ES2345319T3 - Screening de las condiciones de cristalizacion de polimorfos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar el polimorfismo de por lo menos un análito, que comprende proporcionar un conjunto de composiciones en un medio de soporte sólido, comprendiendo el medio de soporte sólido una pluralidad de celdas independientes, comprendiendo cada una de dichas composiciones por lo menos un análito, y provocando o permitiendo cada composición adoptar por lo menos una primera condición que posiblemente influya en la cristalización de las composiciones que se encuentran en las celdas con el medio de soporte sólido, y detectando cualquier cristalización en por lo menos una composición, determinando los espectros de difracción por rayos X en geometría de difracción de la transmisión en las celdas en las que se ha realizado la cristalización, comparando los espectros de difracción por rayos X e identificando de este modo cualquier polimorfo del análito.
Description
Screening de las condiciones de cristalización
de poliformos.
La presente invención se refiere a unos
procedimientos para formas cristalinas (polimorfos) de análitos que
utilizan, por ejemplo, un procedimiento y un aparato para screening
del comportamiento de fase, más particularmente el comportamiento
de la cristalización en fase líquida, de gel o sólida de dichos
análitos, tales como moléculas orgánicas, por ejemplo compuestos de
interés farmacéutico y complejos, oligómeros, sales, ésteres y
solvatos de los mismos, moléculas organometálicas tales como
catalizadores para catálisis homogéneas, etc. La presente invención
se refiere asimismo a la detección en paralelo de transiciones de
fase, más específicamente la cristalización, de dichos
análitos.
La presente invención proporciona asimismo unos
procedimientos para producir cristales de análitos a cualquier
escala pretendida utilizando las condiciones identificadas según la
presente invención. Se proporciona, además, la utilización de los
cristales y las composiciones que comprenden dichos cristales. Se
pueden utilizar asimismo los cristales de análitos según la
presente invención para recoger información sobre la estructura de
análitos, más particularmente con respecto a la existencia de
polimorfismo cristalino. La presente invención proporciona un
procedimiento para la determinación rápida de polimorfismo
cristalino.
En general se considera la cristalización como
la separación o precipitación fuera de un medio líquido. El
planteamiento básico de la cristalización es habitualmente muy
sencillo. La molécula a cristalizar se disuelve o suspende y a
continuación se somete a unas condiciones que afectan a la
solubilidad de la molécula de la disolución. Ello se puede realizar
mediante la eliminación del disolvente o mediante la adición de
otros compuestos que reducen la solubilidad, opcionalmente en
combinación con la variación de otros factores tales como la
temperatura, la presión o la fuerza de la gravedad. Cuando las
condiciones son las correctas, se formarán unos núcleos pequeños a
partir de los que crecerán los cristales. Sin embargo, generalmente
no se comprende bien la relación entre las condiciones y la
cristalización. La optimización de las condiciones de cristalización
se basa en gran medida en procedimientos empíricos. La
determinación de las condiciones de cristalización óptimas para
ello puede resultar un proceso laborioso y lento.
Muchas moléculas pueden cristalizar en distintas
formas cristalinas, un fenómeno conocido como polimorfismo. El
aspecto de dichas distintas formas cristalinas depende en gran
medida del medio físico y químico en el que el cristal forma un
núcleo, crece o se expone tras el crecimiento. Las distintas formas
cristalinas proceden de las diferentes condiciones en las que se
realiza la cristalización. Sin embargo, no existe un marco teórico
significativo que permita predecir de un modo fiable si existen o se
pueden esperar unas formas polimórficas específicas de una molécula
y, en caso afirmativo, cuántas se pueden producir de las mismas. La
identificación del comportamiento polimórfico de las moléculas y la
determinación de las condiciones en las que se pueden obtener las
distintas formas polimórficas de las mismas se ha de realizar
experimentalmente, un proceso lento y laborioso.
Una vez que el material se encuentra en forma
cristalina, se puede obtener una información valiosa con respecto a
la estructura tridimensional de la molécula. Además, se puede
obtener información valiosa a partir de distintas formas
cristalinas de las moléculas. Por ejemplo, distintas formas
polimórficas pueden expresar distintos comportamientos de
disolución o incluso expresar distintas propiedades por lo que se
refiere a su actividad biológica.
Muchas moléculas farmacéutica y/o
industrialmente importantes tales como fármacos o catalizadores
para catálisis homogéneas son sólidos una temperatura ambiente. Con
frecuencia dichas moléculas cristalizan en distintas formas
estructurales, presentando de este modo un comportamiento
polimórfico. Por lo tanto, resulta interesante obtener información
del comportamiento de cristalización de dichos compuestos.
El comportamiento de cristalización de un
compuesto viene determinado principalmente por su estereoquímica.
Esta comprende obviamente su pauta de enlaces covalentes así como su
estructura iónica tal como se determina mediante la presencia de
contraiones disponibles en la red cristalina. Aparte de su
constitución cristalina, otros parámetros externos afectan asimismo
a la cristalización de compuestos orgánicos tales como la
concentración del compuesto en la disolución madre, la
hidrofobia/polaridad de los disolventes, la temperatura, la
velocidad de formación de los cristales (nucleación), la presión y
muchos otros.
Debido a este gran número de parámetros que
afectan a la cristalización, la determinación de la combinación
óptima de parámetros tiene como resultado una gran cantidad de
combinaciones posibles. La optimización lineal convencional
(analizar una condición tras otra) basada en procedimientos
empíricos es, por lo tanto un procedimiento largo y engorroso, si
es que resulta factible. Constituye por lo tanto un objetivo de la
presente invención proporcionar unos procedimientos en los que el
análisis de las diversas combinaciones resulte posible y se pueda
realizar eficiente y rápidamente, y preferentemente en paralelo, es
decir analizando diversas combinaciones de parámetros al mismo
tiempo.
La optimización lineal convencional tal como se
ha descrito anteriormente constituye una práctica habitual en la
búsqueda de polimorfos de compuestos orgánicos pequeños. Al realizar
el screening en serie de distintas condiciones por separado y
analizar los resultados, puede obtenerse la información pretendida
en cada uno de los artículos estándar de cristal para laboratorios,
aunque se trata de un proceso lento. La recogida del material
cristalino (por ejemplo en forma de polvo) antes de la
caracterización se realiza habitualmente a mano, de uno en uno.
La presente invención pretende proporcionar
mejoras en la determinación de las condiciones de cristalización en
general y particularmente la determinación del comportamiento
polimórfico. La presente invención pretende además superar las
desventajas mencionadas anteriormente haciendo referencia a las
técnicas convencionales.
Los presentes inventores han descubierto un
procedimiento para el screening de un gran número de condiciones de
cristalización. Además, han diseñado un modo de screening de un gran
número de condiciones de cristalización en paralelo y de
identificación de polimorfos cristalinos.
Se dan a conocer un procedimiento y un aparato
para generar y analizar, preferentemente en paralelo, una pluralidad
de formas cristalinas (polimorfos) de sustancias químicas o de
mezclas de sustancias (el análito) de las que se conoce
preferentemente por lo menos forma cristalina. Con este objetivo se
prepara un conjunto de disoluciones o, por lo menos, una
disolución, por ejemplo en una serie de disolventes o mezclas de
disolventes, o por lo menos un disolvente. Se puede proporcionar el
análito en un sustrato diseñado especialmente, pero puede resultar
suficiente un sustrato convencional tal como una placa de
microvaloraciones siempre que se satisfagan algunas condiciones que
se mencionan a título de ejemplo en diversas formas de realización.
Se cambian las condiciones en las que se mantienen los análitos en
el sustrato, por ejemplo, alterando o modificando condiciones
físicas o químicas tales como mediante una disminución de la
temperatura o permitiendo que se evapore un disolvente. Se puede
provocar la cristalización de los análitos cambiando dichas
condiciones físicas o químicas. Se analiza el material insoluble,
mediante técnicas de difracción por rayos X en geometría de
transmisión. El análisis del material insoluble se realiza en
situ sobre el sustrato. Los espectros de difracción por rayos X
se corrigen y comparan, preferentemente automáticamente. Se
comparan los espectros de distintos análitos, permitiendo de desde
modo la identificación de distintos polimorfos y las condiciones en
las que se forman dichos polimorfos o se convierten a partir de una
forma polimórfica en otra.
La presente invención se refiere, en un aspecto,
a un procedimiento según la reivindicación 1.
Un análito, en el contexto de la presente
invención, es un compuesto del que se ha de determinar el
comportamiento de cristalización. Un análito, en el contexto de la
presente invención, es una sustancia química o una mezcla de
distintas sustancias de las que se conoce por lo menos una forma
cristalina o de las que se espera que exista por lo menos una forma
cristalina. Un análito, en el contexto de la presente invención, es
preferentemente una molécula o compuesto orgánico u organometálico,
tal como una molécula farmacéuticamente activa o un complejo
catalizador - ligando o un dímero, sal, éster o solvato de la misma.
En otro aspecto, un análito, en el contexto de la presente
invención, puede ser asimismo una biomolécula, es decir, ácidos
nucleicos, ADN, ARN APN, polipéptidos, péptidos, glucoproteínas y
otras sustancias proteicas, complejos lipoproteína - ácido nucleico
peptídico, hidratos de carbono, sustancias biomiméticas, etc.
Un modo preferido de realizar el procedimiento
de la presente invención comprende proporcionar un sustrato que
comprende un conjunto de recipientes que opcionalmente se pueden
precintar, presentando dichos recipientes opcionalmente unos medios
para provocar la cristalización, tales como sustancies que alteren o
influyan en el comportamiento de la cristalización tales agentes de
nucleación, depositando unos volúmenes separados de análitos en
forma de sólidos, suspensiones, emulsiones o disoluciones y en los
que la composición de cada recipiente difiere en por lo menos un
aspecto de la composición de por lo menos otro recipiente,
precintando opcionalmente los recipientes con respecto a la
atmósfera, proporcionando opcionalmente a los recipientes una
atmósfera que influyan en comportamiento de cristalización,
permitiendo que se forme el material cristalino, manipulando la
difracción del material cristalino obtenido, por ejemplo retirando
los disolventes o proporcionando el material cristalino en un
material transportador para permitir el análisis de la estructura
cristalina, preferentemente mediante técnicas de difracción por
rayos X, preferentemente determinando automáticamente los espectros
de difracción por rayos X de análitos o composiciones opcionalmente
seleccionados, comparando opcionalmente los espectros de difracción
de los análitos o composiciones, corrigiendo opcionalmente los
espectros de difracción con respecto a las fluctuaciones de fondo,
identificando opcionalmente polimorfos del análito y relacionando
opcionalmente la presencia y la forma cristalina de los polimorfos
con la composición y las condiciones a las que se ha sometido el
análito.
El sustrato es preferentemente químicamente
inerte ante las sustancias y los disolventes utilizados y es
preferentemente transparente a la técnica de detección utilizada,
es decir es transparente a los rayos X con la técnica de difracción
por rayos. El sustrato es asimismo preferentemente transparente al
espectro de luz visible (aproximadamente entre 200 nm y 1000 nm)
para permitir una inspección visual u óptica. El sustrato puede
asimismo preferentemente transmitir calor, permitiendo de este modo
variaciones de temperatura. Los ejemplos de conjuntos de elementos
son de 8 por 12 hasta 32 por 48, con una distancia ortogonal entre
centros que varía entre 2 y 10 mm entre los recipientes o pocillos
del sustrato.
Se realiza la determinación de las formas
polimórficas del análito mediante la tecnología de difracción por
rayos X. Los distintos polimorfos de un análito producen distintos
espectros de difracción. Al determinar los espectros de difracción
en geometría de transmisión a partir de los análitos cristalizados y
comparar dichos espectros de difracción, se obtiene información
sobre las distintas condiciones de cristalización para las
distintas formas cristalinas del análito.
La determinación de las características de
difracción por rayos X de los análitos cristalizados se puede
realizar ventajosamente en el conjunto de recipientes proporcionado
en el que se ha realizado el procedimiento de cristalización (in
situ). En geometría de difracción de la transmisión, el modo de
realización preferido, se necesita que el propio conjunto de
recipientes sea transparente a la difracción por rayos X o que se
determine el espectro de difracción de fondo del conjunto de
recipientes se corrijan los datos obtenidos mediante la difracción
por rayos X del cristal del conjunto de recipientes con respecto a
dicho espectro de fondo. La ventaja de utilizar la geometría de
transmisión con respecto a métodos más convencionales de geometría
de reflexión para los experimentos de difracción, es que se obtiene
sustancialmente más señal por unidad de masa del análito. Por lo
tanto, resulta posible de este modo utilizar unas cantidades en
miligramos, preferentemente nanogramos o picogramos del material y
conseguir todavía un rendimiento mejorado.
La determinación de la existencia de distintos
polimorfos de un análito se puede utilizar para determinar y/o
optimizar las condiciones de conversión de una forma cristalina del
análito en otra forma del análito. Un aspecto ventajoso de la
presente invención se refiere a un procedimiento para optimizar las
condiciones de transformación de una forma polimórfica de un
análito en otra forma polimórfica sometiendo una forma polimórfica
del análito al procedimiento de detección del polimorfismo de la
presente invención.
Según la presente invención, se proporciona
preferentemente una pluralidad de condiciones distintas, difiriendo
cada una de las mismas en por lo menos un parámetro que influye en
el comportamiento de cristalización del análito a cristalizar. En
una forma de realización de la presente invención, las distintas
condiciones pueden ser químicas o físicas. Una condición química
comprende en general distintos tipos (concentraciones de)
disolventes, amortiguadores del pH, precipitantes, sales, etc. Una
condición física se considera desde el punto de vista de la
temperatura, la presión, etc.
Aunque en la técnica se describe generalmente
que se requieren grandes de material para una cristalización
satisfactoria, los presentes inventores han demostrado que se pueden
utilizar cantidades inferiores al microgramo para moléculas
pequeñas (peso molecular aproximadamente inferior a 500 gramos por
mol) y incluso inferiores a 1 nanogramo en el caso de las proteínas
(peso molecular aproximadamente superior a 5000 gramos por mol).
Gracias a los pequeños volúmenes que se pueden utilizar en los
procedimientos según la presente invención, la disponibilidad de
los análitos resulta menos problemática y se realizan fácilmente
análisis de numerosas condiciones y se ajustan fácilmente las
condiciones apropiadas. El procedimiento resulta, por lo tanto,
ventajoso cuando únicamente se encuentran disponibles unas
cantidades muy reducidas del análito, por ejemplo en las primeras
etapas de la inves-
tigación.
tigación.
Las principales ventajas del procedimiento según
la presente invención son que, generalmente, la preparación
automática de los experimentes es más rápida en el caso de volúmenes
pequeños, la detección automática de cristales en un conjunto de
condiciones es más rápida al poder analizar simultáneamente más
muestras, se requiere menos material, reduciendo de este modo
pérdidas, se pueden realizar más pruebas considerando la cantidad
de material disponible, las posibilidades de que las condiciones en
las que se alcanza la cristalización aumentan significativamente y
las probabilidades de identificar distintas formas polimórficas
aumentan del mismo modo.
Un modo preferido de proporcionar un conjunto de
composiciones para determinar las condiciones de cristalización de
análitos consiste en un procedimiento en el que dicho conjunto de
composiciones se proporciona en un medio de soporte sólido que
comprende una pluralidad de celdas independientes, comprendiendo
cada una de las mismas una composición. De este modo, se
proporciona un formato de análisis del tipo conjunto permitiendo una
fácil automatización en la dispensación de composiciones y/o en el
cambio de las condiciones por composición y de detección del
comportamiento del cambio de fase (habitualmente cristalización del
análito). En cualquier formato, la cristalización se puede alcanzar
mejor mediante un cambio adicional de las condiciones permitiendo
cambios en cualquiera de los parámetros mediante la difusión,
evaporación, cambios de temperatura u otras técnicas o procesos y
combinaciones de los mismos. Dichos cambios adicionales de las
condiciones físicas o químicas se pueden aplicar en la presente
invención y muy ventajosamente en el formato del conjunto de
recipientes. Se pueden realizar asimismo cambios adicionales para
ajustar las condiciones de cristalización. Las celdas del soporte
sólido están preferentemente equipadas con unos medios para
controlar la atmósfera de, o justo encima de, las celdas. Con este
objetivo el medio de soporte se equipa, por ejemplo, con unos
dispositivos de cierre hermético o unas sustancias de cierre
hermético que sellan el soporte entero o precintando las celdas
individuales o los grupos de células. Con este objetivo se pueden
disponer bolas, placas, tapas, líquidos inertes tales como el
aceite de parafina, el aceite de silicona, etc.
Se dispone el análito en las celdas del soporte
sólido mediante técnicas que permitan la distribución precisa y
controlada de unas cantidades muy reducidas de materia. Las técnicas
apropiadas son aquellas que permiten la distribución precisa y
controlada de cantidades de líquidos o sólidos del orden de
microlitros o microgramos, preferentemente nanolitros o nanogramos,
más preferentemente picolitros o picogramos. Cuando el análito se
proporciona en cualquier forma líquida, se pueden utilizar
preferentemente técnicas de dispensación tales como técnicas de
dispensación piezoeléctrica, técnicas de dispensación en chorro,
técnicas de dispensación de electropulverización, así como otras
técnicas de microdispensación y submicrodispensación, se utilizan
preferentemente técnicas de nanodispensación. Al utilizar dichas
técnicas de dispensación resulta posible disponer en cada celda una
cantidad determinada de análito. De este modo, resulta igualmente
posible disponer en cada celda una cantidad distinta de
análito.
Se puede utilizar asimismo ventajosamente la
dispensación no direccional de un fluido sobre el sustrato, por
ejemplo cubriendo el sustrato al sumergirlo en un fluido, vertiendo
el fluido sobre el sustrato, u otras técnicas de sumersión.
Cuando se proporciona el análito con algún
transportador, por ejemplo en forma de disolución o emulsión, la
opción preferida es retirar por lo menos parcialmente los
disolventes y/o los otros fluidos transportadores permitiendo o
provocando un cierto grado de evaporación, secado, drenaje,
liofilización u otra técnica de eliminación de fluidos de las
celdas.
A menudo se pretende poder influir en la
velocidad y la duración de los procesos de cristalización, así como
en el tamaño y la distribución de tamaños y homogeneidad y/o pureza
de los cristales resultantes. La presente invención es
particularmente apta para este propósito. Si se pretende de este
modo, se puede diseñar una formación rápida de los núcleos, seguido
por una cristalización lenta en dichos núcleos. Se pueden determinar
las condiciones sobre cómo influir en la velocidad y el crecimiento
y cómo finalizar la cristalización. A continuación, una escala de
producción de cristales, por ejemplo para uso farmacéutico (en
preparaciones farmacéuticas) se puede basar en las condiciones
identificadas según la presente invención. Durante el crecimiento de
los cristales, la convección provocada por la gravedad que se
origina por los gradientes de concentración local que se producen
como resultado de la acreción de moléculas en el cristal en
crecimiento, pueden afectar negativamente al orden cristalino de
dicho cristal. En volúmenes pequeños, dicha convección provocada por
la gravedad es menos importante, ya que junto con la velocidad de
difusión y la velocidad de crecimiento de los cristales, dicha
convección aumenta el tamaño físico del recipiente en el que tiene
lugar la cristalización. Por lo tanto, el presente procedimiento en
general tendrá como resultado unos cristales que están mejor
ordenados que los cristales que han crecido en volúmenes
superiores, que se encuentran sometidos a la gravedad.
Debido a que el procedimiento reduce la
convección provocada por la gravedad durante el crecimiento de los
cristales, el orden cristalino de los cristales producido con el
procedimiento se aproximará al de los cristales de alta calidad que
hayan crecido en el espacio, es decir, en unas condiciones de
microgravedad.
La presente invención proporciona la
determinación de las condiciones de cristalización que permiten el
crecimiento de distintas formas cristalinas del análito,
permitiendo de este modo la identificación de formas polimórficas
del análito. Ésta es una información valiosa, por ejemplo en el caso
de un producto farmacéutico en el que cada uno de los polimorfos
del compuesto farmacéutico de interés pueden presentar propiedades
distintas en lo que se refiere a su actividad biológica. La
autorización oficial de un fármaco específico y bien definido por
parte de la Dirección General de Fármacos y Alimentos de los Estados
Unidos no se puede trasladar a otro polimorfo del mismo fármaco,
aunque la naturaleza química de las moléculas constituyentes sea
idéntica. Resulta, por lo tanto, muy importante descubrir e
identificar los diversos polimorfos de un fármaco a fin de
comprender sus propiedades biológicas. Además, el descubrimiento
temprano de dichos polimorfos de un fármaco resulta asimismo
farmacéuticamente interesante ya que los distintos polimorfos pueden
presentar una actividad biológica distinta, por ejemplo diferencias
de solubilidad.
Una utilización preferida de los cristales
producidos según la presente invención es la determinación de las
estructuras de los análitos. De este modo, la presente invención
proporciona además un procedimiento para determinar la estructura
de un análito que comprende someter los cristales de dicha
composición según la presente invención a técnicas de resonancia
magnética nuclear (NMR) en estado sólido, difracción de neutrones,
difracción de electrones y/o difracción por rayos X y determinar su
estructura cristalina.
Preferentemente, el procedimiento se realiza en
un conjunto de celdas independientes, en el que cada celda contiene
una composición distinta. Cuando se produce un cambio en el
comportamiento de fase, éste se detecta y se puede correlacionar
con la composición específica y las condiciones en las que se está
realizando el screening. Para aumentar la fiabilidad del
procedimiento, se puede proporcionar cada combinación por duplicado
o triplicado en el mismo medio de soporte sólido.
Se conoce que cualquier cristal que no presente
una simetría cúbica cambia la polarización de la luz polarizada
linealmente, en función de su orientación con respecto a la
dirección de polarización de la luz de transiluminación. Dicha
propiedad de los cristales y del biomaterial cristalino
particularmente, se utiliza en la actualidad para determinar e
inspeccionar la calidad de los cristales individuales. Sin embargo,
se puede utilizar asimismo dicha propiedad para determinar la
presencia o ausencia de un cristal de un análito que no sea cúbico.
Cuando se analiza el cambio en la polarización de la luz de
transiluminación, al cambiar la dirección de polarización, se puede
determinar la presencia de material cristalino no cúbico.
Preferentemente, el cambio en comportamiento de fase del análito
está provocado por la formación del material cristalino. Ello
permite la incorporación de una etapa independiente en el
procedimiento de detección del comportamiento polimórfico. Al
determinar en primer lugar la presencia de material cristalino,
disminuye el número de espectros de difracción por rayos X que se
han de grabar. Ello permite aumentar adicionalmente la eficiencia
del procedimiento según la presente invención.
Los cambios en el comportamiento de fase se
pueden determinar de diversos modos, pero para el screening rápido
de una pluralidad de muestras en unas condiciones reproducibles las
técnicas preferidas se basan en la detección o determinación de,
continuamente o intermitentemente, de las características ópticas
y/o de difracción de las celdas individuales.
La determinación de las características ópticas
y/o de difracción de las celdas individuales se puede realizar con
un sistema que comprende:
- -
- una fuente lumínica cuya dirección de polarización se puede variar
- -
- un soporte para
- -
- un sustrato que comprende una pluralidad de celdas
- -
- un sistema para detectar un cambio en la polarización de la luz que procede de una fuente de luz polarizable.
- -
- un detector sensible a la posición.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cambio en la polarización de la luz
corresponde generalmente a un cambio en el comportamiento de fase.
Se prefiere que el cambio en comportamiento de fase se deba
principalmente a un cambio de fase del análito. Un cambio en el
comportamiento de fase que no está provocado por un cambio de fase
del análito puede proporcionar adicionalmente una información útil
y valiosa con respecto al comportamiento de fase del propio análito.
Por ejemplo, si cristaliza una sal cualquiera, mientras la
sustancia de interés continúa siendo soluble, la sustancia de
interés no se puede precipitar a su concentración actual con dicha
sal.
La detección de los cambios de fase se puede
realizar asimismo mediante identificación visual, por ejemplo
utilizando técnicas de microscopía. A continuación se puede
determinar la existencia de polimorfos mediante la técnica descrita
anteriormente.
La presente invención proporciona además como
forma de realización específica un procedimiento para identificar
el comportamiento de cristalización de por lo menos un análito que
comprende las etapas de:
- -
- proporcionar un medio de soporte sólido que comprenda una pluralidad de celdas independientes,
- -
- combinar el análito en cada celda independiente con uno o más componentes distintos, preferentemente de tal modo que la composición total de una celda individual difiera en por lo menos un aspecto de la composición de por lo menos otra celda, realizándose la mezcla de los componentes y los análitos simultáneamente o en secuencia, en cualquier orden;
- -
- modificar opcionalmente las condiciones que provocan cambios en el comportamiento de fase en las composiciones individuales;
- -
- detectar los cambios en el comportamiento de fase, más particularmente en la cristalización, de las composiciones de las celdas independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de acelerar la identificación de las
condiciones ideales, las distintas celdas se pueden comparar
(automáticamente) entre sí.
Naturalmente, el cambio en el comportamiento de
fase de la composición está preferentemente provocado principalmente
por un cambio de fase, más particularmente por la cristalización,
del análito.
Para aumentar cristalización del análito, se
puede proporcionar un núcleo inerte o núcleos inertes para la
cristalización. En una forma de realización, la presente invención
proporciona, por lo tanto, un procedimiento en el que la superficie
del medio de soporte comprende por lo menos un núcleo cristalización
que comprende un cristal inerte, preferentemente en los que los
centros de nucleación se encuentran en forma de cristalitos
pequeños, preferentemente de sales o complejos del análito. En otra
forma de realización la propia naturaleza (cristalina) del sustrato
puede influir en la cristalización del análito.
La iniciación de la cristalización se puede ver
afectada además por una etapa en la que la nucleación se provoque
por agitación, vibraciones, tratamiento con microondas, tratamientos
(ultra)sónicos o una combinación de los mismos.
- Figura 1: Esquema global de la microplaca de
sustrato con 96 recipientes.
- Figura 2: Soporte del filtro.
- Figura 3: Tabla de traslación X - Y en el
difractómetro.
- Figura 4: Espectros de difracción por rayos X
de distintos polimorfos grabados en el conjunto de
microrrecipientes.
- Figura 5: Espectros de difracción de polvo por
rayos X de los polimorfos A, B y C de
F_{5}O_{3}NC_{18}H_{2}.
- Figura 6: Vía utilizada para producir los
polimorfos B y C en masa a partir del polimorfo A de
F_{5}O_{3}NC_{18}H_{2}.
- Figura 7: Micropocillo que contiene un
polimorfo de F_{5}O_{3}NC_{18}H_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un conjunto de microgrupos diseñado
para procesar líquidos orgánicos e inorgánicos a una temperatura y
presión elevadas. Se seleccionaron los materiales para que fueran
tan químicamente inertes como resultara posible, para permitir una
transferencia térmica rápida hacia y desde los compartimientos de
los líquidos. Se preparó con latón una disposición en microplaca
con unas dimensiones exteriores de 127,7 mm por 85,5 mm, que
contenía 96 pocillos, y a continuación se revistió de oro. El
volumen de los micropocillos era aproximadamente de 50 \mul y se
precintaron los pocillos individuales con una junta tórica realizada
de un polímero flexible sintético. Para ello se utilizaron juntas
de Viton®, pero pueden resultar preferibles anillos químicamente
más inertes de Kalrez® o Teflon®. Los pocillos se cerraron cubriendo
las juntas tóricas con una placa de cristal de 4 mm de espesor
(longitud 117 mm, anchura 75 mm). Para inmovilizar la placa de
cristal en la microplaca, se dispone una abrazadera de latón con 16
tornillos pequeños. El formato de la disposición en microplaca se
basa en un tamaño estándar de placa de microvaloración con 96
pocillos. La microplaca de latón se atornilla a un soporte
adaptador de acero inoxidable que se aprieta suavemente con el
elemento calefactor de un alternador térmico de 96 pocillos
comercialmente disponible. (Viton y Kalrez son marcas registradas de
DuPont Dow Elastomers, Teflon es una marca registrada de DuPont
Company).
Los pocillos o recipientes del sustrato se
llenan con cualquier dispositivo de dispensación manual,
semiautomático o automático. Se introduce el análito en disolución,
con lo que se pude evaporar el disolvente. Puede ser importante
filtrar completamente la disolución de dicho análito antes de
introducirla en dichos recipientes. Posteriormente, se pueden
introducir otros componentes o disolventes mediante pipeteo. Si
alguno o todos los análitos presentes en un recipiente no se
disuelve en su medio líquido, se puede elevar la temperatura,
opcionalmente una vez que se ha precintado dicho recipiente, hasta
una temperatura suficientemente elevada para alcanzar la disolución
total.
Se pueden proporcionar opcionalmente unos medios
para cambiar las condiciones del conjunto de recipientes, lo que
tiene como resultado la cristalización del análito. Al cambiar la
temperatura, permitiendo que se evapore el disolvente, o mediante
una combinación de dichos dos procesos, se provoca la cristalización
en paralelo en uno o más de los recipientes de dicho sustrato. Se
proporcionan unos medios de análisis de la cristalinidad y de
identificación de polimorfos en cada una de las fracciones sólidas
del conjunto de recipientes.
Opcionalmente, los materiales sólidos de cada
uno de los recipientes individuales se pueden transferir
simultáneamente a una membrana fina transportadora utilizando uno
de diversos modos. Por ejemplo, Whatman Polyfiltronics ha
desarrollado un sistema para recoger en un filtro simple productos
químicos precipitados procedentes de una placa con 96 pocillos por
filtración, utilizando un sistema especial de aspiración. Se
proporcionan unos medios de análisis automático y de identificación
de las propiedades físicas de los polimorfos del conjunto de
recipientes.
El filtro opcional se monta en un sistema de
traslación X - Z, tal como el fabricado por Altechna Co. Ltd.,
(Vilnius, Letonia) que se dispone en un difractómetro de rayos X,
tal como un generador FRG-391 de Nonius (Delft,
Países Bajos). Los espectros de difracción por rayos X (polvo de
transmisión) se pueden registrar en un detector de áreas, tal como
el detector de imágenes en placas de MAR-345 de MAR
Research GmbH (Hamburgo, Alemania). Se registran los espectros de
difracción por rayos X de cada uno de los concentrados que
permanecen en el filtro. Una vez que ha finalizado la exposición de
un concentrado, la tabla de traslación X-Z desplaza
el siguiente concentrado hasta la posición de exposición. Se
analizan y se comparan las imágenes de la difracción por rayos X.
Las fluctuaciones de fondo, debidas a, por ejemplo, irregularidades
del filtro, se pueden eliminar de las imágenes de la difracción
antes de comparar entre sí los espectros observados.
A continuación se proporciona un ejemplo de
aplicación de la técnica descrita:
Un compuesto químico simple
(F_{5}O_{3}NC_{18}H_{2}, peso molecular: 393,36) se analizó
con respecto a sus condiciones de cristalización y su polimorfismo,
utilizando un ciclo simple de calentamiento y enfriamiento en una
muestra que consistía en 16 composiciones de distintos disolventes.
Los espectros de difracción de los distintos polimorfos se
identificaron automáticamente utilizando un procedimiento de
correlación cruzada. La muestra completa comprendía 6 subconjuntos
idénticos. Los polimorfos identificados se indican en la tabla
I.
En algunos de los recipientes no se pudo
identificar polimorfo alguno. Ello se puede deber a la ausencia de
cristalinidad y/o la cantidad muy reducida de material cristalino
presente. De los 73 compuestos clasificados, según su difracción
por rayos X, únicamente dos pocillos contenían material que
no era polimorfo del material original (polimorfo A). Los
espectros de difracción por rayos X de los tres polimorfos se
proporcionan en la figura 4. En resumen, resulta posible producir y
detectar polimorfos en volúmenes pequeños. Es posible relacionar
las condiciones del proceso con la formación del polimorfo
pretendido. Se obtuvo información adicional a partir de screening
adicionales explorando el diagrama de fases con un mayor detalle
para encontrar unas condiciones de proceso optimizadas.
Se obtuvieron dos polimorfos B y C a partir del
material original, el polimorfo A, utilizando distintas vías. La
formación del polimorfo B se realizó tras disolver el polimorfo A en
agua a una temperatura de 120ºC y una presión elevada. Ésta parece
ser una estructura intermedia y se pueden utilizar diversas vías
para obtener el polimorfo C en masa. Los espectros de difracción
por rayos X de los tres polimorfos se proporcionan en la figura 5.
En resumen, tanto B como C se pueden producir en masa utilizando
distintas vías tal como se representa en la figura 6. La masa de
los polimorfos A y C se determinó mediante espectrometría de masas
ESI y ambas masas resultaron coherentes con la composición química
tal como se encuentra documentada. Se puede descartar que el
polimorfo B o C sean productos de degradación, ya que C se puede
producir a partir de A puro pasando por el intermedio B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La composición del screening con los 16
disolventes se repitió seis veces en cada conjunto de 96
pocillos.
Claims (22)
1. Procedimiento para detectar el polimorfismo
de por lo menos un análito, que comprende proporcionar un conjunto
de composiciones en un medio de soporte sólido, comprendiendo el
medio de soporte sólido una pluralidad de celdas independientes,
comprendiendo cada una de dichas composiciones por lo menos un
análito, y provocando o permitiendo cada composición adoptar por lo
menos una primera condición que posiblemente influya en la
cristalización de las composiciones que se encuentran en las celdas
con el medio de soporte sólido, y detectando cualquier
cristalización en por lo menos una composición, determinando los
espectros de difracción por rayos X en geometría de difracción de
la transmisión en las celdas en las que se ha realizado la
cristalización, comparando los espectros de difracción por rayos X
e identificando de este modo cualquier polimorfo del análito.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el conjunto proporcionado de composiciones contiene por lo
menos un análito en una forma polimórfica y en el que, mediante la
comparación de los espectros de difracción por rayos X y la
identificación de cualquier otro polimorfo del análito, se
determinan y/u optimizan las condiciones de la transformación de
una forma polimórfica de un análito en otra forma polimórfica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que cada elemento de dicho conjunto de composiciones difiere en
por lo menos una condición de cualquier otra composición de dicho
conjunto.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicha por lo menos una condición comprende una condición
física.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicha por lo menos una condición comprende una condición
química.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, que
comprende además cambiar por lo menos una condición adicional tras
exponer la composición a dicha primera condición.
7. Procedimiento según la reivindicación 3, que
comprende además identificar las condiciones en las que se obtienen
el tamaño y la homogeneidad pretendidos de los análitos.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho análito es una molécula
orgánica pequeña, un compuesto organometálico, un catalizador, una
sal de una molécula orgánica o un compuesto farmacéuticamente
activo o una biomolécula.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la composición presenta un
volumen inferior a 1000, preferentemente inferior a 100, más
preferentemente inferior a 10 microlitros.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición total de una celda individual difiere en por
lo menos un aspecto de la composición de por lo menos otra celda y
en el que se detectan los cambios en comportamiento polimórfico de
las composiciones en las celdas independientes determinando la forma
cristalina del análito.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
que comprende además una etapa en la que la composición de la celda
se modifica adicionalmente.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el análito se proporciona en
forma de un estado cristalino o agregado, disolución, emulsión o
suspensión.
13. Procedimiento según la reivindicación 10 a
12, en el que la superficie del medio de soporte comprende por lo
menos un núcleo cristalización que comprende un cristal inerte.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que las celdas presentan un volumen
o se llenan hasta un volumen total de como máximo 1000,
preferentemente como máximo 100, más preferentemente como máximo 10
microlitros.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que las celdas contienen como máximo
100, preferentemente como máximo 10, más preferentemente como máximo
1 microgramo del análito.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, en el que el cambio en el comportamiento
de la cristalización del análito comprende la formación de material
cristalino del análito.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que la formación de material cristalino del análito comprende la
formación de por lo menos una forma polimórfica del material
cristalino.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17, en el que el material cristalino del
análito comprende cocristales de dos o más análitos o de un análito
con una molécula pequeña, tal como una sal o un solvato.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, que comprende además una etapa en la que
se provoca la nucleación mediante la adición de centros de
nucleación, por agitación, vibraciones, tratamiento con microondas,
tratamientos (ultra)sónicos o una combinación de los
mismos.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que los centros de nucleación se encuentran en forma de
cristalitos pequeños.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que los cristalitos pequeños son sales o complejos del
análito.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que el análito y/o componentes se
añaden a las celdas mediante técnicas de dispensación
piezoeléctrica, técnicas de dispensación en chorro, técnicas de
dispensación de electropulverización, técnicas de microdispensación
y nanodispensación, o sumersión o combinaciones de las mismas.
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