PT840886E - Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SISTEMA DE MANIPULAÇÃO DE LÍQUIDO À ESCALA MICROSCÓPICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a sistemas de manipulação de liquido à escala microscópica e, particularmente, aos sistemas desse tipo fabricados num dispositivo à escala microscópica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os actuais desenvolvimentos em técnicas de fabrico à escala microscópica permitiram a integração de ferramentas miniatura à escala microscópica para análise bioquímica no interior de um dispositivo de dimensões muito pequenas. Sistemas de processamento químico completos, e. g., câmaras de reacção, tubos capilares de separação e seus reservatórios de eléctrodos associados, bem como determinados tipos de detectores, podem ser consolidados num microship, e. g., em vidro ou sílica fundida. Esses "laboratórios incorporados num chip" permitem, em princípio, a utilização e manipulação eficaz de quantidades mínimas de material. Depois da realização dos processos pretendidos, os compostos processados são disponibilizados no chip, numa forma concentrada espacialmente, que é apropriada para a execução de posteriores operações analíticas. Como os componentes de amostragem se apresentam em volumes da ordem dos nanolitros, as operações subsequentes devem, de um modo preferido, ser realizadas no mesmo dispositivo. (Ver, e. g., 1

Effenhauser et al.

Anal. Chem. 67:2284-2287, 1995). Este condicionalismo, no entanto, permite uma utilização pouco eficiente de determinados instrumentos analíticos potentes, tais como um espectrómetro de massa.

Deve salientar-se que o documento US-A-5376252 divulga um sistema de manipulação de líquido à escala microscópica compreendendo um substrato tendo um canal formado no seu interior. Além disso, deve salientar-se que o documento WO 96/12546 Al, publicado em 2 de Maio de 1966, descreve um dispositivo de colunas planares miniaturizado para utilização num aparelho de separação de fase líquida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um sistema de acordo com as reivindicações de sistema independentes anexas, bem como um método de acordo com as reivindicações de método independentes anexas. A invenção refere-se a um sistema de manipulação de líquido à escala microscópica que permite a transferência eficiente de quantidades em nanolitros ou outras quantidades pequenas de uma amostra de fluido desde o ambiente concentrado espacialmente de um dispositivo à escala microscópica, tal como um chip fabricado à escala microscópica, para dispositivos analíticos ou de recolha "exteriores ao chip" sem aumentar o volume de amostra. 0 sistema de manipulação de líquido da invenção é fabricado na forma de um ou mais canais capilares num corpo ou substrato, que pode ser feito num material não condutor apropriado, tal como sílica ou plástico polimérico, ou num material condutor 2 apropriado, tal como aço inoxidável, metal nobre ou metal semicondutor, tal como silício. 0 dispositivo à escala microscópica da invenção inclui uma ou mais portas de saída integradas numa extremidade de um ou mais dos canais para análise ou recolha consecutiva ou simultânea exterior ao chip de uma amostra aplicada. A porta ou portas de saída podem ser configuradas, por exemplo, para transferir uma amostra para ser analisada por electrovaporização para análise por espectrometria de massa (ESI/MS), para ser analisada por ionização química à pressão atmosférica para análise por espectrometria de massa (APCI/MS), para desorção/ionização da matriz induzida por laser para análise por espectrometria de massa (MALDI/MS), para análise por ressonância magnética nuclear (RMN), para manipulação de amostras por vaporização induzida de modo pneumático ou por ultra-sons, para transferência para um sistema de detecção exterior ao chip, tal como electroquímica, condutividade, fluorescência induzida por laser ou para recolha de fracções específicas, e. g., em tubos capilares de recolha ou sobre membranas de recolha. A amostra é transferida por gotícula, vaporização ou fluxo, como desejado, ou como apropriado para o instrumento ou dispositivo que recebe a amostra transferida. 0 fluido transferido apresenta-se na forma de um líquido.

Os canais do dispositivo à escala microscópica podem ser organizados num qualquer formato que permita um processamento sequencial ou simultâneo de amostras de líquido. Numa forma de realização da invenção, os canais estão dispostos de forma paralela e espaçada, representando cada canal um sistema analítico independente à escala microscópica tendo as suas próprias porta de introdução de amostras e porta de saída. Noutra forma de realização, os canais no dispositivo à escala 3 microscópica estão dispostos segundo um padrão circular, como os raios de uma roda. No centro do padrão circular, todos os canais podem convergir numa porta de saída formada solidariamente numa face do dispositivo à escala microscópica. A porta de saída está adaptada para interagir com um dispositivo externo, tal como um espectrómetro de massa ou membrana, que recebe amostras por meio da porta de saída para análise.

Numa forma de realização, cada canal pode incluir contactos eléctricos, para se poder estabelecer um caminho de circuito eléctrico ao longo do canal. Por exemplo, um contacto eléctrico pode estar situado no lado de entrada de um canal e outro contacto eléctrico pode estar no lado de saída. Numa configuração alternativa, um circuito eléctrico pode ser completado por um contacto externo, para lá da extremidade de saída do canal. Por exemplo, se a porta de saída de um canal for utilizada como uma fonte de electrovaporização para um espectrómetro de massa, o orifício de amostragem do espectrómetro de massa pode servir como o eléctrodo auxiliar. As amostras podem ser transferidas para o exterior do chip para análise subsequente ao comutar a corrente eléctrica, de modo sequencial, para cada canal no chip. No fim da análise, o chip pode ser eliminado. Assim, a invenção permite passar sem manipulações, tal como lavagem, e elimina problemas de transferência de amostras entre operações, ao mesmo tempo que proporciona uma utilização eficiente do espectrómetro de massa ou de outro dispositivo para análise e/ou recolha.

As amostras podem ser introduzidas num canal no dispositivo à escala microscópica da invenção por uma variedade de métodos, e. g., por pressão, injecção electrocinética ou outra técnica, e uma corrente eléctrica e/ou queda de pressão pode ser, depois, 4 aplicada para fazer com que os componentes da amostra migrem ao longo do canal. Os canais podem funcionar apenas para transferência de fluido, e. g., para um espectrómetro de massa, ou os canais podem servir como ambientes para diversos tipos de manipulações de amostras, e. g., para operações de preparação à escala microscópica ou analíticas, tais como electroforese capilar (CE) ou a reacção em cadeia de polimerase (PCR) ou para realizar qualquer tipo de química sobre as amostras. Os canais podem ser preenchidos com membrana ou material de enchimento para efectuar pré-concentração ou enriquecimento de amostras ou para outros passos de tratamento, tal como dessalinização. Além disso, são possíveis outras modificações de componentes de amostras, e. g., por enzimas que estão ligadas de modo covalente às paredes de um canal ou existem livremente num canal. 0 material de enchimento pode estar ligado às paredes dos canais ou pode incluir outros componentes, tais como partículas magnéticas, para que, quando se aplica um campo magnético, as partículas magnéticas mantenham o material de enchimento no lugar. As partículas magnéticas também podem ser utilizadas para uma mistura eficiente de fluidos no interior dos canais, utilizando um campo magnético externo. Também pode ser empregue m filtro maquinado à escala microscópica ou outra estrutura estacionária para reter material de enchimento no lugar. Em alternativa, as estruturas estacionárias podem ser maquinadas à escala microscópica, fundidas ou formadas de qualquer outro modo na superfície de um canal para proporcionar uma área superficial elevada que pode substituir o material de enchimento. Outro método de aplicação de amostras é anexar um suporte de múltiplas amostras miniaturizado, como um sistema híbrido maquinado à escala microscópica, às portas de entrada dos canais. 5

Uma amostra pode ser introduzida num canal numa curta zona inicial ou pode preencher completamente todo o canal. 0 preenchimento de apenas uma pequena parte do canal com a amostra é preferível quando se quer realizar uma separação de componentes de amostra no chip, tal como electroforese ou cromatografia. 0 preenchimento de todo o canal com a amostra pode ser vantajoso em casos em que a análise no exterior do chip exige um fluxo de amostra prolongado, tal como infusão/ionização por electrovaporização de amostras para análise estrutural por espectrometria de massa.

Em muitos casos, pode ser necessário um escoamento de líquido para transportar os analitos numa amostra para um canal específico ou ao longo do comprimento do canal ou para fora do canal por meio de uma porta de saída. Por conseguinte, para ajudar na transferência exigida de fluido, pode incorporar-se um dispositivo de bombagem no ou associado com o dispositivo à escala microscópica da invenção. Por exemplo, pode utilizar-se um elemento de aquecimento para provocar uma expansão térmica, o que irá dar origem a um movimento do líquido de amostra ou pode utilizar-se um elemento de aquecimento para gerar uma microbolha, cuja expansão leva a amostra a deslocar-se no canal. Outras opções podem incluir bombagem pela pressão de um gás ou gases gerados por electrólise no chip. 0 escoamento também pode ser gerado pela aplicação de uma queda de pressão ao longo de um canal ou por electro-osmose no interior de um canal. À medida que as amostras se deslocam para a extremidade de canal, podem ser submetidas a detecção ou análise num local externo ao dispositivo à escala microscópica da invenção por uma variedade de técnicas, incluindo espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear, fluorescência induzida por laser, 6 detecção por ultravioleta, detecção electroquímica ou semelhantes. A extremidade de cada canal pode incluir uma ponta configurada para facilitar a transferência do volume de amostra. Quando a espectrometria de massa é o método analítico, a extremidade de cada canal pode ser fabricada à escala microscópica para formar uma porta ou ponta de saída de electrovaporização que permite transferir iões para o orifício de amostragem do espectrómetro de massa por electrovaporização à escala microscópica. Podem utilizar-se outras configurações de portas de saída para transferir amostras por vaporização assistida de modo pneumático ou por ultra-sons, entre outras. Além disso, se a amostra a transferir for um gás dissolvido, transportado no canal por um líquido de transporte, a porta de saída pode ser configurada para aquecer o líquido de transporte para recuperar a amostra para a fase gasosa para transferência por vaporização. A extremidade de saída do canal pode ser configurada e/ou dimensionada para servir como uma ponta de electrovaporização ou a ponta pode ser formada como uma extensão do canal ou como um anexo do canal. A superfície marginal do substrato pode ser reentrante entre portas de saída adjacentes para minimizar a contaminação cruzada ou o substrato pode ser um material não molhante ou pode ser quimicamente modificado para ser não molhante para que o próprio líquido de saída proporcione a electrovaporização. Quando necessário, o dispositivo à escala microscópica pode ser posicionado num andar de translação para que cada porta de saída possa ficar alinhada com precisão, por sua vez, com o orifício de amostragem do espectrómetro de massa ou de outro dispositivo de utilização. A invenção pode ser utilizada num revestimento fluido (e. g., líquido ou gás) ou modo sem revestimento dependendo do tipo de análise exigida e do tamanho da amostra que sai de um 7 canal. Numa configuração sem revestimento, a porta de saída é formada na extremidade do canal. Quando um revestimento fluido é obrigatório (e. g., para a adição de um líguido, um agente químico e/ou normalizado antes da electrovaporização ou para proporcionar uma ligação eléctrica por meio do revestimento fluido) pode criar-se uma porta de saída no ponto de fusão dos dois canais, um fornecedor da amostra e o outro do líquido de revestimento. A análise selectiva de substâncias a analisar nos modos catiónico e aniónico pode ser efectuada facilmente por uma comutação rápida da polaridade do campo eléctrico.

Podem empregar-se canais com diferentes tamanhos no mesmo dispositivo à escala microscópica. Por exemplo, canais de maiores dimensões podem ser utilizados para operações de limpeza e canais mais pequenos podem ser utilizados para operações de processamento. Além disso, podem efectuar-se outras operações noutras regiões do dispositivo, tais como processamento químico, separação, isolamento ou detecção de uma amostra ou de um componente da amostra, antes da introdução da amostra num canal. Assim, é possível realizar operações químicas na amostra ou levar a cabo operações de preparação à escala microscópica e analíticas numa amostra inicial e nos seus componentes distintos no interior do dispositivo da invenção antes da transferência da amostra ou dos seus componentes para o exterior do chip para análise posterior ou recolha. Além disso, a detecção de uma amostra pode ser realizada no próprio dispositivo à escala microscópica, e. g., por um sistema de detecção de fibra óptica, que pode proporcionar informação de controlo complementar para análise e detecção no exterior do chip ou por qualquer outro detector apropriado, tal como fluorescência induzida por laser, condutividade e/ou detector electroquímico.

Processos apropriados para fabricar o dispositivo à escala microscópica da invenção são, eles próprios, bem conhecidos na técnica e incluem, como exemplos, técnicas de fotolitografia e de gravação química, maquinação a laser, técnicas de fabrico de multicamadas, tal como estereolitografia, e técnicas de estampagem, moldagem ou fundição.

Os canais podem ser cilíndricos, trapezoidais ou com uma secção transversal com qualquer outra forma. 0 padrão dos canais pode ser linear ou curvilíneo num único plano. Além disso, o dispositivo à escala microscópica pode incluir múltiplas dessas camadas de canais independentes e desconectados. Em alternativa, um canal individual pode estender-se entre dois ou mais planos para permitir a transferência de uma amostra desde um local de uma porta de entrada desejado para um local de porta de saída desejado. Um canal também pode ter um qualquer comprimento necessário para permitir uma tal transferência. De um modo mais básico, um canal pode ser simplesmente uma fenda rectilínea ligando uma porta de entrada e uma porta de saída.

Reservatórios tampão, câmaras de reacção, reservatórios de amostras e células de detecção também podem ser fabricados em conjunto com cada canal individual. Estruturas mais complexas podem ser criadas por empilhamento ou, então, por montagem de dois ou mais dispositivos fabricados à escala microscópica. Além disso, blocos de instrumentos individuais, tais como reservatórios de amostras, canais de pré-tratamento ou separação e portas de saída, podem ser maquinados à escala microscópica, em separado e combinados num sistema completo, tal como se formam circuitos híbridos integrados no campo da electrónica. As técnicas de fabrico à escala microscópica são precisas e irão 9 permitir um elevado grau de reprodutibilidade de formas e dimensões de canais e portas de sarda seleccionados. 0 sistema de manipulação de fluido à escala microscópica da invenção permite uma utilização mais eficiente de dispositivos analíticos potentes, tais como o espectrómetro de massa, do que é actualmente possível. Além disso, o sistema da invenção pode ser fabricado como um dispositivo descartável apropriado para uma automação económica da análise de um grande número de amostras. Ao utilizar esta abordagem de maquinação à escala microscópica, seria possível uma análise de elevada produtividade por espectrometria de massa. Além disso, a manipulação de pequenos volumes e quantidades de amostras seria facilitada e o consumo de amostras e reagentes de valor elevado seria reduzido. Aplicações incluem quaisquer métodos de análise laboratorial, especialmente quando se deseja uma produtividade elevada e minimização de contaminação cruzada, tais como métodos de detecção e diagnóstico, e outros métodos analíticos, como farmacodinâmica, nos quais se exigem colunas novas para cada análise.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição que se segue das suas formas de realização preferidas e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. la é uma vista em planta de uma forma de realização do sistema de manipulação de fluido à escala microscópica da invenção, na qual os canais associados para transporte de amostras estão dispostos em paralelo num único plano; 10 A Fig. lb é uma vista em corte de uma forma de realização da invenção que mostra extensões de cavidades opcionais; A Fig. lc é uma vista em corte de uma forma de realização da invenção que mostra um bloco de portas amostra/eléctrodo anexado; A Fig. ld é uma vista em corte de uma forma de realização da invenção que mostra múltiplas camadas de canais desconectados para transporte de amostras; A Fig. le é uma vista em corte de uma forma de realização da invenção que mostra um canal com uma configuração multiplanar; A Fig. 2a é uma vista em planta de outra forma de realização do sistema de manipulação de fluido à escala microscópica da invenção na qual os canais associados para transporte de amostras têm uma disposição circular, fundindo-se numa porta de saida comum;

As Figs. 2b-2d são vistas laterais de três formas de realização diferentes da porta de saida representada na Fig. 2a; A Fig. 3 mostra outra disposição circular de canais de transporte de amostras na qual cada canal termina numa porta de saida distinta da orla de um orifício no centro do chip; A Fig. 4 é uma vista em planta de uma disposição de canais noutra forma de realização da invenção na qual as portas de saída estão configuradas como portas de vaporização a 11 utilizar com um liquido de revestimento para vaporização pneumática ou electrovaporização para manipulação de amostras no exterior do chip; A Fig. 5 é uma vista em planta de uma disposição de canais noutra forma de realização da invenção na qual vários canais se fundem numa porta de saída; A Fig. 6a é uma representação esquemática do dispositivo à escala microscópica da Fig. la utilizado como uma interface de electrovaporização com um espectrómetro de massa; A Fig. 6b é uma ampliação de uma parte indicada da Fig. 6a;

As Figs. 7a e 7b mostram espectros de massa por electrovaporização resultantes da infusão de 0,01 mg/mL de mioglobina (200 nL/min) desde dois canais seleccionados do dispositivo à escala microscópica da Fig. la com a mesma largura e profundidade;

As Figs. 8a e 8b mostram espectros de massa por electrovaporização resultantes da infusão de diferentes amostras em metanol/água/ácido acético (75/25/0,1) desde canais diferentes do dispositivo à escala microscópica da: Fig. 8a, 0,1 mg/mL de mioglobina; Fig. 8b, 0,1 mg/mL de endorfina; Fig. 8c, 0,1 mg/mL de hormona de crescimento humano; e Fig. 8d, 0,1 mg/mL de ubiquitina; A Fig. 9 mostra um espectro de massa por electrovaporização resultante da detecção ESI/MS de 0,001 mg/mL de mioglobina em metanol/água/ácido acético (75/25/0,1); 12 A Fig. 10 mostra um espectro de massa por electrovaporização de uma mistura de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano e 0,05 mg/mL de ubiquitina em metanol/água/ácido acético (75/25/0,1), infundida desde o dispositivo à escala microscópica da Fig. la, num estudo do limite de detecção utilizando o dispositivo; A Fig. 11 mostra um espectro de massa por electrovaporização resultante da infusão de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano desde uma solução aquosa, com metanol/água/ácido acético (75/25/0,1) numa seringa para aplicação de pressão e A Fig. 11b mostra um espectro de massa por electrovaporização resultante da infusão de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano directamente de uma solução de metanol/água/ácido acético (75/25/0,1); A Fig. 12a, partes i e ii, mostram espectros de massa por electrovaporização de uma digestão tríptica no chip de melitina a 30 μΜ em 20 mM Tris pH 8,2, com uma proporção de melitinina/tripsina = 300/1 (p/p) para dois períodos de tempo diferentes; A Fig. 12b, partes i e ii, mostram espectros de massa por electrovaporização de digestões trípticas no chip e no exterior do chip de caseína a 2 μΜ em 20 mM Tris pH 8,2, com uma proporção de caseína/tripsina = 60/1 (p/p); e A Fig. 13 mostra um espectro de massa por electrovaporização de um curto fragmento de ADN (20 mer) em 60% de acetonitrilo, 40% H20. 13

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO O dispositivo à escala microscópica da invenção permite a integração de sistemas de reacção e separação à escala microscópica com os potentes sistemas analíticos e/ou de recolha que só estão disponíveis no exterior do chip. Uma forma de realização da invenção é mostrada nas Figs. la e lb e inclui um substrato ou corpo de microship contendo uma série de canais ou ranhuras independentes, fabricados com uma disposição em paralelo em conjunto com as suas portas de entrada de amostras associadas e reservatórios tampão, numa superfície de uma parte planar de um corpo ou chip de vidro. As portas de saída são fabricadas na extremidade dos canais respectivos, na borda do chip. A parte preenchida com ranhuras do chip está coberta com uma placa de cobertura para fechar os canais.

No que se refere à Fig. la, o chip (10), mostrado sem a sua placa de cobertura associada, contém nove canais (12) paralelos, todos com a mesma largura e profundidade (60 pm x 25 pm) , gravados numa superfície do substrato (11) do microship. Os canais têm três comprimentos diferentes de modo a optimizar a disposição dos canais. Cada canal (12) está ligado a três cavidades (13, 14, 15) que permitem aceder aos canais, e. g., para infundir amostras através dos canais, para manipular soluções diferentes que poderiam ser adicionadas a uma amostra num canal e também para utilizar como um reservatório tampão de electrof orese. Cada cavidade tem um dm de 1 mm e uma profundidade de 0,5 mm, com um volume de 0,4 pL. Cada cavidade (13 e 15) está acoplada ao seu canal correspondente por uma ranhura ou canal (12a). Tubos microscópicos em plástico (não mostrados) podem ser fixos ao topo da cobertura e em comunicação com as cavidades para aumentar o seu volume, por exemplo, até 14 10 pL. No que se refere à Fig. lb, as amostras são introduzidas nas cavidades (13), através de extensões (13a) de cavidade opcionais e de furos (13b) de entrada de amostras na placa (13c) de cobertura, por qualquer meio conveniente, tal como tubos de alimentação ou seringas nas quais se coloca o chip durante a introdução de amostras.

No que se refere, de novo, à Fig. la, portas (16) de saida na extremidade de cada canal e na borda do substrato de microship servem como portas de saida de electrovaporização através da utilização de um revestimento não molhante, e. g., polidimetilsiloxanodiol, na área (18) superficial externa do substrato de microship entre duas portas (16) de saida, para isolar uma solução a ser electrovaporizada desde uma porta de saida. Os canais estão afastados entre si, na versão ilustrada, por 6 mm. Em alternativa, entalhes ou reentrâncias (20) podem ser recortados na superfície externa do substrato de microship entre portas (16) de saída adjacentes, para isolar as portas de saída e evitar ou minimizar contaminação cruzada entre canais.

Na forma de realização mostrada na Fig. lc, proporciona-se um bloco de portas amostra/eléctrodo na forma de um elemento distinto que está fixo ao corpo do microship. No que se refere à Fig. lc, o corpo (11) tem um bloco (30) de portas amostra/eléctrodo disposto ao longo de um lado do corpo. O bloco (30) contém portas (31) de entrada de amostras que estão acopladas, por meio de canais (33) de alimentação, à extremidade de entrada de respectivos canais (12). Um eléctrodo (32) é suportado pelo bloco (30) e tem uma extremidade disposta no canal (33) de alimentação e a extremidade oposta externa ao bloco para ligação a uma fonte de alimentação de alta tensão. Nesta forma de realização, o canal (33) de alimentação contém um 15 material (34) de enchimento para pré-tratamento interno de amostras. 0 canal (12) ilustrado tem uma extremidade (35) afunilada formando uma ponta de porta de saída a partir da qual o líquido de amostra é pulverizado para ser transferido para um dispositivo de recolha ou analítico externo.

Para determinadas aplicações, o substrato do dispositivo à escala microscópica é fabricado de modo a conter múltiplas camadas de canais independentes desconectados. No que se refere à Fig. ld, uma vista em corte de uma forma de realização da invenção mostra canais (12b), (12c) e (12d) independentes, representando cada, múltiplos canais num único plano de acordo com a forma de realização da invenção mostrada na Fig. la. Os planos contendo canais (12b), (12c) e (12d) estão posicionados em múltiplas camadas empilhadas, umas em cima das outras, no bloco (11a) de substrato, terminando cada canal em cada camada na sua própria porta de saída, representada por portas (16b), (16c) e (16d) de saída, respectivamente, como mostrado. Esta forma de realização é particularmente útil para uma detecção de elevada produtividade de múltiplas amostras.

Nas formas de realização descritas acima, os canais situam-se, de um modo geral, num único plano do substrato ou corpo. Os canais também podem estender-se entre dois ou mais planos, tal como mostrado na Fig. le. Como ilustrado, o canal (12e) estende-se desde um primeiro plano superior até um segundo plano inferior e termina na porta (16 e) de saída na borda do substrato (11) de microship. De um modo geral, os canais podem apresentar uma qualquer configuração e seguir um qualquer caminho conveniente no interior do substrato ou corpo (11) de modo a permitir a densidade de enchimento pretendida dos canais e componentes associados do dispositivo de microship. 16 A distância entre dois canais dados é escolhida em função da densidade exigida dos canais e das operações químicas associadas, bem como para minimizar a contaminação cruzada. Se se desejar uma densidade de canal baixa, a distância entre canais individuais (e entre portas de saída individuais) pode ser de vários milímetros. Neste caso, todo o dispositivo pode ser posicionado num andar móvel para alinhamento preciso de cada porta de saída com um analisador no exterior do chip (dispositivo à escala microscópica no exterior). Se se desejar uma densidade de canal elevada, os canais e as suas portas de saída associadas irão estar mais próximas umas das outras (separadas apenas por várias dezenas de mícrones). Neste caso, um andar móvel pode não ser necessário. A invenção também pode ser implementada com os canais com uma disposição circular ou de raios. No que se refere à Fig. 2a, uma série de canais (42) capilares é proporcionada no corpo (40) numa disposição circular ou de raios. As extremidades internas dos canais (42) confrontam uma porta (46) de saída comum. As extremidades de entrada dos canais estão acopladas a uma entrada (56) de amostras e reservatórios (52) tampão, como ilustrado. Os eléctrodos, tipicamente constituídos por uma película de ouro fina, formado no ou fixo ao substrato (41), têm cada uma extremidade disposta no interior de um reservatório tampão respectivo e uma extremidade oposta acessível para ligação a uma fonte de alimentação externa. As entradas (56) de amostras e reservatórios (52) tampão são acessíveis para fornecimento de líquidos ou para portas e/ou tubos associados estendidos até uma superfície do substrato ou para o exterior deste para acoplamento a um aparelho de alimentação. A porta de saída pode ter várias configurações. No que se refere à Fig. 2b, mostra-se que a porta de saída está acoplada a uma ponta (48) de 17 electrovaporização estendida para fora desde uma placa (43) de cobertura, que envolve os canais do substrato. A ponta tem, tipicamente, um orifício de saída com cerca de 1 a 60 micrómetros. Na forma de realização da Fig. 2c, a porta (46) de saída está acoplada a uma série de pontas (50) de emissão de campo, em que cada uma tem um orifício de saída com um diâmetro de cerca de 1 a 10 micrómetros. Uma outra configuração de porta de saída alternativa é mostrada na Fig. 2d, na qual um orifício injector está formado no interior de uma reentrância (49) na placa (43 ) de cobertura adjacente à porta (46) de saída. 0 orifício injector tem um diâmetro de cerca de 1 a 50 micrómetros.

Numa outra forma de realização mostrada na Fig. 3, os canais (62) estão dispostos numa disposição circular regularmente espaçada no substrato (61). As extremidades externas dos canais (61) estão unidas a reservatórios (69) respectivos. Um eléctrodo é proporcionado para cada reservatório (69), como na forma de realização descrita acima. Cada um dos canais tem uma extremidade interna afunilada até uma porta (66) de saída individual, sendo todas elas acessíveis através de um único furo (68) no substrato (61) no centro da disposição. Cada um dos canais pode conter um ou mais reservatórios de amostras e um ou mais reservatórios tampão para satisfazer requisitos de desempenho e operacionais. A Fig. 4 mostra uma forma de realização tendo pares de canais (72) de separação/infusão de amostras e canais (73) de líquido de revestimento (reagente), convergindo cada par numa porta (76) de saída. As portas de saída sao portas de vaporização a utilizar com um líquido ou gás de revestimento. Pode realizar-se uma vaporização pneumática ou 18 electrovaporização para análise ou recolha de amostras no exterior do chip. Para transferência por electrovaporização de uma amostra no modo de revestimento, uma fonte (78) de alimentação de alta tensão é ligada entre eléctrodos (79) num reservatório (74) de amostras e num reservatório (75) de revestimento. Em alternativa, a tensão pode ser aplicada entre um eléctrodo no reservatório (74) ou (75) e um eléctrodo na entrada de um espectrómetro de massa adjacente às portas (76) de saída. Na primeira configuração, o potencial de electrovaporização nas portas (76) de saída é uma função da tensão aplicada total e das resistências de ambos os canais (72) e (73). Na segunda configuração, o potencial de electrovaporização nas portas (76) de saída é directamente proporcional à tensão aplicada no reservatório de amostras. As portas de saída também podem conter um eléctrodo para controlo activo do seu potencial. 0 escoamento de líquido de revestimento pode ser controlado do mesmo modo que descrito anteriormente para o escoamento nos canais de escoamento. A composição do líquido de revestimento depende da aplicação desejada. Por exemplo, o líquido pode conter uma solução água/orgânica de um ácido (ou base) volátil para controlar o pH da solução electrovaporizada. 0 líquido de revestimento também pode conter uma solução de uma matriz adequada (e. g., ácido di-hidrobenzóico, ácido sinapinico) para desorção de matriz induzida por laser e análise por espectrometria de massa por tempo de voo (TOF) consecutivo. Neste caso, tanto se pode utilizar electrovaporização como vaporização induzida de modo pneumático. A desorção/ionização por laser e/ou de matriz induzida por laser pode ser executada após deposição da solução que sai do dispositivo à escala 19 microscópica num suporte externo, e. g., membrana, aço inoxidável. A Fig. 5 mostra uma forma de realização na qual um substrato tem várias portas (84) de entrada e canais (82) que se fundem numa porta (86) de saida. Duas dessas disposições são mostradas na Fig. 5. Cada canal (82) pode ser fornecido com diferentes fluidos contendo, por exemplo, um fluido de revestimento liquido normalizado de calibração ou um reagente químico para melhorar a análise no exterior do chip. 0 escoamento em cada canal pode ser controlado em termos de pressão ou pode utilizar-se um distribuidor (88) de corrente eléctrica regulado para um controlo preciso de electromigração e electro-osmose nos canais.

Como descrito acima, o dispositivo de microship da invenção pode ser utilizado como uma interface de electrovaporização para transferir uma amostra para um espectrómetro de massa (ESI/MS). No que se refere à Fig. 6a, para aumentar a eficiência de injecção de amostras para detecção no espectrómetro de massa, o microship (10) da Fig. la está montado num andar (21) tridimensional que permite um alinhamento preciso, como mostrado na Fig. 6b, de uma porta (16) de saída de canal com o orifício (22) de amostragem do espectrómetro (23) de massa. Uma cavidade (14) acoplada a um canal (12) é utilizada como um reservatório tampão de electroforese. Outra cavidade (13) é utilizada para introdução de amostras. Uma terceira cavidade (15) disponível está tamponada e não é utilizada nesta forma de realização. Quando se realiza uma experiência de infusão de amostras, as cavidades são herméticas, e. g., através da utilização de obturadores de plástico, para que se possa aplicar pressão para transportar uma amostra de fluido num canal na direcção da respectiva porta de saída de canal. 20

Utiliza-se uma fonte (24) de alimentação de alta tensão e baixa corrente para aplicar uma tensão, por meio de um eléctrodo (25) inserido numa cavidade (14) de reservatório tampão, a cada canal (12), à vez, para transferência por electrovaporização de uma amostra no canal respectivo. A fonte (24) de alimentação de alta tensão está ligada (26) à terra e há uma segunda terra (27) no espectrómetro de massa. A parte mais elevada do potencial de tensão é na folga entre a porta (16) de saida de electrovaporização e o orifício (22) de amostragem do espectrómetro de massa, fazendo, assim, com que ocorra a transferência por electrovaporização da amostra. A transferência por electrovaporização de amostras de fluido desde os nove canais do microship é realizada sequencialmente. Quando um canal é utilizado para injectar uma amostra no espectrómetro de massa, pode utilizar-se outro canal para preparação de amostras. Depois de cada análise do espectrómetro de massa, o canal seguinte irá ser deslocado pelo andar (21) para ficar alinhado com o orifício de amostragem. 0 alinhamento pode ser efectuado manualmente, regulando a posição do andar tridimensional à mão ou automaticamente, deslocando o andar com um motor passo a passo. Depois de se atingir uma tensão optimizada, determinada, e. g., pelo aumento da tensão até se obter o melhor sinal, esta pode ser utilizada para o canal seguinte sem qualquer regulação posterior. A distância entre as portas de saída e o orifício de amostragem do espectrómetro de massa não é crítica e pode estar compreendida no intervalo entre menos de um milímetro e várias dezenas de milímetros.

Os exemplos que se seguem são apresentados para ilustrar as vantagens da presente invenção. Estes exemplos não foram, de modo nenhum, concebidos para limitar o âmbito da invenção. 21

EXEMPLO I

Infusão da mesma amostra a partir de diferentes canais

Para investigar o desempenho de diferentes canais, infundiu-se uma amostra de 0,01 mg/mL de mioglobina a partir de dois canais seleccionados com a mesma secção transversal utilizando a forma de realização do dispositivo à escala microscópica da invenção mostrado na Fig. la. Como mostrado nas Figs. 7a e 7b, a sensibilidade dos espectros de massa por electrovaporização registados foi muito semelhante para estes dois canais, implicando que o processo de fabrico à escala microscópica utilizado para preparar o dispositivo à escala microscópica pode gerar canais reprodutíveis. O peso molecular da mioglobina determinado experimentalmente foi 16953, o que, comparativamente com o peso molecular real de 16950, representa um limite de exactidão de 0,02%. As diferenças subtis nos espectros são típicas na análise de proteínas.

EXEMPLO II

Infusão de diferentes amostras a partir de diferentes canais para realizar uma análise de elevada produtividade

Para demonstrar que o microship da invenção pode ser utilizado como uma interface de electrovaporização com um espectrómetro de massa para análise sequencial, processaram-se, em sequência, quatro amostras diferentes, sendo cada amostra (em metanol/água/ácido acético; 75/25/0,1) vaporizada a partir de um diferente canal no dispositivo à escala microscópica mostrado na 22

Fig. la. Os espectros correspondentes aos quatro exemplos analisados são apresentados nas Figs. 8a-8d. 0 peso molecular determinado experimentalmente, o peso molecular real e o limite de exactidão para cada amostra foram os seguintes: Fig. 8a, 0,1 mg/mL mioglobulina, MWexp = 16953, MWact = 16950, limite de exactidão = 0.02%; Fig. 8b, 0,1 mg/mL endorfina, MWexp = 3438,3, MWact = 3438, limite de exactidão = 0,01%;

Fig. 8c, 0,1 mg/mL hormona de crescimento humano, MWexp = 22120,

MWact = 22124, limite de exactidão = 0,02%; e Fig. 8d, 0,1 mg/mL ubiquitina, MWexp = 8565, MWact = 8557, limite de exactidão = 0,09%. Cada análise pode ser realizada em poucos minutos quando o sistema é operado num modo de análise sequencial, no qual a produtividade é muito elevada para analisar amostras biológicas. Esta abordagem operacional implica que a preparação de amostras pode ser realizada num canal, enquanto outro canal está a ser utilizado simultaneamente para analisar uma amostra. Neste modo, o rendimento de utilização do espectrómetro de massa irá ser mais elevado do que era anteriormente possivel. Com uma concepção semelhante à mostrada na Fig. la, pode fabricar-se um dispositivo à escala microscópica da invenção com um número elevado de 20 canais para aumentar a produtividade das análises de um espectrómetro de massa. Além disso, um dispositivo à escala microscópica tendo uma disposição tridimensional de canais, tal como é mostrado na Fig. ld, possibilitaria uma produtividade de amostras ainda substancialmente mais elevada. 23

EXEMPLO III

Estudo de limite de detecção A Fig. 9 mostra um espectro de massa por electrovaporização de mioglobina obtido por electrovaporização de 0,001 mg/mL de uma solução de mioglobina a 200 nL/min em metanol/água/ácido acético (75/25/0,1) directamente da porta de saída do dispositivo à escala microscópica para o orifício de amostragem do espectrómetro de massa. A relação sinal-ruído neste exemplo é superior a 10:1, indicando que o limite de detecção é superior a 1CT8 Μ. A tensão de electrovaporização foi 4,4 Kv.

EXEMPLO IV

Electrovaporização de uma mistura de amostras A Fig. 10 mostra um espectro de massa de uma mistura de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano e 0,05 mg/mL de ubiquitina em metanol/água/ácido acético (75/25/0,1) vaporizada a partir de canais de chip maquinados à escala microscópica com uma largura de 6 0 pm e profundidade de 25 pm com um caudal de 200 nL/min. A tensão de electrovaporização (4,3 kV) foi aplicada desde o lado de injecção do chip. Duas envolventes separadas de múltiplos iões carregados correspondentes a componentes de amostras individuais são visíveis no espectro. O cálculo do peso molecular exacto de cada componente de amostra é possível a partir destes dados e os valores de MW determinados experimentalmente foram iguais aos do Exemplo II, quando cada amostra foi analisada a partir de um canal distinto. Esta experiência ilustra o facto de uma mistura complexa poder ser analisada com uma separação apenas parcial ou sem separação, dos componentes de amostra no interior do dispositivo à escala microscópica. 0 espectrómetro de massa funciona como a ferramenta de separação. Em experiências distintas, pode utilizar-se a operação MS/MS para deduzir a estrutura de iões individuais.

EXEMPLO V

Análise de uma amostra em solução aquosa A Fig. 11a mostra um espectro de massa por electrovaporização resultante da infusão de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano a partir de uma solução aquosa com metanol/água/ácido acético (75/25/0,1) na seringa para aplicação de pressão e a Fig. 11b mostra um espectro de massa por electrovaporização resultante da infusão de 0,05 mg/mL de hormona de crescimento humano directamente a partir de uma solução de metanol/água/ácido acético (75/25/0,1). Este exemplo mostra que a electrovaporização directa no exterior do chip (no exterior do dispositivo à escala microscópica) de uma solução aquosa sem qualquer adição anterior de um solvente orgânico proporciona um espectro de qualidade elevada (Fig. 11a), comparativamente com o obtido com uma amostra suplementada com metanol (Fig. 11b) e que se obtém o mesmo valor de peso molecular determinado experimentalmente de 22 120, esteja a amostra num ambiente totalmente aquoso ou suplementando com metanol. Na prática actual, com interfaces de electrovaporização normalizadas, as amostras são, tipicamente, suplementadas com aditivos orgânicos; no entanto, para amostras biológicas que não 25 toleram aditivos orgânicos, a vaporizaçao directa de uma solução aquosa é a melhor abordagem para executar a análise.

EXEMPLO VI

Digestão no chip de péptidos e proteínas

No que se refere à Fig. 12a, realizou-se uma digestão no chip de melitina num tampão de 20 mM Tris de pH 8,2, com uma proporção de melitina/tripsina = 300/1 (p/p). A concentração de melitina foi de 40 pm. O espectro de massa por electrovaporização (i) tem uma digestão de 10 min e o espectro (ii) é para uma digestão de 1 h. Detectaram-se os mesmos fragmentos de amostra, mas com diferentes níveis, depois dos dois períodos de tempo de digestão. Por exemplo, o pico n° 5, representando um ião molecular, é reduzido depois do período de tempo de digestão mais prolongado, enquanto o pico n° 2, representando um ião de produto da digestão aumenta com o tempo. A Fig. 12b apresenta uma comparação entre a digestão no chip e no exterior deste de 2 μΜ de caseína. As condições de reacção foram semelhantes às utilizadas na experiência da Fig. 12a, excepto no facto de a proporção caseína/triptina ser 60. Os dois espectros mostraram padrões substancialmente idênticos. Estes resultados demonstram que o sistema de manipulação de fluido à escala microscópica da invenção pode ser utilizado para estudar a digestão cinética de péptidos e proteínas e também mostra que a digestão no chip e no exterior deste, gera fragmentos muito semelhantes. O sucesso da digestão no chip também indica que a incorporação de uma preparação de amostra para espectrometria de massa por electrovaporização num 26 chip é prática e irá simplificar o processo de manipulaçao de amostras e aumentar a produtividade das análises.

EXEMPLO VII

Análise de uma amostra de ADN modelo

Para explorar o potencial da invenção na análise de variedades de amostras, um curto fragmento de ADN (20 mer) foi analisado por espectrometria de massa por electrovaporização sem qualquer tratamento anterior e o espectro resultante é apresentado na Fig. 13. Comparativamente com o peso molecular calculado de 6 155, o peso molecular medido experimentalmente da amostra é 6164,3, uma exactidão da ordem dos 0,615%. A amostra de ADN foi vaporizada a partir de uma solução de 60% de acetonitrilo, 40% de H20 para facilitar a percentagem de vaporização de amostra. Com uma exactidão tão elevada como esta na determinação do peso molecular do ADN, prevê-se que a invenção possa ser analisada para rastrear mutações de ADN.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em associação com uma forma de realização preferida, um especialista na técnica, após ler a descrição exposta, estará apto a efectuar várias alterações, substituições de equivalentes e outras alterações das composições e métodos aqui enunciados. Pretende-se, por conseguinte, que a protecção concedida à presente invenção pela Carta-Patente seja apenas limitada pelas reivindicações apensas e seus equivalentes.

Lisboa, 23 de Junho de 2010 27

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Sistema de manipulação de liquido à escala microscópica compreendendo um substrato tendo um ou mais canais formados solidariamente no mesmo, terminando o ou os referidos canais numa ou mais portas de saída numa superfície externa do referido substrato para transferir uma quantidade à escala microscópica de uma amostra de líquido que circula no ou nos referidos canais do referido substrato por qotícula, vaporização ou fluxo; e um sistema analítico e/ou de recolha externo tendo uma entrada próxima, mas separada, da ou das referidas portas de saída do referido substrato para receber a referida quantidade à escala microscópica de uma amostra de líquido.
2. 2. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o ou os referidos canais atravessam mais do que um plano principal do referido substrato.
3. 3. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato compreende múltiplos canais contidos num único plano principal do referido substrato.
4. 4. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 3, em que o referido substrato compreende múltiplos dos referidos planos principais paralelos, contendo, cada, múltiplos dos referidos canais. 1 5. Sistema de manipulação de liquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que, pelo menos uma, da ou das referidas portas de sarda está situada num primeiro plano principal do referido substrato que é diferente de um segundo plano principal paralelo através de um do ou dos referidos canais.
5. 5/15 PORTAS DE SAÍDA

   FIG. 4 86 T\
6. 6/15 FIG. 6A

   ANDAR uTRI-DIMENSIONAly FONTE DE ALIMENTAÇÃO HV —

   \«J 2i FIG. 6B -26 7/15 Jl T gZ. / MESMA AMOSTRA DE 0,6 μηι DE MIOGLOBINA DE *- -* ^ * * U. -M. DIFERENTES CANAIS Γ 1304.9 Em INTENSIDADE RELATIVA INTENSIDADE RELATIVA

   6. Sistema de manipulação de liquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato é um material de qualidade óptica.
7. 7. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato é um material não condutor.
8. 8/15 FIG. 8A AMOSTRAS DIFERENTES DE CADA CANAL INTENSIDADE RELATIVA

   m- +5 688.7 £+087 51 80- < > H < _1 LU DC LU Q < Q ω z LU 60- 40- 20- 600 +4 860.5 +3 1/47.1 .LLl 30 μαι DE ENDORFINA MWexp * 3438.3 MWact - 3438 EXACTIDÃO · 0.0/ % 800 /000 FIG. 8B /200 m/z -H- /400 /600 /800 9/15 FIG. 8C AMOSTRAS DIFERENTES DE CADA CANAL

   INTENSIDADE RELATIVA

   8. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato é um material condutor.
9. 9. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que se recortam reentrâncias na referida superfície externa entre portas de saída adjacentes.
10. 10/15 ESPECTRO PARA 60 μηι DE MIOGLOBINA INTENSIDADE RELATIVA

    FIG.9 11/15 MISTURA DE 2 μηι DE HORMONA DE CRESCIMENTO HUMANO E 6 um DE UBUQUITINA INTENSIDADE RELATIVA

    FIO. 10 12/15 HaO VS. 75% DE MeOH HORMONA DE CRESCIMENTO HUMANO FIG. 11 A

    10. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e a referida superfície externa do referido substrato é uma superfície não molhante.
11. 11. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, compreendendo duas ou mais portas de saída, em que uma parte de uma superfície do referido 2 substrato entre duas das referidas portas de saída é reentrante.
12. 12. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e a ou as referidas portas de saída são formadas por um afunilamento do ou dos referidos canais.
13. 13/15 10 MIN. VS 1 HR. DIGESTÃO DE MELITINA NO CHIP INTENSIDADE RELATIVA INTENSIDADE RELATIVA

    FIG. 12 A 14/15 DIGESTÃO DE CASEÍNA INTENSIDADE RELATIVA

    13. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, compreendendo dois ou mais dos referidos canais no referido substrato, em que dois dos referidos canais terminam numa da ou das referidas portas de saída.
14. 14. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, compreendendo ainda meios para introdução de amostras no ou nos referidos canais.

    15. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que uma região do referido substrato adjacente ao ou aos referidos canais está adaptada para realizar operações químicas ou operações de preparação à escala microscópica ou analíticas numa quantidade à escala microscópica de uma amostra de fluido e para transferir uma amostra de fluido da referida região para o ou os referidos canais.

    16. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato compreende ainda um reservatório ou porta de entrada fixo ao referido substrato e adaptado para transferir um fluido para o ou os referidos canais. 3 17. Sistema de manipulação de liquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido substrato tem um ou mais primeiros canais formados solidariamente no mesmo, para conduzir uma amostra de líquido e um ou mais segundos canais para conduzir um fluido adicional.

    18. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 17, em que o ou os referidos segundos canais convergem com o ou os referidos primeiros canais numa porta de saída comum.

    19. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que a ou as referidas portas de saída são fabricadas solidariamente com o referido substrato.

    20. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que a ou as referidas portas de saída são fabricadas distintamente do referido substrato e fixas aos referidos terminais dos referidos canais.

    21. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico de espectrometria de massa externo.

    22. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 21, em que a referida transferência de uma quantidade à escala microscópica de uma amostra de líquido para fora do referido substrato é por ionização por electrovaporização.

    23. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um ou mais sistemas de recolha. 4 24. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e uma parte de uma superfície do referido substrato em torno da ou das referidas portas de saída está revestida com um material para impedir a molhagem da superfície pela referida amostra de líquido que sai da ou das portas de saida.

    25. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e o referido substrato é um material não molhante de superfície.

    26. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que a referida porta de saída está revestida a metal.

    27. Sistema de manipulação de líquido à escala microscópica da reivindicação 1, em que uma superfície interior de um do ou dos referidos canais está revestido com um material diferente do referido substrato.

    28. Método para processar quantidades à escala microscópica de um líquido compreendendo os seguintes passos: proporcionar um sistema de manipulação de líquido à escala microscópica compreendendo um substrato tendo um ou mais canais inteqrados no referido substrato, terminando o ou os referidos canais numa ou mais portas de saída numa superfície externa do referido substrato; introduzir uma amostra de líquido num do ou dos referidos canais; 5 fazer com que a referida amostra de líquido circule no referido canal na direcção da referida porta de saída; e fazer com que a referida amostra de líquido saia do referido substrato através da referida porta de saída do referido canal e seja transferida para fora do referido substrato por gotícula, vaporização ou fluxo para um sistema analítico e/ou de recolha externo, tendo o referido sistema uma entrada próxima, mas separada, da referida porta de saída.

    29. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um espectrómetro de massa e faz-se com que a referida amostra de líquido seja transferida para o referido espectrómetro de massa por ionização por electrovaporização.

    30. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e faz-se com que a referida amostra de líquido seja transferida para o referido sistema analítico externo por nebulização pneumática ou por ultra-sons.

    31. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um espectrómetro de massa e faz-se com que o referido líquido seja transferido para o referido espectrómetro de massa por ionização química.

    32. Método da reivindicação 28, em que se faz com que a referida amostra de líquido seja transferida para o 6 referido sistema analítico e/ou de recolha externo por desorção/ionização de matriz induzida por laser.

    33. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é para detecção por fluorescência induzida por laser.

    34. Método da reivindicação 28, em que, no referido passo em que se faz com que a referida amostra de líquido saia do referido substrato, o referido sistema de manipulação de líquido à escala microscópica está estacionário em relação ao referido sistema analítico e/ou de recolha externo.

    35. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e, no referido passo em que se faz com que a referida amostra de líquido saia do referido substrato, o referido sistema de manipulação de líquido à escala microscópica desloca-se em relação ao referido sistema analítico externo.

    36. Método da reivindicação 28, em que, antes do referido passo em que se faz com que a referida amostra de líquido saia do referido substrato, a referida amostra de líquido ou um componente da referida amostra de líquido é detectada(o) no referido canal.

    37. Método da reivindicação 28, em que o referido substrato compreende ainda um dispositivo para separar uma amostra de líquido em componentes da referida amostra e o referido método compreende ainda o passo de separar a referida amostra em componentes da referida amostra. 7

    38. Método da reivindicação 37, em que o referido dispositivo para separar uma amostra de líquido em componentes da referida amostra está integrado no referido substrato.

    39. Método da reivindicação 37, em que o referido dispositivo para separar uma amostra de líquido em componentes da referida amostra está ligado de modo amovível ao referido substrato.

    40. Método da reivindicação 37, em que o referido canal do ou dos referidos canais compreende o referido dispositivo para separar uma amostra de líquido em componentes da referida amostra.

    41. Método da reivindicação 28, em que o referido substrato compreende ainda um dispositivo para fazer a digestão de uma amostra e o referido método compreende ainda o passo de digerir a referida amostra.

    42. Método da reivindicação 28, em que o referido substrato compreende ainda um dispositivo para dessalinizar uma amostra e o referido método compreende ainda o passo de dessalinizar a referida amostra.

    43. Método da reivindicação 28, em que o referido substrato compreende ainda um dispositivo para concentrar previamente uma amostra e o referido método compreende ainda o passo de concentrar previamente a referida amostra.

    44. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e o referido substrato compreende ainda um dispositivo para realizar uma ligação por afinidade numa amostra e o 8 referido método compreende ainda o passo de realizar a ligação por afinidade na referida amostra.

    45. Método da reivindicação 28, em que o referido sistema analítico e/ou de recolha externo é um sistema analítico e o referido substrato compreende ainda um dispositivo para cromatografia de exclusão por tamanho e o referido método compreende ainda o passo de realizar a cromatografia de exclusão por tamanho na referida amostra.

    46. Método da reivindicação 28, em que o referido substrato tem um ou mais canais formados solidariamente no mesmo para conduzir uma amostra de líquido e um ou mais segundos canais para conduzir um fluido adicional.

    47. Método da reivindicação 46, em que, no referido substrato, o ou os referidos segundos canais convergem com um ou mais dos referidos primeiros canais numa porta de saída comum.

    48. Método da reivindicação 46, em que o ou os referidos segundos canais no referido substrato conduzem um fluido adicional que é adicionado à referida quantidade à escala microscópica de uma amostra de líquido para que o referido fluido adicional funcione como um revestimento de fluido. Lisboa, 23 de Junho de 2010 9 1/15

    FIG. ΙΑ 2/15 -~/Ja /3c ES /J-

    FIG. 1B FIG. 1D

    FIG. 1E 3/15

    FIG. 2 A PONTAS DE EMISSÃO DE CAMPO 0-1-10 ír50 ===ΛΛΑΛ= £. 43 43 ESI TIP I-60 μΓΠ COBERTURA 43 3 ^==f CANAL CE SUBSTRATO DE CHIP, 41 i CHIP, 41 CANAL CE SUBSTRATO DE CHIP, 41FIG. 2C FIG. 2B INJECTOR 49 de 1 -50 μιη COBERTURA 43 I- CANAL CE jr- SUB^ SUBSTRATO DE CHIP, 41 FIG. 2D 4/15
15. 15/15 ANÁLISE DE AND (20 mer) 6164.9 INTENSIDADE RELATIVA

    FIG. 13 £+06 ~ 7.74 mo