ES2346850T3 - Vectores de expresion de adn. - Google Patents

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ES2346850T3 ES01980716T ES01980716T ES2346850T3 ES 2346850 T3 ES2346850 T3 ES 2346850T3 ES 01980716 T ES01980716 T ES 01980716T ES 01980716 T ES01980716 T ES 01980716T ES 2346850 T3 ES2346850 T3 ES 2346850T3
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Jonathan Henry c/o GlaxoSmithKline ELLIS
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John Richard c/o GlaxoSmithKline RHODES
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Abstract

Uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor, un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato de citomegalovirus humanos (IE1 de HCMV) que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable con el promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido.

Description

Vectores de expresión de ADN.
Campo de la invención
La invención se refiere al uso de vectores de ADN que contienen una secuencia reguladora de la transcripción derivada del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano en la preparación de composiciones de vacuna para aumentar una respuesta inmune. En particular, la invención proporciona vectores que contienen una región promotora mínima y un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano que incluye el exón 1 pero no el intrón A.
Antecedentes de la invención
Se sabe usar el promotor y las regiones potenciadoras en la dirección 5' del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (abreviado en el presente documento como cono IE1 de HCMV) para impulsar la expresión de las proteínas recombinantes. Por ejemplo, la patente europea con número EP 0 323 997 B describe vectores de expresión que incorporan el promotor, el potenciador en la dirección 5' y la región 5' no traducida funcionalmente completa del gen IE1 de HCMV, que incluye el primer intrón. En dichas construcciones, la 5' UTR de IE1 de HCMV está unida directamente a la región de codificación de un gen heterólogo, que sustituye a la 5' UTR natural del gen heterólogo. La inclusión de la 5' UTR de longitud completa potencia significativamente los niveles de expresión más allá de los observados con el promotor mínimo de IE1 de HCMV solo.
Se acepta por lo general que la expresión potenciada observada en presencia de la 5' UTR de IE1 de HCMV completo se puede es atribuir a la inclusión del primer intrón (denominado como intrón A o intrón 1). Los presentes inventores han observado ahora sorprendentemente que el uso de un fragmento de la 5' UTR que incluye el exón 1 pero que carece del primer intrón, da como resultado una expresión potenciada sobre y por encima de los niveles de expresión alcanzados con el promotor mínimo de IE1 de HCMV solo. Además, la sustitución del intrón A natural de IE1 de HCMV con un intrón heterólogo da como resultado una expresión potenciada. El potenciamiento de la expresión mediante el uso del exón 1 en ausencia del intrón A fue completamente inesperado en base al conocimiento previo del comportamiento del promotor mínimo de HCMV y la 5' UTR.
La 5' UTR natural del gen IE1 de HCMV es relativamente grande (1021 bases). El uso del exón 1 en ausencia del intrón A tiene el potencial de permitir minimizar el tamaño del promotor/5' UTR, a la vez que se mantiene una expresión eficaz de las proteínas recombinantes. Esto tendrá utilidad en el campo de las vacunas de ADN, en el que es ventajoso minimizar la longitud de las secuencias no codificantes incluidas en una construcción de una vacuna de ADN, y también en vectores plásmidos que contienen múltiples casetes de expresión en los que minimizará la posibilidad de recombinación a través de las secuencias homólogas en el interior del plásmido.
Descripción de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor, un fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV que incluye la totalidad del exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable al promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido.
La invención se basa en la observación de que un fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV que incluye el exón 1 pero no el intrón A es capaz de potenciar el nivel de expresión de un promotor básico, tal como el promotor mínimo de IE1 de HCMV.
Un promotor puede definirse por lo general como una región de ADN que es capaz de dirigir el inicio de la transcripción mediante la ARN polimerasa. El promotor usado en la presente invención puede ser esencialmente cualquier promotor dependiente de la ARN polimerasa II.
En una realización preferida, el promotor puede ser el promotor mínimo de IE1 de HCMV. Se puede definir un promotor mínimo de IE1 de HCMV como un fragmento de la región del promotor de IE1 de HCMV que es capaz de funcionar como un promotor, impulsando la transcripción desde el lugar de inicio de la transcripción natural. Por ejemplo, un fragmento del gen IE1 de HCMV que comprende los nucleótidos -116 a +1, siendo el nucleótido +1 el lugar de inicio de la transcripción de IE1 de HCMV, que presenta actividad de promotor.
El fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV se situará como lo más preferible inmediatamente en 3' a (es decir, en la dirección 3' de) el promotor, de tal manera que la secuencia 5' no traducida de HCMV estará incluida en las transcripciones que se inician en el lugar de inicio de la transcripción asociado con el promotor. En la Figura 5 adjunta se ilustra la secuencia de nucleótidos del exón 1 de IE1 de HCMV procedente de la cepa Towne de HCMV. Sin embargo, no se pretende que el término "un exón 1 de IE1 de HCMV" esté limitado a esta secuencia precisa Este término abarca también las variantes menores, que incluyen las secuencias del exón 1 procedentes de otras cepas de HCMV, tales como AD169. El exón 1 procedente de AD169 está entre 514-634 de la secuencia dada a conocer por A Krigg, A. y col Virus research 2, 107-121 (1985)y también las secuencias variantes que presentan sustituciones, inserciones, adiciones y delecciones de bases. El lector experto apreciará que puede llevarse a cabo la variación menor en la secuencia del exón 1 sin afectar sustancialmente su capacidad para potenciar la expresión procedente de un promotor asociado.
En una realización, el vector puede comprender adicionalmente un intrón heterólogo, es decir, un intrón diferente del intrón A del gen IE1 de HCMV, situado inmediatamente en la dirección 3' del exón 1 de IE1 de HCMV. El intrón heterólogo puede sustituir el intrón A natural en la 5' UTR de IE1 de HCMV, en cuyo caso, la parte no traducida del exón 2 de IE1 de HCMV puede estar incluida inmediatamente en la dirección 3' del intrón heterólogo. El intrón heterólogo puede producirse de manera sintética o natural diferente de la del intrón A. El intrón heterólogo se transcribirá junto con el fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV, que forma parte de la 5' UTR de la transcripción resultante. Se puede localizar el intrón A de AD169 en la posición 635-1461 de la secuencia dada a conocer por A Krigg. A. y col. más arriba.
Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, la inclusión de un intrón heterólogo puede aumentar los niveles de expresión por encima de los alcanzados usando solo un promotor y el exón 1. Ventajosamente, el intrón heterólogo será corto (preferiblemente menos de 100 bases) con el fin de reducir la cantidad de secuencia no codificante presente en el vector. Un ejemplo adecuado es el primer intrón del gen CD68 humano que tiene 87 bases de longitud, pero se pueden usar otros intrones heterólogos con efecto equivalente.
El vector puede incluir además lugares de restricción para permitir la inserción de una secuencia heteróloga de codificación. Los lugares de restricción se situarán preferiblemente en la dirección 3' del fragmento 5' no traducido de IE1 de HCMV, incluyendo cualquier intrón heterólogo que se pueda incluir en el vector.
El vector puede incluir uno o más elementos reguladores de la transcripción, adicionales, además del promotor, tales como los elementos potenciadores. Por ejemplo, los vectores que contienen el promotor mínimo de IE1 de HCMV pueden incluir adicionalmente el elemento potenciador de IE1 de HCMV. Lo más preferible, el elemento potenciador se situará inmediatamente en la dirección 5' del promotor mínimo de IE1 de HCMV.
En una realización preferida, el vector puede ser un plásmido. Un vector plásmido puede contener adicionalmente un origen de la replicación para permitir la replicación autónoma en el interior de una célula huésped procariota y un marcador selectivo, tal como un gen de resistencia a antibiótico. El vector puede contener también un finalizador pol II para finalizar la transcripción y una señal de poliadenilación para la estabilización y el procesamiento del extremo 3' de un ARNm transcrito procedente del promotor. Ventajosamente, pueden estar incluidos uno o más lugares de transcripción entre la secuencia de la 5' UTR de IE1 de HCMV y la señal de poliadenilación para facilitar la inserción de una secuencia heteróloga de codificación. Se pueden construir fácilmente vectores plásmidos según la invención a partir de los elementos componentes de la secuencia usando técnicas recombinantes normalizadas bien conocidas y descritas en la técnica, por ejemplo, en F. M. Ausebel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
En una realización particularmente preferida, el vector puede ser un vector de expresión para uso en la expresión de un polipéptido recombinante en una célula u organismo huésped eucariota. En esta realización, el vector puede comprender además una secuencia de ADN que codifica un polipéptido recombinante unido de manera operable al promotor mínimo de IE1 de HCMV y a la secuencia de la 5' UTR. El término "unido de manera operable" se refiere a una disposición en la que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido se sitúa en la dirección 3' del promotor y de la 5' UTR de tal manera que el inicio de la transcripción en el lugar de inicio de la transcripción asociado con el promotor da como resultado la transcripción de un ARNm que incorpora el fragmento de la 5' UTR de IE1 de HCMV (que incluye cualquier intrón heterólogo) y la secuencia que codifica el polipéptido recombinante.
El vector de expresión puede contener un finalizador pol II para finalizar la transcripción y una señal de poliadenilación para la estabilización y el procesamiento del extremo 3' de un ARNm transcrito procedente del promotor. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen las señales de poliadenilación de mamíferos tales como, por ejemplo, la señal de poliadenilación de la beta globina de conejo o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino y también señales de poliadenilación de origen vírico, tales como la de la región poli(A) tardía de SV40. El vector puede contener además un marcador selectivo que permite la selección en células huéspedes eucariotas El vector de expresión puede contener también uno o más casetes de expresión adicionales para permitir la expresión de múltiples polipéptidos recombinantes procedentes de un vector único. Lo más preferible, el vector de expresión será un vector de expresión plásmido.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido recombinante puede ser esencialmente cualquier secuencia de ADN que codifica la proteína unida mediante los codones de inicio y detención. Esta secuencia de ADN que codifica la proteína puede incluir intrones. En una realización particularmente preferida el polipéptido recombinante puede ser un polipéptido antigénico o proteína terapéutica.
En una realización preferida, el antígeno es capaz de estimular una respuesta inmune contra un patógeno humano, dicho antígeno o composición antigénica se deriva de VIH-1 (tal como tat, nef, gp120 o gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), los virus del herpes humano tales como gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE o gD o sus derivados o de la proteína temprana inmediata tal como ICP27, ICP47, IC P 4, ICP36 de VHS1 o VHS2, citomegalovirus, especialmente humano, (tal como gB o sus derivados), el virus de Epstein Barr (tal como gp350 o sus derivados), el virus Zoster de la varicela (tal como gpI, II, III e IE63), o de un virus de la hepatitis tales como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, el antígeno Superficial de la Hepatitis B o el antígeno núcleo de la Hepatitis o pol), el antígeno del virus de la hepatitis C y el antígeno del virus de la hepatitis E, o de otros patógenos víricos, tales como paramixovirus: el virus sincitial respiratorio (tal como las proteínas F y G o sus derivados), o los antígenos del virus paragripal, los virus del sarampión, el virus de las paperas, los virus del papiloma humano (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18, por ejemplo, L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, flavivirus (por ejemplo, el Virus de la fiebre amarilla, el Virus del dengue, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus de la Encefalitis japonesa) o las células del virus de la gripe, tales como las proteínas HA, NP, NA, o M, o sus combinaciones), o los antígenos derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, que incluye N. gonorrhea y N. meningitidis, por ejemplo, las proteínas de unión a la transferrina, las proteínas de unión a la lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo, proteínas M o sus fragmentos, proteasa C5A, S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, que incluye M. catarrhalis, conocida también como Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, que incluye B. pertussis (por ejemplo, perctatina, toxina pertussis o sus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica, Mycobacterium spp, que incluye M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, B o C, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP75, HSP90, PPD de 19 kDa [Rv3763], PPD de 38 kDa [Rv0934]), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, que incluye L. pneumophila; Escherichia spp, que incluye E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de colonización, toxina lábil al calor o sus derivados, toxina estable al calor o sus derivados), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica (por ejemplo, toxina tipo toxina shiga o sus derivados); Vibrio spp, que incluye V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o sus derivados); Shigella spp, que incluye S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, que incluye Y. enterocolitica (por ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, que incluye C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, que incluye S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., que incluye L. monocytogenes; Helicobacter spp, que incluye H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, que incluye P. aeruginosa; Staphylococcus spp., que incluye S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., que incluye E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., que incluye C. tetani (por ejemplo toxina del tétanos y sus derivados), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y sus derivados), C. difficile (por ejemplo toxinas A o B de clostridium y sus derivados); Bacillus spp., que incluye B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y sus derivados); Corynebacterium spp., que incluye C. diphtheriae (por ejemplo toxina de la difteria y sus derivados); Borrelia spp., que incluye B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., que incluye E. equi y el agente de la Anaplasmosis granulocítica humana; Rickettsia spp, que incluye R. rickettsii; Chlamydia spp., que incluye C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a la heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a la heparina), C. psittaci; Leptospira spp., que incluye L. interrogans; Treponema spp., que incluye T. pallidum (por ejemplo las proteínas raras de la membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; o las derivadas de parásitos tales como Plasmodium spp., que incluye P. falciparum; Toxoplasma spp., que incluye T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., que incluye E. histolytica; Babesia spp., que incluye B. microti; Trypanosoma spp., que incluye T. cruzi; Giardia spp., que incluye G. lamblia; Leshmania spp., que incluye L. major; Pneumocystis spp., que incluye P. carinii; Trichomonas spp., que incluye T. vaginalis; Schisostoma spp., que incluye S. mansoni, o las derivadas de levaduras tales como Candida spp., que incluye C. albicans; Cryptococcus spp., que incluye C. neoformans.
Otros antígenos específicos preferidos de M. tuberculosis son por ejemplo Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rev1009, aceA (Rv0467), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c 16kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (WO 99/51748). Las proteínas de M. tuberculosis incluyen también proteínas de condensación y sus variantes, en las que al menos dos, preferiblemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se condensan en una proteína más grande. Las condensaciones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSLmTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).
Los antígenos más preferidos de Chlamydia incluyen, por ejemplo, la Proteína de elevado peso molecular (HWMP) documento (WO 99/17741), ORF3 (documento EP 366 412), y las presuntas proteínas de membranas (Pmps). Se pueden seleccionar otros antígenos de Chlamydia de la formulación de vacuna a partir del grupo descrito en el documento WO 99/28475.
Las vacunas bacterianas preferidas comprenden los antígenos derivados de Streptococcus spp, que incluyen S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a la colina) y el antígeno de la proteína Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y col., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), y sus derivados mutantes detoxificados (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas preferidas comprenden los antígenos derivados de Haemophilus spp., que incluyen H. influenzae de tipo B (por ejemplo PRP y sus conjugados), H. influenzae no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de elevado peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y los péptidos derivados de fimbrina (documento US 5.843.464) o las múltiples variantes de copia o sus proteínas de fusión.
Los antígenos que se pueden usar en la presente invención pueden comprender además los antígenos derivados de los parásitos que producen la malaria. Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodia falciparum incluyen RTS, S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción C terminal de la proteína del circunsporozoíto (CS) de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno superficial de la hepatitis B al antígeno superficial (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se da a conocer en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/EP92/02591, publicada con el Número WO 93/10152 que reivindica la prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido Nº 9124390.7. Otros antígenos de plasmodia que son candidatos potenciales como componentes de una vacuna de malaria multietapa son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum y sus análogos en Plasmodium spp.
La invención contempla el uso de un antígeno antitumoral y será útil para el tratamiento inmunoterapéutico de cánceres Por ejemplo, antígenos de rechazo tumoral tales como los de próstata, mama, colorrectal, pulmón, pancreático, renal o cánceres de melanoma. Los antígenos a modo de ejemplo incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antígenos MAGE tales como los dados a conocer en el documento WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage (conocido también como NY Eos 1) SAGE y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde y col., International Journal of Clinical & Laboratory Research (enviado en 1997); Correale y col. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293. De hecho, estos antígenos se expresan en una amplia gama de tipos de tumores tales como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga.
Se pueden expresar los antígenos MAGE para uso en la presente invención con un potenciador de la expresión o un compañero de condensación inmunológica. En particular, se puede condensar la proteína Mage con la Proteína D de Haemophilus influenzae B. En particular, el compañero de condensación puede comprender el primer 1/3 de la Proteína D. Se dan a conocer dichas construcciones en el documento WO 99/40188. Otros ejemplos de proteínas de condensación que pueden contener epitopos específicos del cáncer incluyen las proteínas de condensación bcr/abl.
En una realización preferida, se utilizan antígenos de próstata, tales como el antígeno específico de próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA o antígeno conocido como Prostasa.
La prostasa es una serina proteasa específica de la próstata (tipo tripsina), de 254 aminoácidos de longitud, con una tríada conservada de la serina proteasa catalítica H-D-S y una secuencia pre-propeptídica amino terminal, que indica una potencial función secretora (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood y K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression", En Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Se ha descrito un presunto lugar de glicosilación. La estructura predicha es muy similar a la de otras serina proteasas conocidas, mostrando que el polipéptido maduro se pliega en una única región. La proteína madura tiene 224 aminoácidos de longitud, con un epitopo A2 que se muestra por procesarse naturalmente.
Se dan a conocer en Ferguson, y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) y en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO 98/12302 (y también en la correspondiente patente concedida US 5.955.306), WO 98/20117 (y también en las correspondientes patentes concedidas US 5.840.871 y US 5.786.148) (calicreína específica de prostasa) y el documento WO 00/04149 (P703P), la secuencia de nucleótidos de la prostasa y la secuencia y los homólogos polipeptídicos deducidos.
La presente invención proporciona vectores que codifican las proteínas de condensación de la prostasa basadas en la proteína y los fragmentos y de la prostasa y sus homólogos ("derivados"). Dichos derivados son adecuados para el uso en formulaciones de vacunas terapéuticas que son adecuadas para el tratamiento de tumores de próstata. Normalmente, el fragmento contendrá al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos como se da a conocer en la patente y las correspondientes solicitudes de patente anteriormente referenciadas.
Se conoce un antígeno de próstata preferido adicional como P501S, en la secuencia de ID nº 113 del documento WO 98/37814. Se contemplan los fragmentos y porciones inmunógenas codificados por su gen que comprenden al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos según se da a conocer en la solicitud de patente anteriormente referenciada. Un fragmento particular es PS108 (documento WO 98/50567).
Se conocen otros antígenos específicos de próstata a partir de los documentos WO 98/37418, y WO/004149. Otro es STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999.
Otros antígenos asociados a tumor útiles en el contexto de la presente invención incluyen: Plu-1 J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999, HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon y col Bioessays 199, 21 61-70, patente de los Estados Unidos 5.654.140) Criptina patente de los Estados Unidos 5.981.215. Adicionalmente, los antígenos particularmente relevantes para las vacunas en la terapia del cáncer comprenden también tirosinasa y survivina.
La presente invención es también útil en combinación con antígenos del cáncer de mama tales como Muc-1, Muc-2, EpCAM, her 2/neu, mamaglobina (patente de los Estados Unidos 5.668.267) o los dados a conocer en el documento WO 00/52165, WO 99/33869, WO 99/18749, WO 98/45328. Se dan a conocer los antígenos Her 2 neu entre otros, en la patente de los Estados Unidos 5.801.005. Preferiblemente, Her 2 neu comprende la región extracelular completa (que comprende aproximadamente loa aminoácidos 1-645) o sus fragmentos y al menos una porción inmunógena de la región intracelular completa, aproximadamente los 580 aminoácidos C terminales. En particular, la porción intracelular debería comprender la región de fosforilación o sus fragmentos. Se dan a conocer dichas construcciones en el documento WO 00/44899.
Her 2 neu, según se usa en el presente documento, puede derivarse de rata, ratón o ser humano.
La vacuna puede contener también antígenos asociados con mecanismos de soporte tumoral (por ejemplo, angiogénesis, invasión tumoral), por ejemplo, tie 2, VEGF.
Se pueden usar también las vacunas de la presente invención para la profilaxis o la terapia de trastornos crónicos adicionales a alergia, cáncer o enfermedades infecciosas. Dichos trastornos crónicos son enfermedades tales como asma, ateroesclerosis, y Alzheimeres y otras enfermedades autoinmunes. Se pueden considerar también vacunas para uso como contraconceptivos.
Los antígenos relevantes para la profilaxis y la terapia de pacientes susceptibles de o padecer de la enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer son, en particular, el fragmento de 39-43 aminoácidos n terminales de la proteína precursora \beta amiloide y fragmentos más pequeños. Se da a conocer este antígeno en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 99/27944-(Athena Neurosciences).
Los autoantígenos potenciales que se podrían incluir como vacunas para trastornos autoinmunes o como vacunas contraconceptivas incluyen: citocinas, hormonas, factores de crecimiento o proteínas extracelulares, más preferiblemente una citocina 4-helicoidal, lo más preferible IL13. Las citocinas incluyen, por ejemplo, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF y OSM. Las citocinas 4-helicoidales incluyen IL2, IL3, IL4, IL5, IL13, GMCSF y MCSF. Las hormonas incluyen, por ejemplo, hormona luteinizante (LH), hormona estimuladora del folículo (FSH), gonadotropina coriónica (Cg), VGF, GHrelina, agutí, proteína y neuropéptido Y relacionadas con agutí. Los factores de crecimiento incluyen, por ejemplo, VEGF.
Las vacunas de la presente invención son particularmente adecuadas para el tratamiento inmunoterapéutico de las enfermedades, tales como dolencias crónicas y cánceres, pero también para la terapia de infecciones persistentes. Según esto, las vacunas de la presente invención son particularmente adecuadas para la inmunoterapia de enfermedades infecciosas, tales como Tuberculosis (TB), infecciones por VIH, tales como SIDA en infecciones víricas como la Hepatitis B (HepB).
En una realización de la invención, el antígeno es un polinucleótido y se administra/dosifica como ADN "desnudo", según se describe, por ejemplo, en Ulmer y col., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Aquí, el ADN se formula en una disolución salina tamponada. Se puede incrementar la captación del ADN desnudo recubriendo con el ADN perlas biodegradables o que se eliminan naturalmente, que se trasportan eficazmente al interior de las células o usando otros agentes facilitadores de la transfección bien conocidos. Se puede administrar el ADN que codifica el antígeno en conjunción con un vehículo tal como, por ejemplo, liposomas. Normalmente dichos liposomas son catiónicos, por ejemplo, derivados de imidazolio (documento WO 95/14380), derivados de guanidina (documento WO 95/14381), derivados de fosfatidil colina (documento WO 95/35301), derivados de piperazina (documento WO 95/14651) y derivados de biguanida.
Se pueden usar vectores según la invención que expresen péptidos antigénico como base de las composiciones de vacuna de ADN y de las composiciones inmunoterapéuticas. De una manera similar, se pueden usar vectores que codifiquen las proteínas terapéuticas como base de las composiciones terapéuticas. De esta manera, la invención proporciona además el uso de un vector de expresión según se describe en el presente documento que es adecuado para la expresión de un péptido antigénico para la preparación de una composición inmunoterapéutica, vacuna o composición de vacuna. Se describe un procedimiento de vacunación de un sujeto mamífero que comprende administrar al anterior una cantidad efectiva de dicha vacuna o composición de vacuna. Lo más preferible, los vectores de expresión para uso en vacunas de ADN, composiciones de vacuna y composiciones inmunoterapéuticas serán vectores plásmidos.
Se pueden administrar vacunas de ADN en forma de ADN "desnudo", por ejemplo, en una formulación líquida administrada usando una jeringuilla o un chorro a alta presión, o ADN formulado con liposomas o un potenciador irritante de la transfección, o mediante administración de ADN mediada por partículas (PMDD). Se conocen bien en la técnica todos estos sistemas de administración. Se puede introducir el vector en un mamífero, por ejemplo, por medio de un sistema de administración de vector vírico.
Se pueden administrar las composiciones descritas en el presente documento mediante numerosas rutas, tales como de manera intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.
Se administra preferiblemente el vector por ruta intradérmica. En particular, se administra el vector por medio de técnicas de administración con un cañón génico (particularmente bombardeo de partículas) que implican recubrir el vector con una perla (por ejemplo, de oro) que se administra a continuación a alta presión en la epidermis; tal como, por ejemplo, como se describe en Haynes y col, J Biotechnology 44: 37-42 (1996).
En un ejemplo ilustrativo, se puede conseguir la aceleración de partículas impulsadas por gas mediante dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807; y Patente EP Nº 0500 799. Esta solución ofrece una solución de administración sin agujas en la que una formulación de polvo seco de partículas microscópicas, tales como polinucleótidos, se acelera a una elevada velocidad en el interior de un chorro de gas helio generado por un dispositivo de bolsillo que impulsa las partículas al interior de un tejido diana de interés, normalmente la piel. Las partículas son preferiblemente perlas de oro de 0,4-4,0 \mum, más preferiblemente de 0,6-2,0 \mum de diámetro y el conjugado de ADN recubierto sobre éstas y a continuación, comprimido en un cartucho o casete para colocar en el "cañón génico".
Otros dispositivos que pueden ser útiles para la inyección sin utilización de aguja impulsada por gas de las composiciones descritas en el presente documento incluyen los proporcionados por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.790.824; 5.064.913; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 y 5.993.412.
Los vectores que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos antigénicos se administran en la cantidad que sea profiláctica o terapéuticamente efectiva. La cantidad que se va a administrar está por lo general en el intervalo de un picogramo a 1 miligramo, preferiblemente 1 picogramo a 10 microgramos por administración mediada por partículas, y 10 microgramos a 1 miligramo para otras rutas de nucleótidos por dosis. La cantidad exacta puede variar considerablemente dependiendo de la especie y el peso del mamífero que se está inmunizando y de la ruta de administración.
Es posible que componente inmunógeno que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antigénico, se administre en una única vez o que se administre repetidamente, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, preferiblemente entre 1 y 4 veces, a intervalos entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 18 meses. Una vez de nuevo, sin embargo, éste régimen de tratamiento variará significativamente dependiendo del tamaño y la especie de animal tratado, la enfermedad que se está tratando/contra la que se está protegiendo, la cantidad administrada de la secuencia de nucleótidos, la ruta de administración, y otros factores que serán aparentes a un veterinario experto o especialista médico.
Se pueden utilizar los vectores descritos en el presente documento con agentes inmunoestimuladores. Preferiblemente, los agentes inmunoestimuladores se administran a la misma vez que el vector de ácido nucleico y se formulan conjuntamente. Dichos agentes inmunoestimuladores incluyen, pero esta lista no es exhaustiva y no excluye otros agentes: imidazoquinolinas sintéticas tales como imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison, y col. "Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine", Vaccine 19: 1820-1826, (2001)); y resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, y col. "Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN", Cellular immunology 204: 64-74 (2000).), bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente sobre las superficies de las células que presentan antígenos y las células T, tales como tucaresol (Rhodes, J. y col. "Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs"', Nature 377: 71-75 (1995)), citocinas, quimiocinas y moléculas coestimuladoras ya sea proteínas, ya sea péptidos, esto incluiría citocinas proinflamatorias tales como GMCSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa y TGF-beta, inductores Th1 tales como interferón gamma, IL-2, IL-12, IL-15 e IL-18, inductores Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y IL-13 y otras quimiocinas y genes coestimuladores tales como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L, otros ligandos diana inmunoestimuladores tales como CTLA-4 y L-selectina, proteínas y péptidos estimuladores de la apoptosis tales como Fas, (49), adyuvantes basados en lípidos sintéticos, tales como vaxfectina, (Reyes y col., "Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization", Vaccine 19: 3778-3786) squalene, alpha-tocopherol, polysorbate 80, DOPC and cholesterol, endotoxin, [LPS], Beutler, B., "Endotoxin", "Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity", Current Opinion in Microbiology 3: 23-30 (2000)); CpG oligo- and di-nucleotides, Sato, Y. y col., "Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization", Science 273 (5273): 352-354 (1996). Hemmi, H. y col., "A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA", Nature 408: 740-745, (2000) y otros potenciales ligandos que estimulan los receptores ToII para producir citocinas inductoras de Th1, tales como lipoproteínas micobacterianas sintéticas, proteína micobacteriana p19, peptidoglicano, ácido teicoico
y lípido A.
Algunos adyuvantes preferidos para estimular una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, un derivado de Lípido A tal como monofosforil lípido A, o preferiblemente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado. Están disponibles adyuvantes MPL® de Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse, por ejemplo, la Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094).Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) inducen también una respuesta predominantemente Th1. Se conocen bien dichos oligonucleótidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 6.008.200 y 5.856.462. Se describen también secuencias de ADN inmunoestimuladoras, por ejemplo, por Sato y col., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o sus derivados, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa.
La invención proporciona además células huéspedes transformadas con un vector de expresión según la invención. La célula huésped puede ser esencialmente cualquier célula eucariota, prefiriéndose más las células de mamíferos.
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La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante en una célula huésped eucariota, que comprende introducir un vector de expresión según la invención en la célula huésped y cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.
La invención se entenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales, junto con las Figuras que los acompañan, en que:
la Figura 1 es una representación esquemática del casete de expresión estándar usado para la expresión del antígeno del núcleo de VHB o S. Se insertó el gen S o Core en un plásmido 3' de un promotor mínimo de IE1 de HCMV (mCMV) y del intrón A (nucleótidos -116 a +958 en relación con el inicio de la transcripción), y 5' de una señal de poliadenilación de la beta globina de conejo (pA). El esqueleto del plásmido contenía adicionalmente un origen de replicación de pUC19 y un marcador de selección de la kanamicina;
la Figura 2 es una representación gráfica de la expresión de los antígenos S y Core de VHB con y sin 5'UTR de IE1 en células 293T. Se proporciona el nivel de S en ng/ml de S soluble segregado en el medio de cultivo. Se determinó el nivel de expresión de core mediante la densitometría de una Transferencia Western, y es en unidades arbitrarias. Clave: mC-MV = promotor mínimo de CMV; fCMV = promotor de CMV de longitud completa; IA = Exón 1 e intrón A; S = Antígeno de superficie; C = antígeno Core;
la Figura 3 ilustra el efecto de la adición del Exón 1 en ausencia del Intrón A. Se proporciona el nivel de expresión del antígeno S en ng/ml del antígeno S soluble segregado en el medio de cultivo. Se determinó el nivel de expresión de core mediante la densitometría de una Transferencia Western, y es en unidades arbitrarias. Clave: mCMV = promotor mínimo de CMV; IA = Exón 1 e Intrón A; EX1 = Exón 1; CD68I = CD68 del primer intrón;
la Figura 4 ilustra el efecto del Exón 1 sobre el nivel de expresión del gen de la luciferasa;
la Figura 5 muestra la secuencia de un fragmento del gen temprano inmediato principal de la cepa Towne de HCMV, que incluye 19 bases del promotor, el exón 1 completo y 20 bases de intrón A. El exón 1 está subrayado, y
las Figuras 6-8 muestran la respuesta celular a los antígenos de VIH, NEF, RT y Gag generada por ratones que reciben inmunización de ADN por medio de administración mediada de partículas. Los ratones recibieron tanto en ADN que codificaba el antígeno cuya expresión estaba impulsada por el promotor de IE de HCMV que comprendía el intrón A y el exón 1 (promotor f cmv) o el promotor de IE de HCMV que comprendía el exón 1, pero en ausencia del intrón A (I CMV).
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Ejemplo 1
Se construyeron numerosos plásmidos para examinar la eficacia de la expresión de los antígenos S y Core de VHB usando diferentes promotores de IE1 de HCMV y las secuencias 5' no traducidas (UTR), que incorporan normalmente un intrón. En la Figura 1 se ilustra un casete de expresión típica. Se ha demostrado que la expresión de cualquier antígeno de un promotor mínimo de IE1 de CMV proporciona niveles muy bajos de proteínas. Se pueden potenciar los niveles de expresión aumentando la longitud del promotor para incluir la región potenciadora en la dirección 5', o mediante la adición de la 5' UTR natural de IE1 de CMV (Figura 2). La secuencia 5' UTR natural de lE1 (nucleótido -1 a -958 en relación con el lugar de inicio de la transcripción) incluye el primer exón no traducido, el intrón A y unas pocas bases no traducidas del segundo exón.
La 5' UTR natural de IE1 de CMV es relativamente grande (1021 bases). Ya que la convención sugiere que la expresión potenciada que se observa en presencia de la 5' UTR se puede atribuir a la inclusión del intrón, se diseñaron experimentos para evaluar el efecto de eliminar/sustituir el intrón, como sigue:
Se prepararon un primer conjunto de construcciones en las que se clonó un intrón alternativo (el primer intrón CD68 de 87 bases) en lugar de la 5' UTR de CMV. Se usó el intrón CD68 tanto para sustituir la 5' UTR completa como la 3' colocada en el exón 1 para sustituir el intrón A. Cuando se sustituyó la 5'UTR completa por el intrón CD68, se observaron niveles de expresión muy bajos del antígeno S o core. Sin embargo, cuando se retuvo el exón 1 además del intrón CD68, se observaron niveles de expresión muy potenciados, aunque los niveles de expresión del antígeno S fueron adicionalmente relativamente bajos (Figura 3).
Se preparó una construcción adicional en la que se eliminó la secuencia del intrón A, dejando únicamente el exón 1 entre el promotor mínimo de CMV y el gen recombinante. Con esta construcción se observaron elevados niveles de expresión del antígeno S, se potenció también la expresión del antígeno core en comparación con los niveles únicamente del promotor mínimo, pero no a los mismos niveles observados en las construcciones que contenían tanto el intrón A como el intrón CD68 además del exón 1 (Figura 3).
En construcciones adicionales, se encontró también que el exón 1 aumenta el nivel de expresión de la luciferasa cuando se coloca entre el promotor mínimo y el gen de CMV o en la dirección 5' del exón 1 de CD68 (Figura 4). Esto indica que el potenciamiento de la expresión mediante la inclusión del exón 1 en ausencia del intrón A es independiente de la naturaleza de la secuencia de codificación que se está expresando.
Basándose en los resultados de estos experimentos, se concluyó que la inclusión del exón 1 en ausencia del intrón A potencia el nivel de expresión de los antígenos recombinantes a partir de un promotor mínimo de CMV. No se esperaba este potenciamiento basándose en el conocimiento previo del comportamiento del promotor mínimo y la 5' UTR de CMV.
Procedimientos de transfección y detección de productos de expresión
Se transfectaron monocapas de células 293T (-2x10^{5} células) en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos Corning Costar J (Corning Incorporated, Corning NY 14831, EE.UU)) con 1 \mug de ADN usando 2,5 \mul de LipofectAMINEJ 2000 (Life Technologies, 3, Fountain Drive, Inchinnan Business Park Paisley, PA4 9RF) según el protocolo del fabricante. Después de 24 horas, se volvieron a suspender las células en el medio de cultivo mediante aspiración, y se recogieron mediante centrifugación, y se lavaron las células y se volvieron a suspender en 250 \mul de disolución salina tamponada con fosfato. Se determinó el nivel de antígeno S segregado en el sobrenadante del cultivo de tejido mediante captura de anticuerpos, o alternativamente, se determinó el nivel de antígeno S residual en las células mediante inmunotinción con un anticuerpo dirigido contra VBH-S (DAKO M3506, Dako Corporation, Carpinteria, CA 93013, EE.UU.) detectado con una anticuerpo conjugado con FITC dirigido contra ratón (Sigma F5897, Sigma-Aldrich Co. Ltd, Fancy Road, Pool, Dorset, BH12 4QH) seguido por microscopía fluorescente usando protocolos normalizados (descritos en Antibodies, a Laboratory Manual (1998), Ed Harlow y David Lane (Ed) Cold Spring Harbor ISBN:0-87969-314-2 ). Se determinó el nivel de expresión de core en las células mediante SDS Page y transferencia Western usando un anticuerpo en cobaya doméstica generado contra los cores de VHB purificados, y un conjugado de peroxidasa de rábano picante dirigido contra cobaya (DAKO P0141).
Se determinó la expresión cuantitativa de S usando un dispositivo Origen M8. Se midió el antígeno superficial en los sobrenadantes de las células transfectadas. Se mezclaron los sobrenadantes con dos anticuerpos monoclonales del antígeno superficial, marcado uno con biotina (C86312M de Biodesign International, 60 Industrial Park Road Saco, Maine 04072, EE.UU.) y el otro con TAG (C86132M de Biodesign). Tras la incubación, se añadieron a las muestras perlas recubiertas con estreptavidina. Se cuantificó el antígeno superficial mediante análisis de las muestras mediante el Analizador Origen M8 (IGEN Europe, Inc. Oxford BioBusiness Centre, Littlemore Park, Littlemore, Oxford OX4 2SS) reino Unido, que detecta específicamente el anticuerpo de unión.
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Ejemplo 2 Preparación de una "suspensión de oro" recubierta con ADN plásmido para cartuchos de "cañón génico"
Se suspendieron ADN plásmido (aproximadamente 1 \mug/\mul), por ejemplo 100 \mug, y 2 \mum de partículas de oro, por ejemplo 50 mg, (PowderJect), en espermidina 0,05 M, por ejemplo 100 \mul (Sigma). Se precipitó el ADN sobre las partículas de oro mediante la adición de CaCl_{2} 1 M, por ejemplo 100 \mul (American Pharmaceutical Partners, Inc., EE.UU.). Se incubó el complejo ADN/oro durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavó 3 veces en etanol absoluto, por ejemplo 3 x 1 ml, (previamente seco en un tamiz molecular 3A (BDH). Se volvieron a suspender las muestras en etanol absoluto que contenía 0,05 mg/ml de polivinilpirrolidona (PVP, Sigma), y se dividieron en tres alícuotas iguales en tubos de micrófuga de 1,5 ml, (Eppendorf). Las alícuotas fueron para el análisis de (a) la "suspensión de oro", (b) el eluato-plásmido eluido de (a) y (c) para la preparación de cartuchos Tefzel recubiertos de oro/plásmido para el "cañón génico" (véase el Ejemplo 2 a continuación). Para la preparación de las muestras (a) y (b), se hicieron girar los tubos que contenían ADN plásmido/"suspensión de oro" en etanol/PVP durante 2 minutos a gran velocidad en una micrófuga Eppendorf 5418, se eliminó el sobrenadante y se secó la "suspensión de oro" durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se volvió a suspender la muestra (a) en 0,5-1,0 \mug/ml de ADN plásmido en TE, pH 8,0, suponiendo aprox. un 50% de recubrimiento. Para la elución, se volvió a suspender la muestra (b) en 0,5-1,0 \mug/\mul de ADN plásmido en TE, pH 8,0 y se incubó a 37ºC durante 30 minutos, agitando vigorosamente, y a continuación se hizo girar durante 2 minutos a gran velocidad en una micrófuga Eppendorf 5418 y se retiró el sobrenadante, el eluato, y se almacenó a -20ºC. se determinó la concentración exacta del ADN eluido mediante cuantificación espectrofotométrica usando un Genequant II (Pharmacia Biotech).
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Ejemplo 3 Preparaciones de cartuchos para inmunización de ADN
La preparación de cartuchos para el dispositivo de transferencia génica Accell fue como se ha descrito anteriormente (Eisenbraun y col., DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791-797; Pertner y col). Brevemente, se recubrió el ADN plásmido sobre partículas de oro de 2 \mum (DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., EE.UU.) y se introdujo en una tubería Tefzel, que se cortó posteriormente en longitudes de 1,27 cm para servir como cartuchos y se almacenaron desecados a 4ºC hasta el uso. En una vacunación típica, cada cartucho contenía 0,5 mg de oro recubierto con un total de 0,5 \mug de ADN/cartucho.
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Ejemplo 4 Respuesta inmune al antígeno de VIH expresado bajo el control del promotor de It de HCMV en ausencia del Intrón A
Para examinar si el exón 1 en ausencia del Intrón A potencia respuestas inmunes a antígenos de VIH administrados mediante vacunación con ácido nucleico.
Se vacunaron ratones (n = 3/grupo) con antígenos codificados por ácido nucleico y localizados en dos vectores. P7077 utiliza el promotor de IE de HCMV que incluye el Intrón A y el exón 1 (promotor fcmv). P73I administra el mismo antígeno, pero contiene el promotor de IE de HCMV (promotor icmv) que carece de Intrón A, pero incluye el exón 1.
Se administró el plásmido al sitio diana de la piel abdominal afeitada de ratones F1 (CH3 x Balb/c). Se proporcionó a los ratones una inmunización primaria de 2 x 0,5 \mug de ADN en el día 0, estimulada con 2 x 0,5 \mug de ADN en el día 35 y se detectó respuesta celular en el día 40 usando IFN-gamma Elispot.
\bullet P73I-vector vacío
\bullet P7077-vector vacío
\bullet P7077 GRN-(promotor f CMV) Gag, RT, Nef
\bullet P73I GRN-(promotor i CMV) Gag, RT, Nef
\bullet P7077 GH-(promotor f CMV) Gag, Nef
\bullet P73I GN-(promotor i CMV) Gag, Nef.
Respuestas de las células T citotóxicas
Se evaluó la respuesta de las células T citotóxicas mediante el ensayo ELISPOT de IFN-\gamma restringido con células T CD8+ de los esplenocitos recogidos 5 días después. Se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se recogieron los bazos en PBS frío con hielo. Se separaron los esplenocitos en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido por la lisis de los glóbulos rojos (1 minuto en tampón constituido por NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM). Tras dos lavados en PBS para eliminar la materia particulada, se distribuyó en alícuotas la suspensión de células única en placas ELISPOT recubiertas previamente con anticuerpo IFN-\gamma de captura y se estimularon con péptido análogo restringido con CD8-(Gag, Nef o RT). Tras cultivo durante la noche, se visualizaron las células productoras de IFN-\gamma mediante la aplicación de anticuerpo marcado con IFN-\gamma-biotina dirigido contra murino (Pharmingen) seguido por fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina y se cuantificaron usando el análisis de imagen.
En las figuras 6, 7 y 8 se muestran los resultados de este experimento.
Conclusión
La inclusión de sustancialmente todo el exón 1 en ausencia del Intrón A potencia el nivel de expresión de los antígenos recombinantes de un promotor mínimo de CMV. El potenciamiento es independiente del antígeno que se expresa. Los vectores son útiles en los protocolos de vacunación del ácido nucleico y en los protocolos de terapia génica proporcionando una expresión potenciada in vivo de las proteínas deseadas y esta expresión es capaz de impulsar una respuesta inmune in vivo. Además, los vectores pueden aumentar los niveles de proteínas recombinantes en el cultivo.

Claims (11)

1. Uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor, un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato de citomegalovirus humanos (IE1 de HCMV) que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable con el promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido.
2. Uso de un vector según se define en la reivindicación 1 en la preparación de una composición inmunoterapéutica.
3. Uso de un vector según la reivindicación 1 ó 2 en el que el promotor es un promotor mínimo de IE1 de HCMV.
4. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV se sitúa inmediatamente en 3' con el promotor.
5. Uso de un vector según la reivindicación 4 que comprende además una secuencia heteróloga de intrón diferente de la del intrón A del gen IE1 de HCMV situado inmediatamente en la dirección 3' del exón 1 de IE1 de HCMV en la región 5' no traducida.
6. Uso de un vector según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 que comprende además uno o más lugares de restricción situados en la dirección 3' de la región 5' no traducida.
7. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que es un vector plásmido.
8. Uso de un vector según la reivindicación 1 en el que el polipéptido es un péptido antigénico.
9. Uso de un vector según la reivindicación 1 a 8, comprendiendo dicha composición de vacuna un diluyente, excipiente o vehículo adyuvante farmacéuticamente aceptable.
10. Uso de un vector según la reivindicación 9 cuyo vehículo comprende una perla sobre la cual se recubre el vector.
11. Un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor y un fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A y una secuencia de ADN que codifica un péptido antigénico, para uso como una vacuna, o composición inmunoterapéutica o como componente de una composición de vacuna o composición inmunoterapéutica.
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