ES2342807A1 - Uso de bacterias del genero tenacibaculum para quorum quenching. - Google Patents
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Abstract
Uso de bacterias del género Tenacibaculum para quorum quenching. Uso de células bacterianas del género Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, capaces de degradar N- Acil homoserin lactonas, para quorum quenching, para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas o para inhibir la formación de biofilms.
Description
Uso de bacterias del género Tenacibaculum
para Quorum Quenching.
La presente invención se encuentra dentro de la
biología y la biología molecular, y se refiere a especies del género
Tenacibaculum capaces de degradar
N-acil-homoserin lactonas (AHLs) para el
control de enfermedades infecciosas bacterianas, y para evitar la
formación de biofilms.
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Numerosas especies bacterianas usan un mecanismo
de regulación genética coordinada para responder a cambios en el
entorno. Este mecanismo conocido como "quorum sensing"
(QS) consiste en la producción y liberación de moléculas señal al
medio donde se acumulan controlando la expresión de múltiples genes
(Fuqua et al., 1994. J Bacteriol 176:
269-275). Mediante la comunicación por QS las
poblaciones bacterianas pueden coordinarse para ejecutar importantes
funciones biológicas, muchas de ellas implicadas en la virulencia de
importantes patógenos, como: movilidad, "swarming",
agregación, luminiscencia, biosíntesis de antibióticos, factores de
virulencia, simbiosis, formación y diferenciación de biofilms,
transferencia de plásmidos por conjugación,... (Williams et
al., 2007. Phil Trans R Soc B 362:
1119-1134).
Las señales de QS más estudiadas y conocidas son
las N-acil-homoserin lactonas (AHLs)
empleadas por numerosas bacterias Gram-negativas
(Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362:
1119-1134). Las AHLs, también conocidas como
autoinducers (Als), son una familia de moléculas señales usadas en
el sistema de QS de muchas bacterias, principalmente Gram negativas,
que se basan en un anillo lactona con una cadena lateral acilo de
tamaño variable entre 4 y 14 carbonos, con o sin saturación y con o
sin sustituciones Oxo- o Hidroxi- en el tercer carbono (Whitehead
et al., 2001. FEMS Microbiol Rev 25:
365-404). Como las poblaciones de especies
bacterianas coordinadas por QS obtienen importantes ventajas
competitivas en sus múltiples interacciones con otros procariotas y
eucariotas, sus competidores han desarrollado mecanismos para
interferir con su comunicación por sistemas QS, a estos mecanismos
se les conoce como "quorum quenching" (QQ). Se basan en
la producción de inhibidores que mimetizan las AHLs bloqueando el
receptor, como las furanonas producidas por el alga marina
Delisea pulchra (Givskov et al., 1996. J
Bacteriol 178: 6618-6622). Otra estrategia para
bloquear los sistemas de QS mediados por AHLs es la degradación
enzimática de las moléculas señal. Hasta el momento se han descrito
dos tipos principales de enzimas que llevan a cabo esta degradación:
las Lactonasas que hidrolizan el anillo lactona y las acilasas que
rompen el enlace entre el anillo lactona y la cadena lateral (Dong
et al, 2007. Phil Trans R Soc B 362:
1201-1211).
Aunque la síntesis de quimioterápicos
artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han
supuesto en el siglo pasado una auténtica revolución médica en el
tratamiento de enfermedades infecciosas, el desarrollo de
resistencia a antibióticos por parte de algunas bacterias patógenas
es un grave problema mundial, que obliga a la industria farmacéutica
a desarrollar nuevas generaciones de antibióticos más potentes, y
que puede originar cepas multirresistentes en las que el tratamiento
es más largo y con frecuencia ineficaz, llegando incluso a la muerte
del paciente. La presión selectiva que se ejerce en el ambiente
microbiano, el estado inmunitario del hospedero, los microambientes
bacterianos y factores propios de las bacterias involucradas, tienen
un papel importante en el desarrollo de la resistencia.
Debido a que gran cantidad de patógenos humanos
(p. e.: Pseudomonas putida, Serratia spp,...), de
plantas (p. e.: Agrobacterium spp., Erwinia
carotovora,...) y patógenos marinos (p. e.: Aeromonas
salmonicida, Vibrio anguillarum,...) (Williams et
al., 2007. Phil Trans R Soc B 362:
1119-1134; Bruhn et al., 2005. Dis Aquat
Org 65: 43-52.) usan AHLs para el control de
producción de factores de virulencia, la interferencia con estos
sistemas de comunicación constituye una interesante y prometedora
vía para el control de enfermedades infecciosas bacterianas (Dong
& Zhang. 2005. J Microbiol 43: 101-109;
Dong et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362:
1201-1211). Además este tipo de mecanismos en
combinación con antibióticos puede ser una estrategia interesante en
el tratamiento de enfermedades infecciosas por patógenos
multirresistentes como Pseudomonas aeruginosa, en la que está
descrito el control de QS sobre mecanismos de virulencia (Venturi,
2006. FEMS Microbiol Rev 30: 274-291) y otros
patógenos de humanos, animales y plantas. El interés de las
estrategias de QQ para el tratamiento de enfermedades infecciosas es
que al no afectar directamente a la supervivencia del patógeno sino
a la expresión de los factores de virulencia no ejercen presión
selectiva evitando la aparición de resistencias.
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La presión selectiva que representa la
aplicación a gran escala de los quimioterápicos ha permitido la
diseminación de cepas microbianas con mecanismos de resistencia que,
en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico,
llegando incluso a la muerte del paciente. Puesto que muchas
bacterias usan el sistema de señales de QS para sincronizar la
expresión genética y coordinar su actividad biológica dentro de una
población, controlando la virulencia y la formación de biofilms
entre otras funciones biológicas, una vía para evitar el aumento de
mecanismos de resistencia de las bacterias patógenas sería controlar
estos sistemas de señales QS. La inhibición de este sistema de
señales es lo que se ha denominado Quorum Quenching (QQ). La
presente invención proporciona los medios para controlar las
infecciones bacterianas, sin ejercer presión selectiva sobre las
poblaciones de estas bacterias y evitando así la aparición de
resistencias así como para la inhibición de otros procesos de
colonización bacteriana en las que están implicadas las señales de
QS tipo AHL, como la formación de biofilms. En la presente invención
se describe por primera vez el uso de células bacterianas del género
Tenacibaculum capaces de degradar las
N-Acil-homoserin lactonas (AHLs),
para el control de enfermedades infecciosas bacterianas y para la
inhibición de la formación de biofilms.
Así, un primer aspecto de la invención se
refiere al uso de las células bacterianas del género
Tenacibaculum,
del extracto celular crudo o el sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para quorum quenching.
del extracto celular crudo o el sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para quorum quenching.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, las células bacterianas del género
Tenacibaculum, el extracto celular crudo o el sobrenadante de
sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, se usan para
degradar N-Acil-homoserin lactonas
(AHLs).
Cualquier bacteria regula su expresión génica en
respuesta a diferentes señales medioambientales, una propiedad
esencial para competir con otros organismos. En el caso particular
de bacterias patógenas, la regulación génica es crucial para
permitir la supervivencia de la bacteria al particular ambiente que
le ofrece su hospedador. Los genes de virulencia bacterianos están
sujetos a complejos mecanismos de regulación para asegurar la
expresión del gen apropiado en el momento apropiado. Las AHLs son
las señales de QS más estudiadas y conocidas, y son empleadas por
multitud de bacterias patógenas humanas, de plantas y marinas para
el control de la producción de factores de virulencia.
Por tanto, una realización preferida de este
aspecto de la invención es el uso de las células bacterianas del
género Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del
sobrenadante de cultivos de dichas bacterias del género
Tenacibaculum, o cualquiera de sus combinaciones, que son
capaces de degradar N-Acil homoserin lactonas, y por
tanto interferir con el sistema de señales de QS de bacterias, para
elaborar un medicamento. En una realización aún más preferida, el
medicamento se usa para el tratamiento de enfermedades infecciosas
bacterianas.
Los "biofilms" o "biopelículas", tal y
como se definen en esta memoria, son comunidades de microorganismos
que crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a
una superficie inerte o un tejido vivo. Es una comunidad de
bacterias (de una única especie o varias), que se adhiere a una
superficie sólida. La inhibición de las AHLs permitiría inhibir la
formación de biopelículas formadas por procesos controlados por
QS.
Los biofilms producen una gran cantidad de
polisacáridos extracelulares, responsables de la apariencia viscosa,
y se caracterizan por una gran resistencia a agentes antibióticos.
Esta resistencia puede deberse a que la matriz extracelular en la
que se encuentran embebidas las bacterias proporciona una barrera
frente a la penetración de biocidas. Otra posibilidad es que la
mayoría de las células del biofilm crecen muy lentamente, en un
estado de privación de comida, por lo que no son susceptibles al
efecto de los agentes antimicrobianos. Un tercer aspecto podría ser
que las células en el biofilm adoptasen un fenotipo distinto, por
ejemplo, mediante la expresión de bombas efluentes de
fármacos.
fármacos.
La contaminación biológica de superficies es
común, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies
hidrófobas, hidrofilas, bióticas o abióticas, y conduce a la
degradación del material, productos de contaminación, bloqueo
mecánico e impedancia de la transferencia de calor en procesos
acuáticos. Los biofilms son también la primera causa de la
contaminación biológica de sistemas de distribución de agua potable,
y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de
biofilms en los sistemas antiincendios. El establecimiento de
bacterias adheridas a los alimentos o a las superficies en contacto
con los alimentos, conlleva serios problemas higiénicos e incluso
casos de toxiinfecciones alimentarias, así como numerosas pérdidas
económicas por los productos que se llegan a desechar (Carpentier
& Cerf, 1993. J App Bacter.
75:499-511).
En acuicultura tiene especial relevancia la
formación de biofilm en estructuras sumergidas tales como jaulas,
redes y contenedores; o equipamiento tales como cañerías, bombas,
filtros y tanques colectores, y para especies de cultivo, como
mejillones, vieiras, ostras, etc. Se conoce como biofouling y
afecta a todos los sectores de la acuicultura europea, siendo un
problema creciente debido a la aplicación de la Directiva de
Productos Biocidas EC 98/8/EC, resultando en sustanciales pérdidas
económicas. Tiene además, repercusiones ecológicas importantes
porque los organismos acuáticos que se afianzan a los cascos de los
barcos como consecuencia del biofouling acompañan a estos
navíos a donde quiera que vayan. Esto ha significado un problema
ecológico mundial, ya que los barcos están trasladando especies
invasoras hacia los lagos, los ríos y los océanos que no son su
hábitat original.
Así, la fabricación de pinturas
anti-incrustaciones con células bacterianas del
género Tenacibaculum, el extracto celular crudo o el
sobrenadante de los cultivos de dichas bacterias reduciría el
biofouling en los cascos pintados con ella, sin tener elementos
químicos tóxicos para la vida marina.
Por tanto, en otra realización preferida, las
células bacterianas del género Tenacibaculum, el extracto
celular crudo o el sobrenadante de los cultivos de dichas bacterias
del género Tenacibaculum, se usan para inhibir la formación
de biofilms.
\newpage
Existen numerosas evidencias epidemiológicas que
relacionan los biofilms con distintos procesos infecciosos en
humanos (Tabla 1) (Wilson, 2001. Sci Prog 84:
235-254; Costerton et al., 1999.
Science 1999; 284: 1318-1322). Los mecanismos
por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía
no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las
bacterias del biofilm pueden producir endotoxinas, se pueden liberar
grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a
la acción fagocitaria de las células del sistema inmune y por otro
lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias
resistentes a los tratamientos antibióticos. Este último aspecto
puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes
originadas en un biofilm podrían extenderse de paciente a paciente a
través de las manos del personal sanitario.
Además este tipo de mecanismos en combinación
con antibióticos puede ser una estrategia interesante en el
tratamiento de enfermedades infecciosas por patógenos
multirresistentes como Pseudomonas aeruginosa, en la que está
descrito el control de QS sobre mecanismos de virulencia (Venturi,
2006. FEMS Microbiol Rev 30: 274-291) y otros
patógenos de humanos, animales y plantas. Por tanto, una realización
aún más preferida de este aspecto de la invención es el uso de las
células.
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\vskip1.000000\baselineskip
bacterianas del género
Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante
de cultivos de dichas bacterias del género Tenacibaculum, que
son capaces de degradar N-Acil homoserin lactonas,
en combinación con antibióticos, para el tratamiento de enfermedades
infecciosas bacterianas o inhibir la formación de
biofilms.
Las bacterias del género Tenacibaculum de
la invención se caracterizan por ser capaces de degradar AHLs. Para
llevar a cabo la presente invención se ensayaron distintas cepas de
distintas especies del género Tenacibaculum. Así por ejemplo,
esta actividad degradadora de AHLs fue detectada en diferentes
ensayos con los biosensores: Chromobacterium violaceum CV026
con las AHLs:
N-Hexanoil-L-homoserin
lactona (C6-HSL) (Fig. 1A) y C10-HSL
(Fig. 1B), Escherichia coli JM109 pSB536 ó pSB1075 con las
AHLs: C4 y C12-HSL, y confirmada por cromatografía
liquida-espectrometría de masas
(LC-MS) con las AHLs C4, C6, C8, C10, C12 y
C14-HSL (Para C4 y C12-HSL,
Fig. 2).
Fig. 2).
La información que se proporciona en esta
memoria es suficiente para permitir a un experto en la materia
identificar a otras cepas y otras especies que estén dentro de este
género.
El género Tenacibaculum fue descrito por
Suzuki et al. en 2001 (Suzuki et al., 2001. Int J
Syst Evol Microbiol, 51: 1639-1652) en base a
sus características filogenéticas, quimiotaxonómicas y fenéticas,
combinando dos especies del género Flexibacter (F.
maritimus y F. ovolyticus, describiendo
Tenacibaculum maritimum como la especie tipo, y otras
dos especies nuevas para el género, Tenacibaculum mesophilum
y Tenacibaculum amylolyticum. Posteriormente se han añadido
otras especies al género, existiendo en la fecha de redacción de
esta memoria, un total de 14 especies aceptadas:
Tenacibaculum adriaticum Heindl et
al. 2008.
Tenacibaculum aestuarii Jung et
al. 2006.
Tenacibaculum aiptasiae Wang et
al. 2008.
Tenacibaculum amylolyticum Suzuki et
al. 2001.
Tenacibaculum discolor
Piñeiro-Vidal et al. 2008.
Tenacibaculum gallaicum
Piñeiro-Vidal et al. 2008.
Tenacibaculum litopenaei Sheu et
al. 2007.
Tenacibaculum litoreum Choi et al.
2006.
Tenacibaculum lutimaris Yoon et
al. 2005.
Tenacibaculum maritimum (Wakabayashi
et al. 1986) Suzuki et al. 2001,
Tenacibaculum mesophilum Suzuki et
al. 2001.
Tenacibaculum ovolyticum (Hansen et
al. 1992) Suzuki et al. 2001.
Tenacibaculum skagerrakense Frette et
al. 2004.
Tenacibaculum soleae
Piñeiro-Vidal et al. 2008.
Por las especiales características de estos
organismos, que aún no se han estudiado en profundidad, y por las
dificultades que supone su descripción, ésta será más fácil y fiable
si su delimitación taxonómica se basa en métodos de biología
molecular.
Así, en la identificación de un microorganismo
como perteneciente al género Tenacibaculum son aplicables los
parámetros siguientes, sea aisladamente o en combinación con los
anteriores. Dado que las cepas de Tenacibaculum son afines en
cuanto a su evolución, puede esperarse que la homología global de
los genomas al nivel de los nucleótidos, y más concretamente a nivel
de la región 16 S del ARN ribosómico nuclear, y más concretamente al
polinucleótido de la región 16S del ARN ribosómico nuclear que se
recoge en la SEQ ID NO: 1, y que pertenece al microorganismo
depositado en el CECT con número 7426 el 18 de junio de 2008 y que
en este documento se denomina como T. discolor cepa 20J, sea
de un 80% o mayor, y más preferiblemente de un 85%, de un 90%, de un
95% o mayor. La correspondencia entre la secuencia genómica de
la(s) cepa(s) de Tenacibaculum
putativa(s) y la secuencia de otro microorganismo se puede
determinar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de la
información de secuencia del polinucleótido procedente del
Tenacibaculum putativo, y la secuencia del polinucleótido de
la SEQ ID NO: 1 de esta memoria. Los métodos de comparación de
secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen,
aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, y FASTA
(Altschul et al., 1999. J Mol Biol 215:
403-410). Por ejemplo, también, aquéllas se pueden
determinar por hibridación de los polinucleótidos en condiciones que
forman dúplex estables entre regiones homologas, seguido por
digestión con nucleasa(s) específica(s)
monocatenaria(s), seguido por determinación del tamaño de los
fragmentos digeridos.
El porcentaje de homología se ha determinado
midiendo la identidad entre el polinucleótido que se muestra en la
SEQ ID NO: 1 (perteneciente a la cepa del género
Tenacibaculum depositada en el CECT) y todos los
polinucleótidos homólogos del género Tenacibaculum que se
encontraban recogidos en el momento de escritura de esta memoria, en
el GenBank. Tras este análisis cabe pensar que un organismo que
pertenezca al género Tenacibaculum tendrá un polinucleótido
homólogo al de la SEQ ID NO: 1, perteneciente a la región 16S de su
RNA ribosómico nuclear, que presente, al menos, una identidad del
80% con éste.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
cepa de células bacterianas del género Tenacibaculum, que han
sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT),
con el número CECT 7426. Dicha cepa bacteriana se ha identificado
como perteneciente a la especie Tenacibaculum
discolor, y la secuencia de polinucleótidos de la región
ribosómica 16S se recoge parcialmente en la SEQ ID NO: 1.
En relación con otras cepas de bacterias con
actividad QQ, la cepa con número de depósito CECT 7426 presenta una
elevada actividad degradadora, alta inespecificidad, siendo capaz de
degradar todas las AHLs probadas con cadenas de entre 4 y 14
carbonos en un periodo de 24 horas según datos obtenidos mediante
cuantificación por LC-MS, buen crecimiento,
capacidad de crecer en medios marinos y no marinos, y carácter
constitutivo de la actividad QQ que deriva de la degradación
inmediata de AHLs (no es necesaria la exposición de la bacteria a
AHLs para que se active).
Se trató de determinar el tipo de actividad
enzimática de Tenacibaculum discolor de la cepa
depositada con número de acceso CECT 7426, para ello se acidificó a
pH 2.0 tras la degradación. Se observó una recuperación de C4 (Fig.
2) y C6-HSL (Fig. 1A) tras la acidificación,
indicando una actividad del tipo lactonasa, porque el pH ácido
cierra el anillo lactona. Sin embargo no se recupera
C10-HSL (Fig. 1B) y C12-HSL (Fig.
2), lo que indica la presencia de una doble actividad enzimática:
lactonasa para AHLs de cadena lateral corta y acilasa para AHLs de
cadena lateral larga. Esto está apoyado por la distinta cinética de
degradación observada para 30 \muM C4-HSL y
C12-HSL, que fue determinada por
LC-MS (Fig. 4). La cepa 20J degrada toda la C12 en
30 min y la C4 en 8 horas (Fig. 4). La actividad degradadora se
encuentra tanto en el sobrenadante como en el extracto celular crudo
(CCE) de cultivos (Fig. 5), lo que posibilita la utilización de la
cepa viva o de extractos celulares crudos o purificados para sus
aplicaciones biotecnológicas.
La alta capacidad degradadora y amplio rango de
especificidad mostrada por los enzimas de las bacterias del género
Tenacibaculum, miembros del grupo
Cytophaga-Flexibacter-Bacteroidetes
(CFB), contra el rango de tamaños de cadena lateral de AHL:
C4-C14 lo convierte en un candidato prometedor para
el control de patógenos con QS basado en AHL en salud humana,
cultivos marinos, animales y plantas, así como para la inhibición de
la formación de biopelículas formadas por procesos controlados por
QS.
Así, en una realización preferida de este
aspecto de la invención la célula bacteriana del género
Tenacibaculum con el número de depósito CECT 7426, el
extracto celular crudo o el sobrenadante de sus cultivos, o
cualquiera de sus combinaciones, se usa para quorum
quenching. En una realización más preferida, se usa para
degradar N-Acil homoserin lactonas. En otra
realización aún más preferida se usa para elaborar un medicamento.
En otra realización aún mucho más preferida, el medicamento se usa
para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas. En otra
realización preferida, se usa para inhibir la formación de biofilms.
En otra realización aún más preferida se usa en combinación con
antibióticos u otros agentes antibacterianos. En una realización aún
más preferida las bacterias causantes de la enfermedad infecciosa o
de la formación del biofilm son bacterias Gram negativas.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición, de ahora en adelante composición de la invención, que
comprende:
- a.
- una célula bacteriana perteneciente al género Tenacibaculum,
- b.
- el extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la célula bacteriana de a),
- c.
- el sobrenadante del cultivo bacteriano de a),
o cualquiera de sus combinaciones, para su uso
como agente antibacteriano.
Un agente antibacteriano es una sustancia
química natural (sintetizadas por hongos o bacterias) que inhibe el
crecimiento (bacteriostático) o mata a las bacterias
(bactericida).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de la composición de la invención, que comprende:
- a.
- una célula bacteriana perteneciente al género Tenacibaculum,
- b.
- el extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la célula bacteriana de a),
- c.
- el sobrenadante del cultivo bacteriano de a),
o cualquiera de sus combinaciones, para la
elaboración de un medicamento.
En una realización preferida, la composición de
la invención se usa para el tratamiento de infecciones bacterianas.
En otra realización preferida, la composición de la invención se usa
para elaborar un medicamento para el tratamiento de infecciones
bacterianas. Los biofilms bacterianos son una causa común de
infecciones bacterianas, tanto en humanos (Costerton et al.,
1999. Science 284: 1318-1322), como en
animales y plantas. En otra realización preferida, la composición de
la invención se usa para inhibir la formación de biofilms. En otra
realización preferida, la composición de la invención se usa en
combinación con otros agentes antibacterianos. En una realización
aún más preferida, las bacterias que provocan la formación de
biofilm y/o la infección son bacterias Gram negativas.
El término "medicamento", tal y como se usa
en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para
prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de
enfermedades en el hombre, animales y plantas. En el contexto de la
presente invención las enfermedades son provocadas por la infección
de bacterias patógenas.
El término "infección" es el término
clínico para describir la colonización de un organismo huésped por
organismos de otras especies. En la utilización clínica del término
infección, el organismo colonizador es perjudicial para el
funcionamiento normal y supervivencia del huésped, por lo que se
califica al microorganismo como patógeno.
El término "género", tal y como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a la categoría de la clasificación
biológica (categoría taxonómica) que comprende una o más especies
relacionadas filogenéticamente y morfológicamente similares. También
se espera que compartan características químicas y metabólicas
similares.
Por "categoría taxonómica" se entiende el
nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los
organismos.
El término "polinucleótido", tal como se
utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polímera de
nucleótidos de cualquier longitud, sean ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos. Los términos "polinucleótido" y
"ácido nucléico" se usan aquí de manera intercambiable y se
refieren exclusivamente a la estructura primaria de la molécula.
El término "homología", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre do
estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más
concretamente, a la semejanza entre los nucleótidos de dos o más
polinucleótidos.
El término "identidad", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de
nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos homólogos que se
comparan.
El término "genotipo", tal como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a la constitución hereditaria o
genética de un individuo; todo el material genético contenido en una
célula, al que, por lo general, se denomina material nuclear.
El término "fenotipo", tal como se utiliza
en esta memoria, se refiere a la suma total de las propiedades
estructurales y funcionales observables de un organismo; producto de
la interacción entre el genotipo y el medio ambiente.
El término "especie tipo" hace referencia a
la especie designada como el tipo de un género o un subgénero,
siendo el "tipo" bajo el punto de vista taxonómico, el elemento
simple de un taxón al cual se le asigna permanentemente el nombre y
sobre el que están basadas las características descriptivas que
satisfacen las condiciones de disponibilidad o de publicación
válidas.
El medio de cultivo empleado para el crecimiento
de las células bacterianas puede ser cualquier medio conocido en el
estado del arte. Preferiblemente el medio contiene los componentes
que comprenden el medio ambiente de donde se coge la muestra. Por
ejemplo, el medio de cultivo de bacterias marinas contiene
preferiblemente sales marinas. El soporte sólido para crecer
colonias aisladas individuales puede ser agar, agar noble,
Gel-Rite o cualquier otro medio sólido conocido en
el estado del arte.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Ensayo con Chromobacterium
violaceum CV026 para detectar degradación por
Tenacibaculum discolor 20J de 2 \muM
C6-HSL (A) y C10-HSL (B) en relación
con controles antes (C) y después de acidificar a pH 2.0 (C Ac).
Fig. 2. Ensayo con las cepas indicadoras
Chromobacterium violaceum CV026 y C. violaceum VIR07
para detectar degradación por Tenacibaculum discolor
20J y de T. maritimum de 2 \muM C6-HSL (A)
y C10-HSL (B), donde se observa que T.
maritimum no degrada C6-HSL.
Fig. 3. Porcentaje de degradación de
C4-HSL (barras negras) y C12-HSL
(barras blancas) por Tenacibaculum discolor 20J sin y
con acidificación (Ac) en relación a controles (C) (50 \muM)
cuantificada mediante Lc-MS.
Fig. 4. Cinética de degradación de
C4-HSL (4A) y C12-HSL (4B) por
cultivos vivos de la cepa T. discolor 20J medida por
LC-MS. Concentración inicial de las AHLs: 30
\muM.
Fig. 5. Actividad degradadora de
C4-HSL (5A) y C12-HSL (5B) en
cultivos celulares completos de la cepa T. discolor 20J,
extractos crudos celulares (CCE) y sobrenadante (SUP) después de 24
horas. La cuantificación de las AHLs se llevó a cabo por
LC-MS. Los extractos se midieron con y sin
acidificación para estimar el grado de posible actividad lactonasa
presente. Concentración inicial de las AHLs: 50 \muM.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de distintas cepas de
distintas especies del género Tenacibaculum para degradar
N-Acil homoserin lactonas.
Para la detección de bacterias marinas con
actividad quorum quenching (QQ) de señales tipo AHL se
procedió al aislamiento de colonias procedentes de muestras de
diferentes medios marinos.
Se tomaron tres tipos de muestras con material
estéril:
- -
- Muestra de sedimento de un tanque-reservorio de agua de mar de un circuito cerrado para el cultivo de peces de la Universidad de Santiago de Compostela.
- -
- Muestra de biopelícula de un tanque de cemento para el cultivo marino de peces en circuito abierto del instituto IGAFA (isla de Arosa).
- -
- Muestra de alga Fucus sp. obtenida de un sustrato rocoso intermareal en la IIIa de Arousa. 1 g del alga fue troceado y diluido en 10 ml de agua de mar esterilizada.
Los medios sólidos empleados para el aislamiento
fueron: Triptona soja agar (TSA) 1% NaCl, Agar marino (AM, Difco),
Agar marino en dilución 1/100, medio FAS suplementado con 1 g/L de
casaminoácidos (FAS CAS) (Schut et al., 1993. Appl Environ
Microbiol 59: 2150-2160) y medio FAS
suplementado con 0.5 g/L de los polímeros agarosa, quitina y almidón
(FAS POL) (Bruns et al., 2002. Appl Environ Microbiol
8: 3978-3987). Se prepararon 3 diluciones (1/10,
1/100 y 1/1000) en agua de mar esterilizada para cada una de las
muestras y se sembraron en placas con los medios de cultivo
nombrados. Las placas fueron incubadas a 15 y 22ºC durante 15 días.
Se aislaron un total de 165 colonias en función de su diferente
morfología y tonalidad para el análisis de actividad QQ. Puesto que
las 165 cepas obtenidas presentaban crecimiento en AM a 22ºC, se
seleccionaron estas condiciones de cultivo como método de cultivo
estándar y para su mantenimiento en el laboratorio.
Las 165 cepas aisladas fueron ensayadas para su
actividad QQ utilizando dos tipos de ensayos: en medio líquido y
sólido.
Las AHLs utilizadas en el ensayo líquido para
detectar la capacidad degradadora/inhibidora de las cepas fueron
N-Butiril-L-homoserín
lactona (C4-HSL) como representante de las AHLs de
cadena corta y
N-Dodecanoil-L-homoserín
lactona (C12-HSL) como representante de AHLs de
cadena larga. Para cuantificar las AHLs se utilizaron dos
biosensores de E. coli JM109 transformados cada uno con un
plásmido portador del operón lux, para la detección de
C4-HSL (pSB536) y para la detección de
C12-HSL (pSB1075). Los biosensores se cultivaron a
37ºC en medio LB suplementado con el antibiótico adecuado (Winson
et al., 1998. FEMS Microbiol Lett
163:185-192).
Cada aislado marino se inoculó en tubos
eppendorf con 1 mL de Caldo Marino (CM) y se incubó a 22ºC y 200
rpm. Tras 24 horas de incubación el cultivo fue dividido en dos
microtubos y centrifugado a 2000 x g durante 5 min. Los
correspondientes pellets fueron resuspendidos en CM fresco con 50
\muM C4-HSL ó C12-HSL e incubados
durante otras 24 horas a 22ºC y 200 rpm para permitir la posible
degradación de las AHLs. Una vez incubados, los cultivos se
centrifugaron a 2000 x g, 5 min y se pipeteraron 10 \muL de
sobrenadante en una placa microtiter para cuantificar la actividad
AHL. Ésta se midió mediante la adición de 90 \muL de una dilución
1/100 de cultivos de 12 horas a 37ºC 200 rpm de las cepas
biosensoras basadas en lux, E. coli JM109 pSB536 ó pSB1075
antes mencionadas, usando un luminómetro (Ultra Evolution
Xfluor4beta E 4.51e) tras 4 horas de incubación a 37ºC de las placas
microtiter. Se dispusieron diferentes placas para cada AHL y
biosensor. Como controles se usaron pocillos con 10 \muL de CM con
y sin C4-HSL ó C12-HSL 50
\muM.
Para el ensayo sólido se utilizaron dos
biosensores derivados de la especie Chromobacterium violaceum
en los que la producción del exopigmento violaceína es dependiente
de la presencia de AHLs en el medio de cultivo. La cepa C.
violaceum CV026 se utilizó inicialmente para la comprobación de
los resultados obtenidos en los bioensayos realizados en medio
líquido con las cepas de E. coli, permitiendo la detección de
la degradación de
N-hexanoil-L-homoserín
lactona (C6-HSL, McCIean et al., 1997.
Microbiol 143: 3703-3711). Con posterioridad
se confirmó la capacidad de degradación de C10-HSL
utilizando la cepa C. violaceum VIR07 (Morohoshi et
al., 2008. FEMS Microbiol Lett 279:
124-130). Las cepas marinas aisladas se inocularon
en tubos con 1 mL de CM a 22ºC y 200 rpm. Tras 24 horas se
centrifugaron 500 \muL de los cultivos a 2000 x g, durante 5 min y
se resuspendieron en 500 \muL de CM al que se añadió
C6-HSL ó C10-HSL 2 \muM,
incubándose durante otras 24 horas. Para la evaluación de la
degradación de las AHLs, se colocaron 50 \muL de los sobrenadantes
de estos cultivos en pocillos realizados con un sacabocados en
placas de LB cubiertas con LB blando inoculado con 500 \muL de un
cultivo de 12 horas de C. violaceum CV026 ó C.
violaceum VIR07, añadiéndose 50 \muL de agua destilada estéril
para completar el volumen del pocillo. Tras 24 horas de incubación a
25ºC se observó la producción de violaceína.
En algunos casos, para la detección de la
degradación de AHLs de cadena larga se utilizó el ensayo de
inhibición de producción de violaceína con la cepa C.
violaceum CV026 (Fig. 1B). En este caso, para evaluar la
degradación de C10-HSL se prepararon placas de LB
cubierto con LB blando inoculado con la cepa sensora a la que se le
añadió su AHL afín, C6-HSL. En este caso la
presencia de C10-HSL produce un halo de inhibición
en la producción de violaceina inducida por la
C6-HSL. La degradación de C10-HSL se
detecta en este ensayo por la desaparición o disminución del halo de
inhibición (McCIean et al., 1997. Microbiol 143:
3703-3711).
La identificación de la cepa bacteriana que
degradó AHLs se realizó por amplificación directa por PCR del gen
del 16S rRNA, secuenciación parcial del mismo (con lecturas en las
dos direcciones) y análisis de las secuencias.
A continuación se realizó un análisis BLAST de
las secuencias frente a las bases de datos del NCBI, recogiendo la
extensión del fragmento solapado, el porcentaje de semejanza y el
nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de
secuencia. Así, la cepa 20J se identificó como Tenacibaculum
discolor con una semejanza de 1018/1019 pb (99,9%) sobre la
secuencia AM411030 (cepa tipo DSM 18842).
Adicionalmente se probaron otras cepas de
distintas especies del mismo género (Tabla 2) para ver si
presentaban actividad degradatoria de AHLs. Todas las cepas y
especies ensayadas degradaron tanto C6-HSL como
C10-HSL, a excepción de T. maritimum, que no
degradó C6-HSL (Fig. 2).
Se seleccionó Tenacibaculum
discolor 20J por ser el único aislado con actividad QQ contra
las tres AHLs testadas inicialmente (C4-HSL,
C6-HSL y C12-HSL), para determinar
el tipo de actividad QQ que presentaba y su especificidad contra un
rango más amplio de longitud de cadena lateral de AHL mediante
LC-MS, técnica analítica que permite comprobar de
forma inequívoca la degradación de las AHLs.
La cepa fue inoculada en 20 mL de CM e incubada
a 22ºC y 200 rpm; tras 24h se tomaron muestras de 500 \muL para su
centrifugación. Los pellets se resuspendieron en 500 \muL de CM,
con AHL 50 \muM (C4-HSL, C6-HSL,
C8-HSL, C10-HSL,
C12-HSL ó C14-HSL) y fueron
incubados otras 24 horas a 22ºC y 200 rpm. Los sobrenadantes (2000 x
g 5 min) de estos cultivos se extrajeron tres veces con el mismo
volumen de Etil-Acetato y se evaporaron bajo flujo
de nitrógeno. El extracto seco obtenido se resuspendió en 200 \muL
de acetonitrilo y se procedió a la cuantificación de las AHLs por
LC-MS. De la misma forma se extrajeron muestras
control con 500 \muL de CM más AHL 50 \muM.
El sistema LC utilizado fue un Agilent 1100
series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Con columna:
Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 x 4.6 mm (tamaño de
partícula de 5 \mum). La fase móvil: ácido fórmico al 0.1% en agua
(A) y metanol (B), y la velocidad de flujo de 0.4 mL/min. El
gradiente establecido fue el siguiente: 50%B de 0 a 10 min, seguido
de un gradiente lineal del 50 al 90%B durante 15 min, seguido de
90%B durante 25 min (Morin et al., 2003. J Chromatogr
A, 1002:79-92). La columna se reequilibró
durante 4 min. En la columna se inyectó un volumen de 20 \muL de
muestra diluida en ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. El MS
utilizado fue un API4000 triple-quadrupolo con
trampa de iones lineal (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), en
modo electrospray de iones positivos. Como estándares para la
identificación y cuantificación de las AHLs presentes en las
muestras se utilizaron AHLs sintéticas de longitudes de cadena de 4
a 14 carbonos. La cuantificación de AHLs en las muestras se realizó
mediante extrapolación en curvas de calibración obtenidas a partir
de la abundancia de los iones moleculares obtenidos para cada AHL
patrón con concentración conocida (Milton et al., 2001. J
Bacteriol 183: 3537-3547).
Para determinar el tipo de actividad enzimática
degradadora de AHLs (acilasa o lactonasa) presente en
Tenacibaculum discolor 20J se llevaron a cabo dos
tipos de ensayos: Duplicados de los cultivos anteriormente descritos
a los que se habían añadido C4-HSL y
C12-HSL se acidificaron hasta pH 2,0 con HC11M y se
incubaron 24 horas más en las mismas condiciones para la posterior
extracción de AHLs y cuantificación por LC-MS. La
acidificación del medio de cultivo permite la recuperación de la
actividad AHL solamente en el caso de que la molécula haya sido
degradada por una lactonasa (Yates et al., 2002. Infect
Immun 70: 5635-5646). Paralelamente se realizó
un ensayo en sólido con C. violaceum CV026 para las AHLs:
C6-HSL, C10-HSL y
C12-HSL, con y sin acidificación hasta pH 2,0 (Yates
et al., 2002. Infect Immun 70:
5635-5646).
Se incubaron a 22ºC y 200 rpm 60 mL de CM
inoculados con Tenacibaculum discolor 20J. Tras 24
horas, el cultivo fue dividido y centrifugado (2000 x g 5 min), y el
pellet se lavó dos veces con 10 mL de PBS pH 6,5. En las dos
suspensiones celulares así obtenidas se añadió
C4-HSL ó C12-HSL a una concentración
final de 30 \muM. Las mezclas de reacción fueron incubadas a 22ºC
y 200 rpm durante 24 horas y se fueron tomando muestras de 500
\muL a diferentes tiempos desde el tiempo 0. Estas muestras se
extrajeron mediante el procedimiento anteriormente descrito y las
concentraciones de C4-HSL ó C12-HSL
restantes en cada muestra se determinaron por LC-MS
(Milton et al., 2001. J Bacteriol 183:
3537-3547).
Para determinar la localización celular de la
actividad degradadora de AHLs, se obtuvo el sobrenadante y extracto
celular crudo (CCE) de un cultivo de 24 horas de
Tenacibaculum discolor 20J en 15 mL de CM. Se
centrifugó el cultivo durante 5 minutos a 2000 x g para separar la
biomasa del medio de cultivo. El sobrenadante se filtró a través de
un filtro de 0,22 \mum y fue almacenado a 4ºC hasta su
utilización. El pellet se lavó con 15 mL de PBS pH 6,5, se
resuspendió en otros 5 mL del mismo tampón, se sonicó durante 5
minutos en hielo y se centrifugó a 16000 x g durante 90 min a 4ºC.
El CCE así obtenido se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum y
se almacenó a 4ºC (Uroz et al., 2005. Microbiol 151:
3313-3322).
Con el sobrenadante y el CCE de
Tenacibaculum discolor 20J se realizaron dos
ensayos:
- -
- Un ensayo en sólido con C. violaceum CV026 como se describió anteriormente. Se incubaron 500 \muL de sobrenadante y de CCE durante 24 horas con C6 ó C10-HSL 20 \muM a 22ºC y 200 rpm. Los controles se incubaron de la misma forma, con 500 \muL de CM ó PBS C6 ó C10-HSL 20 \muM.
- -
- Otro ensayo con 500 \muL de sobrenadante y de CCE incubados 24 horas con C4 ó C12-HSL 50 \muM a 22ºC y 200 rpm con o sin acidificación hasta pH 2,0 con HCl 1M (24 horas más a 22ºC y 200 rpm). Las concentraciones de las AHLs tras este ensayo fueron cuantificadas por LC-MS como se describió anteriormente. Los resultados se compararon con la degradación del cultivo completo (bacteria viva) incubado en las mismas condiciones y con controles de CM fresco con C4 ó C12-HSL 50 \muM.
<110> Universidade de Santiago de
Compostela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> uso de bacterias del género
Tenacibaculum para Quorum Quenching
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1596.13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1019
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tenacibaculum
discolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (14)
1. Uso de una célula bacteriana del género
Tenacibaculum cuya región 16S del ARNr presenta una identidad
de al menos un 80% con la secuencia polinucleotídica homologa
recogida en la SEQ ID NO: 1, del extracto celular crudo o del
sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones,
para degradar N-Acil homoserin lactonas y provocar
quorum quenching.
2. Uso de una célula bacteriana del género
Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante
de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según la
reivindicación anterior, para elaborar un medicamento.
3. Uso de una célula bacteriana del género
Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante
de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, para elaborar un
medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas
bacterianas.
4. Uso de una célula bacteriana del género
Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante
de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, para inhibir la
formación de biofilms.
5. Uso de una célula bacteriana del género
Tenacibaculum, del extracto celular crudo o del sobrenadante
de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, en combinación con
antibióticos u otros agentes antibacterianos.
6. Uso de una célula bacteriana, del extracto
celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, según cualquiera
de las reivindicaciones 3-5, donde las bacterias
causantes de la enfermedad infecciosa o de la formación del biofilm
son bacterias Gram negativas.
7. Cepa de células bacterianas de la especie
Tenacibaculum discolor depositada en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con el número de depósito CECT
7426.
8. Uso de la célula bacteriana del género
Tenacibaculum según la reivindicación anterior, del extracto
celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de
sus combinaciones, según cualquiera de las reivindicaciones
1-6.
9. Composición que comprende:
- a.
- una célula bacteriana del género Tenacibaculum como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7,
- b.
- el extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la célula bacteriana de (a),
- c.
- el sobrenadante del cultivo bacteriano de (b),
o cualquiera de sus combinaciones, para su uso
como agente antibacteriano.
10. Uso de la composición según la
reivindicación anterior, para la elaboración de un medicamento.
11. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 9-10, para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas.
12. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 9-11, en combinación con
antibióticos u otros agentes antibacterianos.
13. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 9-12 donde la formación de
biofilm o las infecciones bacterianas son provocadas por bacterias
Gram negativas.
14. Uso de la composición según la
reivindicación 9 para inhibir la formación de biofilms.
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2008
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