ES2344137T3 - Sistema de microescala para manipulacion de liquidos. - Google Patents

Abstract

SE REVELA UN SISTEMA DE MANIPULACION DE FLUIDOS A ESCALA MICROSCOPICA (10) QUE PERMITE EL TRASIEGO EFICIENTE DE CANTIDADES DESDE NANOLITROS HASTA PICOLITROS DE UNA MUESTRA DE FLUIDO DESDE EL ENTORNO CONCENTRADO ESPACIALMENTE DE UN CHIP MICROFABRICADO PARA DISPOSITIVOS DE ANALISIS O RECOGIDA FUERA DEL CHIP (23) PARA REALIZAR POSTERIORMENTE LA MANIPULACION Y EL ANALISIS DE LA MUESTRA FUERA DEL CHIP. EL SISTEMA DE MANIPULACION DE FLUIDOS (10) ESTA FABRICADO EN FORMA DE UNO O MAS CANALES (12), EN CUALQUIER FORMATO ADECUADO, DISPUESTO EN UN CUERPO O SUSTRATO DE MICROCHIP DE SILICE, POLIMERO U OTRO MATERIAL NO CONDUCTIVO ADECUADO, O DE ACERO INOXIDABLE, METAL NOBLE, SILICIO U OTRO MATERIAL CONDUCTIVO O SEMICONDUCTIVO ADECUADO. EL SISTEMA DE MANIPULACION DE FLUIDOS DE MICROCHIPS (10) INCLUYE UNO O MAS ORIFICIOS DE SALIDA (16) INTEGRADOS CON EL EXTREMO DE UNO O MAS CANALES (12) PARA REALIZAR CONSECUTIVA O SIMULTANEAMENTE EL ANALISIS O LA RECOGIDA DE LA MUESTRA FUERA DEL CHIP. EL ORIFICIO U ORIFICIOS DE SALIDA (16) PUEDEN CONFIGURARSE, POR EJEMPLO, COMO CONEXION DE ELECTROPULVERIZACION PARA EL TRASIEGO DE UNA MUESTRA DE FLUIDO A UN ESPECTROMETRO DE MASAS (23).

Description

Sistema de microescala para manipulación de líquidos.

Campo de aplicación del invento

Este invento se refiere a sistemas de microescala para manipulación de líquidos y en particular a dichos sistemas fabricados en un dispositivo de microescala.

Antecedentes del invento

Los desarrollos recientes en las técnicas de microfabricación han permitido la integración de herramientas microminiatura para análisis bioquímicos dentro de un dispositivo diminuto. Los sistemas de tratamiento químico completo, tales como cámaras de reacción, tubos capilares para separación y sus correspondientes depósitos de electrodo, así como ciertos tipos de detectores, se pueden consolidar en un microchip de, por ejemplo, un cristal de sílice o sílice fundido. Dichos "laboratorios en un chip"., en principio, permiten una utilización y una manipulación eficaces de cantidades diminutas de material. Una vez que se han llevado a cabo los procedimientos previstos, los componentes procesados están disponibles en el chip en una forma concentrada espacialmente que es adecuada para realizar operaciones analíticas adicionales. Como los componentes de la muestra están en volúmenes del orden de nanolitros, las operaciones subsiguientes se deberían llevar a cabo preferiblemente sobre el mismo dispositivo. (Véase comunicación de Effenhauser y colaboradores, Análisis Químico, 67; págs. 2284-2287, 1955). Sin embargo, esta restricción permite una utilización menos que eficaz de ciertos poderosos instrumentos de análisis, tal como un espectrómetro de masas.

Se resalta que el documento US-A-5.376.252 describe un sistema de microescala para manipulación de líquidos, que comprende un sustrato que tiene un canal formado en el mismo. Además, se hace notar que el documento WO 96/12546 A1, publicado el 2 de mayo de 1996, describe un dispositivo de columna plana miniaturizado para uso en un aparato de separación de fase líquida.

Sumario del invento

El invento provee un sistema de acuerdo con las reivindicaciones independientes de sistema que se adjuntan, así como un método de acuerdo con las reivindicaciones de método que se adjuntan.

El invento está destinado a sistemas de microescala para manipulación de líquidos que permite el trasiego eficaz de cantidades de nanolitros o de otras cantidades de una muestra de fluido desde un ambiente concentrado espacialmente o un dispositivo de microescala, tal como un chip microfabricado, a dispositivos de recogida o de análisis "fuera del chip" sin un aumento en el volumen de la muestra. El sistema para manipulación de fluidos del invento se fabrica en la forma de uno o más canales capilares practicados en un cuerpo o sustrato, que podrían fabricarse de un material no conductor adecuado tal como sílice o un polímero de plástico, un metal noble, o un material semiconductor como el silicio. El dispositivo de microescala del invento incluye una o más lumbreras de salida integrales con un extremo de uno o más de los canales para un análisis o recogida en chip consecutivos o simultáneos de una muestra aplicada. La lumbrera o lumbreras de salida se podrían configurar, por ejemplo, para transferir una muestra de un análisis por espectrometría de masas por electroaspersión (en adelante ESI/MS), para análisis químico por espectrometría de masas con ionización a la presión atmosférica (en adelante APCI/MS), para espectrometría de masas con desorción e ionización con láser asistida por matriz (en adelante MALDI/MS), para análisis por resonancia magnética nuclear (en adelante NMR), para manipulación de muestras de aspersión asistida mecánica o hidráulicamente, para transferencia a un sistema de detección fuera de chip, tal como fluorescencia por electroquímica, por conductividad o inducida con láser, para la obtención de fracciones específicas, por ejemplo, en tubos capilares para obtención de muestras o en membranas de obtención de muestras. La muestra se trasiega por gotículas, por aspersión o por una corriente, según se desee, o como sea adecuado para el instrumento o dispositivo que recibe la muestra trasegada. El fluido trasegado está en forma de un líquido.

Los canales del microdispositivo se podrían ordenar en cualquier formato que permita el tratamiento secuencial o simultáneo de muestras líquidas. En una realización del invento, los canales están dispuestos en una forma en paralelo y espaciados, representando cada canal un sistema de microanálisis independiente que tiene su propia lumbrera de introducción y su propia lumbrera de salida de muestras. En otra realización, los canales del dispositivo de microescala están dispuestos en un patrón circular, como los radios de una rueda. En el centro del patrón circular, todos los canales pueden converger en una lumbrera de salida formada integralmente en una cara frontal del dispositivo de microescala. La lumbrera de salida está destinada a establecer una interfaz con un dispositivo externo, tal como un espectrómetro de masas o una membrana, que recibe muestras a través de la lumbrera de salida para su análisis.

En cualquier realización, cada canal podría incluir contactos eléctricos, de tal manera que se pueda establecer un camino de circuito eléctrico a lo largo del canal. Por ejemplo, un contacto eléctrico podría estar en el lado de entrada de un canal y otro contacto eléctrico podría estar en el lado de salida. En una disposición alternativa, se puede completar un circuito eléctrico mediante un contacto externo, más allá del extremo de salida del canal. Por ejemplo, si la lumbrera de salida de un canal se usa como una fuente de electroaspersión para un espectrómetro de masas, el orificio de toma de muestras del espectrómetro de masas puede servir como electrodo contador. Las muestras se pueden trasegar fuera del chip para su análisis subsiguiente mediante la conmutación de la corriente eléctrica secuencialmente a cada canal en el chip. Al final del análisis, se puede desechar el chip. De ese modo, el invento alivia las manipulaciones tales como el lavado a presión, y elimina los problemas del traslado de las muestras entre series, al mismo tiempo que provee un uso eficaz del espectrómetro de masas o de otro dispositivo para análisis y/u obtención de muestras.

Las muestras se pueden introducir en un canal del dispositivo de microescala del invento por una variedad de métodos, por ejemplo, por presión, por inyección electrocinética, o por otra técnica, y luego se puede aplicar una corriente eléctrica y/o una caída de presión para causar que los componentes de la muestra se desplacen a lo largo del canal. Los canales podrían funcionar solamente para el trasiego de fluidos, por ejemplo, a un espectrómetro de masas, o bien los canales podrían servir como entornos para diversos tipos de manipulaciones de muestras, por ejemplo, para operaciones de micropreparación o de análisis, tales como electroforesis capilar (en adelante CE) o la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante PCR), o para llevar a cabo cualquier tipo de química de muestras. Los canales podrían llenarse con material de membrana o de empaquetadura para efectuar la preconcentración o el enriquecimiento de muestras o para otras etapas de tratamiento, tales como la desalación. Además, son posibles otras modificaciones de componentes de muestras, por ejemplo, mediante enzimas que están vinculadas de forma covalente a las paredes de los canales o podrían incluir oíros componentes, tales como partículas magnéticas, de tal manera que cuando se aplique un campo magnético, las partículas magnéticas retengan en posición al material de empaquetadura. Las partículas magnéticas se pueden usar también para mezclar eficazmente fluidos dentro de los canales, usando un campo magnético externo. Se podría emplear también un filtro micromecanizado u otra estructura estacionaria para sujetar en posición al material de empaquetadura. Alternativamente, las estructuras estacionarias se pueden micromecanizar, fundir o conformar de otro modo en la superficie de un canal para proveer una zona de gran superficie que pueda hacer las veces de material de empaquetadura. Otro método de aplicación de muestras es un soporte de múltiples muestras miniaturizadas como un sistema híbrido micromecanizado a las lumbreras de entrada de los canales.

Una muestra se puede introducir en un canal en una zona corta de iniciación o puede llenar por completo todo el canal. El llenado de solamente una pequeña parte del canal con la muestra es preferible cuando se vaya a llevar a cabo una separación sobre chip de los componentes de la muestra, tal como una electroforesis o una cromatografía. El llenado de todo el canal con la muestra podría ser ventajoso en los casos en que un análisis fuera de chip requiera un flujo de salida extendido, tal como la ionización por electroaspersión o por infusión de una muestra para realizar un análisis de la estructura por espectrometría de masas.

En muchos casos, se podría requerir un flujo de líquido para transportar los análitos de una muestra a un canal específico, o fuera del canal a través de una lumbrera de salida. Por tanto, para asistir en el trasiego requerido del fluido, se podría incorporar un dispositivo de bombeo a - o establecer una relación de asociación entre un dispositivo de bombeo y- el dispositivo de microesacala del invento. Por ejemplo, se puede usar un elemento de calentamiento para causar dilatación térmica, que efectúe un desplazamiento del líquido de una muestra, o bien se podría usar un elemento de calentamiento para generar una microburbuja, cuya expansión cause el desplazamiento de la muestra en el canal. Otras opciones podrían incluir un bombeo por la presión de un gas o de unos gases generados por electrólisis en chip Se podría generar también flujo mediante la aplicación de una caída de presión a lo largo de un canal o por electro-osmosis dentro de un canal.

A medida que las muestras se desplazan hasta el extremo de un canal, pueden estar sometidas a detección o análisis en un sitio externo al dispositivo de microesacala del invento por una variedad de técnicas, incluyendo espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear, fluorescencia inducida por láser, detección por radiación ultravioleta, detección electroquímica, o técnicas similares. El extremo de cada canal podría incluir una punta configurada para facilitar el trasiego del volumen de la muestra. Cuando el método de análisis es la espectrometría de masas, el extremo de cada canal se podría microfabricar para formar una lumbrera de salida por electroaspersión, o punta, que permitiese el trasiego de iones al orificio de muestreo del espectrómetro de masas por microelectroaspersión. Se pueden usar otras configuraciones de lumbrera de salida para trasiego de muestras por aspersión asistido neumática o ultrasónicamente, entre otras. Además, si la muestra a transferir es un gas disuelto. transportado en el canal por un líquido portador, la lumbrera de salida se puede configurar para calentar el líquido portador, para recuperar la muestra a la fase de gas para su trasiego por aspersión. ES extremo de salida del canal se podría configurar y/o dimensionar para servir como una punta de electroaspersión, o bien la punta se podría formar como una prolongación del canal o como un elemento adjunto al canal. La superficie de borde del sustrato se podría rebajar entre lumbreras adyacentes de salida para minimizar la contaminación cruzada, o bien el sustrato podría ser de un material no humidificador, o se podría modificar químicamente para ser no humidificador, de tal manera que el propio líquido de salida proporcione la electroaspersión. Cuando sea necesario, el microdispositivo se puede posicionar en una etapa de traslación para que cada lumbrera de salida se pueda alinear con precisión, por turno, con el orificio de toma de muestras del espectrómetro de masas u otro dispositivo de utilización.

El invento se podría usar en un modo con envoltura de fluido (por ejemplo, un líquido o un gas) o sin envoltura, dependiendo del tipo de análisis requerido y del tamaño de la muestra que sale de un canal. En una disposición sin envoltura, la lumbrera de salida se forma en el extremo del canal. Cuando se requiere una envoltura de líquido, (por ejemplo, para la adición de un líquido, un producto químico y/o un patrón antes de la electroaspersión o para proveer conexión eléctrica por medio del fluido de la envoltura), se puede crear una lumbrera de salida en el punto de fusión de los canales, uno que suministre la muestra y el otro el líquido de la envoltura. Se puede realizar fácilmente un análisis selectivo de los análitos en ambos modos catiónico y amónico mediante una rápida conmutación de la polaridad del campo eléctrico.

Se podrían emplear canales de dimensiones diferentes en el mismo dispositivo de microescala. Por ejemplo, se podrían usar canales más grandes para operaciones de limpieza, y los canales más pequeños se usarían para operaciones de tratamiento. Más aún, se pueden realizar otras operaciones en otras regiones del dispositivo, tales como un tratamiento químico, una separación, un aislamiento o una detección de una muestra o de un componente de la muestra, antes de cargar la muestra en un canal. De ese modo, es posible llevar a cabo operaciones químicas de muestras o realizar operaciones de micropreparación y de análisis tanto en una muestra de iniciación como en sus componentes separados dentro del dispositivo del invento, antes de transferir la muestra o sus componentes fuera del chip para su posterior análisis o recogida. Adicionalmente, se podría llevar a cabo la detección de una muestra en el propio microdispositivo, por ejemplo, mediante un sistema de detección por fibra óptica, que puede aportar información de control complementaria para análisis y detección fuera de chip, o mediante cualquier otro detector adecuado tal como un detector por fluorescencia inducida por láser, un detector por conductividad y/o un detector electro-
químico.

Los procedimientos adecuados para fabricar el dispositivo de microescala del invento son bien conocidos de por sí en la técnica e incluyen, a título de ejemplo, técnicas fotolitográficas y de ataque químico, mecanización por láser, técnicas de fabricación de estratos múltiples tales como la estereolitografía, y técnicas de estampación, moldeo o colada.

Los canales podrían ser cilíndricos, trapezoidales o de cualquier otra forma de sección transversal. El patrón del canal podría ser lineal o curvilíneo dentro de un plano único. Además, el microdispositivo podría incluir muchos de dichos estratos de canales independientes no unidos. Alternativamente, un canal individual se podría extender entre dos o más planos para permitir el trasiego de una muestra desde una ubicación prevista de lumbrera de entrada hasta una ubicación prevista de lumbrera de salida. Un canal podría ser también de cualquier longitud necesaria para permitir dicho trasiego. En su aspecto más básico, un canal podría ser simplemente una hendedura recta que una lumbrera de entrada a una lumbrera de salida.

Se podrían fabricar también junto con cada canal individual depósitos de amortiguador, cámaras de reacción, depósitos de muestras, y celdas de detección. Se pueden crear estructuras más complejas apilando o ensamblando de otro modo dos o más dispositivos microfabricados. Adicionalmente, bloques de instrumentación individuales tales como depósitos de muestras, canales de pretratamiento o de separación, y lumbreras de salida se pueden micromecanizar por separado y combinarse en un sistema completo en gran parte de la misma forma que se forman los circuitos integrados híbridos. Las técnicas de microfabricación son precisas y permitirán un alto grado de reproducibilidad de canales y formas de lumbrera de salida seleccionados.

El sistema de microescala para manipulación de fluidos del invento permite un uso más eficiente de poderosos dispositivos de análisis,, tales como el espectrómetro de masas, de lo que es posible actualmente. Adicionalmente, el sistema del invento se puede fabricar como un dispositivo desechable que es adecuado para una automatización rentable del análisis de un gran número de muestras. Usando esta solución micromecanizada, sería posible un análisis de elevada productividad por espectrometría de masas. Además, se facilitaría el manejo de pequeños volúmenes y pequeñas cantidades de muestras, y se reducirían los reactivos. Las aplicaciones incluyen cualesquiera métodos para análisis en laboratorio, especialmente cuando sean convenientes una productividad elevada y la minimización de la contaminación cruzada, tales como los métodos de detección sistemática y métodos de diagnóstico, y tales otros métodos de análisis como la farmacocinética, donde para cada serie se requieren columnas nuevas.

Otras características y ventajas del invento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas del mismo y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1a es una vista en planta de una realización del sistema de microescala para manipulación de fluidos del invento, en el que los canales en relación de asociación para transporte de muestras están en una disposición en paralelo dentro de un único plano;

La Figura 1b es una vista en corte de una realización del invento mostrando extensiones opcionales de pocillos;

La Figura 1c es una vista en corte de una realización del invento que muestra un bloque adjunto de lumbreras de muestra/electrodo;

La Figura 1d es una vista en corte de una realización del invento mostrando múltiples estratos de canales no unidos para transporte de muestras;

La Figura 1e es una vista en corte de una realización del invento que muestra un canal en una configuración de múltiples planos;

La Figura 2a es una vista en planta de otra realización del sistema de microescala para manipulación de fluidos del invento, en la que los canales en relación de asociación para transporte de muestras están en una disposición circular, fundiéndose en una lumbrera de salida común;

Las Figuras 2b hasta 2d son vistas laterales de tres realizaciones diferentes de la lumbrera de salida representada en la Figura 2a;

La Figura 3 muestra otra disposición circular de canales de transporte de muestras en la que cada canal termina en una lumbrera de salida separada sobre el reborde de un orificio en el centro del chip;

La Figura 4 es una vista en planta de una disposición de canales en otra realización del invento, en la que las lumbreras de salida están configuradas como lumbreras de aspersión, para usar con un líquido de envoltura para aspersión neumática o electroaspersión para manipulación de muestras fuera del chip;

La Figura 5 es una vista en planta de una disposición de canales en otra realización del invento, en la que varios canales se funden en una lumbrera de salida;

La Figura 6a es una representación esquemática del dispositivo de microescala de la Figura 1a usado como una interfaz de electroaspersión con un espectrómetro de masas;

La Figura 6b es una disposición de una parte indicada de la Figura 6a;

Las Figuras 7a y 7b muestran espectros de masas obtenidos por electroaspersión de la infusión de 0,01 mg/ml de mioglobina (200 nl/min.) de dos canales seleccionados del dispositivo de microescala de la Figura 1a, de la misma anchura y profundidad;

Las Figuras 8a hasta 8d muestran espectros de masas obtenidos por electroaspersión de la infusión de diferentes muestras en metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1) de diferentes canales del dispositivo de microescala de la Figura 8a, 0,1 mg/ml de mioglobulina; la Figura 8b, 0,1 mg/ml de endorfina; la Figura 8c, 0,1 mg/ml de hormona de crecimiento humana; y la Figura 8d, 0,1 mg/ml de ubicuitina;

La Figura 9 muestra un espectro de masas obtenidos por electroaspersión de la detección por ESl/MS de 0,001 mg/ml de mioglobina en metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1);

La Figura 10 muestra un espectro de masas obtenido por electroaspersión de una mezcla de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana y 0,05 mg/ml de ubicuitina, en metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1), infundidos desde el dispositivo de microesacala de la Figura 1a, en un estudio del límite de detección que usa el dispositivo;

La Figura 11 muestra un espectro de masas obtenido por electroaspersión de la infusión de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana de una solución acuosa, con metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1) en una jeringuilla para aplicar presión, y

La Figura 11b muestra un espectro de masas obtenido por electroaspersión de la infusión de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana directamente de una solución de metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1);

La Figura 12a, partes i y ii, muestra espectros de masas obtenidos por electroaspersión de un digesto tripsínico en chip de melitina, a 30 \muM en 20 mM Tris de pH 8,2, relación melitina/tripsima = 300/1 (w/w), para dos períodos de tiempo diferentes;

La Figura 12b, partes i y ii, muestra espectros de masas obtenidos por electroaspersión de ambos digestos de tripsina en chip y fuera de chip de caseína, de 2 \muM en 20 mM Tris de pH 8,2, relación caseína/tripsina = 60/1 (w/w); y

La Figura 13 presenta un espectro de masas obtenido por electroaspersión de un corto fragmento de ácido desoxirribonucleoico (en adelante ADN) (20 mer) en un 60% de acetonitrilo, y un 40% de agua.

Descripción detallada del invento

El microdispositivo del invento permite la integración de los sistemas de microescala de reacción y separación con los potentes sistemas de análisis y/o de obtención de muestras que solamente están disponibles fuera de un chip. En las Figuras la y 1b se muestra una realización del invento que incluye un sustrato o cuerpo de microchip que contiene una serie de canales o acanaladuras independientes, fabricados en una disposición paralela junto con sus correspondientes lumbreras de entrada de muestras y depósitos de amortiguador, en una superficie de una parte plana de un cuerpo de vidrio o chip. Las lumbreras de salida se fabrican en el extremo de sus respectivos canales, en el borde del chip. La parte acanalada del chip se cubre con una placa de cubierta para encerrar a los canales.

Refiriéndose a la Figura 1a, el chip (10) mostrado sin su correspondiente placa de cubierta, contiene nueve canales paralelos (12), todos de la misma anchura y profundidad (60 \mux 25 \mum), grabados en una superficie del sustrato (11) de microchip. Los canales son de tres longitudes diferentes con el fin de optimizar la disposición de canales. Cada canal (12) está unido a tres pocillos (13, 14, 15) que permiten el acceso a los canales, por ejemplo, para infundir muestras a través de los canales, para manipular diferentes soluciones que se podrían añadir a una muestra en un canal, y también para uso como un depósito de amortiguador para electroforesis. Cada pocillo tiene un diámetro de 1 mm y una profundidad de 0,5 mm, con un volumen de 0,4 \mul. Cada pocillo (13 y 15) se acopla a su correspondiente canal por una acanaladura o canal (12a). Se pueden fijar unos microtubos de plástico (que no se han mostrado) en la parte superior de la cubierta y en comunicación con los pocillos para aumentar su volumen, por ejemplo, hasta 10 \mul. Refiriéndose a la Figura 1b, las muestras se introducen en los pocillos (13), a través de extensiones opcionales (13a) de pocillo y de los orificios de entrada de muestras (13b) de la placa de cubierta (13c) por cualesquiera medios convenientes
tales como tubos o jeringuillas de alimentación en los que se coloque el chip durante la carga de las muestras.

Volviendo a referirse a la Figura 1a, unas lumbreras de salida (16) en el extremo de cada canal, y en el borde del sustrato de microchip, sirven como lumbreras de salida por electroaspersión por medio del uso de un revestimiento no humidificador, por ejemplo, el diol del polidimetilsiloxano sobre el área de superficie externa (18) del sustrato de microchip entre dos lumbreras de salida (16), para aislar una solución que se va a asperjar desde una lumbrera de salida. Los canales están espaciados entre sí por una distancia de 6 mm en la versión ilustrada. Alternativamente, se pueden cortar unas depresiones o rebajos (20) en la superficie externa del sustrato de microchip entre lumbreras de salida adyacentes (16), para aislar las lumbreras de salida y evitar o minimizar la contaminación cruzada entre canales.

En la realización del invento mostrada en la Figura 1c, se ha provisto un bloque de lumbreras de muestras/electrodos como un elemento separado que se fija al cuerpo del microchip. Refiriéndose a la Figura 1c, el cuerpo (11) tiene un bloque (30) de lumbrera de muestras/electrodos dispuesto a lo largo de un costado del cuerpo. El bloque (30) contiene unas lumbreras (31) de admisión de muestras que se acoplan por medio de unos canales de alimentación (33) al extremo de entrada de los respectivos canales (12). Un electrodo (32) es soportado por el bloque (30) y tiene un extremo dispuesto en el canal de alimentación (33) y el extremo contrario externo al bloque para su conexión a una fuente de alimentación de energía eléctrica de alta tensión. En esta realización, el canal de alimentación (33) contiene un material de empaquetadura (34) para pretratamiento interno de muestras. El canal ilustrado (12) tiene un extremo estrechado progresivamente (36) que forma una punta de lumbrera de salida desde la que el líquido de la muestra se asperja para trasegarlo a un dispositivo externo de recogida de muestras o a un dispositivo de análisis externos.

Para ciertas aplicaciones, el sustrato del microdispositivo se fabrica para contener múltiples estratos de canales independientes no conectados. Refiriéndose a la Figura 1d, una vista en corte de una realización del invento muestra unos canales independientes (12b), (12c) y (12d) cada uno de los cuales representa múltiples canales dentro de un solo plano de acuerdo con la realización del invento mostrada en la Figura 1a. Los planos que contienen a los canales (12b), (12c) y (12d) están posicionados en múltiples estratos apilados, uno encima de otro, del bloque (11a) de sustrato, con cada canal de cada estrato terminando en su propia lumbrera de salida, representada por las lumbreras de salida (16b), (16c), (16d), respectivamente, como se ha mostrado. Esta realización resulta particularmente útil para la detección sistemática de elevada productividad de múltiples muestras.

En las realizaciones anteriormente descritas, los canales yacen generalmente dentro de un único plano del sustrato o cuerpo. Los canales podrían también extenderse entre dos o más planos tal como se ha mostrado en la Figura 1e. Como se ha ilustrado, el canal (12e) se extiende desde un primer piano superior hasta un segundo plano inferior y termina en una lumbrera de salida (16e) en el borde del sustrato (11) del microchip. En general, los canales pueden ser de cualquier configuración y seguir cualquier camino conveniente dentro del sustrato o cuerpo (11) con el fin de permitir la densidad de empaquetadura prevista de los canales y componentes en relación de asociación del dispositivo de microchip.

La distancia entre dos canales determinados se elige dependiendo de la densidad requerida de los canales y de las correspondientes operaciones químicas, así como para minimizar la contaminación cruzada. Si se desea una baja densidad de canales, la distancia entre canales individuales (y entre lumbreras de salida individuales) puede ser de varios milímetros. En este caso, todo el dispositivo se puede posicionar sobre una plataforma móvil para la alineación precisa de cada lumbrera de salida con un analizador de fuera de chip (microdispositivo de fuera de chip). Si se desea una elevada densidad de canales, los canales y sus correspondientes lumbreras de salida están más cerca entre sí (separados solamente por varias decenas de mieras). En este caso, podría no ser necesaria una plataforma móvil.

El invento se puede implementar también con los canales en una disposición circular o de radios. Refiriéndose a la Figura 2a, en el cuerpo (40) se ha provisto una agrupación de canales capilares (42) en una disposición circular o de radios. Los extremos interiores de los canales (42) confrontan una lumbrera común de salida (46). Los extremos de entrada de los canales están acoplados a una admisión de muestras (56) y a unos depósitos (52) de amortiguador según se ha ilustrado. Unos electrodos, típicamente de una película delgada de oro, formados sobre el- - o fijados al - sustrato (41), tienen cada uno un extremo dispuesto dentro de un respectivo depósito de amortiguador y un extremo opuesto accesible para su conexión a una fuente externa de alimentación de energía eléctrica. Las admisiones (56) de muestras y los depósitos (52) de amortiguador son accesibles para el suministro de líquidos, o para las correspondientes lumbreras y/o tubos que se extienden hasta una superficie del sustrato o hacia fuera de la misma para acoplarse al aparato de suministro. La lumbrera de salida podría ser de diversas configuraciones. Refiriéndose a la Figura 2b, se ha mostrado la lumbrera de salida acoplada a una punta (48) de electroaspersión que se extiende hacia fuera desde una placa de cubierta (43), que encierra a los canales del sustrato. La punía tiene típicamente un orificio de salida de alrededor de 1 a 60 micrómetros. En la realización de la Figura 2c, la lumbrera de salida (46) está acoplada a una agrupación de puntas (50) de emisión de campo, cada una de las cuales tiene un orificio de salida de aproximadamente 1 a 10 micrómetros de diámetro. En la Figura 2d se muestra una configuración adicional alternativa de lumbrera de salida en la que un orificio de boquilla está formado dentro de un rebajo (49) de la placa de cubierta (43) junto a la lumbrera de salida (46). El orificio de la boquilla es de aproximadamente 1 a 50 micrómetros de diámetro.

En una realización adicional mostrada en la Figura 3, los canales (62) están dispuestos en una agrupación circular espaciada regularmente en sustratos (61). Los extremos exteriores de los canales (62) se unen a respectivos depósitos (69). Para cada depósito (69) se ha provisto un electrodo como en la realización anteriormente descrita. Cada uno de los canales tiene un extremo interior que se estrecha progresivamente hasta una lumbrera individual de salida (66), de los que todos son accesibles a través de un único agujero (68) practicado en el sustrato (61) del centro de la agrupación. Cada uno de los canales podría contener uno o más depósitos de muestras y uno o más depósitos de amortiguador para adaptarse a requisitos previstos de operación y prestaciones.

La Figura 4 presenta una realización que tiene pares de canales (72) de infusión/separación de muestras y canales (73) de líquido (reactivo) de envoltura, convergiendo cada par en una lumbrera de salida (76). Las lumbreras de salida son lumbreras de aspersión, para usarse con un líquido o un gas de envoltura. Se pueden llevar a cabo una aspersión neumática o una electroaspersión para análisis u obtención de muestras fuera del chip. Para el trasiego por electroaspersión de una muestra en el modo de envoltura, se conecta una fuente de alimentación de energía eléctrica de alta tensión (78) entre los electrodos (76) en un depósito (74) de muestras y en un depósito (75) de envoltura. Alternativamente, se puede aplicar la tensión entre un electrodo de un depósito (74) o (75) y un electrodo en la entrada de un espectrómetro de masas adyacente a las lumbreras de salida (76). En la primera disposición, el potencial de electroaspersión en las lumbreras de salida (76) es función de la tensión total aplicada y de las resistencias de ambos canales (72) y (73). En la segunda disposición, el potencial de electroaspersión en las lumbreras de salida (76) es directamente proporcional a la tensión aplicada en el depósito de muestras. Las lumbreras de salida podrían contener también un electrodo para el control activo de su potencial. El flujo del líquido de envoltura se puede controlar del mismo modo que el descrito anteriormente para el flujo de los canales de muestras. La composición del líquido de envoltura depende de la aplicación prevista. Por ejemplo, el líquido puede contender una solución de agua/compuesto orgánico de un ácido (o base) volátil para controlar el pH de la solución asperjada. El líquido de envoltura puede contener también una solución de una matriz adecuada (por ejemplo, ácido dihidrobenzoico, ácido sinapínico) para la desorción por láser asistida por matriz y el análisis consecutivo por espectrómetro de masas del tiempo de vuelo (en adelante TOF). En este caso se pueden usar tanto la electroaspersión como la aspersión asistida por medios neumáticos. La ionización y desorción con láser asistida por matriz o la ionización por láser se pueden realizar tras la deposición de la solución que sale del microdispositivo sobre un soporte externo, por ejemplo, una membrana, acero inoxidable, etc.

La Figura 5 presenta una realización en la que un sustrato tiene varias lumbreras de admisión ((84) y canales (82) que se funden en una lumbrera de salida (86). Dos de estas agrupaciones se han mostrado en la Figura 5. Cada canal (82) se puede alimentar con diferentes fluidos que contengan, por ejemplo, un patrón de calibración, un fluido de líquido de envoltura o un reactivo químico para mejorar el análisis fuera de chip. El flujo de cada canal se puede controlar por presión, o se puede usar un distribuidor (88) de intensidad de corriente eléctrica regulada para el control preciso de la electromigración y la electro-osmosis en los canales.

Según se ha descrito anteriormente, el dispositivo de microchip del invento se puede usar como una interfaz de electroaspersión para el trasiego de una muestra a un espectrómetro de masas (ESI/MS). Refiriéndose a la Figura 6a, para aumentar el rendimiento de la inyección de muestras en el espectrómetro de masas, el microchip (10) de la Figura 1a se monta en una plataforma tridimensional (21) que permite una alineación precisa, como se muestra en la Figura 6b, de una lumbrera (16) de salida de canal con el orificio de toma de muestras (22) del espectrómetro de masas (23). Un pocillo (14) acoplado a un canal (12) se usa como un depósito de amortiguador para electroforesis. Otro pocillo (13) se usa para entrada de muestras. Un tercer pocillo disponible (15) está obturado y no se usa en esta realización. Cuando se lleva a cabo un experimento de infusión de muestras, los pocillos se hacen herméticos al aire, por ejemplo por medio de obturadores de plástico, para que se pueda aplicar presión para el transporte de una muestra de fluidos en un canal hacia la respectiva lumbrera de salida del canal.

Una fuente de alimentación (24) de energía eléctrica de baja intensidad y alta tensión se usa para aplicar una tensión a través de un electrodo ((25) insertado en un pocillo (14) de depósito de amortiguador a cada canal (12) por turno, para la transferencia por electroaspersión de una muestra del canal respectivo. La fuente de alimentación (24) de alta tensión está conectada a tierra, y hay una segunda conexión a tierra (27) en el espectrómetro de masas. La parte más grande del potencial de tensión es a través del espacio intermedio entre la lumbrera de salida(16) por electroaspersión y el orificio (22) de toma de muestras del espectrómetro de masas, causando de ese modo que tenga lugar la transferencia por electroaspersión de la muestra. La transferencia por electroaspersión de las muestras de fluidos desde los nueve canales del microchip se lleva a cabo en un modo secuencial. Mientas un canal se usa para inyectar una muestra en el espectrómetro de masas, se puede usar otro canal para la preparación de muestras. Después de cada análisis por espectrómetro de masas, el próximo canal será movido por la plataforma (21) a alinearse con el orificio de toma de muestras. La alineación se puede realizar a mano, ajustando manualmente la posición de la plataforma tridimensional, o bien automáticamente, moviendo la plataforma con un motor paso a paso. Una vez alcanzada una tensión óptima, determinada, por ejemplo, mediante el incremento de la tensión hasta que se obtenga la señal óptima, se puede usar para el siguiente canal sin necesidad de ajuste. La distancia entre las lumbreras de salida y el orificio de toma de muestras del espectrómetro de masas no es critica, y puede estar comprendida en el intervalo desde menos de un milímetro hasta varias decenas de milímetros.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar las ventajas del presente invento. Estos ejemplos no están destinados en modo alguno a limitar el alcance del invento.

Ejemplo 1 Infusión de la misma muestra desde diferentes canales

Para investigar las prestaciones de diferentes canales, se infundió una muestra de 0,01 mg/ml de mioglobina desde dos canales seleccionados de la misma sección transversal, usando la realización del microdispositivo del invento mostrada en la Figura 1e. Como se ha mostrado en las Figuras 7a y 7b, la sensibilidad de los espectros de masas registrados obtenidos por electroaspersión era muy similar para estos dos canales, lo que implica que el procedimiento de microfabricación utilizado para preparar el microdispositivo del invento puede generar canales reproducibles. El peso molecular determinado experimentalmente de la mioglobina fue de 16.953, el cual, cuando se compara con el peso molecular real de 16,950, representa un límite de precisión del 0,02%. Las pequeñas diferencias en los espectros son típicas para analizar proteínas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo II Infusión de muestras diferentes de canales diferentes para llevar a cabo análisis de alta productividad.

Para demostrar que el microchip del invento se puede usar como una interfaz de electroaspersión con un espectrómetro de masas para análisis secuenciales, se procesaron en secuencia cuatro muestras diferentes, con cada muestra (en metanol/agua/ ácido acético; 75/25/0,1) rociándose desde un canal diferente en el microdispositivo mostrado en la Figura 1a. En las Figuras 8a hasta 8d se presentan los espectros correspondientes a los cuatro ejemplos analizados. El peso molecular determinado experimentalmente, el peso molecular real y el límite de precisión para cada muestra fueron los siguientes: Figura 8a, 0,1 mg/ml de mioglobulina, Pm_{exp.} = 16,853, Pm_{real} = 16,950, límite de precisión = 0,02%; Figura 8b, 0,1 mg/ml de endorfina, Pm_{exp.} = 3438,3, Pm_{real} = 3438, límite de precisión = 0,01%; Figura 8c, 0,1 mg/ml de hormona de crecimiento humana, Pm_{exp} = 22.120, Pm_{real} = 22124, límite de precisión = 0,02%; y Figura 8d, 0,1 mg/ml de ubicuitina, 8565, Pm_{exp.} = 8565, Pm_{real} = 8557, límite de precisión = 0,09%. Cada análisis se puede llevar a cabo en unos pocos minutos cuando el sistema se opera en un modo de análisis secuencial, una productividad muy elevada para analizar muestras biológicas. Esta solución operativa implica que se puede llevar a cabo la preparación de las muestras en un canal mientras que se está usando otro canal simultáneamente para analizar una muestra. De este modo, el rendimiento de utilización del espectrómetro de masas será más alto de lo que hasta ahora había sido posible. Con un diseño similar al mostrado en la Figura la, se puede fabricar un microdispositivo del invento con tantos como 20 canales para aumentar la productividad de un espectrómetro de masas. Además, un microdispositivo que tenga una agrupación tridimensional de canales, tal como la mostrada en la Figura 1d, haría posible incluso una productividad de muestras sustancialmente más elevada.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo III Estudio de límite de detección

La Figura 9 muestra un espectro de masas por electroaspersión de mioglobina obtenido asperjando una solución de 0,001 mg/ml de mioglobina a 200 nl/min. en metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1) directamente desde la lumbrera de salida del microdispositivo al orificio de toma de muestras del espectrómetro de masas. La relación señal/ruido en el ejemplo es mejor de 10:1, lo que indica que el límite de detección es mejor de 10^{-6} M. La tensión de electroaspersión fue 4,4 kV.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo IV Electroaspersión de una mezcla de muestras

La Figura 10 presenta un espectro de masas de una mezcla de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana y 0,05 mg/ml de ubicuitina en metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1) asperjada desde canales de chip micromecanizados de 60 \mum de anchura y 25 \mum de profundidad a un caudal de 200 nl/min. La tensión de electroaspersión (4,3 kV) se aplicó desde el lado de inyección del chip. En el espectro son visibles dos envolventes separadas de iones múltiplemente cargados que corresponden a componentes individuales de muestra. A partir de estos datos es posible calcular el peso molecular exacto de cada componente de muestra, y los valores de pesos moleculares determinados experimentalmente eran iguales a los del Ejemplo II, cuando cada muestra se analizaba desde un canal separado. Este experimento ilustra que se puede analizar una mezcla compleja con una separación solamente parcial o incluso sin separación de los componentes de muestra dentro del microdispositivo. El espectrómetro de masas sirve de herramienta de separación. En experimentos separados, se puede usar la operación MS/MS para deducir la estructura de los iones individuales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo V Análisis de una muestra en solución acuosa

La Figura 11a presenta un espectro de masas obtenido por electroaspersión de la infusión de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana de una solución acuosa, con metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1) en la jeringuilla para aplicar presión, y la Figura 11b muestra un espectro de masas obtenido por electroaspersión de la infusión de 0,05 mg/ml de hormona de crecimiento humana directamente desde una solución de metanol/agua/ácido acético (75/25/0,1). Este ejemplo muestra que la electroaspersión directa fuera del chip (fuera del microdispositivo) de una muestra acuosa sin ninguna adición anterior de un disolvente orgánico proporciona un espectro de alta calidad (Figura 11a), comparable al obtenido con una muestra suplementada con metanol (Figura 11b), y que se obtuvo el mismo valor determinado experimentalmente de 22.120 tanto si la muestra estaba en un entorno totalmente acuoso como si el entorno se había suplementado con metanol. En la práctica actual con interfases estándar de electroaspersión, las muestras típicamente se suplementan con aditivos orgánicos; sin embargo, para muestras biológicas que no toleran los aditivos orgánicos, la aspersión directa de una solución acuosa es la mejor solución para realizar el análisis.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo VI Digestión en chip de péptidos y proteínas

Refiriéndose a la Figura 12a, se llevó a cabo una digestión en chip de melitina en 20 mM de Tris amortiguador de pH 8,2, relación melitina/tripsina = 300/1 (w/w). La concentración de melitina era de 40 \muM. El espectro (i) de masas obtenido por electroaspersión es para una digestión de 10 minutos, y el espectro (ii) es para una digestión de 1 hora. Se detectaron los mismos fragmentos de muestra, pero en diferentes niveles, después de los dos periodos de tiempo de digestión. Por ejemplo, el pico nº 5, que representa un ión molecular, se redujo después del mayor período de tiempo de digestión, mientras que el pico nº 2, que representa un ión de producto de la digestión, aumentaba con el tiempo.

La Figura 12b presenta una comparación de digestión en chip y fuera de chip de 2 \muM de caseína. Las condiciones de la reacción eran similares a las usadas en el experimento de la Figura 12a, con la excepción de que la relación de caseína/tripsina era de 60. Los dos espectros muestran patrones sustancialmente idénticos. Estos resultados demuestran que el sistema de microescala para manipulación de fluidos del invento se puede usar para estudiar la cinética de la digestión de péptidos y proteínas y también muestra que las digestiones en chip y fuera de chip generan fragmentos muy similares. El éxito de la digestión en chip indica también que la incorporación de la preparación de muestras para la espectrometría de masas en un chip es práctica y simplificará el proceso de manipulación de las muestras y aumentará la productividad de los análisis.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo VII Análisis de una muestra de modelo de ADN

Para explotar el potencial del invento en el análisis de variedades de muestras, se analizó un fragmento corto de ADN (20 mer) por espectrometría de masas por aspersión sin ningún tratamiento anterior, y el espectro resultante se presenta en la Figura 13. Comparado con el peso molecular calculado de 6155, el peso molecular medido experimentalmente de la muestra de 6164,3 da una precisión dentro del 0,615%. La muestra de ADN se roció de una solución del 60% de acetonitrilo y un 40% de agua para facilitar el porcentaje de vaporización de la muestra. Con una precisión tan elevada en la determinación del peso molecular del ADN, se contempla que el invento se puede analizar la detección sistemática de mutaciones de ADN.

Aunque el presente invento se ha descrito en conjunción con una realización preferida, el que tenga una experiencia normal en la técnica tras la lectura de la memoria descriptiva anterior, será capaz de efectuar diversos cambios, sustituciones de equivalentes, y otras alteraciones a las composiciones y métodos especificados en la presente memoria. Por tanto, se pretende que la protección concedida por la Cédula de Privilegio de Invención de la presente sea limitada solamente por las reivindicaciones que se adjuntan como apéndice y las equivalentes de las mismas.

Claims (48)

1. Un sistema microescala para manipulación de líquidos, que comprende:

un sustrato que tiene uno o más canales formados integralmente en el mismo, cuyos uno o más canales terminan en una o más lumbreras de salida en una superficie exterior de dicho sustrato para el trasiego de una cantidad en microescala de una muestra líquida que se desplaza en dichos uno o más canales de dicho sustrato por gotículas, aspersión o corriente; y

un sistema externo de análisis y/o de recogida que tiene una admisión que está próxima - pero separada - de dichas una o más lumbreras de salida de dicho sustrato para recibir dicha cantidad en microescala de una muestra líquida.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dichos uno o más canales cruzan más de un plano principal de dicho sustrato.

3. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato comprende múltiples canales contenidos dentro de un único plano principal de dicho sustrato.

4. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 3, en el que dicho sustrato comprende planos múltiples paralelos de dichos planos principales, cada uno conteniendo múltiples de dichos canales.

5. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que al menos una de dichas una o más lumbreras de salida está situada en un primer plano principal de dicho sustrato que es diferente de un segundo plano principal paralelo a través de dichos uno o más canales.

6. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato es un material de grado óptico.

7. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato es un material no conductor.

8. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato es un material conductor.

9. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que se han cortado rebajos en dicha superficie exterior entre lumbreras de salida adyacentes.

10. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis y dicha superficie exterior de dicho sustrato es una superficie no humidificadora.

11. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, que comprende dos o más de dichas lumbreras de salida, en el que una parte de una superficie de dicho sustrato entre dos de dichas lumbreras de salida está rebajada.

12. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis, y dichas una o más lumbreras de salida se han formado mediante un estrechamiento progresivo de dichos uno o más canales.

13. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, que comprende dos o más de dichos canales en dicho sustrato, en el que dos de dichos canales terminan en una de dichas una o más lumbreras de salida.

14. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, que comprende además medios para la introducción de muestras en el interior de dichos uno o más canales.

15. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que una región de dicho sustrato adyacente a dichos uno o más canales está destinada a llevar a cabo operaciones químicas de muestras u operaciones de preparación u operaciones analíticas en una cantidad en microescala de una muestra de fluidos y para trasegar una muestra de fluidos desde dicha región al interior de dichos uno o más canales.

16. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato comprende además un depósito o lumbrera de admisión fijada a dicho sustrato y destinada a trasegar un fluido al interior de dichos uno o más canales.

\newpage

17. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato tiene uno o más primeros canales formados integralmente en el mismo para conducir una muestra líquida y uno o más segundos canales para conducir un fluido adicional.

18. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 17, en el que dichos uno o más segundos canales convergen con uno o más de dichos primeros canales en una lumbrera de salida común.

19. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dichas una o más lumbreras de salida se han fabricado integralmente con dicho sustrato.

20. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dichas una o más lumbreras de salida se han fabricado por separado de dicho sustrato y se han fijado a dichos términos de dichos canales.

21. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema externo de análisis de espectrómetro de masas.

22. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 21, en el que dicho trasiego de una cantidad en microescala de una muestra líquida de dicho sustrato es por ionización por electroaspersión.

23. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es uno o más sistemas de recogida.

24. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis, y una parte de una superficie de dicho sustrato alrededor de dichas una o más de dichas lumbreras de salida está recubierta con un material para prevenir la humidificación de superficies por dicha muestra líquida que sale de dichas una o más lumbreras de salida.

25. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis, y dicho sustrato es un material no humidificador de superficies.

26. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que dicha lumbrera de salida está recubierta de metal.

27. El sistema microescala para manipulación de líquidos de la reivindicación 1, en el que una superficie interior de uno de dichos uno o más canales está recubierta con un material diferente de dicho sustrato.

28. Un método para procesar cantidades en microescala de un líquido, que comprende las etapas de:

proveer un sistema microescala para manipulación de líquidos que comprende un sustrato que tiene uno o más canales integrados en dicho sustrato, cuyos uno o más canales terminan en una o más lumbreras de salida de una superficie exterior de dicho sustrato;

cargar una muestra líquida en el interior de dichos uno o más canales;

causar que dicha muestra líquida se desplace en dicho canal en la dirección de dicha lumbrera de salida; y

causar que dicha muestra líquida salga de dicho sustrato a través de dicha lumbrera de salida de dicho canal y transferir dicho sustrato por gotículas, aspersión o corriente a un sistema externo de análisis y/o de recogida, cuyo sistema tiene una admisión que está próxima, pero separada, de dicha lumbrera de salida.

29. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un espectrómetro de masas y se causa que dicha muestra líquida se trasiegue a dicho espectrómetro de masas mediante ionización por electroaspersión.

30. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis y se causa que dicha muestra líquida se trasiegue a dicho sistema externo de análisis por nebulización neumática o ultrasónica.

31. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un espectrómetro de masas y se causa que dicha muestra líquida se trasiegue a dicho espectrómetro de masas por ionización química.

32. El método de la reivindicación 28, en el que se causa que dicha muestra líquida se trasiegue a dicho sistema externo de análisis y/o de recogida por ionización de desorción por láser asistida por matriz.

33. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es para la detección por fluorescencia inducida por láser.

34. El método de la reivindicación 28, en el que, en dicha etapa de causar que dicha muestra líquida salga de dicho sustrato, dicho sistema microescala para manipulación de líquidos está estacionario en relación con dicho sistema externo de análisis y/o de recogida.

35. El método de la reivindicación 28, en el que, dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis y en dicha etapa de causar que dicha muestra líquida salga de dicho sustrato, dicho sistema microescala para manipulación de líquidos se mueve en relación con dicho sistema externo de análisis.

36. El método de la reivindicación 28, en el que, antes de dicha etapa de causar que dicha muestra líquida salga de dicho sustrato, dicha muestra líquida o un componente de dicha muestra líquida son detectados en dicho canal.

37. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sustrato comprende además un dispositivo para separar una muestra líquida en componentes de dicha muestra y dicho método comprende además la etapa de separar dicha muestra en componentes de dicha muestra.

38. El método de la reivindicación 37, en el que dicho dispositivo para separar una muestra líquida en componentes de dicha muestra está integrado en dicho sustrato.

39. El método de la reivindicación 37, en el que dicho dispositivo para separar una muestra líquida en componentes de dicha muestra está unido de forma desechable a dicho sustrato.

40. El método de la reivindicación 37, en el que dicho uno de dichos uno o más canales comprende dicho dispositivo para separar una muestra líquida en componentes de dicha muestra.

41. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sustrato comprende además un dispositivo para causar la digestión de una muestra y dicho método comprende además la etapa de digerir dicha muestra.

42. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sustrato comprende además un dispositivo para desalar una muestra y dicho método comprende además la etapa de desalar dicha muestra.

43. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sustrato comprende además un dispositivo para preconcentrar una muestra y dicho método comprende además la etapa de preconcentrar dicha muestra.

44. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis y dicho sustrato comprende además un dispositivo para llevar a cabo la aglutinación por afinidad sobre una muestra y dicho método comprende además la etapa de llevar a cabo la aglutinación por afinidad sobre dicha muestra.

45. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sistema externo de análisis y/o de recogida es un sistema de análisis y dicho sustrato comprende además un dispositivo para cromatografía de exclusión de tamaño y dicho método comprende además la etapa de llevar a cabo la cromatografía de exclusión de tamaño sobre dicha muestra.

46. El método de la reivindicación 28, en el que dicho sustrato tiene uno o más primeros canales formados integralmente en el mismo para conducir muestra líquida, y uno o más segundos canales para conducir un fluido adicional.

47. El método de la reivindicación 46, en el que, en dicho sustrato, dichos uno o más segundos canales convergen con uno o más de dichos primeros canales en una lumbrera de salida común.

48. El método de la reivindicación 46, en el que dichos uno o más segundos canales de dicho sustrato conducen un fluido adicional que se añade a dicha cantidad en microescala de una muestra líquida de tal manera que dicho fluido adicional funciona como una envoltura de fluido.