ES2345809B1 - Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso de obtencion, sistemaquimiosensor que lo contiene y procedimiento para la deteccion de policarboxilatos. - Google Patents
Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso de obtencion, sistemaquimiosensor que lo contiene y procedimiento para la deteccion de policarboxilatos. Download PDFInfo
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Abstract
Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso
de obtención, sistema quimiosensor que lo contiene y procedimiento
para la detección de policarboxilatos.
La presente invención se refiere a un compuesto
tripodal de base escuaramida junto con su proceso de obtención, al
sistema quimiosensor que contiene a dicho compuesto como receptor, y
a un procedimiento que utiliza dicho sistema quimiosensor para la
detección cualitativa y/o cuantitativa de policarboxilatos,
concretamente dicarboxilatos y tricarboxilatos, preferiblemente
folato y análogos del mismo, de una manera rápida, simple, eficaz en
muestras comerciales en agua.
Description
Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso
de obtención, sistema quimiosensor que lo contiene y procedimiento
para la detección de policarboxilatos.
La presente invención se refiere a un compuesto
tripodal de base escuaramida junto con su proceso de obtención, al
sistema quimiosensor que contiene a dicho compuesto como receptor, y
a un procedimiento que utiliza dicho sistema quimiosensor para la
detección cualitativa y/o cuantitativa de policarboxilatos,
concretamente dicarboxilatos y tricarboxilatos, preferiblemente
folato y análogos del mismo.
La coordinación selectiva de iones en un medio
altamente competitivo, como el agua, ha cautivado al químico durante
años. El reconocimiento molecular de aniones biológicamente activos,
como fosfatos o carboxilatos, ha sido un foco de atención
prioritario en la investigación con el ánimo de mimetizar las
enzimas o las proteínas de transporte. Este tipo de investigaciones
se dirigen hacia el establecimiento de una mayor coordinación y
selectividad entre receptor y substrato. El primer aspecto viene
controlado por el tipo de grupos funcionales y disolvente
utilizados. Mientras que el segundo aspecto, viene sujeto por la
introducción de elementos complementarios a la geometría y las
características propias de coordinación del substrato.
A pesar del elevado grado de sofisticación
alcanzado actualmente en este tipo de investigaciones, el desarrollo
de nuevos receptores capaces de establecer una fuerte coordinación
selectiva con aniones en un disolvente, de elevada constante
dieléctrica, como el agua, sigue siendo una tarea harto difícil.
Es bien sabido en la técnica que las
escuaramidas son consideradas vinilogas a las amidas y son una
unidad estructural muy adecuada para el establecimiento de enlaces
de hidrógeno intermoleculares. Este hecho se fundamenta en que una
escuaramida disecundaria ofrece dos grupos NH aceptores de enlace de
hidrógeno y dos átomos de oxígeno carbonílicos donadores de enlace
de hidrógeno intermoleculares, dispuestos de forma que puedan actuar
bien por separado, o en ciertos casos de forma sinérgica. A esto
debemos añadir que cálculos teóricos avalan que el ciclo de
escuaramida al formar enlaces de hidrógeno intermoleculares con
aniones, o bien con cationes, provoca en el ciclo escuaramidico, y
en consecuencia en toda la molécula, un incremento de estabilidad
cercana a la aromaticidad. Todo ello reunido hace que la unidad de
escuaramida disecundaria sea una prometedora unidad de enlace con
restos carboxilatos. Está sólidamente fundamentado en la
bibliografía, que el diseño de un receptor para aniones
policarboxilatos en agua debe reunir una gran preorganización,
capacidad de formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares,
establecimiento de fuerzas intermoleculares no covalentes diferentes
y complementarias a las de enlace de hidrógeno, como
electrostáticas, y ser perfectamente soluble en agua. Por otro lado,
los grupo amonio han demostrado ser irás efectivos para la formación
de pares iónicos que los grupo guanidinio debido a su elevada
localización de la carga positiva, de esta forma, la naturaleza
muestra preferencia por la arginina más que la lisina para enlazar
con este tipo de aniones, posiblemente debido a una mayor
acumulación de enlaces de hidrógeno.
No debemos olvidar que la naturaleza del
disolvente juega un papel crítico en el control de la fuerza de
coordinación y selectividad entre receptor-analito.
Estas interacciones generalmente esta dominadas por las
interacciones de tipo electrostático. Por lo general los aniones
tienen una energía libre de solvatación mayor que los cationes y
requieren interacciones más fuertes en agua para competir de manera
eficiente con las moléculas de agua que se encuentran sólidamente
vinculadas en la esfera de solvatación del anión. Ejemplos de
receptores naturales para aniones en agua son la espermidina, la
carboxipeptidasa A, y las proteínas que enlazan con fosfatos.
El documento de Frontera A. et al.,
"Rational design, synthesis, and application of a new receptor for
the molecular recognition of tricarboxylate salts in aqueous
media". The Journal of Organic Chemistry. Sep 2006. ISSN
0022-3263 (Print). Vol. 71. Nr. 19. Pág. 7185 - 7195
describe receptores tripodales destinados al reconocimiento de
únicamente sales tricarboxilatos y en medios sólo parcialmente
acuosos, en particular se menciona la utilización de un medio
H_{2}O:EtOH 1:3.
El documento Prohens, R. et al.
"Squaramido-based receptors: Molecular recognition
of carboxylate anions in highly competitive media". Tetrahedron
Letters. Feb. 1998. ISSN 0040-4039. Vol. 39. Nr. 9.
Pág. 1063-1066 describe receptores ditópicos que
muestran unos valores de asociación con dicarboxilatos en medio no
acuoso aceptables, pero que a medida que se aumenta la cantidad de
agua la constante de asociación disminuye drásticamente, es decir,
los dicarboxilatos prefieren estar asociados con el agua
(solvatados) en lugar de formar un complejo con el
receptor.
receptor.
Hasta la fecha no se ha descrito ningún
compuesto tripodal de base escuaramida que sea capaz de
interaccionar con tricarboxilatos y dicarboxilatos, especialmente en
muestras con un medio totalmente acuoso.
Por otro lado, dentro del ámbito biológico los
dicarboxilatos son especies importantes debido a que juegan
diferentes roles en numerosos procesos metabólicos y en la
biosíntesis de importantes intermedios, así como en la generación de
enlaces energéticos con fosfatos, y son una pieza estructural clave
en la composición de los aminoácidos y proteínas. De esta forma, el
anión glutamato, un aminoácido con dos grupos carboxilatos, es el
mayor estimulante del sistema nervioso central.
Otro dicarboxilato importante es el folato, que
pertenece a la familia de las vitaminas B, con una limitada
solubilidad en agua a pH neutro, solo es soluble en agua a pH muy
ácido y en disoluciones alcalinas, mostrando una total insolubilidad
en disolventes orgánicos. La mayor fuente de folato en la dieta
humana procede de las verduras de hoja verde (espinacas, acelgas,
etc), guisantes, legumbres, yema de huevo, germen de trigo y
levaduras. El ácido fólico es comercialmente muy interesante debido
a que una deficiencia en la dieta humana provoca la incorporación
masiva de uracilo en el ADN humano (4 millones por célula) rompiendo
el cromosoma. Esta ruptura cromosómica provoca un aumento del riesgo
de cáncer y lleva agregado defectos cognoscitivos asociados a esta
deficiencia de folato en la
dieta.
dieta.
Por este motivo, la falta de ácido fólico
detectado en la dieta humana a nivel mundial ha llevado a diversos
fabricantes, a incorporar ácido fólico a una gran variedad de
alimentos y especialmente aquellos que van dirigidos a mujeres
embarazadas, niños en edad de crecimiento, y como medida de
prevención contra el cáncer a la población en general. Así se
encuentran comercializados alimentos enriquecidos con ácido fólico,
como cereales, galletas y derivados lácteos. En cosmética el ácido
fólico se utiliza en cremas antienvejecimiento. Además, como medida
preventiva contra la aparición de bebes con espina bífida es
recomendable en estado de gestación por parte de la madre tomar
preparados farmacológicos de ácido fólico.
Los análogos del folato también son compuestos
interesantes, ya que, por ejemplo, el metotrexato es utilizado como
antirreumático, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias
crónicas y formas poliartríticas de la artritis idiopática juvenil,
así como en el tratamiento de la psoriasis, la artritis psoriásica y
la poliartritis.
Por tanto, dada la importancia del folato y
análogos del mismo es necesario disponer de métodos para su
detección y cuantificación con el fin de controlar las cantidades
dicho compuesto de una manera rápida y eficaz.
En la técnica se conocen métodos tradicionales
que utilizan ensayos microbiológicos, o bien, técnicas
cromatográficas como TLC o HPLC que requieren el uso de aparatos
especializados.
Los ensayos microbiológicos requieren personal
experto en el manejo de cultivos de microorganismos y un adecuado
control y mantenimiento de estos microorganismos, pero su mayor
inconveniente es que estas técnicas son tediosas y se tarda mucho
tiempo en obtener una respuesta (24-48 h).
Otra alternativa utilizada en la determinación
de ácido fólico son los inmunoensayos (test ELISA), que son rápidos
(1-3 h) y que no requieren aparatos caros, ni
tampoco se precisa de personal altamente especializado. No obstante,
entre sus mayores limitaciones se encuentra la notoria variabilidad
en los resultados en función del "kit" utilizado. Otra
desventaja añadida en esta metodología viene motivada por la rápida
caducidad de estos "kits".
En la actualidad no hay una metodología de
análisis de ácido fólico y análogos del mismo perfecta y que
destaque sobremanera, debido a que el ácido fólico es muy sensible
al entorno físico en que se encuentra, y que se presenta en varias
formas. Aunque hay que resaltar que la técnica de ensayo por
microorganismos, es el único método oficial de determinación de
folato en alimentos establecido por la AOAC(Method
992.05(2002)) y AACC (ACC Meted 86-47). En
esta técnica el microorganismo irás utilizado es Lactobacillus
rhamnosus que responde a una gran variedad de análogos de
folatos. Otros microorganismos utilizados son: Streptococcus
faecalis, Pediococus cerevisae, Tetrahymena pyriformis y
Bacillus coagulans. Estas determinaciones ofrecen una elevada
sensibilidad (nivel de nanogramo) para la mayoría de isómeros del
folato. (Trends in Food Science & Technology, 2005, 16,
253-266). Mientras que las técnicas cromatográficas
TLC y HPLC, y especialmente esta última, ofrecen una elevada
especificidad hacia los diferentes isómeros del folato asociadas a
una inequívoca identificación de cada isómero. Se ha comprobado que
debido a la limitación de los detectores de HPLC utilizados, en
ciertos casos, se ha observado una pérdida de sensibilidad entre el
30 al 40% respecto a los ensayos realizados con microorganismos. A
pesar de esto sigue siendo el método por HPLC uno de los métodos más
utilizados en la bibliografía.
Los procedimientos biológicos de determinación
de ácido fólico como el uso de ligandos
bio-específicos o bien, inmunoensayos con
anticuerpos (ensayo ELISA), son muy sensibles y específicos debido a
la fuerte interacción entre anticuerpo/ligando folato. Y son una
clara alternativa al método por HPLC y microbiológico especialmente
debido a la rapidez de obtención de resultados.
Aunque el mayor inconveniente que presentan
estos métodos de determinación por procedimientos bioespecíficos es
la ausencia de una medida de folato total.
En un esfuerzo exhaustivo de los inventores por
encontrar compuestos con características de solubilidad apta para
ser utilizados en sistemas quimiosensores que permitan la detección
cualitativa y/o cuantitativa de policarboxilatos (dicarboxilatos,
tricarboxilatos), preferiblemente folato y análogos del mismo, los
inventores de la presente invención han obtenido sorprendentemente y
de manera satisfactoria compuestos tripodales de base escuaramida
que cumplen o permiten cumplir con los siguientes objetivos
mencionados a continuación.
\newpage
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un compuesto tripodal de base escuaramida con unas
características de solubilidad en agua que permiten su utilización
en métodos de ensayo con analitos difícilmente solubles en agua.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un compuesto tripodal de base escuaramida con un diseño
y una rigidez en su esqueleto que permita su interacción con
dicarboxilatos.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la obtención de un compuesto
tripodal de base escuaranida según las características descritas en
los objetivos anteriores.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un sistema quimiosensor que permita la interacción
entre el compuesto tripodal de base escuaramida indicado
anteriormente y un indicador de fluorescencia.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento que utiliza el sistema quimiosensor
mencionado anteriormente para la detección cualitativa y/o
cuantitativa de policarboxilatos (dicarboxilatos, tricarboxilatos),
preferiblemente folato ara logos del mismo, de una manera rápida,
simple, eficaz en muestras comerciales en agua.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un kit que comprenda el sistema quimiosensor indicado
anteriormente con el cual pueda llevarse a cabo el procedimiento de
detección indicado en el párrafo anterior de una manera cómoda y
rápida.
La presente invención se refiere en un primer
aspecto a un compuesto tripodal de base escuaramida de fórmula
general (I)
en la
que:
R_{1} es una sal de amonio alquil
C_{3}-C_{5}-N(CH_{3})_{3};
y
R_{2} se selecciona, independientemente entre
sí, de un anillo benceno no sustituido; un anillo benceno
trisustituido con radicales, iguales o diferentes entre sí,
seleccionados entre metilo o etilo; y una poliamina.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la obtención de compuestos de
fórmula general (I).
En un tercer aspecto, la presente invención se
refiere a un sistema quimiosensor para la detección cualitativa y/o
cuantitativa en muestras acuosas de policarboxilatos seleccionados
del grupo que consiste en dicarboxilatos y tricarboxilatos, que
comprende:
- a)
- un compuesto receptor de fórmula general (I)
y
- b)
- un indicador fluorescente.
En un cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la detección cualitativa y/o
cuantitativa de policarboxilatos seleccionados del grupo que
consiste en dicarboxilatos y tricarboxilatos, preferiblemente los
dicarboxilatos son folato y análogos del mismo.
En un quinto aspecto, la presente invención se
refiere a un kit que contiene el sistema quimiosensor mencionado
anteriormente.
La Figura 1A representa el termograma
correspondiente a la valoración del receptor de fórmula (I) en donde
R_{1} es una sal de amonio
C_{3}-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el ácido fólico en
un sistema agua y tampón (TRIS/HCl) a pH= 9, a 294 K.
La Figura 1B representa la curva que mejor se
ajusta a los valores integrados del termograma de la Figura 1A a un
modelo de estequiometría 1:1, una vez corregida con la disolución
del ácido fólico en un sistema agua y tampón (TRIS/HCl) a pH = 9, a
294 K.
La Figura 2A representa el termograma
correspondiente a la valoración del receptor de fórmula (I) en donde
R_{1} es una sal de amonio
C_{3}-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el metotrexato en un
sistema agua y tampón (TRIS/HCl) a pH = 9, a 294 K.
La Figura 2B representa la curva que mejor se
ajusta a los valores integrados del termograma de la Figura 2A a un
modelo de estequiometria 1:1, una vez corregida con la disolución
del ácido fólico en un sistema agua y tampón (TRIS/HC1) a pH= 9, a
294 K.
La figura 3 representa la recta de calibrado a
525 nm obtenida para el sistema formado por el receptor de fórmula
(I) en donde R_{1} es una sal de amonio
C_{3}-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y la
carboxifluoresceina a diferentes concentraciones de ácido fólico, en
un sistema agua y tampón (TRIS/HCl) a pH = 9, a 294 K. En el
interior de la figura se muestran los resultados del ajuste
matemático de la recta.
La figura 4 representa la recta de calibrado a
525 nm obtenida para el sistema formado por el receptor de fórmula
(I) en donde R_{1} es una sal de amonio
C_{3}-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y la
carboxifluoresceina a diferentes concentraciones de metotrexato, en
un sistema agua y tampón (TRIS/HCl) a pH = 9, a 294 K. En el
interior de la figura se muestran los resultados del ajuste
matenático de la recta.
La presente invención se refiere a un compuesto
tripodal de base escuaramida de fórmula general (I)
en la
que:
R_{1} es una sal de amonio alquil
C_{3}-C_{5}-N(CH_{3})_{3};
y
R_{2} se selecciona, independientemente entre
sí, de un anillo benceno no sustituido; un anillo benceno
trisustituido con radicales, iguales o diferentes entre sí,
seleccionados entre metilo o etilo; y una poliamina.
En una realización preferida, R_{1} es una sal
de amonio
propil-N(CH_{3})_{3}.
Los compuestos de fórmula general (I) se
obtienen a partir de la reacción entre espaciadores de diversa
naturaleza, previamente funcionalizados, de mayor o menor
flexibilidad molecular, con las escuaramidas de partida. Estas
escuaramidas están dotadas de una sal de amonio cuaternario
terminal. La reacción de condensación se realiza en condiciones muy
suaves y con buen rendimiento (>80%). A modo esquemático, el
proceso de síntesis de compuestos de fórmula general (I) comprende
las etapas de:
Etapa
A
A1) reacción de escuarato de etilo con
N,N-dimetil-alquilen-C_{3}-C_{5}
diamina para obtener un producto (a1) que es
N,N-dimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-alquil
C_{3}-C_{5} amina;
A2) reacción de (a1) con yoduro de metilo para
obtener el yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-alquil
C_{3}-C_{5} amonio (a2).
Etapa
B
B1) reacción de
1,3,5-tris(bromometil)-benceno,
donde el benceno puede estar sustituido por radicales iguales o
diferentes entre sí seleccionados entre metilo o etilo, con
NaN_{3}, para obtener el correspondiente producto (b1) que es
1,3,5-tris(azidometil)-benceno
(o el correspondiente benceno sustituido);
B2) hidrogenación catalítica de (b1) para
obtener el correspondiente
1,3,5-tris(aminometil)-benceno
(o el correspondiente benceno sustituido) (b2).
Etapa
C
C) reacción del producto obtenido (a2) con el
producto obtenido (b2) para producir el compuesto de fórmula general
(I); o alternativamente, reacción del producto (b2) con (a1) y
posterior reacción con CH_{3}I para producir el compuesto de
fórmula general (I);
en el que si se desea obtener el compuesto de
fórmula general (I) con R_{2} = poliamina, el producto obtenido
(a2) reacciona directamente con tris
(2-aminoetil)amina sin pasar por las etapa B
y C.
Preferiblemente, alquilen
C_{3}-C_{5} y alquil
C_{3}-C_{5} corresponden a radicales propileno y
propilo, respectivamente.
Los productos de partida o reactivos utilizados
para las diferentes reacciones se encuentran disponibles
comercialmente o son fácilmente obtenibles a partir de
procedimientos descritos en la técnica.
Cabe indicar que el compuesto de fórmula general
(I) se suele obtener en forma de sal (en particular, triyoduro).
Dichos compuestos así obtenidos son tripodales
lo que permite la previsible interacción con tricarboxilatos. No
obstante, sorprendentemente, la estructura concreta de este
compuesto hace que sea útil para la interacción con dicarboxilatos,
ya que dos de los brazos de este compuesto forman una asociación de
tipo electrostático (como una interacción habitual con
dicarboxilato) y el tercer brazo interacciona con la parte
hidrofóbica del dicarboxilato, lo cual provoca que aumente la
asociación de manera exponencial. Esta característica estructural
permite que los compuestos de la presente invención sean altamente
solubles en agua a diferentes valores de pH, y hace que sean óptimos
para ensayos con analitos que son difícilmente solubles en agua.
Debido a estas características, el compuesto
tripodal de base escuaramida de fórmula general (I) es útil como
receptor en un sistema quimiosensor. Por lo tanto, la presente
invención también se refiere a un sistema quimiosensor para la
detección cualitativa y/o cuantitativa en muestras acuosas de
policarboxilatos seleccionados del grupo que consiste en
dicarboxilatos y tricarboxilatos, que comprende:
a) un compuesto receptor de fórmula general
(I)
en la
que:
R_{1} es una sal de amonio alquil
C_{3}-C_{5}-N(CH_{3})_{3};
y
R_{2} se selecciona, independientemente entre
sí, de un anillo benceno no sustituido; un anillo benceno
trisustituido con radicales, iguales o diferentes entre sí,
seleccionados entre metilo o etilo; y una poliamina;
y
b) un indicador fluorescente.
En una realización preferida, R_{1} es una sal
de amonio
propil-N(CH_{3})_{3}.
En una realización preferida, el indicador
fluorescente se selecciona del grupo que consiste en fluoresceínas,
Eritrosina, Eosina, Rosa de Bengala y Floxina.
En otra realización preferida, los
dicarboxilatos a detectar son folato y análogos del mimo.
Por "folato" se entiende el anión del ácido
fólico o ácido pteroilglutá mico (PGA) que es una molécula compleja
formada por un resto bicíclico de pterina enlazado por un grupo
metilénico al ácido paraaminobenzoico (pABA) que a su vez y través
de un enlace peptídico se une a una molécula de ácido
L-glutámico. El resto de pteridina puede existir
tanto en forma oxidada como reducida. La carga del ácido fólico,
menos dos, un dicarboxilato, se encuentra en el resto del ácido
L-glutámico.
Cuando se hace referencia a "análogos de
folato" en la presente invención se entiende que se refiere a
compuestos seleccionados del grupo que consiste en:
- ácido
N-[4-[2-(2-amino-4-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)etil]benzoil]-L-Glutámico
Número Registro
CAS: [306314-88-5].
CAS: [306314-88-5].
- ácido
N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS: [54-62-6];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil]-2-propin-1-ilamino]benzil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[76849-19-9];
- ácido
N-[4-[[(1,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro
CAS: [112887-79-3];
CAS: [112887-79-3];
- ácido
(2S)-[[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-sulfo-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[139347-01-6];
- ácido
(2S)-[5-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]-1,3-dihidro-1-oxo-2H-
isoindol-2-il]-pentanodioico. Número Registro CAS: [246545-24-4];
isoindol-2-il]-pentanodioico. Número Registro CAS: [246545-24-4];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-1,4,5,6-tetrahidro-5-metil-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
28581-42-2;
- ácido
N-[4-(3-amino-1,2,5,6,6a,7-hexahidro-1-oxoimidazo[1,5-f]pteridin-8(9H)-il)benzoil]-L-Glutámico.
Nú-
mero Registro CAS: [3432-99-3];
mero Registro CAS: [3432-99-3];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]formilamino]benzoil]-L-Glutámico
Nú-
mero Registro CAS: [2800-34-2];
mero Registro CAS: [2800-34-2];
- dihidrógeno fosfato de
N-[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]-L-homoserina.
Número Registro CAS:
[866772-91-0];
- ácido
N-[[5-[2-[(6R)-2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il]etil]-2-tienil]carbonil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[127228-54-0];
- sal cálcica (1:1) del ácido,
N-[4-[[(2-amino-5-formil-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[1492-18-8];
- ácido
N-[4-[2-[(6R)-2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il]etil]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[106400-81-1];
-
3-amino-8-[4-[[[(1S)-1,3-dicarboxipropil]amino]carbonil]fenil]-1,2,5,6,(6aR),7-hexahidro-1-oxo-imidazo[1,5-f]pteridinio.
Número Registro CAS:
[10360-12-0];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[2410-93-7];
- ácido,
N-[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico.
Número
Registro CAS: [135-16-0];
Registro CAS: [135-16-0];
- ácido
N-[4-[[(1,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-6-il)metil]metilamino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[148315-60-0];
- ácido
(2S)-[[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-sulfo-butanoico.
Número Registro CAS:
[866772-95-4];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4,7,8-tetrahidro-4-oxo-6-pteridini1)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS: [4033-2
7-6];
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-\gamma-glutamil-L-glutámico.
Número Registro CAS:
[19360-00-0];
- ácido
2-[[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-fosfono-butanoico.
Número Registro CAS:
[170470-98-1];
- ácido
N-[4-[2-(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-quinazolinil)etil]benzoil]-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[132014-31-4];
- ácido
N-(4-aminobenzoil)-L-Glutámico.
Número Registro CAS:
[4271-30-1];
- Metotrexato;
- Pemetrexed; y
- Raltitrexed.
Preferiblemente, los "análogos de folato"
son Metotrexato, Pemetrexed o Raltitrexed.
En la presente invención, por
"policarboxilato" se entiende estrictamente
"dicarboxilatos" y "tricarboxilatos".
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para la detección de policarboxilatos seleccionados
del grupo que consiste en dicarboxilatos y tricarboxilatos, que
comprende las etapas de:
- a)
- disolución de la muestra en una solución tamponada a pH 9 que contiene el sistema quimiosensor de la presente invención con todas sus realizaciones;
- b)
- observación de la fluorescencia después de por lo menos una hora.
En una realización particular, si dicha muestra
es sólida, el procedimiento comprende adicionalmente una etapa de
pretratamiento de la muestra que consiste en la solubilización de la
muestra sólida en una disolución tamponada a pH 9 por irradiación
con ultrasonidos durante por lo menos 15 minutos, centrifugación y
obtención de un líquido sobrenadante que se utilizará en dicha etapa
a).
En otra realización particular, la detección es
cuantitativa y comprende adicionalmente las siguientes etapas:
- c)
- medición de la fluorescencia observada;
- d)
- correlación entre dicha fluorescencia observada y la concentración de dichos policarboxilatos en el analito.
En una realización preferida, los dicarboxilatos
a detectar son folato y análogos del mismo, tal y como se han
definido anteriormente.
\newpage
La presente invención también se refiere a un
kit que comprende el sistema quimiosensor descrito anteriormente en
la presente invención y el tampón en un envase adecuado. El kit
contiene preferiblemente las instrucciones para el uso del sistema
quimiosensor para la detección de policarboxilatos (dicarboxilatos,
tricarboxilatos).
A continuación, se indican los siguientes
ejemplos con propósitos únicamente ilustrativos, y no se pretende de
ningún modo limitar el ámbito de la presente invención.
Síntesis del receptor en el que:
R_{1} es una sal de amonio
propil-NR_{3}, en el que R es metilo; y
R_{2} es un anillo de benceno no
sustituido
En un matraz de fondo redondo de 100 mL, se
introduce una disolución de 2 g (11,8 mmol) de escuarato de dietilo
en 10 mL de éter dietílico anhidro. Sobre ésta, se añade gota a
gota, en agitación constante y bajo atmósfera de argón, una
disolución de 1 g de la N,N-dimetilpropilendiamina (9,8 mmol)
en 10 mL de éter dietílico anhidro. La mezcla se deja en agitación
bajo atmósfera inerte durante 12 horas. Pasado este tiempo, se
observa la aparición de un precipitado. Se añaden 20 mL de pentano y
se enfría en un baño de agua-hielo, provocando la
precipitación del producto deseado. Se centrifuga y se retira el
líquido por decantación. El sólido resultante se lava tres veces con
10 mL de pentano y unas gotas de éter dietílico. Se obtienen 2,21 g
(9,78 mmol, 98%) de
N,N-dimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamina
como un sólido blanco que se seca al aire.
En un matraz de fondo redondo de 250 mL se
disuelven 2,17 g (9,6 mmol) de la
N,N-dimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamina
en 60 mL de acetona. Con la ayuda de una jeringa, se introducen en
la disolución 910 \mul (14,6 mmol) de yoduro de metilo. La mezcla
de reacción se deja a reflujo en atmósfera de argón durante 12
horas. Después de este tiempo, el crudo se enfría a temperatura
ambiente, se añaden 30 mL de pentano y se coloca en un baño de
agua-hielo. De esta forma se consigue la
precipitación de un polvo amarillo, que se recupera por decantación
y se lava 3 veces con 30 mL de pentano y unas gotas de acetona. Se
seca al aire, obteniéndose 3,5 g (9,51 mmol, 99%) del yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamonio.
Una disolución que contiene 6 g (0,05 mol) de
mesitileno, 27,5 g (0,15 mol) de N-bromosuccinimida (NBS),
0,27 g de peróxido de benzoilo, y 150 mL de benceno se calienta a
reflujo para iniciar la reacción. La reacción es tan exotérmica que
incluso se mantiene el reflujo sin necesidad de calentar.
Posteriormente se calienta de nuevo a reflujo durante 1 hora irás
para completar la reacción. Se filtra el sólido, y el filtrado se
lava con agua y se seca con Na_{2}SO_{4} anhidro. Se elimina el
benceno a presión reducida obteniéndose un sólido cristalino en
forma de finas agujas. La recristalización del crudo se lleva a cabo
en una mezcla de etanol y hexano (1:1 en volumen). Obteniéndose 16,2
g (0,046 mol, 92%) de
1,3,5-Tris(bromometil)-benceno
puro.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 1 g
(2,82 mmol) de
1,3,5-tris(bromometil)-benceno
en 30 ml de acetona anhidra. A continuación se añaden 1,48 g (22,77
mmol) de azida sódica. La mezcla se refluye durante 8 horas, y se
deja en agitación a temperatura ambiente 12 horas irás. Transcurrido
este tiempo se filtra el sólido sobre celita. El disolvente se
elimina a presión reducida. El sólido obtenido se disuelve en
CH_{2}Cl_{2}, se lava con 3 x 15 mL de agua. Se seca con sulfato
sódico anhidro. Y el disolvente se destila a presión reducida. El
producto obtenido, 0,68 g (2,80 mmol, 99%) de
1,3,5-tris(azidometil)-benceno
es un aceite amarillo pálido.
Se disuelven 1,38 g (5,68 mmol) de
tris(azidometil)-benceno en 40 mL de etanol
absoluto en un matraz de hidrogenación. A esta disolución se añaden
170 mg de Pd/C al 10% en peso a la mezcla. La mezcla se hidrogena, a
temperatura ambiente, durante 4 horas a 30 mm de Hg de presión. El
Pd/C se filtra sobre celita y el filtrado se destila a presión
reducida obteniéndose 0,63 g (3,82 mmol, 67%) de
1,3,5-tris(aminometil)-benceno
como un aceite amarillo pálido que no necesita posterior
purificación.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 368
mg (1 mmol) del yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamonio,
en 20 ml de metanol absoluto. A esta disolución, en agitación
constante y a temperatura ambiente, se le añaden, gota a gota, 54,4
mg (0.33 mmol) de
1,3,5-tris(aminometil)-benceno
disueltos en 30 ml de metanol absoluto. La adición se realiza en
atmósfera inerte (Argón). Una vez acabada se deja a temperatura
ambiente en agitación durante 15 h. Transcurrido este tiempo, se
observa la formación de un precipitado blanco esponjoso. Se le añade
15 mL de pentano y se deja en un baño de agua-hielo.
El precipitado se recupera por centrifugación. El sólido se lava
tres veces con 10 ml de éter dietílico y unas gotas de pentano. Se
seca al vacío una hora, obteniéndose de esta forma 280 mg ( 0,25
mmol, 75%) el triyoduro de
1,3,5-tris[metil-[3-N',N',N'-trimetilamoniopropilamino]-3,4-dioxo-1-ciclobutenil]-benceno,
como un sólido blanco.
Síntesis del receptor en el que:
R_{1} es una sal de amonio
propil-NR_{3}, en el que R es metilo; y
R_{2} es un anillo benceno trisustituido con
metilos
En un matraz de fondo redondo se disuelven 2 g
(4,6 mmol) de
1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trimetilbenceno
en 50 ml de N,N-dimetilformamida (DMF). A continuación se
añaden 2 g (30,8 mmol) de azida sódica. La mezcla se calienta a 80ºC
durante 8 horas, y se deja posteriormente en agitación a temperatura
ambiente durante 12 horas más. Transcurrido este tiempo se añaden 40
ml de éter dietílico, para provocar la precipitación del BrNa. El
precipitado se filtra sobre celita. El filtrado se lava con 5 x 40
mL de agua. Este se seca con sulfato sódico anhidro. Y el disolvente
se destila a presión reducida. El producto sólido obtenido se
recristaliza de acetato de etilo y hexano, obteniéndose 1,44 g (4,43
mmol, 97%) de
1,3,5-tris(azidometil)-2,4,6-trimetilbenceno.
Se disuelven 286 mg (1 mmol) de
tris(azidometil)-2,4,6-trimetilbenceno
en 25 mL de etanol absoluto en un matraz de hidrogenación. Se añaden
30 mg de Pd/C al 10% en peso a la disolución. La mezcla se
hidrogena, a temperatura ambiente durante 4 horas a 30 mm de Hg de
presión. El Pd/C se filtra sobre celita y el filtrado se destila a
presión reducida, obteniéndose 207 mg (1,73 mmol, 100%) de
1,3,5-tris(aminometil)-2,4,6-trimetilbenceno
como un sólido amarillo pálido que no necesita posterior
purificación.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 368
mg (1 mmol) del yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,
4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamonio,
en 20 ml de etanol. A esta disolución, en agitación constante y a
temperatura ambiente, se le añaden, gota a gota, 69 mg (0,33 mmol)
de
1,3,5-tris(aminometil)-2,4,6-trimetilbenceno
disueltos en 20 ml de etanol. La adición se realiza en atmósfera
inerte (Argón). Una vez acabada se deja a temperatura ambiente en
agitación durante 15 h. Pasado este tiempo, se observa la formación
de un precipitado blanco que se recupera por centrifugación. El
sólido se lava dos veces con 10 mL de etanol frío y después dos
veces irás con 10 mL de éter dietílico, se seca al vacío durante 1
h, obteniéndose de esta manera 297 mg (0, 254 mmol, 76%) del
triyoduro de
1,3,5-tris[metil-[3-N',N',N'-trimetilamoniopropilamino]-3,4-dioxo-1-ciclobutenil]-2,4,6-trimetilbenceno
como un sólido marrón pálido.
Síntesis del receptor en el que:
R_{1} es una sal de amonio
propil-NR_{3}, en el que R es metilo; y
R_{2} es un anillo benceno trisustituido con
etilos.
Se añade lentamente a temperatura ambiente, 19,9
g (87,5 mmol) de bromuro de zinc a una mezcla de paraformaldehído
(16,7 g, 556,3 mmol) y trietilbenceno (10 mL, 53,1 mmol) en 100 mL
de HBr/AcOH (30% en peso). La mezcla se calienta a reflujo a 90ºC
durante 17 horas, observándose durante este tiempo la formación de
cristales blancos. El crudo de reacción se deja enfriar a
temperatura ambiente, separándose el sólido formado por filtración.
El sólido se lava con agua, y se seca al vacío durante una noche. De
esta forma se obtiene 22,79 g (51,7 mmol, 97%) de
1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trietilbenceno
como un sólido blanco.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 0,2 g
(0,45 mmol) de
1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trietilbenceno
en 12 ml de N,N-dimetilformamida (DMF). A continuación se
añaden 0,2 g (3,08 mmol) de azida sódica. La mezcla se calienta a
80ºC durante 8 horas, y se deja en agitación a temperatura ambiente
12 horas más. Transcurrido este tiempo se añaden 20 ml de éter
dietílico, para provocar la precipitación del BrNa. El crudo se
filtra sobre celita. El filtrado se lava con 5 x 40 mL de agua. Se
seca con sulfato sódico anhidro. Y el disolvente se destila a
presión reducida. El producto obtenido se recristaliza de acetato de
etilo y hexano, obteniéndose 0,14 g, (0,43 mmol, 94,3%) de
1,3,5-tris(azidometil)-2,4,6-trietilbenceno.
Se disuelven 605 mg (1,8 mmol) de
tris(azidometil)-2,4,6-trietilbenceno
en 35 mL de etanol absoluto en un matraz de hidrogenación.
Añadiéndose 61 mg de Pd/C al 10% en peso a la mezcla. La mezcla se
hidrogena durante 4 horas a 30 mm de Hg de presión. El Pd/C se
filtra sobre celita y el filtrado se destila a presión reducida
obteniéndose 430 mg (1,73 mmol, 95%) de
1,3,5-tris(aminometil)-2,4,6-trietilbenceno
como un sólido amarillo pálido que no necesita posterior
purificación.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 0.66
g (2.9 mmol) de
N,N-dimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamina,
en 20 ml de etanol. A esta disolución, en agitación constante, se le
añaden gota a gota 0,22 g (0.89 mmol) de
1,3,5-tris(aminometil)-2,4,6-trietilbenceno
disueltos en 20 ml de etanol. La adición se realiza en atmósfera
inerte (Argón). Una vez acabada se deja a temperatura ambiente en
agitación durante 15 h. Pasado este tiempo, se observa la formación
de un precipitado, que se recupera por filtración. El sólido se lava
con etanol frío 2 x 10 ml y se seca al vacío durante una hora,
obteniéndose de esta manera 0.44 g (0,56 mmol, 66%) de
1,3,5-tris-[(3-aminometil)-4-(2-N,N-dimetilaminopropilamino)-3-ciclobuteno-l,2-diona]-2,4,6-trietilbenceno
como un sólido blanco.
En un matraz de fondo redondo se disuelven a
temperatura ambiente, 758 mg (0,96 mmol) de
1,3,5-tris-[(3-aminometil)-4-(2-N,N-dimetilaminopropilamino)-3-ciclobuteno-1,2-diona]-2,4,6-trietilbenceno
en 40 mL de N,N-dime-
tilformamida (DMF). A continuación se añaden 60 mL de acetona. Con la ayuda de una microjeringa se añaden 162 microlitros (2,6 mmol) de yoduro de Metilo. La disolución se mantiene a reflujo durante 8 h en atmósfera de argón. Observándose que medida que se calienta la mezcla el sólido se va disolviendo. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se enfría el matraz en un baño de agua-hielo para provocar la precipitación del sólido. El sólido se aísla por centrifugación, y se lava dos veces con 10 mL de acetona, y se seca al vacío durante 1 hora, obteniéndose de esta forma 456 mg (0,37 mmol, 39%) del triyoduro de 1,3,5-tris[metil-[3-N',N',N'-trimetilamoniopropilamino]-3,4-dioxo-1-ciclobutenil]-2,4,6-trietilbenceno como un sólido blanco.
tilformamida (DMF). A continuación se añaden 60 mL de acetona. Con la ayuda de una microjeringa se añaden 162 microlitros (2,6 mmol) de yoduro de Metilo. La disolución se mantiene a reflujo durante 8 h en atmósfera de argón. Observándose que medida que se calienta la mezcla el sólido se va disolviendo. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se enfría el matraz en un baño de agua-hielo para provocar la precipitación del sólido. El sólido se aísla por centrifugación, y se lava dos veces con 10 mL de acetona, y se seca al vacío durante 1 hora, obteniéndose de esta forma 456 mg (0,37 mmol, 39%) del triyoduro de 1,3,5-tris[metil-[3-N',N',N'-trimetilamoniopropilamino]-3,4-dioxo-1-ciclobutenil]-2,4,6-trietilbenceno como un sólido blanco.
Síntesis del receptor en el que:
R_{1} es una sal de amonio
propil-NR_{3}, en el que R es metilo; y
R_{2} es una poliamina.
En un matraz de fondo redondo se disuelven 368
mg (1 mmol) del yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobutenil)-propilamonio,
en 20 ml de metanol. A esta disolución, en agitación constante y a
temperatura ambiente, se le añaden, gota a gota, 45,3 mg (0,33 mmol)
de tris(2-aminoetil)amina (tren)
disueltos en 15 ml de metanol, en atmósfera de argón. A
continuación, se deja en agitación a temperatura ambiente durante 12
h. Pasado este tiempo, se observa la formación de un precipitado
blanco. Se elimina el disolvente a presión reducida. El sólido se
lava tres veces con 10 mL de éter dietílico, se seca al vacio,
obteniéndose de esta manera 282 mg (0,253 mmol, 82%) de triyoduro de
N,N,N-tris[[3-N',N',N'-trimetilamoniopropilamino]-3,4-dioxo-1-ciclobutenil]-tris(2-aminoetil)amina.
Las isotermas se han obtenido con un
microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
C_{3}-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el folato (es decir,
adicionando el folato sobre el receptor y no a la inversa), a una
temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor como el sustrato
se encuentran disueltos en agua que contiene un 25% de tampón 1M de
TRIS:HC1 (pH =9), en una concentración aproximadamente de
2,06x10^{-3} M de receptor y 18,24x10^{-3} M de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n que se muestran en la Tabla 1.
Que corresponden a las Figuras 1A y 1B.
Las isotermas (correspondientes a las figuras 2A
y 2B) se han obtenido con un microcalorímetro isotermo (ITC) de la
marca Microcal Inc., por valoración directa entre el receptor de
fórmula (I) en donde R_{1} es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el metotrexato (es
decir, adicionando el metotrexato sobre el receptor y no a la
inversa), a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor
como el sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25%
de tampón 1M de TRIS:HC1 (pH =9), en una concentración
aproximadamente de 1,03x10^{-3} M de receptor y 8,76x10^{-3} M
de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpía de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n que se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
Las isotermas (no mostradas) se han obtenido con
un microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el pemetrexed (es
decir, adicionando el pemetrexed sobre el receptor y no a la
inversa), a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor
como el sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25%
de tampón 1M de TRIS:HC1 (pH = 9), en una concentración
aproximadamente de 1,01x10^{-3} M de receptor y 8,85x10^{-3} M
de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n. Se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
Las isotermas (no mostradas) se han obtenido con
un microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el raltitrexed (es
decir, adicionando el raltitrexed sobre el receptor y no a la
inversa), a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor
como el sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25%
de tampón 1M de TRIS:HC1 (pH = 9), en una concentración
aproximadamente de 1,08x10^{-3} M de receptor y 9,45x10^{-3} M
de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n. Se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
Las isotermas (no mostradas) se han obtenido con
un microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el citrato (es
decir, adicionando el citrato sobre el receptor y no a la inversa),
a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor como el
sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25% de
tampón 1M de TRIS:HC1 (pH = 9), en una concentración aproximadamente
de 1,91x10^{-3} M de receptor y 1,8x10^{-2} M de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n. Se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
Las isotermas (no mostradas) se han obtenido con
un microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el tricarballato (es
decir, adicionando el tricarballato sobre el receptor y no a la
inversa), a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor
como el sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25%
de tampón 1M de TRIS:HCl (pH = 9), en una concentración
aproximadamente de 1,05x10^{-3} M de receptor y 9,45x10^{-3} M
de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso,
K_{a}, el valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la
entropía, \DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría
de la complejación, el parámetro n. Se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
Las isotermas (no mostradas) se han obtenido con
un microcalorímetro isotermo (ITC) de la marca Microcal Inc., por
valoración directa entre el receptor de fórmula (I) en donde R_{1}
es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y el trimesoato (es
decir, adicionando el trimesoato sobre el receptor y no a la
inversa), a una temperatura estabilizada de 21ºC. Tanto el receptor
como el sustrato se encuentran disueltos en agua que contiene un 25%
de tampón 1M de TRIS:HCl (pH = 9), en una concentración
aproximadamente de 1,14x10^{-3} M de receptor y 9,84x10^{-3} M
de sustrato.
Para ello se adicionan un total de 250
microlitros de disolución de sustrato a 1,8 ml de disolución de
receptor, en alícuotas de 6 microlitros cada una. Los datos
obtenidos de esta forma se ajustan mediante el modelo de interacción
1:1 del programa Microcal Origin (Delta H). Con este ajuste se
obtienen los valores de la constante de asociación del proceso, el
valor de la entalpia de reacción, \DeltaH, y de la entropía,
\DeltaS, así como la confirmación de la estequiometría de la
complejación, el parámetro n. Se muestran en la Tabla 1 más
adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar esta determinación se preparan
tres disoluciones "madre", la primera con
4(5)-carboxifluoresceina, la segunda con el
receptor de fórmula (I) en donde R_{1} es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3}, y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y finalmente otra con
el folato. La tres disoluciones se preparan con agua purificada con
un 25% de tampón HC1/TRIS
(tris(hidroximetil)aminometano)) 1M de pH = 9. La
disolución que contiene la carboxifluoresceina es 2,88x10^{-5} M.
La disolución que contiene el receptor es 6,26x10^{-4} M y la
disolución que contiene el folato es de 444 ppm. A partir de estas
disoluciones madre se preparan otras cuatro disoluciones de la
siguiente manera:
Se mezclan 3 ml de la disolución de
carboxifluoresceina con 1 ml de agua purificada 25% tampón,
obteniendo una concentración final de 2,16x10^{-5} M. Esta
disolución se utiliza para calibrar la intensidad de emisión irá
xima de fluorescencia, que se calibra a 7,2 unidades de
fluorescencia.
Se prepara una segunda disolución a partir de 3
ml de disolución de carboxif luoresceina con 0,5 ml de disolución de
receptor y 0,5 ml de agua con 25% de tampón, obteniendo
concentraciones finales de 2,16x10^{-5} M de carboxifluoresceina y
de 6,26x10^{-5} M de receptor.
La tercera disolución se prepara a partir de 3
ml de disolución de carboxifluoresceina, 0,5 ml de disolución de
receptor y 0,5 ml de disolución del folato, obteniendo
concentraciones finales 2,16x10^{-5} M de carboxifluoresceina,
6,26x10^{-5} M de receptor y 55,5 ppm de folato.
Finalmente, la cuarta disolución se prepara a
partir de 3 ml de disolución de carboxifluoresceina, 0,5 ml de
disolución de receptor y 0,5 ml de disolución de muestra
desconocida, obteniendo concentraciones finales de 2,16x10^{-5} M
de carboxif luoresceina y de 6,26x10^{-5} M de receptor.
Para preparar la disolución de la muestra
comercial (acfol®) se procede de la siguiente manera:
Se suspende una pastilla que contiene 5 mg de
ácido fólico (acfol®) en 25 ml de una mezcla de agua purificada con
un 25% de tampón TRIS/HCl 1M. Tratando la suspensión en un baño de
ultrasonidos durante 10 minutos. La suspensión resultante se
centrifuga a 7.000 rpm/min durante 10 minutos. El líquido
sobrenadante se trasvasa a un matraz aforado de 25 ml enrasando con
agua Millipore con un 25% de tampón TRIS/HCl 1M.
Las disoluciones anteriores así preparadas se
dejan envejecer un mínimo de 2 horas. Finalizado este tiempo se mide
la fluorescencia observada, longitud de onda de excitación 450 nm,
longitud de onda de emisión 525 nm.
Para obtener la recta de calibrado se valora la
disolución que contiene solo la
4(5)-carboxifluoresceína y el receptor con la
disolución que contiene la
4(5)-carboxifluoresceína y el receptor, y el
folato. La lectura de cada punto se realiza tres veces, (véase la
Figura 3).
La obtención de la concentración de la muestra
desconocida se obtiene a partir de la lectura de la intensidad de la
cuarta disolución, que contiene la
4(5)-carboxifluoresceína, receptor y muestra
desconocida, calculándola a partir de la recta de calibrado (Figura
3) la concentración de folato en ppm. El valor obtenido, 4,6 mg, es
la media aritmética de tres medidas independientes siendo el error
relativo de un 8%.
Para realizar esta determinación se preparan
tres disoluciones "madre", la primera con
4(5)-carboxifluoresceína, la segunda con el
receptor de fórmula (I) en donde R_{1} es una sal de amonio
propil-N(CH_{3})_{3} y R_{2} es
un anillo de benceno trisustituido con etilos y finalmente otra con
el metotrexato. La tres disoluciones se preparan con agua purificada
con un 25% de tampón HCl/TRIS
(tris(hidroximetil)aminometano)) 1M de pH = 9. La
disolución que contiene la carboxif luoresceina es 2,72x10^{-5} M.
La disolución que contiene el receptor es 5,13x10^{-4} M y la
disolución que contiene el metotrexato es de 438 ppm. A partir de
estas disoluciones madre se preparan otras cuatro disoluciones de la
siguiente manera:
Se mezclan 3 ml de la disolución de
carboxifluoresceina con 1 ml de agua purificada 25% tampón,
concentración final 2,05x10^{-5} M. Esta disolución se utiliza
para calibrar la intensidad de emisión máxima de fluorescencia, que
se calibra a 7,2 unidades de fluorescencia.
Se prepara una segunda disolución a partir de 3
ml de disolución de carboxifluoresceina con 0,5 ml de disolución de
receptor y 0,5 ml de agua con 25% de tampón, obteniendo
concentraciones finales 2,05x10^{-5} M de carboxif luoresceina y
6,42x10^{-5} M de receptor.
La tercera disolución se prepara a partir de 3
ml de disolución de carboxifluoresceina, 0,5 ml de disolución de
receptor y 0,5 ml de disolución del metotrexato, obteniendo
concentraciones finales de 2,05x10^{-5} M de carboxif luoresceina,
6,42x10^{-5}: M de receptor y 54,7 ppm de metotrexato.
Finalmente, la cuarta disolución se prepara a
partir de 3 ml de disolución de carboxifluoresceina, 0,5 ml de
disolución de receptor y 0,5 ml de disolución de muestra
desconocida, obteniendo concentraciones finales de 2,05x10^{-5} M
de carboxif luoresceina y 6,42x10^{-5} M de receptor.
Para preparar la disolución de la muestra
comercial (metoject®) se procede de la siguiente manera:
Se diluyen en un matraz aforado 120 microlitros
(1,2 mg) de la muestra en 10 ml de agua purificada con un 25% de
tampón TRIS/HCl 1M.
Las disoluciones anteriores así preparadas se
dejan envejecer un mínimo de 2 horas. Finalizado este tiempo se mide
la fluorescencia observada, longitud de onda de excitación 450 nm,
longitud de onda de emisión 525 nm.
Para obtener la recta de calibrado se valora la
disolución que contiene sólo la
4(5)-carboxifluoresceina y el receptor con la
disolución que contienen la
4(5)-carboxifluoresceina y el receptor, y el
metotrexato. La lectura de cada punto se realiza tres veces. (Véase
la Figura 4).
La obtención de la concentración de la muestra
desconocida se obtiene a partir de la lectura de la intensidad de la
cuarta disolución, que contiene la
4(5)-carboxifluoresceina, receptor y muestra
desconocida, calculándola a partir de la recta de calibrado (Figura
4) la concentración de metotrexato en ppm. El valor obtenido, 1,37
mg, es la media aritmética de tres medidas independientes siendo el
error relativo de un 12%.
Claims (12)
1. Compuesto tripodal de base escuaramida de
fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R_{1} es una sal de amonio alquil
C_{3}-C_{5}-N(CH_{3})_{3};
y
R_{2} se selecciona, independientemente entre
sí, de un anillo benceno no sustituido; un anillo benceno
trisustituido con radicales, iguales o diferentes entre sí,
seleccionados entre metilo o etilo; y una poliamina.
2. Compuesto tripodal de base escuaramida según
la reivindicación 1, en el que R_{1} es una sal de amonio
propil-NR_{3}.
3. Procedimiento para la obtención del compuesto
según la reivindicación 1 ó 2 que comprende las etapas de:
Etapa A
A1) reacción de escuarato de etilo con
N,N-dimetil-alquilen-C_{3}-C_{5}
diamina para obtener un producto (a1) que es
N,N-dimetil-N'-(2-etoxi-3,4-dioxo-1-
ciclobutenil)-alquil C_{3}-C_{5}
amina;
A2) reacción de (a1) con yoduro de metilo para
obtener el yoduro de
N,N,N-trimetil-N'-(2-etoxi-3,
4-dioxo-1-ciclobutenil)-alquil
C_{3}-C_{5} amonio (a2).
Etapa B
B1) reacción de
1,3,5-tris(bromometil)-benceno,
donde el benceno puede estar sustituido por radicales iguales o
diferentes entre sí seleccionados entre metilo o etilo, con
NaN_{3} para obtener el correspondiente producto (b1) que es
1,3,5-tris(azidometil)-benceno
(o el correspondiente benceno sustituido);
B2) hidrogenación catalítica de (b1) para
obtener el correspondiente
1,3,5-tris(aminometil)-benceno
(o el correspondiente benceno sustituido) (b2).
Etapa C
C) reacción del producto obtenido (a2) con el
producto obtenido (b2) para producir el compuesto de fórmula general
(I); o alternativamente, reacción del producto (b2) con (a1) y
posterior reacción con CH_{3}I para producir el compuesto de
fórmula general (I);
en el que si se desea obtener el compuesto de
fórmula general (I) con R_{2} = poliamina, el producto obtenido
(a2) reacciona directamente con
tris(2-aminoetil)amina sin pasar por
las etapas B y C.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que alquilen C_{3}-C_{5} y alquil
C_{3}-C_{5} corresponden a radicales propileno y
propilo, respectivamente.
5. Sistema quimiosensor para la detección
cualitativa y/o cuantitativa en muestras acuosas de policarboxilatos
seleccionados del grupo que consiste en dicarboxilatos y
tricarboxilatos, que comprende:
a) un compuesto receptor según la reivindicación
1 ó 2;
y
b) un indicador fluorescente.
6. Sistema quimiosensor según la reivindicación
5 en el que el indicador fluorescente se selecciona del grupo que
consiste en fluoresceinas, Eritrosina, Eosina, Rosa de Bengala y
Floxina.
7. Procedimiento para la detección de
policarboxilatos seleccionados del grupo que consiste en
dicarboxilatos y tricarboxilatos, que comprende las etapas de:
- a)
- disolución de la muestra en una solución tamponada a pH 9 que contiene el sistema quimiosensor según la reivindicación 5 ó 6;
- b)
- observación de la fluorescencia después de por lo menos una hora.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el
que dicha muestra es sólida, que comprende adicionalmente una etapa
de pretratamiento de la muestra que consiste en la solubilización de
la muestra sólida en una disolución tamponada a pH 9 por irradiación
con ultrasonidos durante por lo menos 15 minutos, centrifugación y
obtención de un líquido sobrenadante que se utilizará en dicha etapa
a).
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
en el que dicha detección es cuantitativa y comprende adicionalmente
las siguientes etapas:
- c)
- medición de la fluorescencia observada;
- d)
- correlación entre dicha fluorescencia observada y la concentración de dichos policarboxilatos en el analito.
10. Kit que comprende el sistema quimiosensor
según las reivindicaciones 5 ó 6.
11. Sistema quimiosensor según las
reivindicaciones 5 ó 6, procedimiento según las reivindicaciones 7 a
9 o kit según la reivindicación 10, en los que los dicarboxilatos
son folato o ara logos del mismo seleccionados del grupo que
consiste en:
- ácido
N-[4-[2-(2-amino-4-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)etil]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil]-2-propin-1-ilamino]benzil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(1,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
(2S)-[[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-sulfo-L-Glutámico;
- ácido
(2S)-[5-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]-1,3-dihidro-1-oxo-2H-isoindol-2-il]-pentanodioico;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-1,4,5,6-tetrahidro-5-metil-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-(3-amino-1,2,5,6,6a,7-hexahidro-1-oxoimidazo[1,5-f]pteridin-8(9H)-il)benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]formilamino]benzoil]-L-Glutámico;
- dihidrógeno fosfato de
N-[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]-L-homoserina;
- ácido
N-[[5-[2-[(6R)-2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il]etil]-2-tienil]carbonil]-L-Glutámico;
- sal cálcica (1:1) del ácido,
N-[4-[[(2-amino-5-formil-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[2-[(6R)-2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il]etil]benzoil]-L-Glutámico;
-
3-amino-8-[4-[[[(1S)-1,3-dicarboxipropil]amino]carbonil]fenil]-1,2,5,6,(6aR),7-hexahidro-1-oxo-imidazo[1,5-f]pteridinio;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido,
N-[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(1,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-6-il)metil]metilamino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
(2S)-[[4-[[(2-amino-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-sulfo-butanoico;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4,7,8-tetrahidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-[4-[[(2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-L-\gamma-glutamil-L-glutámico;
- ácido
2-[[4-[[(2-amino-1,4-dihidro-4-oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metil]amino]benzoil]amino]-4-fosfono-butanoico;
- ácido
N-[4-[2-(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxo-6-quinazolinil)etil]benzoil]-L-Glutámico;
- ácido
N-(4-aminobenzoil)-L-Glutámico;
- Metotrexato;
- Pemetrexed; y
- Raltitrexed.
12. Sistema quimiosensor según la reivindicación
11, procedimiento según la reivindicación 11 o kit según la
reivindicación 11, en los que los dicarboxilatos son folato,
metotrexato, pemetrexed o raltitrexed.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES200930022A ES2345809B1 (es) | 2009-03-31 | 2009-03-31 | Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso de obtencion, sistemaquimiosensor que lo contiene y procedimiento para la deteccion de policarboxilatos. |
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| ES200930022A ES2345809B1 (es) | 2009-03-31 | 2009-03-31 | Compuesto tripodal de base escuaramida, proceso de obtencion, sistemaquimiosensor que lo contiene y procedimiento para la deteccion de policarboxilatos. |
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-
2009
- 2009-03-31 ES ES200930022A patent/ES2345809B1/es active Active
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|---|
| A FRONTERA et al., Journal Organic Chemistry 2006, vol. 71 páginas 7185-7195. "{}Rational design, synthesis and application of a new receptor for the molecular recognition of tricarboxylate salts in aqueous media"{}, todo el documento. * |
| R PROHENS et al., Tetrahedron Letters 1998, vol. 39, páginas 1063-1066. "{}Squaramido-based receptors: molecular recognition of carboxylate anions in highly competitive media"{}. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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