, suitable vectors according to the invention are, for example, vectors pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (Messing, 1983. Meth. In Enzymology 101 : 20-77; Vieira and Messing, 1982. Gene 19: 259-268), Bluescript (Stratagene, La Jolla, California) and its derivatives, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, pNH8A, pNH16a, pNH18a. In a particular embodiment of the invention, when said bacterium is E. coli , said vector is plasmid pET, in particular, plasmid pET21d. The genes cloned in said plasmid are transcribed under the control of the bacteriophage T7 promoter, when T7 RNA polymerase is activated in the host cell. The expression is induced with IPTG, which removes the repressor from the operator so that the transcription is carried out and the expression of the protein of interest is promoted.

       \global\parskip0.900000\baselineskip\ global \ parskip0.900000 \ baselineskip

Adicionalmente, ejemplos ilustrativos de vectores adecuados para la presente invención cuando dicha célula a transformar es una célula de levadura son los siguientes:Additionally, illustrative examples of vectors suitable for the present invention when said cell a transform is a yeast cell are the following:

--: Plásmidos autónomos multicopia: Estos plásmidos contienen secuencias que permiten la generación de múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser las denominadas 2 \mu, como la que aparece en los plásmidos episomales (YEp o "yeast episomal plasmids") o secuencias tipo ARS, como las que aparecen en los plásmidos de replicación (YRps o "yeast replication plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.Multicopy autonomous plasmids: These Plasmids contain sequences that allow the generation of multiple copies of said vectors. These sequences can be the called 2 µ, such as the one that appears in episomal plasmids (YEp or "yeast episomal plasmids") or ARS type sequences, such as those that appear in the replication plasmids (YRps or "yeast replication plasmids "). Examples of vectors based on this type of plasmids are p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD or p426GAL, YEp24 and YEplac.

--: Plásmidos autónomos de una única copia: Plásmidos que contienen la secuencia autónoma de replicación ARS1 y una secuencia centromérica (CEN4). Este tipo de plásmidos incluye los plásmidos centroméricos (YCps o "yeast centromere plasmids").Single-copy autonomous plasmids: Plasmids containing the autonomous replication sequence ARS1 and a centromeric sequence (CEN4). This type of plasmids includes centromeric plasmids (YCps or "yeast centromere plasmids ").

--: Plásmidos de integración: Plásmidos que son capaces de integrarse en el genoma de la célula que los hospeda. Este tipo de plásmidos incluye plásmidos de integración (YIPs o "yeast integrating plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.Integration Plasmids: Plasmids that They are able to integrate into the genome of the cell that hosts them. This type of plasmids includes integration plasmids (YIPs or "yeast integrating plasmids"). Examples of vectors based on These types of plasmids are pRS303, pRS304, pRS305 or pRS306 and Similar.

En una realización particular de la invención, cuando la célula transformada es una célula de levadura, en particular Kluyveromyces lactis, el vector de expresión es el plásmido pKLACl.In a particular embodiment of the invention, when the transformed cell is a yeast cell, in particular Kluyveromyces lactis , the expression vector is plasmid pKLACl.

La elección de un promotor y otro/s elemento/s regulatorios generalmente varía en función de la célula huésped utilizada. Promotores adecuados en el contexto de la presente invención incluyen promotores constitutivos que promueven la expresión de las secuencias asociadas a ellas de forma constante y promotores inducibles, que requieren de un estímulo externo para promover la transcripción de las secuencias asociadas a ellos.The choice of a promoter and other element / s Regulatory generally varies depending on the host cell used Adequate promoters in the context of this invention include constitutive promoters that promote the expression of the sequences associated with them constantly and inducible promoters, which require an external stimulus to promote the transcription of the sequences associated with them.

Promotores útiles para la realización de la presente invención incluyen:Promoters useful for the realization of the Present invention include:

--: Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1), el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor MRP7 y el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1).Constitutive promoters as per example, the alcohol dehydrogenase (ADH1) promoter, the elongation factor 1 alpha (TEF) promoter and gene promoter which encodes the triosa phosphate isomerase (TPI), the promoter of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GPD) and the 3-phosphoglycerate kinase (GPK) promoter, the MRP7 promoter and alcohol oxidase promoter (AOX1).

--: Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneina (CUP1) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor \alpha) según se describen en US5063154, el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1- 10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de la fosfatasa (PH05) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.Inducible promoters such as the metallothionein promoter (CUP1) whose expression is regulated by adding copper to the culture medium, the gene promoter which encodes the FUS1 gene or the FUS2 gene, whose expression is activated in presence of pheromones (the α factor) as described in US5063154, the TET promoter whose expression is regulated in the presence of tetracyclines, the promoters GAL1-10, GALL, GALS that are activated in presence of galactose, the VP16-ER promoter, estrogen-inducible, and the phosphatase promoter (PH05) whose expression is activated in the presence of phosphate and the promoter of the HSP150 heat shock protein, whose expression is activated at high temperature

--: Promotores reprimibles como por ejemplo el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S.cerevisiae cuya expresión se puede reprimir cuando se hace crecer el microorganismo en una fuente de carbono no fermentable así como promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión se verá reprimida cuando parte de la lactosa se ha hidrolizado y comienza a aumentar la concentración de glucosa en el medio, el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae y el promotor de la galactoquinasa (GAL1). Preferiblemente, el promotor que es reprimible por glucosa es el promotor del gen ADH2.Suppressive promoters such as the promoter of the enolase gene (ENO-1) of S.cerevisiae whose expression can be repressed when the microorganism is grown in a non-fermentable carbon source as well as promoters whose expression is subject to glucose repression , so that the expression will be repressed when part of the lactose has been hydrolyzed and begins to increase the concentration of glucose in the medium, the promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH2 / GAP) of S. cerevisiae and the galactokinase promoter (GAL1). Preferably, the promoter that is repressible by glucose is the ADH2 gene promoter.

En una realización particular, cuando la célula a transformar con dicho vector o construcción de la invención es una bacteria, dicho promotor es el sistema promotor beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978), el promotor T7 RNA polimerasa (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990), el promotor lambda (Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990), el promotor trp (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983) y el promotor tac (Russell et al., Gene 20:231, 1982).In a particular embodiment, when the cell to be transformed with said vector or construct of the invention is a bacterium, said promoter is the beta-lactamase and lactose promoter system (Chang et al. , Nature 275: 615, 1978), the T7 promoter RNA polymerase (Studier et al. , Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990), the lambda promoter (Elvin et al. , Gene 87: 123-126, 1990), the trp promoter (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101: 155, 1983) and the tac promoter (Russell et al. , Gene 20: 231, 1982).

       \global\parskip1.000000\baselineskip\ global \ parskip1.000000 \ baselineskip

En una realización más particular de la invención, dicho promotor es un promotor inducible. En una realización más particular, dicho promotor es un promotor inducible por galactosa, lactosa o por IPTG. En una realización preferida, dicho promotor es el promotor de la beta-galactosidasa de forma que las enzimas se secretan al medio de cultivo cuando las células transformadas crecen en presencia de un inductor como galactosa o lactosa. En otra realización particular de la invención, dicho promotor es un promotor que se reprime en presencia de glucosa.In a more particular embodiment of the invention, said promoter is an inducible promoter. In a more particular embodiment, said promoter is an inducible promoter by galactose, lactose or by IPTG. In a preferred embodiment, said promoter is the promoter of the beta-galactosidase so that enzymes are they secrete into the culture medium when the transformed cells grow in the presence of an inducer such as galactose or lactose. In other particular embodiment of the invention, said promoter is a promoter that is repressed in the presence of glucose.

La invención también contempla el uso de aumentadores de la expresión. En una realización particular, dichos aumentadores de la expresión son aumentadores específicos de levaduras (los denominados UAS o "upstream activating sequences") con el fin de regular la expresión del polipéptido o proteína de fusión de la invención. Alternativamente, se pueden utilizar promotores sintéticos híbridos que resultan de la unión de un UAS con la región de activación de la transcripción de otro promotor. Ejemplos de promotores híbridos incluyen la región reguladora del gen ADH unido a la región de activación del promotor del gen GAP, así como promotores que comprenden las secuencias reguladoras de los promotores de los genes ADH2, GAL4, GAL10, y PHO5 combinadas con las regiones de activación de la transcripción de genes que codifican enzimas glicolíticos, tales como GAP o piruvato quinasa. Adicionalmente, cuando la célula a transformar es una célula de levadura, los promotores de levadura pueden contener promotores de otros orígenes que tienen la habilidad de unirse al RNA de levadura y de iniciar la transcripción.The invention also contemplates the use of expression enhancers. In a particular embodiment, said expression enhancers are specific enhancers of yeasts (the so-called UAS or "upstream activating sequences ") in order to regulate the expression of the polypeptide or fusion protein of the invention. Alternatively, they can be use synthetic hybrid promoters that result from the union of a UAS with the transcription activation region of another promoter. Examples of hybrid promoters include the region ADH gene regulator bound to promoter activation region of the GAP gene, as well as promoters comprising the sequences regulators of promoters of ADH2, GAL4, GAL10, and PHO5 genes combined with the transcription activation regions of genes encoding glycolytic enzymes, such as GAP or pyruvate kinase Additionally, when the cell to be transformed is a yeast cell, yeast promoters may contain promoters from other backgrounds who have the ability to join the Yeast RNA and start transcription.

En otra forma de realización, el vector de expresión de la invención incorpora un terminador transcripcional en dirección 3' de la secuencia que codifica para el polipéptido o la proteína de fusión de la invención. Terminadores transcripcionales preferidos que pueden ser incorporados incluyen los terminadores que se encuentran en el gen de la enolasa de S.cerevisiae, en el gen CYC1 de S.cerevisiae y en el gen gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenase.In another embodiment, the expression vector of the invention incorporates a transcriptional terminator in the 3 'direction of the sequence encoding the polypeptide or fusion protein of the invention. Preferred transcriptional terminators that can be incorporated include terminators found in the S.cerevisiae enolasa gene, in the S.cerevisiae CYC1 gene and in the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene.

En general, todos los vectores mencionados en Sikorski ("Extrachromsomoal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae", in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G. Hardy, IRL Press, 1993) y en Ausubel et al. ("Yeast Cloning Vectors and Genes" Current Protocols in Molecular Biology, Section II, Unit 13.4, 1994) son útiles en el contexto de la presente invención.In general, all vectors mentioned in Sikorski ("Extrachromsomoal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae ", in Plasmid, A Practical Approach, Ed. KG Hardy, IRL Press, 1993) and in Ausubel et al. ("Yeast Cloning Vectors and Genes" Current Protocols in Molecular Biology, Section II, Unit 13.4, 1994) are useful in the context of the present invention.

Los vectores que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, típicamente, un origen de replicación, un gen de resistencia a antibióticos, un origen de replicación en bacterias (necesario para la propagación en bacterias), sitios múltiples de clonaje, y un marcador genético. El marcador genético es, habitualmente, un gen que confiere resistencia a un antibiótico o, alternativamente, un marcador autotrófico. Así, genes marcadores útiles en el contexto de la presente invención incluyen por ejemplo el gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa (2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO), el gen de la dihidrofolato reducíase que confiere resistencia a metrotexato, el gen de la puromicina-N-acetil transferasa, que confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere resistencia a 9-beta-D- xilofuranosil adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células crecer en presencia de N-(fosfonacetil)-L-aspartato, timidina kinasa, que permite a las células crecer en presencia de aminopterina o el gen de Xantina-guanina fosforibosiltransferasa, que permite a las células crecer en presencia de xantina y ausencia de guanina. Otros marcadores autotróficos que se pueden usar según la presente invención, son los genes TRP1, URA3, LEU2, HIS3 o LYS2, que complementan defectos genéticos en las células que los portan, lo que permite a dichas células crecer en ausencia de triptófano, uracilo, leucina, histidina y lisina, respectivamente.Vectors that can be used in the context of the present invention typically include an origin of replication, an antibiotic resistance gene, an origin of replication in bacteria (necessary for propagation in bacteria), multiple cloning sites, and a genetic marker The genetic marker is usually a gene that confers resistance to an antibiotic or, alternatively, an autotrophic marker. Thus, marker genes useful in the context of the present invention include, for example, the neomycin resistance gene, which confers resistance to G418 aminoglycoside, the hygromycin phosphotransferase gene that confers hygromycin resistance, the ODC gene, which confers resistance to Ornithine decarboxylase (2- (difluoromethyl) -DL-ornithine (DFMO) inhibitor, the dihydrofolate gene reduced which confers resistance to metrotexate, the puromycin-N-acetyl transferase gene, which confers puromycin resistance, the gene that confers resistance to zeocin, the adenosine deaminase gene that confers resistance to 9-beta-D-xylofuranosyl adenine, the cytosine deaminase gene, which allows cells to grow in the presence of N - (phosphonacetyl) -L- aspartate, thymidine kinase, which allows cells to grow in the presence of aminopterin or the Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene, which allows cells to grow in the presence of xanthine and absence guanine Other autotrophic markers that can be used according to the present invention are the TRP1, URA3, LEU2, HIS3 or LYS2 genes, which complement genetic defects in the cells that carry them, which allows said cells to grow in the absence of tryptophan, uracil, leucine, histidine and lysine, respectively.

El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con un vector proporcionado por esta invención. Células huéspedes adecuadas incluyen: células procariotas o células eucariotas. Las células huésped preferidas son células de procariotas, en particular, de bacteria, o células eucariotas, en particular, de levadura.The vector of the invention can be used. to transform, transfect or infect susceptible cells transformed, transfected or infected by said vector. These Cells can be prokaryotic or eukaryotic. Therefore, in another aspect, the invention relates to a cell comprising a vector of the invention, for which said cell has been able to be transformed, transfected or infected with a vector provided by this invention. Suitable host cells include: cells prokaryotes or eukaryotic cells. Preferred host cells are prokaryotic cells, particularly bacteria, or cells Eukaryotes, in particular, yeast.

Así, ejemplos ilustrativos, no limitativos de bacterias según la presente invención, incluyen bacterias Gram negativas, por ejemplo, una cepa de Escherichia spp. (e.g., E. coli, etc.), una cepa de Salmonella spp. (e.g., S. tiphymurium, etc.), una cepa de Pseudomonas spp. (e.g., P. aeruginosa, P. putida, etc.), etc., que puede ser transformada con una construcción génica de la invención o con un vector de la invención, tal como un vector de expresión proporcionado por esta invención. En una realización preferida, dicha bacteria es Escherichia coli. Ejemplos ilustrativos de cepas de E. coli que pueden ser empleadas según la invención son las cepas BL21 (DE3), DH10B y DH5\alpha.Thus, illustrative, non-limiting examples of bacteria according to the present invention include Gram-negative bacteria, for example, a strain of Escherichia spp. (eg, E. coli , etc.), a strain of Salmonella spp. (eg, S. tiphymurium , etc.), a strain of Pseudomonas spp. (eg, P. aeruginosa, P. putida, etc.), etc., which can be transformed with a gene construct of the invention or with a vector of the invention, such as an expression vector provided by this invention. In a preferred embodiment, said bacterium is Escherichia coli . Illustrative examples of E. coli strains that can be used according to the invention are strains BL21 (DE3), DH10B and DH5α.

Por levadura se entiende cualquier organismo eucariota perteneciente al tipo de los ascomicetes que incluye los organismos conocidos de forma general como levaduras así como los conocidos de forma general como hongos filamentosos. Las levaduras y los hongos filamentosos incluyen Pichia sp (P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membranaefaciens, P. minuta, P. opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria, P. guercuum, P. pijperi, P. stiptis, P. methanolica), Saccharomyces (S. cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, and K. marxianus; K. yarrowia), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus (A.nidulans, A.niger, A.oryzae), Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera, Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp. (for example, Kluyveromyces lactis), Candida albicans, Aspergillus sp (for example, Aspergillus nidulans, Aspergillum niger, Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei, Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (por ejemplo, Fusarium gramineum, Fusarium venenatum), Physcomitrella patens. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica o un vector de expresión según la invención. En otra realización preferida de la invención, dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis.By yeast is meant any eukaryotic organism belonging to the type of ascomycetes that includes organisms generally known as yeasts as well as those generally known as filamentous fungi. Yeasts and filamentous fungi include Pichia sp ( P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membraneefaciens, P. minuta, P. opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria, P. guercuum, P. pijperi, P. stiptis, P. methanolica ), Saccharomyces ( S. cerevisiae ), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces ( K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K thernotolerans, and K. marxianus; K. yarrowia ), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus ( A.nidulans, A.niger, A.oryzae ), Hansenula polymorpha, Candida, Kloe, Kloe, Kloe Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp. ( for example, Kluyveromyces lactis ), Candida albicans, Aspergillus sp ( for example, Aspergillus nidulans, Aspergillum niger, Aspergillus oryzae ), Trichoderma reesei, Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (for example, Fusarium gramineum, Fusarium venenatum ), Physcomitrella patens . Therefore, in another aspect, the invention relates to a cell comprising a nucleotide sequence or a gene construct or an expression vector according to the invention. In another preferred embodiment of the invention, said yeast is selected from Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis .

El polipéptido o la proteína de fusión de la invención se puede obtener mediante diversos métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas de ADN recombinante. De hecho, la secuencia de nucleótidos o vector de la invención puede ser utilizado para producir el polipéptido o la proteína de fusión de la invención. Por tanto, a modo ilustrativo, no limitativo, un método para producir dicho polipéptido o dicha proteína de fusión de la invención comprende crecer una célula proporcionada por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido o proteína de fusión. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula dependerán de la célula utilizada. Si se desea, el polipéptido o la proteína de fusión de la invención puede ser aislado y, opcionalmente, purificada, por métodos convencionales.The polypeptide or fusion protein of the invention can be obtained by various methods known to the person skilled in the art, for example, by employing recombinant DNA techniques. In fact, the nucleotide sequence or vector of the invention can be used to produce the polypeptide or fusion protein of the invention. Therefore, to illustrative, non-limiting way, a method of producing said polypeptide or said fusion protein of the invention comprises grow a cell provided by this invention under conditions which allow the production of said polypeptide or protein of fusion. The conditions to optimize the culture of said cell will depend on the cell used. If desired, the polypeptide or fusion protein of the invention can be isolated and, optionally, purified, by conventional methods.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad esterasa que comprende cultivar una célula según la invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido. Así, el polipéptido de la invención, si se desea, es aislado y, opcionalmente, purificado.Therefore, in another aspect, the invention is relates to a procedure for obtaining a polypeptide with esterase activity that comprises culturing a cell according to the invention under conditions that allow the production of said polypeptide and, if desired, recover said polypeptide. Thus, the polypeptide of the invention, if desired, is isolated and, optionally purified.

Prácticamente cualquier método conocido en la técnica puede ser utilizado para la recuperación de la proteína de interés del interior celular o del medio de cultivo. Si la proteína se produce en el interior de la célula, es necesario lisar las células para liberar las proteínas de interés.Virtually any method known in the technique can be used for protein recovery interest of the cell interior or culture medium. Yes protein occurs inside the cell, it is necessary to lyse the cells to release the proteins of interest.

Así, en el caso de que dicha célula sea una bacteria, dichas células se pueden lisar por diferentes métodos que incluyen tratamiento con álcalis o calor, detergentes iónicos o no iónicos y disolventes orgánicos. La elección del método de extracción dependerá de la especie bacteriana de que se trate de forma que el tratamiento debe modificarse según la cepa hospedadora (especie bacteriana o estirpe, debido a la diferente composición de la pared celular de distintos microorganismos).Thus, in the case that said cell is a bacteria, these cells can be lysed by different methods that include treatment with alkalis or heat, ionic detergents or not ionic and organic solvents. The choice of the method of extraction will depend on the bacterial species in question so that the treatment should be modified according to the host strain (bacterial species or lineage, due to the different composition of the cell wall of different microorganisms).

Convencionalmente, cuando la célula es una célula de levadura, éstas se lisan mediante lisis hipotónica de esferoplastos formados previamente mediante tratamiento con glucanasas, mediante sonicación o mediante agitación en presencia de bolas de vidrio.Conventionally, when the cell is a yeast cell, these are lysed by hypotonic lysis of spheroplasts previously formed by treatment with glucanases, by sonication or by agitation in the presence of glass balls

Una vez que la proteína de interés se encuentra en el medio, bien mediante liberación del interior celular bien porque la proteína es secretada por la propia maquinaria de secreción de la célula, se emplean métodos convencionales para la purificación de dicha proteína, incluyendo, sin estar limitado, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrofóbica, de filtración en gel, HPLC), métodos electroforéticos (isoelectroenfoque preparativo, electroforesis preparativa en geles de poliacrilamida-SDS), solubilidad diferencial (precipitación con sulfato amónico), ultracentrifugación preparativa en gradiente de sacarosa. Una vez que se ha alcanzado el grado deseado de pureza, lo que puede requerir más de un paso cromatográfico, es frecuente que sea necesario concentrar la proteína o eliminar sales e iones que puedan ser peijudiciales para su posterior uso. En ese caso, se recurre a técnicas conocidas, tales como liofilización o ultrafiltración.Once the protein of interest is found in the middle, either by releasing the cell inside well because the protein is secreted by the machinery itself cell secretion, conventional methods are used for purification of said protein, including, but not limited to, chromatography (for example, ion exchange, affinity, hydrophobic interaction, gel filtration, HPLC), methods electrophoretic (preparatory isoelectric focusing, electrophoresis preparative in polyacrylamide-SDS gels), differential solubility (precipitation with ammonium sulfate), preparative ultracentrifugation in sucrose gradient. One time that the desired degree of purity has been reached, which may require more than one chromatographic step, it is often it is necessary to concentrate the protein or eliminate salts and ions that can Be detrimental for later use. In that case, resort to known techniques, such as lyophilization or ultrafiltration.

La determinación del grado de pureza de dicho polipéptido se puede estimar mediante el valor de la actividad enzimática específica que se calcula dividiendo el número de unidades de actividad enzimática entre la cantidad de mg de proteína en un volumen determinado. Preferiblemente, la actividad enzimática se determina mediante el método de medida de actividad lipolítica descrito según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117:233-241).The determination of the degree of purity of said polypeptide can be estimated by the value of the specific enzyme activity that is calculated by dividing the number of units of enzyme activity by the amount of mg of protein in a given volume. Preferably, the enzymatic activity is determined by the method of measuring lipolytic activity described according to Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117: 233-241).

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido o una proteína de fusión según la invención.In another aspect, the invention relates to a composition comprising a polypeptide or a fusion protein according to the invention.

Las esterasas son enzimas capaces de hidrolizar enlaces tipo éster de las grasas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido o una proteína de fusión según la invención en la elaboración de una composición detergente.Esterases are enzymes capable of hydrolyzing ester type bonds of fats. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of a polypeptide or a protein of fusion according to the invention in the preparation of a composition Detergent.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la invención con una grasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.In another aspect, the invention relates to a method for the modification of fats or oils comprising putting in contact with a polypeptide or a fusion protein according to the invention with a grease or oil in conditions where said polypeptide or fusion protein can hydrolyze said fat or oil.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que deben ser considerados como meramente ilustrativos y no limitativos de la misma.The invention is described below by the following examples that should be considered as merely illustrative and not limiting it.

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Example 1 Mesophilic strains of bacteria and yeasts modified to produce a thermophilic esterase of heterologous origin 1. Cloning of the nucleotide sequence of the gene encoding the heterologous enzyme and production of recombinant strains of Escherichia coli

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la enzima heteróloga con actividad esterasa (secuencia completa que codifica una proteína de 329 aminoácidos) de T. thermophilus HB27 (DE3) se amplificó por PCR a partir de DNA genómico de T. thermophilus con los siguientes primers que comprenden sitios BamHI (F) y HindIII (R):The nucleotide sequence of the gene encoding the heterologous enzyme with esterase activity (complete sequence encoding a 329 amino acid protein) of T. thermophilus HB27 (DE3) was amplified by PCR from T. thermophilus genomic DNA with the following primers comprising BamHI (F) and HindIII (R) sites:

       \newpage\ newpage

PUREST-F:PUREST-F: CGGGATCCGAatgaagcggcttatcgcgctCGGGATCCGAatgaagcggcttatcgcgct (SEQ ID NO: 2)(I KNOW THAT ID NO: 2) PUREST-R:PUREST-R: CCCAAGCTTaggccgcacccgggggggcgCCCAAGCTTaggccgcacccgggggggcg (SEQ ID NO: 3)(I KNOW THAT ID NO: 3)

El producto de amplificación se clonó en los correspondientes sitios de restricción del vector pET21d (NOVAGEN).The amplification product was cloned into the corresponding restriction sites of vector pET21d (NOVAGEN).

La bacteria Escherichia coli BL21 (DE3) (NOVAGEN) se transformó con la secuencia clonada en el plásmido pET21d de forma que la proteína se sintetiza fusionada a una cola C-terminal de 6 histidinas tras inducción con IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido). Escherichia coli BL21 (DE3) bacteria (NOVAGEN) was transformed with the sequence cloned into plasmid pET21d so that the protein is synthesized fused to a C-terminal tail of 6 histidines after induction with IPTG (Isopropyl? -D-thiogalactopyranoside ).

Las bacterias transformadas con el plásmido recombinante, se cultivaron en medio líquido LBA (1% Bacto-Triptona, 0,5% Bacto-Yeast-Extract, 0,5% Cloruro Sódico, 0,1% Glucosa, Ampicilina 40 mg/mL) a 37°C en agitación orbital y al alcanzar una DO a 600 nm de 0,6 se llevó a cabo la inducción con IPTG.Bacteria transformed with the plasmid recombinant, were grown in LBA liquid medium (1% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast-Extract, 0.5% Chloride Sodium, 0.1% Glucose, Ampicillin 40 mg / mL) at 37 ° C while stirring orbital and when reaching an OD at 600 nm of 0.6 the induction with IPTG.

La medida de actividad lipolítica y definición de unidad enzimática de la enzima recombinante se realizó según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117:233-241)The measurement of lipolytic activity and definition of the enzyme unit of the recombinant enzyme was performed according to Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117: 233-241)

2. Cloning of the nucleotide sequence of the gene encoding the heterologous enzyme and production of recombinant strains of Kluyveromyces lactis

Por otro lado, se transformaron cepas de la levadura Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 con variantes de la secuencia integradas en multicopia en el genoma fusionadas a una señal de secreción y expresándose bajo el promotor de la beta-galactosidasa. De esta forma, las enzimas se secretan al medio de cultivo cuando las levaduras crecen en presencia de un inductor como galactosa o lactosa.On the other hand, strains of the yeast Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 were transformed with multicopy sequence variants integrated into the genome fused to a secretion signal and expressed under the beta-galactosidase promoter. In this way, enzymes are secreted into the culture medium when yeasts grow in the presence of an inducer such as galactose or lactose.

Las variantes de la secuencia utilizadas consisten en eliminar 16 ó 26 aminoácidos del extremo N-terminal, es decir, las putativas señales de secreción (aminoácidos 1-16) y hélice transmembrana (aminoácidos 6-26) de la proteína nativa y se corresponden con las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.The sequence variants used consist of eliminating 16 or 26 amino acids from the end N-terminal, that is, the putative signals of secretion (amino acids 1-16) and transmembrane helix (amino acids 6-26) of the native protein and it correspond to the sequences identified as SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively.

Las secuencias se amplificaron por PCR a partir de DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los siguientes primers para clonarlas entre los sitios XhoI y KpnI del plásmido pKLAC1 (New England Biolabs) en pauta de lectura con la señal de secreción (K. lactis alfa-mating factor domain).The sequences were amplified by PCR from genomic DNA of T. thermophilus HB27 with the following primers to clone them between the XhoI and KpnI sites of plasmid pKLAC1 (New England Biolabs) in reading pattern with the secretion signal ( K. lactis alfa -mating factor domain).

Empezando en el aminoácido 27Starting at amino acid 27

EST1KF (XhoI)EST1KF (XhoI) TTTCTCGAGAAAAGAgaggtgcccggtggggtctgcTTTCTCGAGAAAAGAgaggtgcccggtggggtctgc (SEQ ID NO: 6)(SEQ ID NO 6) EST1KR (KpnI)EST1KR (KpnI) TTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgtTTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgt (SEQ ID NO: 7)(SEQ ID NO: 7)

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

Empezando en el aminoácido 17Starting at amino acid 17

EST1KF2 (XhoI)EST1KF2 (XhoI) TTTCTCGAGAAAAGAcagggcctcgaggccttctggTTTCTCGAGAAAAGAcagggcctcgaggccttctgg (SEQ ID NO: 8)(SEQ ID NO: 8) EST1KR (KpnI)EST1KR (KpnI) TTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgtTTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgt (SEQ ID NO: 7)(SEQ ID NO: 7)

Con los plásmidos linearizados por digestión enzimática con SacII se transformó la levadura K. lactis NRRL-Y1140 y se seleccionaron los transformantes por crecimiento en medio sólido con 5 mM de acetamida como fuente de nitrógeno, y se comprobó que la construcción se había integrado en multicopia en el genoma. Las levaduras se transformaron según el método del acetato de litio descrito en Ito et al. (1983) (J. Bacteriol, 153: 163-168.).With the linearized plasmids by enzymatic digestion with SacII, the yeast K. lactis NRRL-Y1140 was transformed and the transformants were selected by growth in solid medium with 5 mM acetamide as a source of nitrogen, and it was found that the construction had been integrated into multicopy in the genome Yeasts were transformed according to the lithium acetate method described in Ito et al. (1983) (J. Bacteriol, 153: 163-168.).

Las cepas transformadas se cultivaron en matraces de 1L con 200 mL de medio YPgal (Extracto de levadura: 10 g/L, Bacto-peptona: 20 g/L, Lactosa: 20 g/L) a 30°C en agitación orbital (100 rpm), obteniendo una actividad esterasa aproximada en el medio de cultivo a las 49 horas de 500 U/L en el caso de la variante más larga y de 200 U/L en el caso de la variante más corta, como puede verse en las gráficas de la Figura 1. La actividad especifica (U/mg prot) en los postincubados libres de células fue de 0,09 y 0,04 U/mg proteína, respectivamente. El método de medida de actividad lipolítica empleado es el descrito según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117:233-241).The transformed strains were grown in 1L flasks with 200 mL of YPgal medium (Yeast extract: 10 g / L, Bacto-peptone: 20 g / L, Lactose: 20 g / L) at 30 ° C in orbital shaking (100 rpm), obtaining an approximate esterase activity in the culture medium at 49 hours of 500 U / L in the case of the longer variant and 200 U / L in the case of the shorter variant, as can be seen in the Graphs of Figure 1. The specific activity (U / mg prot) in the cell-free post-incubated was 0.09 and 0.04 U / mg protein, respectively. The method of measuring lipolytic activity used is that described by Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol. 117: 233-241).

3. Cloning of the nucleotide sequence of the gene encoding the heterologous enzyme and production of recombinant strains of Saccharomyces cerevisiae

Se transformó la levadura Saccharomyces cerevisiae BJ3505 (Eastman Kodak Company) con la variante de la secuencia de nucleótidos de la proteína heteróloga sin la región correspondiente a los 16 aminoácidos N-terminales clonada en yEpFlagl (Eastman Kodak Company) en pauta de lectura con la secuencia de la señal de secreción (del alfa-mating factor de S. cerevisiae) y del péptido Flag.The yeast Saccharomyces cerevisiae BJ3505 (Eastman Kodak Company) was transformed with the variant of the nucleotide sequence of the heterologous protein without the region corresponding to the 16 N-terminal amino acids cloned in yEpFlagl (Eastman Kodak Company) in sequence of reading with the sequence of the secretion signal (of the alpha-mating factor of S. cerevisiae ) and of the Flag peptide.

El plásmido lleva un promotor que se reprime por glucosa. Las enzimas se secretan al medio de cultivo, cuando se ha agotado la glucosa, fusionadas al péptido Flag por el extremo N-terminal.The plasmid carries a promoter that is repressed by glucose. Enzymes are secreted into the culture medium, when it has been glucose depleted, fused to the Flag peptide at the end N-terminal

La secuencia se amplificó por PCR a partir de DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los siguientes primers que tienen colas homologas al vector MCS (del inglés, múltiple cloning site).The sequence was amplified by PCR from genomic DNA of T. thermophilus HB27 with the following primers having tails homologous to the MCS vector (multiple cloning site).

PFLAG-ESTPFLAG-EST

F:F: AAAAGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGcagggcctcgaggccttctggAAAAGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGcagggcctcgaggccttctgg (SEQ ID NO: 9)(I KNOW THAT ID NO: 9) R:R: TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTAaggccgcacccgggggggcgtTGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTAaggccgcacccgggggggcgt (SEQ ID NO: 10)(I KNOW THAT ID NO: 10)

Con el producto de PCR y el vector linearizado por digestión en el sitio de clonación múltiple con EcoRI y SalI, se transformó la levadura S. cerevisiae BJ3505 seleccionando los transformantes (que contienen el plásmido recombinante que se ha 1 recircularizado por recombinación) por crecimiento en medio CM-trp. El medio CM sin el correspondiente aminoácido (triptófano) empleado como marcador auxotrófico se preparó según (Zitomer y Hall, 1976, J. Biol. Chem., 251: 6320-6326). Las levaduras se transformaron según el método del acetato de litio de Ito et al. (1983) (J. Bacteriol., 153: 163-168).With the PCR product and the vector linearized by digestion at the multiple cloning site with EcoRI and SalI, S. cerevisiae BJ3505 yeast was transformed by selecting the transformants (containing the recombinant plasmid that has been recirculated by recombination) by growth in medium CM-trp. The CM medium without the corresponding amino acid (tryptophan) used as an auxotrophic marker was prepared according to (Zitomer and Hall, 1976, J. Biol. Chem., 251: 6320-6326). Yeasts were transformed according to the lithium acetate method of Ito et al. (1983) (J. Bacteriol., 153: 163-168).

Las cepas transformadas se cultivaron en un medio que contiene 1% glucosa, 3% glicerol, 1% extracto de levadura y 8% de peptona. Se realiza un cultivo de 100 ml en un matraz de 500 ml, se pone en marcha el cultivo con un inoculo inicial a 0,1 de DO_{600} y se incuba a 30° con agitación orbital continua (250 rpm), obteniendo una actividad lipasa aproximada a las 72 horas en el medio de cultivo de 1000 UE/L como puede verse en la gráfica a modo de ejemplo. La actividad específica en ese momento fue de de 3,79 U mg^{-1}. El método de medida de actividad lipolítica y definición de unidad enzimática según Fuciños et al (2005) J. Biotechnol. 117:233-241.The transformed strains were grown in a medium containing 1% glucose, 3% glycerol, 1% yeast extract and 8% peptone. A 100 ml culture is performed in a 500 ml flask, the culture is started with an initial inoculum at 0.1 OD 600 and incubated at 30 ° with continuous orbital agitation (250 rpm), obtaining a lipase activity approximately 72 hours in the culture medium of 1000 EU / L as can be seen in the graph as an example. The specific activity at that time was 3.79 U mg -1. The method of measurement of lipolytic activity and definition of enzymatic unit according to Fuciños et al (2005) J. Biotechnol. 117: 233-241.

4. Purification of the heterologous protein

Se purificó la proteína producida extracelularmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae BJ3505 transformada con la variante de la secuencia sin la región correspondiente a los 16 aminoácidos N-terminales clonada en yEpFlagl en pauta de lectura con la secuencia de la señal de secreción (del alfa-mating factor de S. cerevisiae) y del péptido Flag.Protein produced extracellularly was purified by Saccharomyces cerevisiae BJ3505 yeast transformed with the sequence variant without the region corresponding to the 16 N-terminal amino acids cloned in yEpFlagl in reading pattern with the secretion signal sequence (from alpha-mating S. cerevisiae factor) and the Flag peptide.

El medio postincubado libre de células (72 horas de cultivo) se concentró por ultrafiltración tangencial (corte 10.000 Da) y a partir del concentrado se purificó la esterasa por cromatografía de afinidad con AntiFlag M2 agarosa (Sigma) siguiendo las instrucciones del proveedor. La actividad específica (media de tres experimentos) aumentó desde 7,30 U/mg en el postincubado concentrado hasta 220,6 U/mg en el eluído de la cromatografía de afinidad (Factor Purificación= 30,2).Post-incubated cell-free medium (72 hours culture) was concentrated by tangential ultrafiltration (cut 10,000 Da) and from the concentrate the esterase was purified by Affinity chromatography with AntiFlag M2 agarose (Sigma) following The supplier's instructions. The specific activity (average of three experiments) increased from 7.30 U / mg in the post-incubated concentrated to 220.6 U / mg in the eluate of the chromatography of affinity (Purification Factor = 30.2).

En la Figura 2 se muestra una electroforesis en gel SDS-PAGE del medio de cultivo postincubado (carril 2), concentrado por ultrafiltración (carril 3) y el eluído de la cromatografía de afinidad (carril 4). El carril 1 es el marcador de Pm (Da). Tras la cromatografía de afinidad se obtienen tres bandas mayoritarias que corresponden a la esterasa (las tres se revelan en el western blot con anticuerpos antiFlag) pero en diferentes formas de glicosilación pues el tratamiento con la glicosidasa EndoH resulta en una única banda (carril 5).Figure 2 shows an electrophoresis in SDS-PAGE gel of post-incubated culture medium (lane 2), concentrated by ultrafiltration (lane 3) and eluted of affinity chromatography (lane 4). Lane 1 is the Pm marker (Da). After affinity chromatography are obtained three major bands corresponding to the esterase (all three are reveal in the western blot with antiFlag antibodies) but in different forms of glycosylation as treatment with EndoH glycosidase results in a single band (lane 5).

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<110> UNIVERSIDAD DA CORUÑA<110> UNIVERSITY DA CORUÑA

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<110> UNIVERSIDAD DE VIGO<110> UNIVERSITY OF VIGO

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<120> ESTERASA TERMÓFILA DE Thermus thermophilus <120> Thermus thermophilic esters of Thermus thermophilus

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<130> P3837ES<130> P3837ES

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<160> 10<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.3<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1<210> 1

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<211> 329<211> 329

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Thermus thermophilus <213> Thermus thermophilus

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<400> 1<400> 1

1one

22

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 2<210> 2

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 30<211> 30

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido cebador PUREST-F para amplificar por PCR la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus <223> PUREST-F primer oligonucleotide to amplify by PCR the nucleotide sequence of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 2<400> 2

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \hskip1cm\ hskip1cm

3

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 3<210> 3

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 29<211> 29

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido cebador PUREST-R para amplificar por PCR la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus <223> PUREST-R primer oligonucleotide for PCR amplification of the nucleotide sequence of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 3<400> 3

         \hskip1cm\ hskip1cm

4

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 4<210> 4

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 16<211> 16

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Thermus thermophilus <213> Thermus thermophilus

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 4<400> 4

55

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 5<210> 5

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 21<211> 21

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Thermus thermophilus <213> Thermus thermophilus

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 5<400> 5

66

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 6<210> 6

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 36<211> 36

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido EST1KF para amplificación por PCR de la variante 1 de la esterasa de T. thermophilus <223> EST1KF oligonucleotide for PCR amplification of variant 1 of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 6<400> 6

         \hskip1cm\ hskip1cm

7

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 7<210> 7

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 33<211> 33

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido EST1KR para amplificar por PCR la secuencia de la variante 1 y 2 de T. thermophilus <223> EST1KR oligonucleotide to amplify by PCR the sequence of variant 1 and 2 of T. thermophilus

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 7<400> 7

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \hskip1cm\ hskip1cm

8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 8<210> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 36<211> 36

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido EST1KF2 para amplificar por PCR la secuencia de la variante 2 de la esterasa de T. thermophilus <223> EST1KF2 oligonucleotide to amplify by PCR the sequence of variant 2 of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 8<400> 8

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \hskip1cm\ hskip1cm

9

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 9<210> 9

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 51<211> 51

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido PFLAG-EST-F para amplificar por PCR la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus <223> PFLAG-EST-F oligonucleotide to amplify by PCR the nucleotide sequence of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 9<400> 9

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \hskip1cm\ hskip1cm

10

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 10<210> 10

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 51<211> 51

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> Artificial<213> Artificial

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Oligonucleótido PFLAG-EST-R para amplificar por PCR la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus <223> PFLAG-EST-R oligonucleotide to amplify by PCR the nucleotide sequence of T. thermophilus esterase

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 10<400> 10

         \hskip1cm\ hskip1cm

eleven

Claims

1. An isolated polypeptide with esterase activity comprising the amino acid sequence identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof.

2. Polypeptide according to claim 1, wherein said esterase is a thermophilic esterase.

3. Polypeptide according to claim 2, wherein said thermophilic esterase is stable at a temperature comprised between 60 and 90 ° C.

4. A fusion protein comprising

i)i): un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; ya polypeptide according to any one of claims 1 to 3; Y

ii)ii): un péptido heterólogo.a heterologous peptide

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

5. Fusion protein according to claim 4, wherein said heterologous peptide is a secretion signal peptide extracellular

6. Polypeptide or fusion protein according to any one of claims 1 to 5, wherein said protein from Fusion further comprises a purification peptide.

7. Polypeptide or fusion protein according to claim 6, wherein said purification peptide is selected between a Flag peptide or a polyhistidine tail.

8. A nucleotide sequence that encodes a polypeptide according to any one of claims 1 to 3 or a fusion protein according to any of claims 4 to 7.

9. A gene construct comprising a nucleotide sequence according to claim 8.

10. An expression vector comprising a nucleotide sequence according to claim 8 or a gene construct according to claim 9.

11. Expression vector according to claim 10, which further comprises the nucleotide sequence of a promoter.

12. Expression vector according to claim 11, wherein said promoter is an inducible or repressible promoter.

13. Expression vector according to claim 12, wherein said promoter is a galactose inducible promoter or lactose.

14. Expression vector according to claim 12, wherein said promoter is an IPTG inducible promoter.

15. Expression vector according to claim 12, where said promoter is a promoter that is repressed in the presence of glucose

16. A cell comprising a sequence of nucleotides according to claim 8 or a gene construct according to claim 9 or an expression vector according to any of claims 10 to 15.

17. Cell according to claim 16, wherein said cell is selected from a bacterium and a yeast.

18. Cell according to claim 17, wherein said bacterium is Escherichia coli.

19. Cell according to claim 17, wherein said yeast is selected from Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis.

20. A composition comprising a polypeptide according to any one of claims 1 to 3 or a protein of fusion according to any of claims 4 to 7.

21. A procedure for obtaining a polypeptide with esterase activity or a functionally variant equivalent thereof that comprises culturing a cell according to any of claims 16 to 19 under conditions that allow the production of said polypeptide and, if desired, recover said polypeptide.

22. Method according to claim 21, where when said polypeptide with esterase activity comprises the amino acid sequence of an extracellular secretion peptide, the recovery of said polypeptide is carried out from the medium of culture.

23. Use of a polypeptide according to any one of claims 1 to 3 or a fusion protein according to a any of claims 4 to 7 in the preparation of a detergent composition

24. Method for fat modification or oils comprising contacting a polypeptide according to a any one of claims 1 to 3 or a fusion protein according to any one of claims 4 to 7 with a grease or oil in conditions where said polypeptide or fusion protein it can hydrolyze said fat or oil.