CN101107508B

CN101107508B - 用于测量粒子动态参数的方法和装置

Info

Publication number: CN101107508B
Application number: CN2006800024851A
Authority: CN
Inventors: 鲁道夫·里格尔; 佩·里格尔; 伦那特·尼桑
Original assignee: Biophos AG
Current assignee: Biophos AG
Priority date: 2005-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2026-01-17
Also published as: CN101107508A

Abstract

本发明涉及一种用于测量粒子动态参数的方法和装置，包括：应用时间相关分析粒子相对于数字图像检测区的起伏。

Description

用于测量粒子动态参数的方法和装置

技术领域

本发明涉及用于测量粒子动态参数的方法和装置，例如，测量精子的平移速度和转速。此外，本发明还可以估算粒子的数目。

背景技术

本发明用于建立与溶液中粒子动力学/迁移率有关的参数，具体是生物实体，例如，细胞和包含精子的细胞器。分析精液中精子的动态参数和数目对于描述精子的特征是十分重要的，并构成评价男性生育能力的重要工具。

平移速度(速率)是指在检测区域或体积中粒子沿一个或多个方向的定向运动，因此，其程长远远大于观察长度。与平移速度形成对比的是布朗运动，布朗运动描述粒子沿所有方向的随机运动，即，其程长远远小于观察长度。

在US Patent No.5116125中公开一种用于确定精子活动性的方法，所述分析仪是基于动态激光散射。

另一种用于测量精子活动性的方法是利用视频摄像机监测精子并利用计算机基分析各个轨迹，对精子的运动进行分析。虽然这种类型的计算机辅助分析产生的健康状况参数与人工测试比较要快得多，但是这种分析有几个缺点，特别是相对于得到的参数有很大的差异，该参数是随精子浓度的增大而增大。

本发明的目的是提供这样一种方法和装置，它可以大大提高溶液中粒子动态参数的质量。此外，还可以准确地建立粒子的浓度。本发明在测量溶液中粒子的动态参数时是特别有利的，该溶液中包含低浓度粒子和高浓度粒子。

根据以下讨论的内容，其他的优点是显而易见的。

发明内容

按照本发明，我们提供一种用于测量溶液中粒子的动态参数和浓度的方法和装置，例如，在权利要求书中限定的精子。

更具体地说，本发明涉及用于测量粒子的浓度和动态或迁移率参数的方法，一种方法包括：检测检测场中的事件，该事件是由粒子产生的，和基于这些事件的起伏，计算相关函数。另一种方法包括：应用粒子相对于数字图像检测区的时间起伏的相关性分析。本发明还涉及一种用于测量粒子动态参数的方法，包括：利用能够产生数字图像的检测器检测粒子，和基于粒子相对于数字图像检测区的时间起伏，应用相关性分析。按照本发明的另一种方法涉及一种用于测量粒子动态参数的方法，包括：提供溶液中的粒子，光源，能够产生数字图像的检测器，计算装置；和应用相关分析，即，基于粒子相对于数字图像检测区的时间起伏，计算时间相关函数。

本发明还包括一种用于测量粒子动态或迁移率参数的装置，该装置包括：样本室，样本室包含有粒子的溶液，光源，至少包含一个检测场的位置灵敏检测器，计算装置，用于处理来自检测器的信号，其中粒子产生的事件是在检测场中被检测，并计算时间分辨的相关函数。在另一个实施例中，该装置包括：包含粒子溶液的样本室，光源，图像传感器，计算装置，用于处理来自传感器的信号，检测由图像传感器产生的数字图像上的粒子，和应用相关分析，即，基于粒子相对于数字图像检测区的时间起伏，计算(时间)相关函数。除了测量粒子在溶液中或另一种物理环境中的动态参数以外，该方法和装置还可用于计算样本溶液中出现的粒子数目和浓度。

在本发明中，利用检测场可以检测代表相关粒子的事件起伏。最好是，利用产生相关函数的相关性分析，分析粒子在数字运动图像中的时间起伏，所述相关函数给出该粒子的动态参数信息，例如，扩散时间，平移速度，转动频率，等等，和在体积单元中的粒子数目，即，浓度。利用上述的动态参数，可以估算粒子的迁移率。按照本发明，可以估算在溶液中出现的任何粒子或实体，其尺寸的范围是从分子到宏观尺度。若该粒子代表精子，则可以计算多个重要的动态参数，例如，称之为活动性的游泳速度，转动频率，和精子浓度。

本发明的一个新颖特征是应用出现在数字运动图像中的粒子的起伏的相关性分析。包含相关粒子的溶液的数字运动图像是利用能够形成数字图像的合适检测器产生的，例如，连接到计算装置的图像传感器。借助于计算装置，数字图像可以适当地被分成几个测量/检测区，它能够在检测区的边界上产生粒子数目或粒子浓度的正确时间有关(时间)起伏。因此，在检测区中的粒子数目是围绕平均数随机地变化的。利用起伏信号的相关函数，该信号代表粒子，可以分析粒子数目相对于数字图像检测区的起伏。因此，该起伏是用于计算(时间)相关函数的基础，相关函数产生粒子的动态参数和数目。粒子在数字图像中是随时间运动的，即，进出检测区边界的运动。本发明的图像传感器是能够产生运动粒子数字图像的传感器，该图像传感器在图像平面上有分辨率，即，在x轴和y轴上的空间分辨率。当图像传感器产生一系列有时间分辨率的数字图像(帧)时，可以得到应用相关分析作进一步分析的运动图像。利用本发明，在与建立数字图像(数字运动图像)相同的时间内，可以评价溶液中粒子的动态参数，但是，该方法也可应用于在合适存储装置上存储的数字运动图像。

图像传感器产生的数字图像信息起源于从粒子传输，散射或发射的光。通常，利用任何类型的数字成像分析，可以适当地滤出与相关粒子没有联系的事件。应用适当的成像分析工具以抑制来自图像传感器的多余信息，可以计算基于注册粒子起伏的时间相关函数。在数字图像中出现几个检测区的情况下，可以同时计算几个时间相关函数，其中每个相关函数是从同一个检测区中产生的。

在特定时间间隔中的多个时间(τ₁，τ₂，τ₃，等等)，监测数字图像检测区中事件和/或粒子数目的起伏。得到的时间相关函数基本上是描述事件在时间尺度上自相似性的函数，即，被检测的粒子是时间相关的。简单地说，时间相关函数G′(τ)是由以下公式给出：

G′(τ)＝<I(t)＊I(t+τ)>

其中角括号<...>表示在时间上的平均，而且也可能是在多个检测区上的平均，而I表示被检测粒子产生的信号。

我们已经计算了相关函数，可以从相关函数在τ＝0的数值中导出粒子浓度，该函数代表在检测区中出现的粒子数目的倒数。

若光学元件放置在物体平面(即，样本室)与图像平面(图像传感器平面)之间的光束中，则数字图像不仅指出位于溶液区域单元中的粒子，而且还指出被聚焦的所有粒子。因此，数字图像给出有关样本体积单元的信息，如果给出光学元件的焦深(景深)。

一般地说，利用平均平方强度<I²>归一化的相关函数G′(τ)是与浓度和迁移率有关：

G(τ)＝1+1/N[f(mobility)]

其中G(τ)＝G′(τ)/<I²>

在以上的公式中，幅度项1/N是与每单位体积的粒子数N倒数和描述平动和转动的函数f(mobility)有关。如在起伏理论中所描述的，起伏是随平均粒子数的减小而增大。

数字图像中的事件和/或粒子在相关时间帧的起伏应当有这样的幅度，可以计算相关函数的准确时间。因此，数字图像的检测区必须有这样的尺度，在检测区边界上可以实现合适的起伏。一般地说，较大的起伏产生较好的时间相关函数。数字运动图像被合适地分成多个检测区，这些检测区都能有相同或不同的尺寸和形状。

我们假设利用计算装置，数字图像被分成多个检测区，最好是≥10，例如，100个检测区，每个检测区代表图像传感器的几个像素单元。在几个时间τ₁，τ₂等(即，在时间τ₁，τ₂等的图像帧)，在时间间隔内，代表检测区A₁中相关粒子的强度I₁，I₂等用于计算相对于区域A₁的相关函数G₁。与此同时，计算其他99个相关函数G₂至G₁₀₀。我们已经有了多个相关函数，可以容易地建立平均相关函数。

数字图像最好是由能够产生数字图像的检测器产生，例如，图像传感器。任何能够产生数字输出的传感器/检测器适合于本发明，应用相关分析该数字输出可用于提取运动粒子的动态参数。可以利用模拟格式捕获和存储该图像，然后再被转换成数字格式，并利用相关分析处理该数字格式。数字图像是指适合于利用多个时间分辨的图像得到合适的数字运动图像，即，图像帧。图像传感器的特征是，它能够快速捕获图像，产生容易进行计算机分析的数字图像，有空间和时间分辨率，并对整个光谱有高的灵敏度。合适的图像传感器是固态图像传感器/检测器，和所谓的管-管型检测器，典型的是视像管检测摄像机。固态型图像传感器是特别优选的。固态图像传感器是硅芯片，它包含称之为图像元件的多个光敏二极管。在很短的瞬时内打开快门，每个像素记录光入射到像素上的强度或亮度而积累电荷。数字图像中的时间分辨图像包含大量的像素，像素的尺寸通常是几个微米，其中每个像素对应于图像传感器中的图像元件。因此，图像分辨率在很大程度上是由图像传感器上的图像元件数目确定。图像传感器的分辨率在本发明中不是一个重要的因素，并可以在约1千至约2千万的很宽范围内变化。图像传感器有较高的分辨率可能是优选的。

最普通的固态图像传感器是电荷耦合器件(CCD)和互补的金属氧化物半导体检测器(CMOS)。这两类固态图像传感器是硅半导体，设计成捕获光子并把它们转换成电子。CCD和CMOS图像传感器的基本设计是类似的，但不同的是如何从传感器中提取图像元件的电荷(电子)。若需要高灵敏度，则可以使用CMOS雪崩光电二极管图像传感器。

固态图像传感器，例如，硅光电二极管，它对于约200nm至约1200nm的宽光谱范围内的光是灵敏的。

数字图像的分辨率基本上是受图像传感器分辨率的控制，因此，图像传感器中的每个像素代表数字图像中的一个像素。然而，利用添加像素到数字图像中的软件也可以提高分辨率。通过引入光学装置，例如，一个或多个光学元件，它利用包含物镜和目镜的透镜系统，可以放大溶液中的粒子。因此，图像平面(图像传感器平面)上的粒子相对于在物体平面上放置的实际粒子是被放大的。然而，光学装置也可以有这样的性质，它使图像平面上的粒子小于物体平面上的粒子。若粒子的投影面积小于图像传感器的总面积，则可以这种安排。数字图像中的最小检测区域是由代表图像传感器中各个像素单元的图像区域确定，在原则上，图像传感器可以包含所有像素的区域。通常，数字图像中检测区的尺寸/形状大于数字图像中相关粒子的投影区。在样本内被分析的体积是由光学装置确定。光学装置可以是合适的显微镜，例如，包含物镜和投影透镜的复合显微镜，它使光源传输，散射或发射的光有与图像传感器匹配的波长。当光学装置放置在物体平面与图像平面(图像传感器平面)之间的光路上时，在样本内被分析的体积原则上是由物镜和它的放大倍数确定，这两个因素限制相对于光路沿径向的体积。此外，由于光学装置的焦深，测量体积原则上被限制在沿轴的方向上。

光源可以有任何的波长，只要电磁辐射的能量不严重地影响被分析的粒子，并可以被图像传感器检测。光可以有很宽的波长范围，例如，可见光，波长从约200nm至约1200nm，或有很窄范围的光至单色光。光源发射单色光或有窄波长的光，若光源有很宽的波长范围，则可以应用合适的滤波器，即，单色滤波器。此外，最好是，可以使用产生相干光的光源，合适的是单色光源。相干光源的例子是激光光源。此外，合适的光源是氙灯，高压和低压汞灯，钨灯，卤素灯，发光二极管(LED)，例如，蓝色二极管，激光和激光二极管。在分析某些类型运动(转动)，有利的是，如果光是偏振光。选取特定类型的照明光在本发明中是不重要的，因此，只要能够产生准确的时间相关函数，可以使用任何照明类型的光。

若使用显微镜作为光学装置，则合适照明技术的例子包括，但不限于，Kohler照明，相位对比度，微分干涉对比度，暗场，反射(散射)和发射光(荧光)，Hoffman调制对比度，Rheinberg照明。

若来自粒子的发射光，例如，荧光，被图像传感器捕获，则通常在物体平面与图像平面之间的光程上安装包括显微镜和附加滤波器的光学装置，为的是分开激励光与发射光。有了入射光荧光显微镜，样本的照明是利用通过物镜的激励光。放置在物镜与图像传感器之间光程上的分色分束器传输或反射光，它取决于波长。用于激励的光源通常是激光器。可以使用能够激励相关荧光粒子的任何激光器，例如，包括：氩激光器或氩氪激光器，单线He-Ne激光器，激光二极管，等等。若较大的激励体积单元是足够的，则还可以使用非相干光源，例如，高压水银灯或卤素灯。若检测到荧光，则最好是有较高的信噪比。离焦的荧光呈现闪光，并严重地降低信号。因此，假设物镜的孔径和它的放大倍数是在径向，则在样本内的测量体积也被限制在轴向。沿轴向的这种体积限制最好是利用孔径(针孔)得到的，该孔径是与物体平面和图像平面共轭。然而，由各个图像元件(像素)构成的图像传感器也可以有孔径和检测器的功能，只要该检测器被定域在与物体平面共轭的图像平面上。若被分析的粒子很小，其分子量是在100000兆道尔顿以下，则入射epi照明荧光显微镜是优选的。这种小粒子的例子是生物分子，例如，囊或细胞器。此外，体积单元有合适的体积，它是从约10^-16升至约10^-10升，最好是从约10^-15升至约10^-12升。为了得到这些很小的测量体积，物镜的数值孔径最好是约0.7，更好的是在1.0以上。

此外，在测量荧光的情况下，利用荧光强度起伏分析，可以计算与特定基因产品表示有关的特定性质，例如，表面蛋白，它对于受精过程是重要的和/或具有其他的重要功能性质。而且，可以测量与总的精子计数以及具体表示水平(表示成每个精子的分子数)有关的精子百分比。类似地，甚至可以分析核酸含量。

最好是，原始光源被分成多个光源，这是通过在光程上放置衍射光学元件实现的。单个光程的数目最好是与数字图像中相同的检测区数目匹配。

附图说明

图1表示本发明的一个实施例，其中测量透射光和散射光的强度起伏。

图2表示本发明的另一个实施例，其中基于从样本容器中粒子发射的荧光。

图3表示本发明的另一个实施例，该装置包含用于分析荧光信号的两个检测器。

图4表示图3中有衍射光学元件的装置。

图5描述一种被集成到样本芯片中的装置。

具体实施方式

只要粒子的特征不是随时间发生重大的变化，样本容器可以有各种闭合和开放的形状。最好是，样本保持装置是适合于保持温度在具体水平上的装置。在分析生物系统时，例如，精子，保持溶液在预定的温度下是十分重要的。最好是，若光学装置放置在样本容器与图像传感器之间的光程上，则该样本容器在沿光程方向上的尺寸等于或小于光学装置的焦深。

按照本发明的装置不仅有一个能够产生数字图像的检测器(不同类型的检测器，例如，CCD型或CMOS型传感器)，特别是，我们需要捕获从粒子发射的光，例如，荧光。第二个检测器适合于捕获有很短响应时间的现象，例如，有高灵敏度的检测器，诸如雪崩光电二极管(APD)检测器，CMOS APD检测器。如果有两个或多个检测器，则至少一个其他的分束器放置在光程上(图3)。

利用衍射光学装置，光源能够被分成产生多个测量体积的多个光源。利用有多个测量场的图像传感器，该测量场正确地对应于衍射光学元件产生的多个光源，可以计算在每个体积单元中出现的粒子动态参数。合适的位置灵敏检测器可以是上述的任何一种检测器。衍射光学元件适合于放置在光源与分束器之间，如图4中所示。

本发明可以测量精子或精液。精子的健康状况是由游泳速度和转动频率给出，此外，当精子的数目是由相关函数在τ＝0的幅度给出时，还可以计算精子的浓度。精子的总浓度也包含死的或不能运动的精子，利用机械方式或计算方式移动检测场而使这些精子相对于检测系统是运动的，也可以测量死精子在检测场内的数目。此外，利用图像传感器，也可以产生精子的视频图像。利用荧光染料或染料结合的标志，也可以标记精子，例如，有某些精子性质的特异性抗体，例如，DNA，表面基受体，与精子的头部，中部或尾部有关的蛋白质。精子的荧光标记通常是通过结合荧光标记完成的，例如，专业人员熟知的抗体与精子的结合。合适的荧光染料是那些在可见光谱中有最大吸收值的染料，即，从350nm至750nm，典型的例子是若丹明，例如，若丹明绿，TMR，若丹明B和6G，氰蓝，例如，Cy2，Cy3和Cy5，德克萨斯红。为了观看(建立特定的发射)核酸，例如，DNA，基因物质，可以使用专门与DNA相互作用的染料，例如，溴化ethidium，碘化propidium，吖啶染料，和其他的核专用分子(例如，基因探子)。

按照本发明的一个实施例，该装置包括：相位对比度复合显微镜和图像传感器，例如，CCD或CMOS检测器。在测量精子/精液时，显微镜的总放大倍数(物体与中间图像的关系)合适地是在约10倍至约30倍的范围内。因此，测量约3μm的精子头在中间图像平面上的尺寸是30μm至90μm。图像传感器适合于放置在中间图像的平面上。图像传感器的数字图像被分成多个分开的检测区。最好是，检测区的尺寸等于或大于数字图像中粒子的尺寸，在利用相关分析计算精确的动态参数时，它适合于达到给出足够粒子数目起伏的区域。只要可以计算精确的相关函数，检测区的形状是不重要的。检测区可以有任意的形状，例如，圆形或矩形。图像传感器还连接到计算装置，计算装置包含用于视频图像分析的合适软件和硬件。利用计算机屏幕，可以产生样本的数字运动图像。应用正确的图像分析，可以滤去噪声，例如，不同类别非相关粒子的背景噪声，因此，仅仅相关粒子的起伏形成用于计算相关函数的基础。此外，借助于图像传感器注册粒子并计算时间相关函数基本上是同时完成的。

本发明的一个优选实施例是图1所示的装置，包括：光源(1)，包含粒子溶液的样本室(3)，诸如显微镜的光学装置(5)，和图像传感器(7)。最好是，利用合适的透镜(2)使光束聚焦到样本室上。光源可以是上述任何类型的光源。光学装置(5)适当地放置在与样本室隔开的一段距离上，可以使焦点(4)是在样本室(3)内。图像传感器可以是合适的CCD或CMOS阵列型，它最好放置在与物镜焦点共轭的图像平面(6)上。利用图像平面上的图像传感器(图1)，可以分析数字图像中粒子的起伏。在图1中没有画出信号处理装置，该装置可以是个人计算机。

按照本发明的另一个实施例(图2)，该装置包括：光源(10)，包含粒子溶液的样本室(8)，光学装置(9)，分束器(11)，传输(截止)滤波器(12)，和检测器(14)。光束被分束器反射90度并被光学装置(9)聚焦，可以使焦点位于样本溶液内。分束器可以是任何的光学装置，该装置能够充分地分开从光源发射的反射光或激励光，例如，波长有关的(分色)分束器。在使用荧光时，一种普通的光学装置是分色反射镜。通常，一个截止滤波器(12)或多个截止滤波器放置在分束器与针孔或图像传感器之间的光程上，为的是提高信噪比。需要测量的粒子可以是非荧光或荧光粒子，或者，该溶液可以包含荧光粒子和非荧光粒子。本发明的这个实施例可用于背散射测量和/或荧光测量。

按照本发明的另一个实施例(图3)，该装置包括：两个分束器，即，第一个分束器(18)和第二个分束器(19)，以及两个图像传感器(20，22)。除了两个图像传感器和两个分束器以外，它的布局类似于图2所示的装置，该装置还包括：样本室(15)和光学装置(16)。传感器可以放置在与物镜(21，23)的焦点共轭的图像平面上。或者，孔径(针孔)放置在图像平面上。这两个传感器(20，22)中的一个传感器是图像传感器，例如，CCD或CMOS检测器。另一个检测器可以是有快时间速响应的检测器，例如，多个APD，CMOS APD，或CMOS APD阵列。

图4描述本发明的一个实施例，其中包括放置在光源与分束器之间的衍射光学元件(24)。

图5描述本发明的另一个实施例，其中图像传感器和照明光源是与测量单元集成。最好是，发光二极管照射的波导(25)放置在一个或多个图像传感器(26)的相对侧。在波导与图像传感器之间的空腔(27)中放置包含粒子的溶液。所有元件的体积是很小的，且它们消耗很少的能量，因此，这种类型装置最好有非常紧致的尺寸。

Claims

1.一种用于测量粒子动态参数的方法，其特征是，该方法包括：应用对粒子数目相对于数字图像检测区的时间起伏的相关性分析，其中时间相关函数的计算是基于粒子数目的时间起伏。

2.按照权利要求1的方法，其特征是，数字图像是由图像传感器产生的。

3.一种用于测量粒子动态参数的方法，其特征是，该方法包括：利用能够产生数字图像的检测器检测粒子，和基于粒子数相对于数字图像检测区的时间起伏，应用相关性分析，其中时间相关函数的计算是基于粒子数目的时间起伏。

4.一种用于测量粒子动态参数的方法，其特征是，该方法包括：提供在溶液中的粒子，光源，图像传感器，计算装置；检测由图像传感器产生的数字图像上的粒子；和基于粒子数目相对于数字图像检测区的时间起伏，计算时间相关函数，其中时间相关函数的计算是基于粒子数目的时间起伏。

5.按照权利要求4的方法，其特征是，光学装置放置在溶液中的粒子与图像传感器平面之间的光路上。

6.按照权利要求4或5的方法，其特征是，时间相关函数是基于粒子相对于多个检测区的起伏。

7.按照权利要求6的方法，其特征是，图像传感器是固态检测器类型的图像传感器。

8.按照权利要求7的方法，其中该方法还包括：背景减法。

9.按照权利要求8的方法，其中该粒子是精子。

10.按照权利要求9的方法，其中该方法还包括：测量粒子的浓度。

11.一种用于测量溶液中粒子动态参数的装置，其特征是，该装置包括：样本室，光源，图像传感器，计算装置，该计算装置用于处理来自图像传感器的信号、检测由图像传感器产生的数字图像上的粒子和基于粒子数目相对于数字图像检测区的时间起伏，计算时间相关函数，其中时间相关函数的计算是基于粒子数目的时间起伏。

12.按照权利要求11的装置，其特征是，图像传感器是固态类型的图像传感器。

13.按照权利要求11或12的装置，其特征是，光学装置放置在样本室与图像传感器平面之间的光路上。

14.按照权利要求13的装置，其特征是，时间相关函数是基于粒子相对于多个检测区的起伏。

15.按照权利要求14的装置，其特征是，该粒子是精子。

16.按照权利要求15的装置，其特征是，它包括：用于测量粒子浓度的装置。

17.权利要求16所定义的装置的用途，用于测量动态参数。

18.按照权利要求17的用途，还包括用于测量粒子浓度。