ES2344185B1 - Uso de una secuencia nucleotidica que regula el momento de la floracion, plantas que la expresan y metodo para producirlas. - Google Patents
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Abstract
Uso de una secuencia nucleotídica que regula el
momento de la floración, plantas que la expresan y método para
producirlas.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de un alga
verde unicelular, Chlamydomonas reinhartii, que es expresada
en una célula vegetal procedente de una planta capaz de producir
flores. La expresión de la secuencia se utiliza para modificar el
momento de la floración de una planta que comprende las células
vegetales transfectadas. Asimismo, la presente invención se refiere
a un método para producir las células y/o las plantas de la
invención.
Description
Uso de una secuencia nucleotídica que regula el
momento de la floración, plantas que la expresan y método para
producirlas.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de un alga
verde unicelular, Chlamydomonas reinhartii, que es expresada
en una célula vegetal procedente de una planta capaz de producir
flores. La expresión de la secuencia se utiliza para modificar el
momento de la floración de una planta que comprende las células
vegetales transfectadas. Asimismo, la presente invención se refiere
a un método para producir las células y/o las plantas de la
invención.
La transición floral es un proceso de desarrollo
crucial para las plantas porque el tiempo en que se reproducen
determina el éxito del individuo y su descendencia. Para
desencadenar la transición floral, las plantas deben coordinar la
respuesta a diferentes señales externas e internas para poder
inducir la expresión de los genes que disparan la transición del
meristemo apical de vegetativo a reproductivo (Bäurle et al.,
2006. Cell 125: 655-664). El control de
CONSTANS (CO) a nivel transcripcional y
postraduccional, es central para la vía del fotoperiodo, una de las
rutas más conservadas para la regulación de la transición floral
(Kobayashi y Weigel. 2007. Genes Dev. 21:
2371-2384).
La transcripción de CO en la planta
modelo Arabidopsis thaliana se controla mediante el reloj
circadiano y el fotoperiodo, lo que induce una mayor abundancia del
ARN mensajero de CO durante la fase diurna en un día largo de verano
que en un día corto de invierno (Suárez-López et
al., 2001. Nature 410: 116-1120). Estos
ritmos estacionales y diarios de los niveles del transcrito de CO se
regulan por una ruta genética que incluye a los genes GIGANTEA,
FLAVIN-BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX
1 y CYCLIN DOF FACTOR 1 (Sawa et al., 2007.
Science 318: 261-265). La acumulación diurna
de CO está influenciada por la luz, bajo el control del sistema de
los fitocromos (Valverde et al., 2004. Science 303:
1003-1006) y se degrada por el proteasoma durante la
noche mediante la ubiquitina ligasa CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1
(COP1), un regulador clave del desarrollo fotomorfogénico de
plántulas (Jang et al., 2008. EMBO J. 27:
1277-1288). Estos ciclos diurnos y nocturnos de
degradación de CO, junto a la regulación circadiana y estacional de
la expresión del ARN mensajero de CO hacen que CO se active
durante la tarde de un día largo. CO activo produce la expresión del
integrador floral FT en el floema foliar y la proteína FT se
mueve desde las hojas hasta el meristemo apical (Corbesier et
al., 2007. Science 316: 1030-1033). Una
vez en el meristemo apical, FT, junto al factor de transcripción FD,
induce la expresión de los integradores florales APETALA1,
SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1 (SOC1),
LEAFY y, eventualmente de los genes homeóticos florales que
controlan el desarrollo de los órganos florales.
El módulo CO-FT está ampliamente
distribuido en fanerógamas y gimnospermas y constituye uno de los
elementos regulatorios más conservados en la inducción de la
floración (Böhlenius et al., 2006. Science 312:
1040-1043). En todas las plantas terrestres,
incluyendo el musgo Physcomitrella (Zobell et al.,
2005. Plant Biol. 7: 266-275) y la licofita
Selaginella (este trabajo), existen genes homólogos a
CO (CO-likes o COLs), pero no
se encuentran en bacterias, hongos, y animales (Robson et
al., 2001. Plant J. 28: 619-631). Sin
embargo, con la excepción de algunos genes de plantas superiores
como HEADING DATE 1 (HD1) en arroz, (PnCO) en
Pharbitis nil o recientemente el de remolacha
(BvCOL.1), ningún gen COL de la línea evolutiva de
plantas ha podido complementar la mutación co de
Arabidopsis y por tanto mostrar una función en la transición
de fase vegetativa a floral. La proteína COL1, de
Arabidopsis, con un porcentaje de similaridad de un 85% con
respecto a CO, no tiene la misma función que CO ya que no consigue
complementar al mutante co (Ledger et al., 2001. Plant
J. 26: 15-22). Intentos previos han fracasado a
la hora de demostrar la presencia de un ortólogo verdadero de
CO en el musgo Physcomitrella (Zobell et al.,
2005. Plant Biol. 7: 266-275).
Chlamydomonas reinhardtii es un alga
verde unicelular que se usa como organismo modelo dada su facilidad
de transformación, su potente genética, su versatilidad metabólica y
su genoma haploide, cuya secuencia completa fue recientemente
liberada (Merchant et al., 2007. Science 318:
245-251). Ciertos procesos como la fototaxia, el
crecimiento sincrónico y la acumulación de almidón se regulan
mediante el reloj circadiano en Chlamydomonas (Mittag et
al., 2005. Plant Physiol. 137: 399-409)
En ésta y otras microalgas verdes el crecimiento se sincroniza con
el ciclo celular en determinados fotoperiodos, de manera que la
mayor parte de la población de un cultivo se compondrá, en un
momento determinado, de células en el mismo estadio de división
(Bizova et al., 2005. Plant Physiol. 137:
475-491). Se conoce un mutante de
Chlamydomonas (roc66) que exhibe un periodo algo más
amplio en su ritmo de crecimiento que el alga silvestre (Matsuo
et al., 2008. Genes Dev. 22: 918-930).
Además, se ha demostrado que el reloj circadiano puede permitir la
entrada en ciclo celular en Chlamydomonas (Goto y Johnson,
1995. J. Cell Biol. 129:1061-1069) y que el
fotoperiodo tiene también una enorme influencia en esta señal y en
la progresión del ciclo celular en Ostreococcus tauri, otra
microalga verde (Moulager et al., 2007. Plant Physiol.
144:1360-1369).
El adelanto de la producción de los frutos puede
suponer una ventaja comercial. La búsqueda de herramientas genéticas
que permitan aproximar la floración lo más posible a un determinado
tiempo dentro del ciclo de cultivo, que haga coincidir la
recolección del fruto con la época más adecuada de mercado, puede
suponer un aumento del rendimiento en la producción de los cultivos
experimentados.
La presente invención se refiere a una secuencia
de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos del
alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii que es
transfectada en una célula vegetal procedente de una planta capaz de
producir flores. La expresión del gen se utiliza para modificar el
momento de la floración de una planta que comprende las células
vegetales que expresan la citada secuencia.
La secuencia SEQ ID NO: 1 y la secuencia
aminoacídica de la proteína CONSTANS (CO) de Arabidopsis
thaliana tienen una identidad de un 27% y la identidad con otras
proteínas COL procedentes de plantas es de entre 20 y 30%. La baja
identidad no hace pensar a priori en un posible uso
relacionado con la función de las proteínas citadas, sobre todo,
tendiendo en cuenta que proteínas como COL1, cuyo gen pertenece al
mismo genoma de Arabidopsis thaliana, tiene una identidad de
un 85% con la proteína CO y sin embargo, no desempeña la misma
función que CO, ya que parece no conseguir complementar la función
de esta proteína en plantas de Arabidopsis thaliana mutantes
para CO (plantas co).
Por tanto, no se puede deducir, dado el bajo
porcentaje de identidad mencionado anteriormente, que la secuencia
SEQ ID NO: 1 sea funcionalmente equiparable a CO, como demuestra el
hecho de que pueda complementar la mutación co e incluso
promover floración temprana en Arabidopsis. La planta
utilizada para llevar a cabo los experimentos de complementación e
inducción de adelanto en la floración, Arabidopsis thaliana
se ha venido utilizando como planta modelo en innumerables procesos
biotecnológicos demostrando que los resultados obtenidos son
extrapolares a cualquier otra especie de planta, especialmente los
procesos conservados en el reino vegetal como es el caso de la
regulación de la floración por medio de la proteína CO. La
transformación de esta planta se ha empleado a modo de ejemplo
porque las técnicas de transformación y seguimiento de la expresión
de los genes recombinantes están optimizadas.
De los resultados obtenidos en la presente
invención no deben conducir a un análisis ex
post-facto, ya que del porcentaje de identidad
de un 27% de SEQ ID NO: 1 respecto de CO no se desprende un
resultado presumible que haga pensar en un posible uso de SEQ ID NO:
1 para acelerar la floración de cualquier planta ya que solamente
llevando a cabo la transformación de dicha secuencia en el genoma de
la planta se puede comprobar el resultado en la floración. En
definitiva, la identidad de los genes no hace obvia la funcionalidad
de SEQ ID NO: 1.
La aplicación del uso de la secuencia SEQ ID NO:
1 de la presente invención en diferentes plantas cuyo fruto tenga
interés comercial, puede suponer un adelanto sustancial de la
floración y como consecuencia, puede adelantar la producción de los
frutos, lo que supone una ventaja comercial respecto de los frutos
producidos por plantas que no comprendan la proteína de la presente
invención. Por otra parte, la estimulación del adelanto de la
floración en los cultivos de plantas permitiría, en principio,
intentar aproximar la floración lo más posible a un determinado
tiempo dentro del ciclo de cultivo, que haga coincidir la posterior
recolección del fruto con la época más adecuada de mercado, en una
zona geográfica concreta. A menudo esto se concreta en el aumento de
rendimiento en la producción de los cultivos experimentados.
En este sentido, el primer aspecto de la
presente invención es el uso de un ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia
aminoacídica con al menos un 90% de identidad con la secuencia SEQ
ID NO: 1, para regular el momento de floración de una planta.
La secuencia SEQ ID NO: 1 es una secuencia
aminoacídica codificada por una secuencia nucleotídica presente en
el genoma del alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El
ácido nucleico aislado comprende al menos una secuencia nucleotídica
que codifica o bien una secuencia con al menos un 90% de identidad
con SEQ ID NO: 1 o bien que codifica para SEQ ID NO: 1. En estos
aspectos de la presente invención, el ácido nucleico aislado puede
ser la secuencia nucleotídica codificante (ADNc), como es el caso de
SEQ ID NO: 14, o secuencias nucleotídicas con o sin intrones, por
tanto queda incluida la secuencia de ADN genómico que codifica para
SEQ ID NO: 1 (en adelante se harán referencia a las secuencias
nucleotídicas como; secuencias nucleotídicas de la presente
invención o de la invención). Es decir, incluyen secuencias de ácido
nucleico cuyo producto de la transcripción, el ARN mensajero (ARNm)
codifica para la misma secuencia de aminoácidos (en adelante,
secuencia de aminoácidos de la presente invención o secuencia de
aminoácidos de la invención). También se incluyen secuencias
variantes degeneradas de las secuencias nucleotídicas de la
invención, cuyo producto es una proteína con la misma función que la
proteína codificada por la secuencia SEQ ID NO: 1. También se
incluyen secuencias de aminoácidos que tengan modificaciones en su
extremo N-terminal, C-terminal y/o
en alguna posición aminoacídica interna de modo que la función de la
proteína sea la misma que la que resulta de la traducción de la
secuencia de ARNm transcrita a partir de la secuencia de nucleótidos
de la invención. La secuencia de aminoácidos puede estar codificada
por cualquier secuencia nucleotídica que de lugar a cualquiera de
las secuencias de aminoácidos de la invención. Debido a que el
código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser
codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma
secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas
secuencias de nucleótidos.
Las secuencias aminoacídicas con, al menos, un
90% de identidad con SEQ ID NO: 1 son secuencias homologas de otros
organismos o algas unicelulares donde la proteína que codifican
tiene una función idéntica a la proteína codificada por el citado
gen. Las secuencias homologas se refieren a secuencias de especies
distintas con expresiones fenotípicas similares que proceden de una
secuencia ancestral común. Dentro de la homología de secuencia se
distinguen dos tipos de homología: la ortología y la paralogía. Las
secuencias ortólogas pertenecen a especies que tienen un antepasado
común. Las secuencias parálogas son aquellas que se encuentran en el
mismo organismo y una procede de la duplicación de la otra. En este
aspecto de la presente invención, se consideran todas las secuencias
homologas, tanto ortólogas como parálogas, que tienen, al menos, un
90% de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Del
mismo modo, quedan incluidas todas aquellas secuencias cuyo producto
de la transcripción es idéntico a la secuencia de aminoácidos de la
presente invención.
Una realización preferida es el uso de un ácido
nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica una secuencia aminoacídica de un alga verde con al menos un
50% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.
La identidad de la secuencia SEQ ID NO: 1,
procedente de Chlamydomonas reinhardtii con respecto a
secuencias aminoacídicas de otras algas verdes, como por ejemplo,
pero sin limitarse, Volvox, es de alrededor de un 60%, por
tanto, en esta realización de la presente invención se incluye
cualquier ácido nucleico aislado que comprende una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica,
procedente de un alga verde, con al menos un 50% de identidad con
respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.
Otra realización preferida de la presente
invención es el uso de un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica la secuencia aminoacídica SEQ ID
NO: 1 para regular el momento de floración de una planta.
Tal como se describe en el apartado de ejemplos
de la presente invención, la floración de plantas modelo de
Arabidopsis thaliana que han sido transformadas con una
secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de aminoácidos
de la invención, son capaces de adelantar la floración respecto de
plantas control que no contienen la secuencia SEQ ID NO: 1. Por
tanto, la secuencia SEQ ID NO: 1 regula el momento de la floración
de una planta. El término "regulación del momento de floración"
se refiere a cambios del instante en el que se produce la
transformación del meristemo apical vegetativo en meristemo floral,
es decir, de la floración. Preferiblemente la secuencia de ácido
nucleico de la invención se usa para adelantar el momento de la
floración de una planta.
Otro aspecto más de la presente invención es el
uso de un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según
cualquiera de los aspectos anteriores (en adelante, vector de la
invención) para regular el momento de floración de una planta.
El término "vector" se refiere a un
fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un
determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de
vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido
fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de
ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención,
el vector puede comprender cualquiera de las secuencias descritas
según los aspectos anteriores que, fusionadas al mismo puede
replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser
plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir
otro tipo de vectores que se correspondan con la definición
realizada de vector.
Un aspecto más es el uso de una célula
transfectada con el vector de la invención que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia aminoacídica
SEQ ID NO: 1 (en adelante, célula de la invención) para regular el
momento de floración de una planta.
El término "célula" tal como se entiende en
la presente invención hace referencia a una célula procariótica o
eucariótica. La célula puede ser una bacteria capaz de replicar un
ADN ajeno transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de
la especie Escherichia coli o una bacteria capaz de
transferir el ADN de interés al interior de una planta como por
ejemplo Agrobacterium tumefaciens. Preferiblemente, la célula
hace referencia a una célula eucariótica vegetal y dentro de este
grupo, más preferiblemente, a aquellas células pertenecientes al
reino Plantae. Así pues, en el caso de que la célula sea
vegetal, el término célula comprende, al menos, una célula del
parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o
indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un
protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).
El término "transfección" hace referencia a
la introducción de material genético externo en células mediante
plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de
transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término
transformación se prefiere para describir las transferencias
no-virales de material genético en bacterias y
células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
Una realización preferida es el uso de la célula
de la invención que comprende cualquier producto de la expresión del
ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia aminoacídica
SEQ ID NO: 1.
El término "producto de la expresión" tal
como se entiende en la presente invención hace referencia a
cualquier producto resultante de la expresión de la secuencia de
nucleótidos según cualquiera de los aspectos anteriores. Así pues,
como producto resultante de la expresión de la secuencia se
entiende, por ejemplo, el ARN que se obtiene de la transcripción de
la secuencia, el ARN procesado, la proteína resultante de la
traducción del ARN o posteriores modificaciones de la secuencia
nucleotídica en el interior de la célula siempre que la secuencia
resultante tenga su origen en la secuencia original transferida.
Otra realización preferida es el uso según
cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores donde el ácido
nucleico aislado está unido funcionalmente a una secuencia
reguladora de la expresión génica.
El ácido nucleico de la presente invención se
une por su extremo 3' a una secuencia reguladora de la expresión
génica. En la presente invención, el término "secuencia reguladora
de la expresión génica" hace referencia a una secuencia de ácidos
nucleicos que tenga efecto sobre la funcionalidad de la secuencia de
ácido nucleico de la invención en lo que se refiere al comienzo de
la transcripción de la secuencia de ADN o al inicio de traducción de
la secuencia de ARN u otras secuencias no descritas. A modo de
ejemplo, entre las secuencias reguladoras de la expresión génica
contempladas en la presente invención están los promotores y otras
menos comunes como determinados intrones.
Según una realización preferida, la secuencia
reguladora de la expresión génica es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:
3.
La secuencia SEQ ID NO: 2 hace referencia a la
secuencia del promotor CaMV 35S, que produce una expresión
constitutiva del gen al que precede en cualquier tejido de la
planta. La secuencia SEQ ID NO: 3 hace referencia a parte de la
secuencia reguladora de la expresión génica del gen SUC2, que
codifica para una proteína transportadora de sacarosa. Esta
secuencia provoca que el gen que precede sea expresado en las
células acompañantes o células de compañía del tejido vascular del
floema.
Según otra realización preferida, la planta a
cuya regulación del momento de la floración se hace referencia según
cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores, pertenece a
la especie Arabidopsis thaliana. Según otra realización
preferida la planta pertenece a la especie Solanum
lycopersicum.
Otro aspecto de la presente invención es una
célula aislada transfectada con un ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia
aminoacídica con al menos un 90% de identidad con la secuencia SEQ
ID NO: 1.
El término "transfección" hace referencia a
la introducción de material genético externo en células mediante
plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de
transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término
transfección para métodos no-virales es usado en
referencia a células eucarióticas de mamífero, mientras que el
término transformación se prefiere para describir las transferencias
no-virales de material genético en bacterias y
células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas. En el
caso de la presente invención, el término transfección es
equivalente al término transformación.
Según una realización preferida, la célula
comprende una secuencia nucleotídica de un alga verde que codifica
una secuencia aminoacídica con al menos un 50% de identidad con la
secuencia SEQ ID NO: 1.
Otra realización preferida es una célula aislada
transfectada con un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica la secuencia aminoacídica SEQ ID
NO: 1.
En adelante, se hará referencia a las células
anteriores como las células de la invención o las células de la
presente invención.
El término "célula aislada" hace referencia
a una célula que se obtiene de cualquier tipo de cultivo
microbiológico (por ejemplo, pero sin limitarse, E. coli o
Agrobacterium tumefaciens) o tejido vegetal. Preferiblemente
la célula es una célula eucariótica procedente de una planta que es
capaz de producir flores. Así pues, el término célula comprende, al
menos, una célula del parénquima, célula meristemática o de
cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se
incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que
carece de pared celular). La célula vegetal comprende la secuencia
SEQ ID NO: 1 de forma estable o de forma transitoria.
Otro aspecto más de la presente invención es una
planta que comprende la célula de la invención. Según una
realización preferida, la planta pertenece a la especie
Arabidopsis thaliana. Según otra realización preferida la
planta pertenece a la especie Solanum lycopersicum. En
adelante, haremos referencia a estas plantas mediante el término,
las plantas de la invención o las plantas de la presente
invención.
El término "planta" engloba cada una de las
partes de la misma, que pueden ser conservadas o cultivadas de forma
aislada o en combinación, así como el germoplasma. El germoplasma
queda definido por aquel material biológico que contiene la
variabilidad genética intraespecífica o por los materiales genéticos
que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo
(ver más adelante semillas, propágulos o progenie). La planta debe
comprender la célula de la presente invención de forma que se
exprese en un tejido específico (en un momento concreto del
desarrollo vegetativo o dependiendo de las condiciones ambientales
en donde se desarrolla) o de forma constitutiva o de forma ectópica
(que se expresa en otras células o tejidos diferentes de las
habituales y esperadas).
Teniendo en cuenta que la proteína codificada
por la secuencia de la presente invención desempeña de forma
sorprendente una función que restituye la función del gen CO
de plantas de Arabidopsis thaliana cuyo gen CO se ha
eliminado de la secuencia genómica (mutante co), es de
suponer, que la transferencia e inserción, en el lugar adecuado, de
las secuencias de la invención a cualquier especie de planta donde
el producto obtenido de las secuencias anteriores tenga la misma
secuencia aminoacídica, origine como resultado plantas que expresan
de forma funcional estas secuencias, que desempeñan la misma función
que el gen intrínseco CO de dichas plantas. En este sentido,
preferiblemente, la planta se selecciona de las familias de plantas
de la lista que comprende, pero sin limitarse, familia Poaceae,
Fabaceae, Lauraceae, Chenopodiaceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae,
Apiaceae, Solanaceae, Asteraceae, Annonaceae, Ebenaceae, Moraceae,
Cactaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae, Fabaceae, Rutaceae, Vitaceae,
Actinidiaceae, Bromeliaceae, Musaceae, Fagaceae, Betulaceae,
Juglandaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Oleaceae o
Capparaceae.
Preferiblemente, la planta de la familia
Cucurbitaceae se selecciona, pero sin limitarse, de los
géneros Cucurbita, Cucumis, Citrullus o Lagenaria.
Preferiblemente, la planta de la familia
Solanaceae se selecciona, pero sin limitarse, de los géneros
Solanum o Capsicum. Preferiblemente la planta del
género Solanum se selecciona, pero sin limitarse, de las
especies S. tuberosum, S. lycopersicum o S. melongena.
Más preferiblemente la planta es de la especie S.
lycopersicum. Preferiblemente la planta del género
Capsicum se selecciona, pero sin limitarse, de las especies
C. angulosum, C. annuum, C. pendulum o C. minimum.
Preferiblemente, la planta de la familia
Rosaceae se selecciona, pero sin limitarse, de las
subfamilias Rosoideae, Maloideae o Prunoideae.
Preferiblemente, la planta de la familia
Rutaceae se selecciona, pero sin limitarse, del género
Citrus. Más preferiblemente la planta es C. aurantium, C.
nobilis, C. grandis, C. limetta, C. limón, C. medica o C.
paradisi.
La planta de la invención puede contener
cualquiera de las secuencias de la invención en homocigosis,
heterocigosis o hemicigosis.
La planta de la invención puede conseguirse por
transformación genética de células vegetales mediada por biolística,
Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra técnica que
permita la integración de cualquiera de las secuencias de la
invención en el ADN de la planta, ya sea éste genómico,
cloroplástico o mitocondrial seguida de un programa de regeneración
in vitro adecuado a las características y necesidades de la
especie vegetal transformada. Asimismo, la planta también puede
conseguirse por transferencia de cualquiera de las secuencias de la
invención por cruzamiento, es decir, empleando polen de la planta de
la invención para polinizar cualquier otra planta que no contenga
cualquiera de las secuencias de la invención o polinizando los
gineceos de plantas que contengan cualquiera de las secuencias de la
invención con otro polen de plantas que no contengan estas
secuencias. Los métodos para conseguir la planta de la invención no
se limitan exclusivamente a los métodos descritos en este párrafo.
Asimismo también se incluye la planta que comprende la célula de la
presente invención de forma estable o de forma transitoria.
Polen, semilla, propágulo, progenie o parte de
la planta que procede de cualquiera de las plantas descritas en la
presente invención.
En la presente invención se tiene en cuenta el
polen como transmisor de los caracteres genéticos y fenotípicos, que
puede llevarse a cabo por la polinización de cualquier variedad
vegetal compatible con el polen al que se hace referencia. De este
modo se consigue una planta que comprende cualquiera de las
secuencias de la presente invención y, tras los respectivos cruces
y/o selecciones, se puede obtener una planta en la que la secuencia
se integra de forma estable (aunque también pueden expresarse de
forma transitoria) y en un número de copias adecuado para obtener
los mismos caracteres deseables en las posteriores generaciones.
Los propágulos son partes de la planta que
permiten la propagación o reproducción asexual en vegetales, por la
que se obtienen nuevas plantas u órganos individualizados. Los
tejidos de la porción separada deben recuperar la condición de
meristemos para producir todo el conjunto de órganos de la planta.
El propágulo se selecciona, pero sin excluir, de la lista que
comprende estolones, rizomas, tubérculos o bulbos.
El término "progenie" hace referencia al
resultado de la reproducción, es decir, el individuo o individuos
producidos mediante la intervención de uno o más individuos
parentales. Por ejemplo, la progenie de las plantas, obtenida
mediante reproducción sexual, son las semillas, sin embargo la
progenie de una planta puede ser cualquier célula resultante de la
fusión de cualquier contenido celular, plasto, compartimento
celular, ADN o cualquiera de sus combinaciones. En los procesos de
división celular (como por ejemplo en el cultivo in vitro) la
progenie son las células resultantes de la división.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para la obtención de la célula de la invención, que
comprende:
- a.
- insertar la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 en un vector,
- b.
- transformar una célula con el vector obtenido según el apartado (a) y
- c.
- seleccionar la célula transformada según el apartado (b) que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1.
La inserción de cualquiera de las secuencias de
la invención en un vector se puede llevar a cabo por medio de los
métodos de clonación que forman parte del conocimiento general
común, mediante corte de las secuencias y el vector con enzimas de
restricción y su posterior ligación, de forma que la secuencia del
vector integre la secuencia de la invención seleccionada. El vector
ha sido definido en un párrafo anterior.
La selección del vector que comprende la
secuencia de la invención escogida, puede llevarse a cabo mediante
técnicas como;
- -
- Selección de células que contengan los vectores de la invención mediante la adición de antibióticos al medio de cultivo. La resistencia de estas células a sustancias como los antibióticos está producida por la síntesis de moléculas codificadas por una secuencia contenida en la secuencia del vector.
- -
- Digestión con enzimas de restricción mediante las cuales se obtenga un fragmento de alguna de las secuencias de la invención insertada en el vector.
- -
- Detección de un gen indicador presente en el vector de transformación, cuya presencia en la planta indica la presencia de las secuencias de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La célula se obtiene de cualquier tipo de
cultivo microbiológico (por ejemplo E. coli o
Agrobacterium tumefaciens) o tejido vegetal.
La transformación genética de las células se
lleva a cabo por medio de técnicas que forman parte del conocimiento
general común, como por ejemplo, electroporación, transformación
genética mediada por biolística, Agrobacterium tumefaciens o
cualquier otra técnica que permita la integración de cualquiera de
las secuencias de la invención en el ADN de la célula. Mediante
estas técnicas se consigue introducir, de forma estable, un vector
que incluye cualquiera de las secuencias de la invención, de forma
que, tras sucesivas divisiones de la célula, la secuencia
incorporada sigue expresándose. También se incluyen las células que
comprenden cualquiera de las secuencias de la invención de forma
transitoria.
La célula transformada con un vector que incluye
cualquiera de las secuencias de la invención puede incorporar la
secuencia en alguno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial
y/o cloroplástico (en este caso se suele insertar una secuencia de
ADNt que contiene, entre otras secuencias, cualquiera de las
secuencias de la invención), o, permanecer como parte de un vector
que posee su propia maquinaria para autoreplicarse. La selección de
la célula que ha incorporado cualquiera de las secuencias de la
invención se lleva a cabo por medio de la adición de antibióticos al
medio de cultivo que suministra nutrientes a las mismas. La
resistencia de estas células a sustancias como los antibióticos está
producida por la síntesis de moléculas codificadas por una secuencia
contenida en la secuencia del vector o del ADNt del vector. También
se puede seleccionar la célula que comprende SEQ ID NO: 1 mediante
cualquier otra técnica que permita discriminar su presencia o
ausencia y/o su expresión.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para obtener la planta de la invención que comprende:
- a.
- regenerar al menos una planta procedente de la célula obtenida según el apartado (c) del método anterior,
- b.
- seleccionar una o varias plantas regeneradas según el apartado (d) que expresa, al menos, la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 y
- c.
- seleccionar una o varias plantas obtenidas según el apartado (b) que presenta un adelanto de la floración respecto de una planta control.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células seleccionadas, si son vegetales,
pueden someterse a un programa de organogénesis o embriogénesis
somática mediante el cual, tras la desdiferenciación de las mismas
mediante una combinación adecuada de hormonas vegetales y otros
compuestos, se da lugar a una planta completa que contiene el
material genético de la célula original de la que procede. Además
son necesarias condiciones de luz y temperatura idóneas para cada
especie vegetal. Las células vegetales son totipotentes, es decir,
contienen una copia íntegra del material genético de la planta a la
que pertenece sin importar su función o posición en ella, y por lo
tanto tiene el potencial para regenerar una nueva planta completa.
Una vez que se ha regenerado la planta procedente de la célula
vegetal seleccionada, se lleva a cabo un análisis de la presencia
y/o de la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica para
SEQ ID NO: 1 o de cualquier otra secuencia de la presente invención
(secuencia promotora, etc...).
El método comprende, además, la selección de una
planta que presenta un adelanto o retraso de la floración respecto
de un control. Preferiblemente se seleccionan las plantas que
presentan un adelanto de la floración respecto de las plantas
control. Las plantas control son plantas que no contienen la
secuencia de la invención que codifica para la secuencia
aminoacídica SEQ ID NO: 1. Preferiblemente las plantas control
contienen el resto de la secuencia del ADN de transferencia del
vector que se ha empleado para insertar la secuencia nucleotídica de
la invención en la célula vegetal. El control también puede ser una
planta tipo salvaje cuyo material vegetal procede de las plantas
transformantes (que comprenden la secuencia nucleotídica que
codifica para SEQ ID NO: 1), antes de ser transformadas, que ha
pasado por los mismos pasos de cultivo in vitro que las
plantas de la invención o que no ha pasado por estos pasos de
cultivo.
Según otra realización preferida, la secuencia
nucleotídica que codifica para la secuencia SEQ ID NO: 1, está unida
funcionalmente a una secuencia reguladora de la expresión génica. La
secuencia reguladora de la expresión génica determina, tal como se
ha descrito anteriormente, el tejido vegetal en el que se expresan
las secuencias de la invención y/o el momento en el que se
expresan.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Figura
1
- A.
- La estructura del gen se dedujo de las ESTs y amplificaciones por PCR utilizando ADNc de molde Parte superior y la secuencia genómica predecible según Chlamydomonas genome database (abajo).
- B.
- Relaciones evolutivas de proteínas CO y COL de la rama evolutiva de las plantas. La distancia del árbol está dibujada a escala, con las longitudes de las ramas en las mismas unidades que las distancias evolutivas usadas para inferir el árbol filogenético. Las relaciones evolutivas representan 1000 réplicas. Los principales grupos resultantes están marcados. Los asteriscos (*) indican valores boostrap del 95% de confianza.
Figura
2
En adelante, la secuencia aminoacídica que
codifica para SEQ ID NO: 1 se denominará CrCO y la proteína
para la que codifica se denominará CrCO.
La expresión de CrCO bajo el control del
promotor 35S complementa la mutación co y acelera la
floración.
- A.
- Detección de ARNm de CrCO mediante RT-PCR en plantas recombinantes 35S::CrCO, en plantas en fondo co-8 (Ler) (35S::CrCO #1) o plantas en fondo co-10 (col-0) (35S::CrCO #2). Plantas Wild type (silvestres) col-0 y Ler, así como los mutantes co-8 fueron utilizados como controles negativos.
- B.
- Plantas co-8 y co-10 mutantes, col-0 y 35S::CrCO #2 crecidas en suelo durante 4 semanas en condiciones de día largo (LD). Las plantas son T3 homocigotas.
- C.
- Detección de los niveles de ARNm de FT por RT-PCR en plantas 35S::CrCO incluyendo controles positivos (SUC2::CO y 35S::CO) y negativos (co-8).
- Las plantas fueron crecidas en suelo durante 2 semanas en condiciones de día largo y fueron recogidas al mediodía (ZT 4) y por la tarde (ZT16).
- D.
- Fenotipo de algunas líneas 35S::CrCO.
Figura
3
- A.
- La expresión de CrCO bajo el control del promotor específico de floema SUC2 (SEQ ID NO: 3) acelera la floración en plantas col-0. Si la expresión se dirige mediante el promotor específico de meristemo KNATI, la floración temprana no ocurre. Las plantas mutante co-10, silvestre col-0 y 35S::CO (en fondo col-0) se utilizaron como control.
- B.
- Expresión de CrCO y FT en las mismas plantas que en A.
- C.
- Inmunodetección de la proteína CrCO con anticuerpos específicos para CO en extractos nucleares de plantas col-0, 35S::CO (col-0) y plantas col-0 transformadas con SUC2::CrCO o KNAT1::CrCO. La detección de H3 se usó como control de carga. La flecha indica la banda específica de 45 KDa detectada en plantas 35S::CrCO y SUC2::CrCO.
- D.
- Detección de la fusión YFP:CrCO en núcleos de células epidérmicas de cebolla mediante microscopia confocal.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos que describen la obtención de una secuencia
nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:
1, el método para la producción de células y plantas que la expresan
así como el uso de dicha secuencia para regular el momento de la
floración de las plantas que lo expresan.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis de la expresión génica y
producción de proteínas se crecieron las plantas de Arabidopsis
thaliana en diferentes fotoperiodos en fitotrones con
condiciones controladas de 80% de humedad y 75 \muE/m^{2} de
intensidad de luz. Las plantas de Arabidopsis también se crecieron
en medio sólido MS-agar suplementado con 1% (p/v) de
sacarosa en diferentes fotoperiodos en un fitotrón
SG-1400 (Radiber SA, España) a 65 \muE/m^{2} de
intensidad de luz. Las estirpes silvestre 21 gr, el mutante de pared
celular CW15 y las líneas transgénicas de C. reinhardtii se
crecieron en recipientes cónicos en agitación o en botellas
cilíndricas aireadas en medio Sueoka o medio TAP en cámaras de
cultivo controladas a 22ºC. Para la inducción del promotor NIA1 se
recogieron por centrifugación algas crecidas hasta fase exponencial
media en medio Sueoka-amonio, se resuspendieron en
medio Sueoka-nitrato y se crecieron en diferentes
condiciones de cultivo. Se emplearon diferentes fotoperiodos desde
condiciones de LD (16:8) hasta SD (8:16) con condiciones de luz de
30 \muE/m^{2} (baja intensidad) o 100 \muE/m^{2} (alta
intensidad).
\vskip1.000000\baselineskip
En adelante, la secuencia aminoacídica que
codifica para SEQ ID NO: 1 se denominará CrCO y la proteína
para la que codifica se denominará CrCO.
Se analizaron varios clones de la colección de
ADNc del Centro de ADN de Kazusa para obtener la ORF completa de
CrCO. La secuenciación de cuatro de estos ADNc (AV628196;
Av628285; AV629179; AV638186) mostró una secuencia nucleotídica de
ARNm única. La secuencia de aminoácidos deducida de CrCO tiene 410
residuos y posee tres dominios característicos: i) Dos dominios en
dedo de zinc en el extremo amino-terminal llamados
cajas-b implicados en interacción
proteína-proteína; ii) Un dominio intermedio acídico
posiblemente implicado en activación transcripcional; y iii) Un
dominio carboxilo CCT (CO-COL-TOC1)
que se ha sugerido su mediación en la interacción con el ADN y que
está conservado en proteínas de plantas funcionalmente relacionadas
con el oscilador central como TOC1 u otros pseudo reguladores
de respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
El tiempo de floración se analizó en plantas
crecidas en tierra en cámaras con condiciones controladas en LD
mediante el conteo de las hojas de roseta y caulinas del mismo tallo
al menos en 10 individuos. Los datos se expresan como medias +/-
error estándar de la media (s.e.m.).
\vskip1.000000\baselineskip
Las relaciones evolutivas entre las proteínas CO
y CO-like se analizaron empleando las secuencias de
aminoácidos deducidas de diferentes bases de datos y alineadas con
el programa CLUSTALX. Este alineamiento se utilizó para generar
diversos árboles evolutivos empleando diferentes criterios
filogenéticos. Como estos árboles mostraban topologías muy
similares, sólo se ha mostrado el que se realizó con el criterio de
la mínima evolución (Fig. 1B). Se calcularon las relaciones
evolutivas empleando el método de la Evolución Mínima (ME). El árbol
consenso de atrapamiento calculado mediante 1000 réplicas representa
la historia evolutiva de las proteínas analizadas. El árbol está
dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas
unidades que las de las distancias evolutivas usadas para calcular
el árbol filogenético. El árbol ME fue rastreado empleando el
algoritmo de Neighbourd-joining a nivel de
rastreo de 1. El algoritmo de
Neighbourd-joining se usó para generar el
árbol inicial. Todas las posiciones que contenían huecos de
desapareamientos o falta de datos fueron eliminadas sólo en las
comparaciones de secuencias de apareamientos (opción de deleción de
apareamiento). Hubo en total 669 posiciones en el set de resultados
finales. Los análisis filogenéticos se realizaron con el programa
MEGA4. Los números de acceso de las secuencias usadas en el
alineamiento se muestran en la tabla 1.
El ARN completo procedente de Células de
Chlamydomonas o plántulas de Arabidopsis se extrajo mediante el
protocolo de TRIZOL (Invitrogen). Se monitorizó la expresión génica
mediante el análisis Northern blot empleando sondas marcadas
radiactivamente o mediante RT-PCR semicuantitativa
empleando cebadores específicos para cada gen analizado y ADNc
construido con el QIAGEN Quick prime RT Kit. Los niveles de
expresión de los genes de \alpha-TUBULINA (TUA1) o
UBIQUITINA-10 (UBQ) se usaron como
control en Chlamydomonas y Arabidopsis respectivamente. Para la
expresión génica circadiana se empleó como control los niveles de
expresión del gen CABII, que codifica para la proteína de
unión a la clorofila a/b del fotosistema II de Chlamydomonas. Los
datos se representan como la media de al menos tres experimentos
diferentes. La lista completa de cebadores usados en este trabajo se
muestra en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el gen CrCO, las condiciones de PCR
son 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 60
segundos a 72ºC. Para el gen TUA1, las condiciones de PCR son
27 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 60 segundos a
72ºC. Para el gen FT, las condiciones de PCR son 30 ciclos de
30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC. Para el
gen UBQ, las condiciones de PCR son 20 ciclos de 30 segundos
a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 60 segundos a 72ºC.
En la columna 1 de la tabla 2 se muestra el
nombre de las proteínas tal y como aparecen en las correspondientes
figuras. En la columna 2 se muestra el número de acceso para las
proteínas en la base de datos del National Centre for
Biotechnology Information (NCBI), o código de secuencia genómico
del DOE Joint Genome Institute (JGI)
(http://www.jgi.doe.gov/) para SmCOL, VcCOL, OtCOL. La secuencia
aminoacídica de GsCOL puede extraerse de la página web del proyecto
genómico de Galdieria sulphuraria
(http//genomics.msu.edu/gladieria/). En la columna 3 se muestra para
Arabidopsis y arroz el número de acceso del gen del Institute for
Genomic Research
(TIGR).
(TIGR).
Se extrajeron las proteínas de material de
plantas congelado mediante trituración en un mortero en presencia de
nitrógeno líquido y un tampón de extracción: tris HCl 50 mM (pH
8.0); EDTA 1 mM (pH 8.0); glicerol 10% (v/v); KCl 50 mM; MgCl_{2}
10 mM; PMSF 10 mM y una mezcla de inhibidores de proteasas de la
marca SIGMA. Las algas se rompieron con el mismo tampón mediante
sonicación breve (2 veces durante 30 segundos en un sonicador
Branson a 10 W de potencia). El extracto crudo de plantas y algas
resultante se centrifugó a 16.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC y se
recogió el sobrenadante. El precipitado se usó para la medida del
almidón. Para el análisis por Western blot se emplearon
anticuerpos contra CO y anti-H3, disponibles
comercialmente (AbCAM), como controles
nucleares.
nucleares.
Las plantas silvestres y mutantes de Arabidopsis
se transformaron mediante la técnica de inmersión floral mediada por
Agrobacterium. Para la expresión de CrCO en
Arabidopsis, las plantas se transformaron con el vector alligator
2. Las plantas CrCOox se seleccionaron por la presencia de GFP
en la semilla bajo el microscopio y se analizó su fenotipo floral en
la primera generación. Se seleccionaron las plantas homocigotas
directamente en esta generación cuando mostraban un 100% de
fluorescencia en las silicuas.
Para generar proteínas fluorescentes de fusión
para determinar la localización nuclear, se empleó el plásmido
pENSG-YFP:GW (de la Dra Nieves
Medina-Escobar, Universidad de Málaga). Este
plásmido genera una fusión amino-terminal de la
proteína YFP a proteínas expresadas por ADNc clonados en un sitio
gateway en la parte 3' del gen YFP, bajo el control de
un promotor 35S y son compatibles con la expresión en plantas
mediada por Agrobacterium.
Para la construcción del vector inducible por
nitrato que expresa CrCO, se introdujo el cassette
gateway en pauta C (Invitrogen) en el sitio EcoRV del
polilinker del vector pNIA1 según las instrucciones
del fabricante, obteniéndose el vector pNIAG. Un fragmento
HindIII del vector pHyg3, que incluye el
cassette de resistencia a higromicina, se introdujo en el
sitio HindIII del vector pBS SK+ y un fragmento
kpnI en el mismo sitio del vector pNIAG, produciéndose
el vector pNIAHG, que se confirmó estaba clonado en
antisentido al cassette gateway por secuenciación. La ORF de
CrCO se amplificó por PCR y se clonó en el vector
pDONR221 mediante recombinación. Los cebadores usados fueron
SEQ ID NO: 12 (directo) y SEQ ID NO: 13. Mediante esta amplificación
se obtuvo una secuencia de ADNc que se muestra en SEQ ID NO: 14
(CrCO). El vector de entrada de CrCO se usó como
sustrato para una reacción L de recombinación en el vector
pNIAHG, obteniéndose el vector final pNIAHG::CrCO. Las
algas transformadas se seleccionaron mediante resistencia a
higromicina en medio Sueoka-amonio y se comprobó la
expresión del gen en presencia de nitrato.
El vector de producción de GST:CrCO se construyó
mediante recombinación molecular del vector de entrada de
CrCO y el plásmido pDESR15 (Invitrogen). La clonación
y purificación en columnas de glutatión-sephadex (GE
Healthcare) se realizó como describe el fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En las bases de datos de ESTs (Expression
Sequence Tags) pueden encontrarse frecuentemente ESTs de
CrCO, pero sólo se pudo identificar un EST para el gen
COL (CONSTANS-LIKE) EDP03468. Además,
empleando cebadores diseñados para una parte interna del gen y como
molde ADNc procedente de diferentes condiciones de crecimiento, no
se pudo amplificar mediante PCR reversa (RT-PCR)
ninguna señal de EDP03468. Por otro lado, se ha descrito que la
expresión de ROC66 es pequeña pero detectable y parece
regularse por el reloj circadiano. Dada su gran divergencia de
secuencia con CO, y su similitud a proteínas de la familia COL,
ROC66 podría considerarse un gen COL de algas. De
manera significativa, en todas las condiciones de crecimiento
estudiadas, la secuencia completa de CrCO podía ser
amplificada mediante ensayos de RT-PCR, generándose
un fragmento de unos 1.4 kb, lo que es consistente con el tamaño
previsto para el gen en la última versión de la secuencia genómica
de C. reinhardtii (Fig. 1A). La estructura del gen
CrCO se generó mediante información recogida de los ESTs, de
las amplificaciones de RT-PCR y de la secuencia
predicha en la base de datos del genoma de C. reinhardtii
(Fig. 1A). CrCO posee cuatro intrones que están conservados
en la secuencia del gen de Volvox cartieri pero no en genes
de plantas, del musgo Physcomitreila patens o de la licofita
Selaginella moeiiendorfi. La secuencia codificante de
CrCO (1230 nt) es similar a la de CO y su ARNm
contiene secuencias cortas en los extremos 5' y 3'. La identidad
completa de las secuencias de aminoácidos deducidas de CO y
CrCO es de 27% y la similitud 37%. En la zona conservada de
las cajas-b la identidad de aminoácidos llega hasta
el 43%, mientras que en el dominio CCT la identidad llega al 78%.
Las identidades con otras secuencias COL de plantas procedentes de
bases de datos varía entre el 20 y el 30% (tabla 3). En conjunto,
los resultados sugieren fuertemente que CrCO es el único
homólogo verdadero de CO que se expresa con normalidad en
C. reinhardtii.
\vskip1.000000\baselineskip
Los números indican el porcentaje de identidad
de aminoácidos entre cada pareja de proteínas. La identidad de CrCO
con las secuencias de plantas es mayor que con las de proteínas COL
de otras algas prasinofíceas como Ostreococcus tauri (OtCOL)
o con el alga roja Galdieria sulphuraria (GsCOL). PpCOL.1:
Physcomitrella patens COL1; SmCOL: Selaginella
moellendorfi COL; VcCO: Volvox cartieri COL.
Se ha empleado la secuencia de aminoácidos
deducida de CrCO, junto a otras secuencias de COs y COLs del linaje
eucariótico fotosintético para generar un alineamiento y un árbol
evolutivo (Fig. 1B). En el árbol de la Fig. 1B, CrCO se agrupa con
Volvox-CO (VcCO), otra alga clorofícea que muestra
una rudimentaria organización multicelular. La estructura génica y
la posición de los intrones son similares entre las dos secuencias
de algas, como era de esperar de la proximidad evolutiva de ambas
especies (Fig. 1B). Esta rama basal está muy cerca del grupo I, que
incluye a las proteínas CO y HD1, de las que se sabe que tienen un
papel central en la floración por fotoperiodo en Arabidopsis y arroz
respectivamente. Por el contrario, los homólogos de CO presentes en
los proyectos genoma del alga verde marina unicelular
Ostreococcus tauri y el alga roja Galdieria
sulphuraria ramificaban lejos de este grupo (96% de
atrapamiento) y junto a miembros COL del grupo II (Fig. 1B).
No se encontraron genes COL en los proyectos
genoma o bases de datos de ETSs de diferentes especies que
pertenecen a otros grupos taxonómicos como las Bacilariofitas
(Thalassiosira pseudonana y Phaeodactylum
tricornutum), Dinofitas (Amphidium operculata),
Euglenofitas (Euglena gracilis) o Haptofitas (Emiliana
huxley). Por todo ello, probablemente la rama evolutiva que
finalmente evolucionó en las plantas terrestres incluía homólogos
verdaderos de CO, aunque la secuenciación de nuevos genomas de algas
podría modificar este escenario.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó el ADNc completo de CrCO bajo el
control del promotor 35S en un vector de expresión de plantas (ver
métodos). La construcción anterior, que sobreexpresa CrCO se
transformó en los mutantes nulos co-8 y
co-10, así como en los ecotipos silvestres
Ler y Columbia. En las plantas transformantes se midió la
expresión del gen CrCO mediante RT-PCR (Fig.
2). En todos los casos la expresión de CrCO bajo el promotor
35S (plantas 35S::CrCO) complementaba a la mutación co
(Fig. 2A y Fig. 2B) y todas las plantas mostraban un fenotipo de
floración temprana (tabla 4). Por otro lado, en las plantas
transformantes de Ler y Col-0, se observaba
una co-segregación directa entre el marcador del
vector y el fenotipo de floración temprana, demostrando que
CrCO también confería floración temprana en plantas
silvestres (tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla, los datos se muestran como la media
+/- s.e.m. de 10 plantas contadas para el número total de hojas en
condiciones de LD. El fondo genético de cada planta se muestra entre
paréntesis al lado de cada genotipo. Las plantas transgénicas
descritas en este trabajo son todas plantas T3 (de tercera
generación).
También se verificó si las plantas que
sobreexpresaban CrCO eran capaces de activar la expresión de
la diana principal de CO, el integrador floral FT. Se
crecieron plantas 35S::CrCO homocigotas en medio sólido en LD
(16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) y se analizó la expresión
de FT a tiempos ZT 4 y ZT 16 (Fig. 2C). Se usaron plantas
silvestres, mutantes co y plantas que sobreexpresaban
CO (35S::CO) como controles. En todos los casos, el
fenotipo de floración temprana de 35S::CrCO iba emparejado
con niveles altos de expresión de FT, incluso durante la
mañana, cuando los niveles de FT son bajos en las plantas
silvestres (Fig. 2C). Las plantas 35S::CrCO también florecían
temprano en condiciones SD no inductivas y esto iba acompañado de
altos niveles de expresión de FT. Por ello, el fenotipo de
floración temprana de las plantas transgénicas que expresaban
CrCO puede probablemente atribuirse al mismo proceso descrito
para la floración por fotoperiodo y mediado por FT. Las
plantas 35S::CO muestran otros fenotipos pleiotrópicos
asociados con la floración temprana como silicuas en forma de maza,
un aumento de la esterilidad masculina y flores terminales. De forma
similar, las plantas 35S::CrCO presentaban un tamaño
reducido, defectos en la formación de silicuas, flores terminales y
frecuentemente eran incapaces de producir semillas maduras, con
flores que degeneraban en estados de desarrollo tardíos (Fig. 2D,
a-d). Estas últimas plantas (Fig. 2D,
c-d) mostraron un tamaño extremadamente pequeño, una
floración extremadamente temprana, estimada tanto por días de
floración como por número total de hojas, y también niveles muy
altos de ARNm de CrCO y FT.
CO promueve la floración en LD mediante
la expresión de una señal sistémica en los haces vasculares. Para
averiguar si la expresión de CrCO específicamente en estos
tejidos podía promover también la floración, se introdujo
CrCO en plantas col-0 de Arabidopsis
bajo el control del promotor del transportador de sacarosa
SUC2, que se conoce se expresa preferentemente en las células
anexas del tejido vascular floemático. La expresión de CrCO
bajo el promotor SUC2 (plantas SUC2::CrCO) indujo
floración temprana en las plantas silvestres Col-0
(Fig. 3A y tabla 4) y complementó la mutación co. Las plantas
transformadas con la construcción SUC2::CrCO tenían
aproximadamente 8,6 +/- 0,2 hojas en el momento de la aparición del
primer botón floral en condiciones LD, mientras que
Col-0 mostraba 19,9 +/- 0,5 hojas en las mismas
condiciones (tabla 4). Sin embargo, cuando el ADNc de CrCO se
expresó bajo el control del promotor del gen KNATI, cuya
expresión es exclusiva del meristemo apical, y se introdujo en
plantas Col-0, no se alteró la floración (Fig. 3A y
tabla 4). Las plantas KNATI::CrCO florecían con 20,4 +/- 0,7
hojas (tabla 4). Para confirmar que el fenotipo de floración
temprana observado en las plantas SUC2::CrCO se debía a la
activación de la vía del fotoperiodo, se comprobó la expresión de
FT mediante RT-PCR. Efectivamente, si se
comparaba con las plantas control, FT se expresaba a altos
niveles en estas plantas tanto en LD como en SD y ello era
concomitante con altos niveles de expresión de CrCO (Fig.
3B). No obstante, aunque presentaban altos niveles de CrCO,
no se observaron mayores niveles de expresión de FT comparado
con plantas silvestres, cuando CrCO se expresaba bajo el
control del promotor exclusivo de meristemo (Fig. 3B).
Mediante inmunoblots se mostró que las plantas
que sobreexpresaban CrCO en fondo Col-0
también mostraban altos niveles de producción de la proteína CrCO en
extractos nucleares (Fig. 3C). Se probó también la presencia de la
proteína CrCO mediante inmunoblots en plantas que expresaban
CrCO bajo los promotores SUC2 y KNATI en fondo
Col-0. De manera consistente con los datos de ARNm,
la proteína podía detectarse en plantas 35S::CrCO y
SUC2::CrCO, pero no en el mutante
co-10 o en plantas donde la expresión de
CrCO estaba controlada por el promotor KNATI (Fig.
3C).
La transformación de plantas con vectores que
contenían fusiones traduccionales de CO a la Proteína Fluorescente
Verde (GFP) había mostrado la presencia nuclear de la fusión
GFP:CO. Se clonó CrCO en el plásmido
pENSG-YFP:GW que produce una fusión
amino-terminal con la variante amarilla de la GFP
(YFP). Este vector se introdujo mediante bombardeo de partículas en
células de la epidermis junto a un vector control que expresaba CO
(YFP:CO) en la mismas condiciones. Como puede verse en la
Fig. 3D, YFP:CrCO se detectó mediante microscopía confocal en
el núcleo de manera similar a las plantas que sobreexpresaban la
fusión YFP:CO, sugiriendo que CrCO también se localiza en el
núcleo.
Ejemplo
3
Aunque la proteína CrCO mantiene alrededor de un
27% de identidad con CO, las plantas transformadas con CrCO
presentan un fenotipo de floración sorprendentemente temprana. Por
el contrario, COL1, una duplicación en tándem de CO en
Arabidopsis, que conserva más del 85% de identidad en
aminoácidos con CO no puede complementar la mutación co si se
expresa bajo un promotor 35S. Esto sugiere que la estructura de CrCO
se asemeja a la de CO y que está involucrada probablemente en los
mismos complejos nucleares que se han propuesto median la
transcripción de FT. El hecho de que pueda complementar tanto
a la mutación co-8 en fondo Ler y a la
mutación co-10 en fondo Col-0
indica que CrCO puede reemplazar eficazmente a CO en el complejo
supramolecular que supuestamente interviene en la modificación de la
transcripción.
En la presente invención también se ha mostrado
que al igual que CO, la expresión de CrCO bajo el
control del promotor del gen específico de floema, SUC2,
provoca floración temprana en Arabidopsis. Las plantas
SUC2::CrCO mostraban niveles de expresión de FT
mayores que las silvestres incluso en condiciones de SD no
inductivas y ello podría explicar el fenotipo observado de floración
temprana. Por el contrario, la expresión de CrCO bajo el
promotor específico del gen meristemático KNATI no promueve
floración temprana y no se detecta expresión de FT. Este es
el caso también de las plantas KNATI::CO.
En conclusión, CrCO es funcional cuando se
expresa específicamente en el tejido vascular, lo que apoya aún más
la conservación de la función de CO en el gen homólogo de plantas a
pesar de la gran distancia filogenética que existe entre ellos.
La dependencia fotoperiódica de la expresión y
regulación génica supone un proceso fundamental para los organismos
fotosintéticos dado que anticiparse a las señales luminosas diurnas
y estacionales permite la elección del mejor momento del día o del
año para realizar las transiciones de fase. En este sentido, las
plantas han adaptado una regulación fotoperiódica para varios
procesos clave que controlan el desarrollo como la dormancia, la
formación de ramas o la transición floral. En esta vía regulatoria,
las proteínas COL parecen tener un importante papel, ya que miembros
de esta familia se regulan por la luz y el reloj circadiano. Al
mismo tiempo están implicados en controlar procesos regulados por la
luz como el control dependiente de PHYB de la elongación del
hipocotilo, la ramificación o el tiempo de floración. Entre los
muchos genes que regulan la transición floral, el módulo
CO-FT parece encontrarse en la mayoría de las
familias de dicotiledóneas y monocotiledóneas y está implicado en el
control de la floración desde plantas herbáceas a árboles. A
diferencia de otros sistemas de regulación de la floración como la
vía de FLC/vernalización, que parece específica de algunas
dicotiledóneas, los genes COL están presentes en los genomas
de las briofitas como el musgo Physcomitrella patens, las
licofitas como Selaginella moellendorfi y varias microalgas
(descrito en la presente invención).
La complementación de la función de CO
por CrCO en Arabidopsis resulta sorprendente porque
implica que los genes COL han estado involucrados en la
regulación circadiana y el control de la reproducción desde muy
temprano dentro del linaje de las clorofitas y que estas
características se han preservado durante su evolución. La mutación
co no es letal en Arabidopsis o en otras plantas, aunque
probablemente ha supuesto una característica crucial en la capacidad
de las plantas de adaptarse a nuevos medios. En
Chlamydomonas, el ciclo celular y el crecimiento se regulan
por el reloj circadiano y el fotoperiodo, como se demuestra por el
cambio en el pico de expresión de componentes clave del ciclo
celular dependiendo de la longitud de noche/día. A raíz de los
resultados presentados en la presente invención, se puede deducir
que la conservación de la función de CO puede haber sido crítica
para la capacidad de las plantas de responder a señales luminosas
externas y promover transiciones de desarrollo.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC)
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUniversidad de Sevilla
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de una secuencia nucleotídica
que regula el momento de la floración, plantas que la expresan y
método para producirlas
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1641.289
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 534
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia reguladora de la expresión
35S
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 2244
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 20
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
\newpage
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 74
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Cebador directo para amplificar el
gen CrCO
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 58
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Cebador reverso para amplificar
CrCO
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 1233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Chlamydomonas reinhardtii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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Claims (20)
1. Uso de un ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia
aminoacídica con al menos un 90% de identidad con la secuencia SEQ
ID NO: 1, para regular el momento de floración de una planta.
2. Uso de un ácido nucleico según la
reivindicación 1 que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica una secuencia aminoacídica de un alga verde con al menos un
50% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.
3. Uso de un ácido nucleico según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2 donde la secuencia nucleotídica codifica
la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
4. Uso de un vector de expresión que comprende
el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
5. Uso de una célula transfectada con el vector
de expresión según la reivindicación 4.
6. Uso de la célula según la reivindicación 5
que comprende cualquier producto de la expresión del ácido nucleico
aislado.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6 donde el ácido nucleico aislado está unido funcionalmente a
una secuencia reguladora de la expresión génica.
8. Uso según la reivindicación 7 donde la
secuencia reguladora de la expresión génica es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID
NO: 3.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8 donde la planta pertenece a la especie Arabidopsis
thaliana.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8 donde la planta pertenece a la especie Solanum
lycopersicum.
11. Célula aislada transfectada con un ácido
nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica una secuencia aminoacídica con al menos un 90% de identidad
con la secuencia SEQ ID NO: 1.
12. Célula según la reivindicación 11 que
comprende una secuencia nucleotídica de un alga verde que codifica
una secuencia aminoacídica con al menos un 50% de identidad con la
secuencia SEQ ID NO: 1.
13. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12 que comprende una secuencia nucleotídica
que codifica la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
14. Planta que comprende la célula según
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
15. Planta según la reivindicación 14 que
pertenece a la especie Arabidopsis thaliana.
16. Planta según la reivindicación 14 que
pertenece a la especie Solanum lycopersicum.
17. Polen, semilla, propágulo, progenie o parte
de la planta que procede de cualquiera de las plantas según las
reivindicaciones 14 a 16.
18. Método para la obtención de la célula según
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende:
- a.
- insertar la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 en un vector,
- b.
- transformar una célula con el vector obtenido según el apartado (a) y
- c.
- seleccionar la célula transformada según el apartado (b) que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1.
19. Método para obtener una planta según
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que comprende:
- a.
- regenerar al menos una planta procedente de la célula obtenida según el apartado (c) de la reivindicación 18,
- b.
- seleccionar una o varias plantas regeneradas según el apartado (d) que expresa, al menos, la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 y
- c.
- seleccionar una o varias plantas obtenidas según el apartado (b) que presenta un adelanto de la floración respecto de una planta control.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 18 ó 19 donde la secuencia nucleotídica que
codifica para SEQ ID NO: 1 está unida funcionalmente a una secuencia
reguladora de la expresión génica.
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