ES2342191T3 - Metodo y dispositivo para medir parametros dinamicos de particulas. - Google Patents

Abstract

Un método para medir parámetros dinámicos de partículas, caracterizado porque comprende aplicar un análisis de correlación sobre fluctuaciones temporales del número de partículas (en 3; 8; 15; 27) con respecto a un área de detección de una imagen digital, en el que se calculan una o más funciones de correlación en el tiempo basándose en las fluctuaciones temporales del número de partículas.

Description

Método y dispositivo para medir parámetros dinámicos de partículas.

Antecedentes del invento

El presente invento se refiere a un método y a un dispositivo para medir parámetros dinámicos de partículas, por ejemplo, espermatozoides, tales como la velocidad de traslación y la velocidad de rotación de partículas. Además, también puede evaluarse el número de partículas.

El presente invento se utiliza para establecer parámetros relacionados con la dinámica/movilidad de partículas en una solución, en particular entidades biológicas, por ejemplo, células y orgánulos celulares, incluyendo los espermatozoides. El análisis de los parámetros dinámicos y del número de espermatozoides en el semen es importante con el fin de caracterizar los espermatozoides, y constituye una importante herramienta para la evaluación de la fertilidad masculina.

Por velocidad de traslación se quiere decir un movimiento dirigido de partículas en una o más direcciones en una zona o volumen de detección tal que la longitud de la trayectoria sea significativamente mayor que la longitud de la observación. En contraste con la velocidad de traslación existe, por ejemplo, el movimiento Browniano, que es el movimiento estocástico de las partículas en todas las direcciones, es decir, la longitud de la trayectoria es significativamente más corta que la longitud de observación.

Un método para determinar la motilidad de los espermatozoides se describe en la patente norteamericana núm. 5116125, basándose dicho analizador en la dispersión dinámica de la luz de un láser.

Otro método de medir la motilidad de los espermatozoides consiste en vigilarlos con una cámara de video y en analizar los movimientos de los espermatozoides mediante un análisis basado en ordenador de las trayectorias individuales. Si bien este tipo de análisis asistido por ordenador genera parámetros de aptitud biológica de forma bastante rápida en comparación con las pruebas manuales, el análisis presenta varios inconvenientes, en particular una varianza significativa con respecto a los parámetros obtenidos, que aumenta al aumentar la concentración de los espermatozoides.

El objeto del presente invento es proporcionar un método y un dispositivo que proporcionen una calidad sustancialmente mejorada de los parámetros dinámicos de partículas en una solución. Además, la concentración de las partículas puede establecerse, también, con precisión. El presente invento resulta ser específicamente ventajoso para medir parámetros dinámicos de partículas en una solución que comprende las partículas en concentraciones tanto bajas como altas.

Otras ventajas son evidentes a partir del texto que sigue.

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Sumario del invento

De acuerdo con el presente invento, se proporcionan un método y un dispositivo para medir parámetros dinámicos y la concentración de partículas en una solución, tales como espermatozoides, como se define mediante las reivindicaciones.

Más específicamente, el presente invento se refiere a un método para medir la concentración y los parámetros dinámicos o de movilidad de partículas, un método que comprende detectar sucesos en un campo de detección, los sucesos generados por las partículas, y calcular una función de correlación en el tiempo basándose en las fluctuaciones de estos sucesos. El método comprende aplicar análisis de correlación sobre fluctuaciones temporales de las partículas con respecto a un área de detección de una imagen digital. El invento se refiere, además, a un método de medir los parámetros dinámicos de partículas, que comprende detectar las partículas mediante un detector capaz de generar una imagen digital, y aplicar un análisis de correlación basándose en la fluctuación temporal de las partículas con respecto a un área de detección de la imagen digital. Otro método de acuerdo con el invento se refiere a un método de medir parámetros dinámicos de partículas que comprende proporcionar las partículas en una solución, una fuente de luz, un detector capaz de generar una imagen digital, medios de computación, y en aplicar un análisis de correlación, es decir, calcular la o las funciones de correlación en el tiempo basándose en la fluctuación temporal de las partículas con respecto a un área de detección de la imagen digital.

El invento abarca, también, un dispositivo para medir los parámetros dinámicos o de movilidad de partículas, comprendiendo el dispositivo un compartimiento de muestra que comprende una solución que incluye las partículas, una fuente de luz, un detector sensible a la posición que comprende por lo menos un campo de detección, medios de computación para tratar señales procedentes del detector, en el que los sucesos generados por las partículas son detectados en el campo de detección y se calcula la función de correlación resuelta en el tiempo. El dispositivo comprende un compartimiento de muestra que incluye una solución de partículas, una fuente de luz, un perceptor de imagen, medios de computación para tratar señales procedentes del perceptor, detectar las partículas en una imagen digital generada por el perceptor de imagen, y aplicar un análisis de correlación, es decir, calcular la función de correlación (tiempo) basándose en la fluctuación temporal de las partículas con respecto a un área de detección de la imagen digital. Aparte de medir parámetros dinámicos de partículas en una solución o en otro entorno físico, el método y el dispositivo pueden utilizarse, también, para calcular el número de partículas presentes y, a partir de él, la concentración en, por ejemplo, la solución de muestra.

En el presente invento, pueden detectarse fluctuaciones de sucesos que representen las partículas de interés mediante un campo de detección. Preferiblemente, se analizan las fluctuaciones temporales de partículas en una imagen digital con movimiento utilizando un análisis de correlación que genera una o más funciones de correlación, proporcionando dichas funciones de correlación información acerca de los parámetros dinámicos de las partículas, tales como tiempos de difusión, velocidad de traslación, frecuencia rotacional, etc., y el número de partículas en un elemento de volumen, es decir, la concentración. Con los antes mencionados parámetros dinámicos, puede valorarse la movilidad de las partículas. De acuerdo con el presente invento, pueden valorarse cualesquiera partículas o entidades presentes en una solución con un tamaño comprendido entre el molecular y un nivel macroscópico. Si las partículas representan espermatozoides, pueden calcularse varios parámetros dinámicos importantes, tales como la velocidad de desplazamiento, denominada motilidad, la frecuencia rotacional y la concentración de espermato-
zoides.

Una característica novedosa del presente invento es la aplicación del análisis de correlación a la fluctuación de las partículas presentes en una imagen digital con movimiento. Una imagen digital con movimiento de una solución que contiene las partículas de interés es generada, entre otras formas, utilizando un detector adecuado capaz de generar una imagen digital tal como un perceptor de imagen conectado a unos medios de computación. La imagen digital puede ser dividida de manera adecuada por medios de computación en varias áreas de medición/detección capaces de generar una fluctuación adecuada, dependiente del tiempo (temporal) del número de partículas o de la concentración de las partículas dentro de los límites del área de detección. Así, el número de partículas en el área de detección cambia aleatoriamente en torno al número medio. La fluctuación del número de partículas con respecto a un área de detección de la imagen digital es analizada por la función de correlación de la señal de fluctuación, representando la señal las partículas. Por ello, las fluctuaciones son la base para calcular una o más funciones de correlación (tiempo) para generar los parámetros dinámicos y el número de partículas. Con el tiempo, las partículas se moverán en la imagen digital, es decir, realizarán un movimiento de entrada-salida a través de los límites del área de detección. Un perceptor de imagen del presente invento es un perceptor capaz de generar imágenes digitales de partículas en movimiento que tengan una resolución en el plano de la imagen, es decir, una resolución espacial en el eje X y en el eje Y. Como el perceptor de imagen genera una serie de imágenes digitales (cuadros) que tienen una resolución en el tiempo, se obtiene una imagen con movimiento que es analizada después aplicando el análisis de correlación. Mediante el presente invento, pueden valorarse parámetros dinámicos de partículas en una solución al mismo tiempo que se crean las imágenes digitales (la imagen digital con movimiento), si bien el método puede aplicarse también a una imagen digital con movimiento almacenada en unos medios adecuados de almacenamiento.

La información sobre la imagen digital generada por el perceptor de imagen procede de, entre otras cosas, la luz transmitida, dispersada o emitida desde las partículas. Normalmente, los sucesos no relacionados con las partículas de interés se eliminan por filtrado, adecuadamente empleando cualquier tipo de análisis de generación de imágenes digitales. Habiendo aplicado las adecuadas herramientas de análisis de generación de imágenes para suprimir la información no deseada procedente del perceptor de imagen, se calcula la función de correlación en el tiempo basándose en la fluctuación registrada de las partículas. En caso de que en la imagen digital haya presentes varias áreas de detección, pueden calcularse simultáneamente varias funciones de correlación en el tiempo, cada una de ellas a partir de una misma área de detección.

Las fluctuaciones de sucesos y/o el número de partículas en un área de detección de la imagen digital son vigiladas en una pluralidad de instantes (\tau_{1}, \tau_{2}, \tau_{3}, etc.) durante un intervalo de tiempo específico. La función de correlación en el tiempo obtenida es, básicamente, una función que describe la auto-similaridad de los sucesos en una escala de tiempo, es decir, la partículas detectadas son correlacionadas temporalmente. Simplificando, la función de correlación en el tiempo G'(\tau) viene dada por:

G'(\tau)=<I(t)*I(t+\tau)>

por lo que los signos <...> designan la media en el tiempo y, posiblemente, también en una pluralidad de áreas de detección, e I designa la señal creada por las partículas detectadas.

Habiéndose calculado la función de correlación, la concentración puede derivarse a partir del valor de la función de correlación a \tau=cero, que representa la inversa del número de partículas presentes en el área de detección.

En caso de que los elementos ópticos estén posicionados en el haz de luz entre el plano del objeto, es decir, el compartimiento de la muestra, y el plano de la imagen (plano del perceptor de imagen), la imagen digital no sólo indicará las partículas existentes en un elemento de área de la solución, sino todas las partículas que estén en el foco. Por ello, la imagen digital ofrece información acerca de un elemento de volumen de la muestra, dado entre otras cosas por la profundidad focal (profundidad de campo) del o de los elementos ópticos.

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En términos generales, la función de correlación en el tiempo G'(\tau) normalizada mediante la intensidad del cuadrado medio <I^{2}> está relacionada con la concentración y la movilidad gracias a

G(\tau)=1+1/N[f(movilidad)].

Siendo G(\tau)=G'(\tau)/<I^{2}>.

En la ecuación anterior, el término amplitud 1/N depende del número inverso de partículas por elemento de volumen N y una función f (movilidad) que describe tanto el movimiento de traslación como el de rotación. Tal como lo revela la teoría de la fluctuación, las fluctuaciones aumentan al disminuir el número medio de partículas.

La fluctuación de los sucesos y/o de las partículas en la imagen digital durante el cuadro de tiempo pertinente debe ser de una magnitud tal que pueda calcularse una función de correlación en el tiempo precisa. Por ello, el o las áreas de detección de la imagen digital deben estar dimensionadas de tal modo que se consiga una fluctuación apropiada a través de los límites del área de detección. En general, una fluctuación superior genera una mejor función de correlación en el tiempo. La imagen digital con movimiento se divide, adecuadamente, en una pluralidad de áreas de detección, todas las cuales pueden tener un tamaño y una forma idénticos o variables.

Supóngase que la imagen digital se divide, merced a medios de computación, en una pluralidad, de preferencia en 10 o más, por ejemplo 100, áreas de detección, representando cada área varios elementos de píxel del perceptor de imagen. En varios instantes \tau_{1}, \tau_{2}, etc. (es decir, cuadros de imagen en los instantes \tau_{1}, \tau_{2}, etc.) durante un intervalo de tiempo, se utilizan las intensidades I_{1}, I_{2}, etc., que representan las partículas de interés del área de detección A_{1} para calcular la función de correlación G_{1} con respecto al área A_{1}. Simultáneamente, se calculan otras 99 funciones de correlación G_{2} a G_{100}. Teniendo varias funciones de correlación, puede establecerse fácilmente la función de correlación media.

La imagen digital es generada, preferiblemente, mediante un detector capaz de generar una imagen digital, tal como un perceptor de imagen. Cualquier perceptor/detector capaz de generar una salida digital que pueda ser utilizada para extraer parámetros dinámicos de partículas en movimiento aplicando, entre otras cosas, un análisis de correlación sobre la salida digital, resulta adecuado para el presente invento. La imagen podría ser capturada y almacenada en formato analógico y, subsiguientemente, ser transformada a formato digital para ser tratada luego utilizando un análisis de correlación. Por imagen digital debe entenderse una imagen digital con movimiento obtenida, adecuadamente, mediante una multitud de imágenes resueltas en el tiempo, es decir, cuadros de imagen. El perceptor de imagen se caracteriza por la capacidad de captura rápida de la imagen, generación de imágenes digitales listas para ser analizadas por ordenador, con resolución espacial y temporal, y elevada sensibilidad a un espectro completo. Perceptores de imagen adecuados son los perceptores/detectores de imágenes de estado sólido y los denominados detectores del tipo tubo-tubo, de los que un ejemplo lo constituyen las cámaras detectoras con tubo vidicón. En especial, se prefieren los perceptores de imagen del tipo de estado sólido. Un perceptor de imagen de estado sólido es un chip de silicio que comprende una multitud de diodos fotosensibles, denominados fotositios. En el breve instante que se abre el obturador, cada píxel registra la intensidad o el brillo de la luz que incide sobre dicho píxel, acumulando una carga. Las imágenes resueltas en el tiempo de la imagen digital contienen un elevado número de píxeles o elementos de imagen, usualmente de unas pocas micras de tamaño, correspondiendo cada píxel a un fotositio del perceptor de imagen. En consecuencia, la resolución de la imagen viene dada, en gran medida, por el número de fotositios del perceptor de imagen. La resolución del perceptor de imagen no es un factor importante para el presente invento y puede variar dentro de un amplio intervalo, desde aproximadamente un millar hasta, aproximadamente, 20 millones. Puede ser favorable una resolución superior del perceptor de imagen.

Los perceptores de imágenes de estado sólido más comunes son los dispositivos de carga acoplada (CCD) y detectores de semiconductor de metal-oxido (CMOS) complementarios. Ambas clases de perceptores de imagen de estado sólido son semiconductores de silicio diseñados para capturar fotones y convertirlos en electrones. Los perceptores de imagen CCD y CMOS son similares en lo que respecta al diseño básico, pero difieren en términos de cómo son extraídas del perceptor las cargas (electrones) de los fotositios. Si se necesita una sensibilidad elevada, pueden utilizarse perceptores de imagen de fotodiodos de avalancha CMOS.

Los perceptores de imagen de estado sólido, por ejemplo, los fotodiodos de silicio, son sensibles a la luz en un amplio intervalo espectral, de desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1200 nm.

La resolución de la imagen digital es gobernada, básicamente, por la resolución del perceptor de imagen, por lo que cada píxel del perceptor de imagen representa un píxel de la imagen digital. Sin embargo, la resolución también puede mejorarse por software añadiendo píxeles a la imagen digital. Introduciendo medios ópticos, por ejemplo, uno o más elementos ópticos tales como sistemas de lentes que incluyan objetivos y oculares, pueden ampliarse las partículas de la solución. Así, las partículas en el plano de la imagen (plano del perceptor de imagen) son ampliadas con respecto a las partículas físicas posicionadas en el plano del objeto. Sin embargo, los medios ópticos pueden, también, tener propiedades que hagan que las partículas en el plano de la imagen sean más pequeñas que en el plano del objeto. Podría considerarse el empleo de una disposición de esta clase si las partículas tuviesen un área proyectada similar al área total del perceptor de imagen. El área de detección más pequeña de la imagen digital viene dada por un área de la imagen que representa un elemento de píxel individual del perceptor de imagen hasta, en principio, un área que comprenda todos los elementos de píxel. Típicamente, el tamaño/la forma de una o más áreas de detección de la imagen digital es menor que el área proyectada de las partículas de interés de la imagen digital. El volumen analizado dentro de la muestra viene dado, entre otras cosas, por los medios ópticos aplicados. Los medios ópticos pueden ser, adecuadamente, un microscopio, tal como un microscopio compuesto que comprenda un objetivo y una lente de proyección que tenga una fuente de luz que consiga que la luz transmitida, dispersada o emitida tenga una longitud de onda que se adapte al perceptor de imagen. Cuando se dispone de medios ópticos en el camino de la luz entre el plano del objeto y el plano de la imagen (perceptor de imagen), el volumen analizado dentro de la muestra viene dado, en principio, por el objetivo y su ampliación, restringiendo el volumen en dirección radial con respecto a la trayectoria de la luz. Además, debido a la profundidad focal de los medios ópticos, el volumen de medición está restringido, en principio, en dirección axial.

La fuente de luz puede tener cualquier longitud de onda, en tanto la energía de la radiación electromagnética no influya de forma significativa sobre las partículas que han de analizarse y pueda ser detectada por el perceptor de imagen. La luz puede tener un amplio margen de longitudes de onda tal como la luz visible, por ejemplo, longitudes de onda de desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1200 nm, o puede abarcar un intervalo más estrecho de longitudes de onda, hasta la luz monocromática. Tanto si la fuente de luz emite luz monocromática como si emite luz con estrechas longitudes de onda, alternativamente, se aplican filtros adecuados, es decir, filtros monocromáticos si la fuente de luz abarca un intervalo más amplio de longitudes de onda. Asimismo, pueden utilizarse, de preferencia, fuentes de luz que generen luz coherente, adecuadamente monocromática. Ejemplos de fuentes de luz coherentes son las fuentes de luz láser. Fuentes de luz adecuadas son, entre otras, las fuentes de luz de xenón, mercurio a alta y baja presión, tungsteno, halógenas, diodos fotoemisores (LED) tales como diodos azules, láseres y diodos láser. Para el análisis de ciertos tipos de movimiento (movimiento de rotación), es ventajoso que la luz esté polarizada. La selección de un tipo específico de iluminación, carece de importancia para el presente invento; por ello, puede aplicarse cualquier tipo de iluminación en tanto pueda generarse una función de correlación en el tiempo precisa.

Ejemplos de técnicas de iluminación adecuadas si se utiliza un microscopio como medios ópticos, incluyen iluminación Köhler, contraste de fase, contraste por interferencia diferencial, campo oscuro, luz reflejada (dispersada) y emitida (fluorescencia), contraste por modulación Hoffman, iluminación Rheinberg, pero no se limitan a éstas.

Si el perceptor de imagen captura luz emitida desde las partículas, por ejemplo, fluorescencia, usualmente se incluyen medios ópticos en la trayectoria de la luz entre el plano del objeto y el plano de la imagen, incluyendo filtros adicionales además de un microscopio, con el fin de separar la luz de excitación de la luz emitida. Con un microscopio de fluorescencia por luz incidente, la muestra es iluminada con luz de excitación a través de la lente del objetivo. Un divisor de haz dicroico situado en la trayectoria óptica, entre el objetivo y el perceptor de imagen, transmite o refleja la luz dependiendo de la longitud de onda. La fuente de luz empleada para excitación es, comúnmente, un láser. Puede utilizarse cualquier láser que sea capaz de excitar las partículas fluorescentes de interés, incluyendo, por ejemplo, láseres de argón o de argón-krypton, láseres de He-Ne de línea única, diodos láser, etc. Si son suficientes mayores de elementos de volumen de excitación, también pueden utilizarse fuentes de luz no coherente, como lámparas de halógeno o lámparas de mercurio a alta presión. Si se detecta fluorescencia se prefiere tener una relación favorable entre señal y ruido. La fluorescencia fuera de foco aparece como destellos y reduce la señal en forma significativa. Por ello, el volumen de medición dentro de la muestra, dado en principio por la apertura del objetivo y su ampliación en dirección radial, también está restringido en dirección axial. Esta restricción del volumen en dirección axial se obtiene, de preferencia, aplicando una abertura (microorificio) que está conjugada con el plano del objeto y de la imagen. Sin embargo, el perceptor de imagen que consiste en fotositios (píxeles) individuales, también puede funcionar, en sí mismo, como abertura y detector suponiendo que el detector esté situado en el plano de la imagen conjugado del plano del objeto. Se prefiere un microscopio de fluorescencia iluminiscente EPI incidente si las partículas analizadas son pequeñas, con un peso molecular inferior a 100.000 megaDaltons. Ejemplos de dichas partículas pequeñas son las biomoléculas tales como vesículas u orgánulos celulares. Además, el elemento volumen tiene un volumen adecuado de desde, aproximadamente, 10^{-16} litros hasta, aproximadamente, 10^{-10} litros, de preferencia desde aproximadamente 10^{-15} litros hasta, aproximadamente, 10^{-12} litros. Con el fin de obtener estos pequeños volúmenes de medición, la apertura numérica del objetivo es, adecuadamente, superior a 0,7 aproximadamente, más preferiblemente superior a 1,0.

Además, en caso de medirse fluorescencia, pueden calcularse propiedades específicas relacionadas con la expresión de productos de genes específicos, tales como proteínas superficiales, que son importantes para los procesos de fertilización y/o dotadas de otras propiedades funcionales importantes, utilizando un análisis de fluctuación de la intensidad de la fluorescencia. Además, pueden medirse el porcentaje de espermatozoides en relación con el recuento total de esperma así como el nivel de expresión específico (moléculas expresadas por espermatozoide). Similarmente, incluso puede analizarse el contenido de ácido nucleico.

La fuente de luz original puede dividirse, preferiblemente, en una pluralidad de fuentes de luz, lo que se consigue posicionando un elemento óptico difractivo en la trayectoria del haz. El número de trayectorias de haz individuales se hace coincidir, preferiblemente, con un número igual de áreas de detección en la imagen digital.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 muestra una realización del presente invento en la que se mide la fluctuación de la intensidad de la luz transmitida y dispersada;

la fig. 2 indica otra realización del presente invento basada en la luz fluorescente emitida desde partículas contenidas en el recipiente de la muestra;

la fig. 3 esquematiza todavía otra realización del invento, conteniendo el dispositivo dos detectores para analizar señales de luz fluorescente;

la fig. 4 muestra el dispositivo de la fig. 3 con un elemento óptico difractivo; y

la fig. 5 describe un dispositivo que está integrado en el chip de muestra.

El recipiente de la muestra puede tener una gran variedad de formas, tanto cerradas como abiertas, en tanto la característica de la solución de partículas no cambie significativamente con el tiempo. De preferencia, los medios que contienen la muestra están dotados de medios para mantener la temperatura en un valor específico. El hecho de mantener la solución a una temperatura predeterminada puede ser importante si se analizan sistemas biológicos, por ejemplo, espermatozoides. Preferiblemente, el tamaño del recipiente de la muestra en la dirección de la trayectoria de la luz es igual o menor que la profundidad focal de los medios ópticos, siempre que dichos medios ópticos estén situados en la trayectoria de la luz, entre el recipiente de la muestra y el perceptor de imagen.

El dispositivo de acuerdo con el presente invento puede tener más de un solo detector capaz de generar una imagen digital (por ejemplo, diferentes tipos de detector tales como un perceptor tipo CCD o un perceptor tipo CMOS), especialmente si ha de capturarse luz emitida desde las partículas, tal como fluorescencia. Un segundo detector está destinado, adecuadamente, a capturar fenómenos con corto tiempo de respuesta, por ejemplo, un detector que tenga una elevada sensibilidad, tal como un detector de fotodiodo de avalancha (APD), por ejemplo un detector APD CMOS. Al tener dos o más detectores, en la trayectoria del haz (fig. 3) hay situado al menos otro divisor del haz.

Utilizando medios ópticos difractivos, la fuente de luz puede dividirse en una pluralidad de fuentes de luz que generen una pluralidad de volúmenes de medición. Los parámetros dinámicos de las partículas presentes en cada elemento de volumen pueden calcularse aplicando un perceptor de imagen que tenga varios campos de medición correspondientes, adecuadamente, al número de fuentes de luz generadas por un elemento óptico difractivo. Un detector sensible a la posición adecuado puede ser cualquiera de los antes mencionados. El elemento óptico difractivo está posicionado, adecuadamente, entre la fuente de luz y el divisor de haz, por ejemplo como se muestra en la fig. 4.

Mediante el presente invento puede realizarse la medición de los espermatozoides o semen. La aptitud biológica de los espermatozoides viene dada por la velocidad de desplazamiento y la frecuencia de rotación; asimismo, puede calcularse la concentración ya que el número de espermatozoides viene dado por la amplitud de la función de correlación a \tau=cero. La concentración total de espermatozoides incluye, también, los espermatozoides muertos o inmóviles, cuyo número, dentro de un campo de detección, puede medirse también haciendo que se desplacen con relación al sistema de detección al mover el campo de detección, ya sea mecánicamente o por computación. Además, utilizando un perceptor de imagen también se genera una imagen visual de los espermatozoides. Los espermatozoides pueden marcarse, también, mediante tinte fluorescente o con marcadores conjugados de tinte, por ejemplo anticuerpos con especificidad para ciertas propiedades de los espermatozoides, por ejemplo el ADN, receptores basados en la superficie, proteínas relacionadas con la cabeza, el cuerpo medio o la cola de los espermatozoides. La marcación fluorescente de los espermatozoides se lleva a cabo, usualmente, ligando marcadores fluorescentes, por ejemplo anticuerpos, a los espermatozoides, método éste conocido por los expertos en la técnica. Tintes fluorescentes adecuados son los que tienen una absorción máxima en el espectro visible, es decir, desde 350 nm a 750 nm, de los que son ejemplos ilustrativos las rodaminas, tal como verde rodamina, TMR, rodamina B y 6G, cianinas como Cy2, Cy3 y Cy5, rojo Tejas. Con el fin de visualizar (crear una emisión específica) ácidos nucleicos como el ADN, el material genético, pueden utilizarse tintes que interaccionen específicamente con el ADN, tales como bromuro de etidio, ioduro de propidio, tintes de acridina y otras moléculas nucleicas específicas (por ejemplo, sondas de genes).

De acuerdo con una realización del invento, el dispositivo comprende un microscopio compuesto de contraste de fase y un perceptor de imagen tal como un detector de CCD o de CNOS. Cuando se miden espermatozoides/semen, la ampliación total del microscopio (objeto frente a imagen intermedia) se encuentra, adecuadamente, en el margen de desde unas 10 a unas 30 veces. Así, la cabeza de un espermatozoide, que mide aproximadamente 3 \mum, que se encontrase en el plano de imagen intermedio, tendría un tamaño de desde 30 \mum a 90 \mum. El perceptor de imagen se encuentra situado, adecuadamente, en el plano de la imagen intermedia. La imagen digital del perceptor de imagen se divide en una pluralidad de áreas de detección separadas. El área de detección puede tener, de preferencia, un tamaño que sea igual o mayor que el tamaño de las partículas en la imagen digital, adecuadamente hasta un área que ofrezca fluctuaciones del número de partículas suficientes para calcular parámetros dinámicos precisos utilizando análisis de correlación. La forma del área de detección no es importante en tanto pueda calcularse una función de correlación precisa. El área puede tener cualquier forma, por ejemplo, circular o rectangular. El perceptor de imagen está conectado, además, a unos medios de computación que comprende software y hardware adecuados para el análisis de imágenes de video. Con la pantalla del ordenador se genera una imagen digital con movimiento de la muestra. Aplicando un análisis de imágenes apropiado puede eliminarse por filtrado el ruido, por ejemplo de fondo tal como el debido a diferentes categorías de partículas no pertinentes, de tal manera que solamente la fluctuación de las partículas pertinentes forme la base para el cálculo de la función de correlación. Además, el registro de partículas mediante el perceptor de imagen y el cálculo de la función de correlación en el tiempo se llevan a cabo, en esencia, de forma simultánea.

Una realización preferida del invento se ilustra a modo de ejemplo en la fig. 1, que esquematiza un dispositivo que comprende una fuente de luz (1), un compartimiento (3) de muestra que comprende una solución de las partículas, medios ópticos tales como un microscopio (5) y un perceptor de imagen (7). El haz de luz se enfoca preferiblemente sobre el compartimiento de muestra utilizando lentes (2) adecuadas. La fuente de luz puede ser cualquiera de los tipos anteriormente mencionados. Los medios ópticos (5) están situados, adecuadamente, a una distancia del compartimiento de muestra tal que el punto focal (4) se encuentre dentro del compartimiento (3) de muestra. Adecuadamente, el perceptor de imagen es del tipo de agrupación de CCD o de CMOS y, preferiblemente, está situado en el plano (6) de imagen conjugado del punto focal del objetivo. Con el perceptor de imagen en el plano de imagen (fig. 1), se analizan las fluctuaciones de las partículas de la imagen digital. En la fig. 1 no se muestran los medios para el tratamiento de las señales que, adecuadamente, están constituidos por un ordenador personal.

De acuerdo con otra realización del invento (fig. 2), el dispositivo comprende una fuente de luz (10), un compartimiento (8) de muestra que contiene una solución de las partículas, unos medios ópticos (9), un divisor de haz (11), un filtro (12) de emisión (corte), y un detector (14). El haz de luz es reflejado en 90 grados por el divisor de haz y es enfocado por los medios ópticos (9) de tal modo que el punto focal esté situado dentro de la solución de muestra. El divisor de haz puede estar constituido por cualesquiera medios ópticos que sean capaces de separar lo suficiente la luz reflejada o la luz excitada de la luz emitida que emana de la fuente de luz, tal como un divisor de haz dependiente de la longitud de onda (dicroico). Cuando se utiliza fluorescencia, unos medios ópticos comunes están constituidos por un espejo dicroico. Usualmente, un filtro (12) o una pluralidad de filtros (12) de corte están posicionados en la trayectoria del haz, entre el divisor del haz y la microperforación o perceptor de imagen con el fin de mejorar la relación entre señal y ruido. Las partículas que han de medirse pueden ser o no fluorescentes; alternativamente, la solución puede comprender tanto partículas fluorescentes como no fluorescentes. Esta realización del invento puede utilizarse para la medición por retro-dispersión y/o para la medición por fluorescencia.

De acuerdo con todavía otra realización del invento (fig. 3), el dispositivo comprende dos divisores de haz (18) y un segundo divisor de haz (19) así como dos perceptores de imagen (20, 22). Aparte de los dos perceptores de imagen y los dos divisores de haz, el esquema es similar al del dispositivo representado en la fig. 2, comprendiendo además un compartimiento (15) de muestra y unos medios ópticos (16). Los perceptores pueden estar posicionados en los planos de imagen (21, 23) conjugados del punto focal del objetivo. Alternativamente, una abertura (microperforación) está posicionada en los planos de imagen. Unos de los perceptores (20, 22) es un perceptor de imagen, por ejemplo un detector CCD o CMOS. El otro detector puede ser un detector que tenga una respuesta rápida en el tiempo, incorporado a modo de ejemplo por múltiples APD, APD CMOS o agrupaciones de APD CMOS.

La fig. 4 ilustra una realización del presente invento que comprende un elemento óptico difractivo (24) posicionado entre la fuente de luz y el divisor de haz.

La fig. 5 representa otra realización del presente invento en la que el perceptor de imagen y la iluminación están integrados con la célula de medición. Un guía-ondas (25), iluminado preferiblemente por diodos fotoemisores, está posicionado frente a uno o más perceptores de imagen (26). En la cavidad (27) comprendida entre el guía-ondas y el perceptor de imagen, está situada la solución que comprende las partículas. Todos los componentes son pequeños y consumen poca energía, por lo que este tipo de dispositivo tiene, de preferencia, unas dimensiones muy compactas.

Claims (18)

1. Un método para medir parámetros dinámicos de partículas, caracterizado porque comprende aplicar un análisis de correlación sobre fluctuaciones temporales del número de partículas (en 3; 8; 15; 27) con respecto a un área de detección de una imagen digital, en el que se calculan una o más funciones de correlación en el tiempo basándose en las fluctuaciones temporales del número de partículas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la imagen digital es generada mediante un perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26).

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende detectar las partículas (en 3; 8; 15; 27) mediante un detector (7; 14; 20, 22; 26) capaz de generar la imagen digital.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende proporcionar las partículas (en 3; 8; 15; 27) en una solución, una fuente de luz (1; 10; 17; 25), un perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26), medios de computación, detectar las partículas en una imagen digital generada por el perceptor de imagen, y calcular la función de correlación basándose en las fluctuaciones temporales del número de partículas con respecto al área de detección de la imagen digital.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque los medios ópticos (5; 9, 11, 12; 16, 18, 19) están posicionados en la trayectoria de la luz entre el plano del objeto y el plano del perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26).

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque la función de correlación se basa en las fluctuaciones de las partículas con respecto a una pluralidad de áreas de detección.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26) es del tipo detector de estado sólido.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la resta del fondo.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas son espermatozoides.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la medición de la concentración de las partículas.

11. Un dispositivo para medir parámetros dinámicos de partículas en una solución, caracterizado porque comprende un compartimiento de muestra (3; 8; 15; 27), una fuente de luz (1; 10; 17; 25), un perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26), unos medios de computación destinados a tratar señales procedentes del perceptor de imagen, detectar las partículas en una imagen digital generada por el perceptor de imagen, y calcular la función de correlación basándose en fluctuaciones temporales del número de partículas con respecto a un área de detección de la imagen digital, en el que se calculan una o más funciones de correlación en el tiempo basándose en las fluctuaciones temporales del número de partículas.

12. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26) es del tipo de estado sólido.

13. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado porque unos medios ópticos (5; 9, 11, 12; 16, 18, 19) están posicionados en la trayectoria de la luz entre el plano del objeto y el plano del perceptor de imagen (7; 14; 20, 22; 26).

14. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque la o las funciones de correlación se basan en las fluctuaciones de las partículas con respecto a una pluralidad de áreas de detección.

15. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque las partículas son espermatozoides.

16. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque comprende medios para medir la concentración de partículas.

17. Uso de un dispositivo como se define mediante una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 para medir parámetros dinámicos.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, para medir además la concentración de partículas.