ES2338523T3 - Poliformismos en el gen cyp2b6 humano y su uso en aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. - Google Patents
Poliformismos en el gen cyp2b6 humano y su uso en aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. Download PDFInfo
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Abstract
Un método de diagnóstico de hipersensibilidad a fármacos relacionada con la presencia de una variante molecular del gen CYP2B6 que comprende determinar en una muestra de un sujeto la presencia de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y (b) un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene una T en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1; en donde la presencia de dicho polinucleótido o fragmento del mismo se considera indicativa de dicha hipersensibilidad a fármacos en dicho método.
Description
Polimorfismos en el gen CYP2B6 humano y su uso
en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
La presente invención se refiere en general a
medios y métodos de diagnosticar el espectro fenotípico así como
las características clínicas superpuestas con varias formas de
expresión y/o función anormal heredada del gen del citocromo
P-450 (CYP)2B6. En particular, la presente
invención se refiere a un método de diagnosticar hipersensibilidad
a fármacos relacionada con la presencia de una variante molecular
del gen CYP2B6 que comprende determinar en una muestra de un sujeto
la presencia de un polinucleótido seleccionado del grupo que
consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T;
en donde la presencia de dicho polinucleótido o
fragmento del mismo se considera indicativa de dicha
hipersensibilidad a fármacos en dicho método.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un oligo- o polinucleótido para diagnosticar la
hipersensibilidad a fármacos relacionada con la presencia de una
variante molecular del gen CYP2B6 que comprende determinar en una
muestra de un sujeto la presencia de un polinucleótido seleccionado
del grupo que consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T.
inhibidores o moduladores de los genes CYP2B6 o
su producto.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método in vitro para el desarrollo de un
perfil farmacodinámico de fármacos que son sustratos del producto
del gen CYP2B6 para un paciente o para mejorar la terapia de
trastornos con fármacos que son dianas del producto del gen CYP2B6
que comprende usar el polimorfismo de nucleótido único del gen
CYP2B6 en la posición 516 ó 1459 como se define en la reivindicación
1.
Los miembros de la familia del citocromo
P-450 (CYP) de hemoproteínas metabolizan una amplia
variedad de sustratos endógenos tales como hormonas esteroideas, y
de xenobióticos incluyendo carcinógenos, toxinas y fármacos; véase,
por ejemplo, Daly, Toxicol. Lett. 102-103 (1998),
143-147; Touw, Drug Metabol. Drug Interact. 14
(1997), 55-82. CYP2B6 está implicada en la
activación e inactivación metabólica de ciertos fármacos
clínicamente importantes tales como los agentes antineoplásicos
usados con frecuencia ciclofosfamida e isofosfamida, el
antiestrógeno tamoxifeno, el inhibidor de agregación plaquetaria
más nuevo clopidogrel, pero también tóxicos medioambientales y
drogas recreativas tales como nicotina y éxtasis. El gen CYP2B6 se
ha mapeado en el cromosoma 19 entre 19q12 y 19q13.2 (Miles et
al., 1989; Carrano et al., 1989; Hoffman et al.,
1995). Abarca una región de aproximadamente 28 kb y como otros
miembros de la familia CYP2 contiene 9 exones que están separados
por 8 intrones. El gen codifica una proteína microsómica con 491
aminoácidos. El gen CYP2B6 está localizado dentro de un agrupamiento
de genes de 350 kb junto con un número de otros genes y pseudogenes
de las subfamilias CYP2A, 2B y 2F (Hoffman et al., 1995). La
subfamilia CYP2B consiste en el gen funcional CYP2B6, el gen no
funcional CYP2B7 y un pseudogén similar a CYP2B7 (Yamamo 1989;
Hoffman 1995). El ARNm y la proteína de CYP2B6 se expresan
principalmente en hígado humano donde contribuye en un 1 a un 5%
estimado del contenido total en hígado de citocromo P450 (Gervot
et al., 1999). La expresión extrahepática se produce a
niveles menores en riñón, intestino y pulmón (Gervot et al.,
1999; González et al., 1992). Inicialmente, se pensó que
CYP2B6 se expresaba sólo en alrededor del 25% de todos los hígados
humanos (Mimura et al., 1993). Sin embargo, con nuevos
anticuerpos de mayor sensibilidad se detectó CYP2B6 en todas las
muestras de hígado con una variabilidad interindividual de expresión
de hasta 100 veces (Code et al., 1997; Gervot et al.,
1999). Las razones para esta gran variabilidad son desconocidas
pero lo más probable es que estén implicados dos mecanismos:
- (a)
- inducción enzimática: CYP2B6 es el homólogo humano de los P450 de rata CYP2B1/CYP2B2 que se sabe que son inducibles por fenobarbital (Sueyoshi et al., 1999);
- (b)
- polimorfismo genético: algunas indicaciones limitadas para la existencia de polimorfismos genéticos, incluyendo un sitio polimórfico Bam HI y Bgl II observados como RFLP se describieron en una de las publicaciones originales (Miles et al., 1988; Yamano et al., 1989).
Está claro que las mutaciones naturales, si
existen pueden tener efectos sobre la metabolización de fármacos y
la eficacia del tratamiento farmacológico, por ejemplo en el
tratamiento del cáncer. Sin embargo, no se sabe cuántas de tales
variaciones existen, ni con qué frecuencia y en qué posiciones en el
gen CYP2B6 humano.
Según esto, medios y métodos para diagnosticar y
tratar una variedad de formas de intolerancia a fármacos
individuales e ineficacia al tratamiento farmacológico resultante de
polimorfismos en el gen CYP2B6 que interfiere, por ejemplo, con el
tratamiento quimioterapéutico de enfermedades, no estaban hasta
ahora disponibles pero sin embargo son muy deseables.
De esta manera, el problema técnico de la
presente invención es ajustarse a las necesidades descritas
anteriormente.
La solución a este problema técnico se alcanza
proporcionando las formas de realización caracterizadas en las
reivindicaciones.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de variaciones nuevas, hasta ahora desconocidas, en
la secuencia de nucleótidos del gen CYP2B6 y la distribución de
población de estos alelos. Basados en el conocimiento de estas
secuencias nuevas se diseñaron pruebas diagnósticas y reactivos para
tales pruebas para la detección específica y el genotipado de
alelos CYP2B6 en seres humanos, incluyendo alelos homocigotos así
como heterocigotos, frecuentes así como raros de los genes CYP2B6.
La determinación del estado de los alelos del gen CYP2B6 de seres
humanos con tales pruebas es útil para la optimización de terapias
con los numerosos sustratos de CYP2B6. También puede ser útil en la
determinación de la predisposición individual a varios cánceres
comunes producidos por carcinógenos medioambientales.
En una primera forma de realización, la
invención proporciona un método de diagnosticar hipersensibilidad a
fármacos relacionada con la presencia de una variante molecular del
gen CYP2B6 que comprende determinar en una muestra de un sujeto la
presencia de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste
en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T;
en donde la presencia de dicho polinucleótido o
fragmento del mismo se considera indicativa de dicha
hipersensibilidad a fármacos en dicho método.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un oligo- o polinucleótido para diagnosticar la
hipersensibilidad a fármacos relacionada con la presencia de una
variante molecular del gen CYP2B6 que comprende determinar en una
muestra de un sujeto la presencia de un polinucleótido seleccionado
del grupo que consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método in vitro para el desarrollo de un
perfil farmacodinámico de fármacos que son sustratos del producto
del gen CYP2B6 para un paciente o para mejorar la terapia de
trastornos con fármacos que son dianas del producto del gen CYP2B6
que comprende usar el polimorfismo de nucleótido único del gen
CYP2B6 en la posición 516 ó 1459 como se define en la reivindicación
1.
Los métodos y usos diagnósticos de la invención
son útiles para el diagnóstico y tratamiento de cáncer y otras
enfermedades cuya terapia depende del tratamiento y tolerancia a
fármacos. Las nuevas formas variantes de los genes CYP2B6 según la
invención proporcionan el potencial para el desarrollo de un perfil
farmacodinámico de fármacos para un paciente determinado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El descubrimiento y caracterización de
variaciones en el gen CYP2B6 y las pruebas diagnósticas para la
discriminación de diferentes alelos de CYP2B6 en individuos humanos
proporciona una herramienta muy potente para mejorar el tratamiento
de enfermedades con fármacos que son dianas del producto del gen
CYP2B6, y cuya metabolización, por tanto, depende de CYP2B6. El
diagnóstico del estado alélico individual de CYP2B6 permite un
tratamiento más enfocado, por ejemplo, al abrir la posibilidad de
aplicar pautas posológicas individuales de fármacos. También puede
ser útil como herramienta de pronóstico para el desenlace de la
terapia. Además, las pruebas diagnósticas para el genotipado de
CYP2B6, y las nuevas variantes de CYP2B6, no sólo mejorarán el
tratamiento con fármacos establecidos y ayudarán a correlacionar
genotipos con actividad de fármacos o efectos secundarios. Estas
pruebas y secuencias también proporcionan reactivos para el
desarrollo de inhibidores nuevos que modulan específicamente la
actividad de tipos individuales de CYP2B6. Se ha descrito la
expresión en levadura, por ejemplo, de tres ADNc alélicos que
codifican CYP3A4 hepática humana y los métodos para probar las
propiedades de unión y actividades catalíticas de sus productos
génicos en Peyronneau, Eur. J. Biochem. 218 (1993).
De esta manera, la presente invención
proporciona una manera nueva de explotar la investigación en
biología molecular y farmacológica para el tratamiento
farmacológico mientras que evita sus potenciales efectos dañinos
que son debidos a la expresión de genes CYP2B6 variantes.
Según esto, la invención se refiere a un método
de diagnosticar la hipersensibilidad a fármacos relacionada con la
presencia de una variante molecular del gen CYP2B6 que comprende
determinar en una muestra de un sujeto la presencia de un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T;
en donde la presencia de dicho polinucleótido o
fragmento del mismo se considera indicativa de dicha
hipersensibilidad a fármacos en dicho método.
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En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un oligo- o polinucleótido para diagnosticar la
hipersensibilidad a fármacos relacionada con la presencia de una
variante molecular del gen CYP2B6 que comprende determinar en una
muestra de un sujeto la presencia de un polinucleótido seleccionado
del grupo que consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1, una T.
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En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método in vitro para el desarrollo de un
perfil farmacodinámico de fármacos que son sustratos del producto
del gen CYP2B6 para un paciente o para mejorar la terapia de
trastornos con fármacos que son dianas del producto del gen CYP2B6
que comprende usar el polimorfismo de nucleótido único del gen
CYP2B6 en la posición 516 ó 1459 como se define en la reivindicación
1.
El polinucleótido y polipéptidos variantes
aplicados en los métodos y usos de la invención también comprenden
fragmentos de dichos polinucleótidos o polipéptidos de la invención.
Los polinucleótidos y polipéptidos así como los fragmentos de los
mismos mencionados anteriormente aplicados en los métodos y usos de
la invención se caracterizan por estar asociados con propiedades
bioquímicas alteradas de la proteína CYP2B6 y/o expresión alterada
del gen CYP2B6 variante comparado con el gen natural
correspondiente. Dichas propiedades bioquímicas alteradas se
consideran dentro de lo esencial de la presente invención para
producir propiedades bioquímicas alteradas de la proteína CYP2B6
tales como actividad proteica y por lo tanto se consideran que
producen diferencias interindividuales en el metabolismo de
fármacos.
En el contexto de la presente invención el
término gen o proteína CYP2B6 "variante molecular" como se usa
aquí significa que dicho gen o proteína CYP2B6 se diferencia del gen
o proteína CYP2B6 natural por medio de
sustitu-
ción(es), adición(es) y/o deleción(es) de nucleótidos (se describen secuencias parcialmente genómicas y de ADNc en, por ejemplo, Miles et al., 1988; Miles et al.,1989; Miles et al., 1990; Yamano et al., 1989; Sueyoshi et al.,1999; números de acceso: J02864; X13494; M29874; X06399; X16864; X06400; Af081569). Preferiblemente, dicha(s) sustitución(es) de nucleótidos produce(n) un cambio correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la proteína CYP2B6.
ción(es), adición(es) y/o deleción(es) de nucleótidos (se describen secuencias parcialmente genómicas y de ADNc en, por ejemplo, Miles et al., 1988; Miles et al.,1989; Miles et al., 1990; Yamano et al., 1989; Sueyoshi et al.,1999; números de acceso: J02864; X13494; M29874; X06399; X16864; X06400; Af081569). Preferiblemente, dicha(s) sustitución(es) de nucleótidos produce(n) un cambio correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la proteína CYP2B6.
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El término "que hibridan" como se usa aquí
se refiere a polinucleótidos aplicados en los métodos y usos de la
invención que son capaces de hibridar con los polinucleótidos de la
invención o partes de los mismos que se asocian con propiedades
bioquímicas alteradas de la proteína CYP2B6 y/o expresión alterada
del gen CYP2B6 variante comparado con el gen salvaje
correspondiente. De esta manera, dichos polinucleótidos que hibridan
también se asocian con dichas propiedades bioquímicas alteradas de
la proteína CYP2B6 y/o dicha expresión alterada del gen CYP2B6
variante comparado con el correspondiente gen natural. Por lo tanto,
dichos polinucleótidos pueden ser útiles como sondas en análisis
por transferencia Northern o Southern de preparaciones de ARN o
ADN, respectivamente, o se pueden usar como cebadores
oligonucleotídicos en análisis por PCR dependiendo de su respectivo
tamaño. También se comprenden polinucleótidos que hibridan que son
útiles para analizar interacciones ADN-proteína a
través, por ejemplo, de análisis de cambio en la movilidad
electroforética (EMSA). Preferiblemente, dichos oligonucleótidos
que hibridan comprenden al menos 10, más preferiblemente al menos 15
nucleótidos de longitud mientras que un polinucleótido que hibrida
de la presente invención a usarse como sonda preferiblemente
comprende al menos 100, más preferiblemente al menos 200 ó lo más
preferiblemente al menos 500 nucleótidos de longitud. Se conoce
bien en la técnica cómo realizar experimentos de hibridación con
moléculas de ácido nucleico, es decir, el experto en la materia
sabe qué condiciones de hibridación tiene que usar según la presente
invención. A tales condiciones de hibridación se refiere en libros
de texto estándar tal como Molecular Cloning A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Preferidos según los
métodos y usos de la presente invención son polinucleótidos que son
capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención o partes
de los mismos que se asocian con propiedades bioquímicas alteradas
de la proteína CYP2B6 y/o con expresión alterada del gen CYP2B6
variante comparado con el correspondiente gen natural en condiciones
rigurosas de hibridación, es decir, que no hibrida con
polinucleótidos no relacionados tales como polinucleótidos que
pueden no cambiar las propiedades bioquímicas de la proteína CYP2B6
y/o alterar la expresión del gen CYP2B6 variante comparado con el
gen natural correspondiente.
El término "correspondiente" como se usa
aquí significa que una posición no solo está determinada por el
número de los nucleótidos y aminoácidos anteriores,
respectivamente. La posición de un nucleótido o aminoácido
determinado según la presente invención que se puede delecionar,
sustituir o comprender uno o más nucleótidos adicional(es)
puede variar debido a deleciones o nucleótidos o aminoácidos
adicionales en algún otro lugar del promotor y/o el gen. De esta
manera, mediante una "posición correspondiente" según la
presente invención se debe entender que los nucleótidos o
aminoácidos pueden ser diferentes en el número indicado pero aún
pueden tener nucleótidos o aminoácidos circundantes similares.
Dichos nucleótidos o aminoácidos que se pueden intercambiar,
delecionar o comprender nucleótidos o aminoácidos adicionales
también están comprendidos por el término "posición
correspondiente". Dichos nucleótidos o aminoácidos pueden formar
por ejemplo, junto con sus vecinos secuencias que pueden estar
implicadas en la regulación de la expresión génica, estabilidad del
ARN correspondiente o edición del ARN, así como dominios o motivos
funcionales de la proteína de la invención.
Según la presente invención, se han analizado el
modo y distribución de población de las variaciones genéticas
nuevas hasta ahora no identificadas en el gen CYP2B6 mediante
análisis de secuencia de las regiones relevantes del gen CYP2B6
humano de muchos individuos diferentes. Excepto por algunas
observaciones iniciales limitadas que indicaron la existencia de
polimorfismos genéticos del gen CYP2B6 (Miles et al., 1989;
Yamano et al., 1989) no se ha llevado a cabo ningún análisis
sistemático. Este estudio se emprendió según la presente invención
como el primer planteamiento sistemático para detectar polimorfismos
genéticos en el gen CYP2B6 humano y, de forma sorprendente, reveló
que existen mutaciones en el gen CYP2B6, en particular en las
regiones codificantes del gen que se puede esperar que cosegregen y
opcionalmente produzcan propiedades bioquímicas alteradas de la
proteína CYP2B6 tales como estabilidad proteica, actividad o
especificidad de sustrato y producirá diferencias interindividuales
en metabolismos de fármacos. Es un hecho bien sabido que el ADN
genómico de individuos, que lleva la composición genética
individual de todos los genes, incluyendo CYP2B6 se puede purificar
fácilmente de muestras de sangre de individuos. Estas muestras de
ADN de individuos se usan después para el análisis de la
composición de secuencia de los alelos del gen CYP2B6 que están
presentes en el individuo que suministra la muestra de sangre. El
análisis de secuencia se llevó a cabo mediante amplificación por PCR
de regiones relevantes del gen CYP2B6, purificación posterior
de
los productos de PCR, seguido por secuenciación automática de ADN con métodos establecidos; véanse los ejemplos.
los productos de PCR, seguido por secuenciación automática de ADN con métodos establecidos; véanse los ejemplos.
Un parámetro importante que se tenía que
considerar en el intento de determinar el genotipo CYP2B6 del
individuo e identificar nuevas variantes de CYP2B6 mediante
secuenciación directa de ADN de los productos de PCR de ADN
genómico de sangre humana es el hecho de que cada humano lleva
(normalmente, con muy pocas excepciones anormales) dos copias
génicas de cada gen autosómico (diploidía). Debido a eso, se tuvo
que tener mucho cuidado en la evaluación de las secuencias para ser
capaz de identificar de modo inequívoco no solo variaciones de
secuencia homocigotas sino también variaciones heterocigotas. Los
detalles de los diferentes pasos en la identificación y
caracterización de nuevos polimorfismos en el gen CYP2B6
(homocigotos y heterocigotos) se describen posteriormente en los
ejemplos.
Las mutaciones en los genes CYP2B6 detectadas
según la presente invención se ilustran en la figura 1 y 2 y en la
tablas 2 y 3, respectivamente. Los métodos del análisis de
mutaciones siguieron protocolos estándar y se describen en detalle
en los ejemplos. En general tales métodos a ser usados según la
presente invención para evaluar el espectro fenotípico así como las
características clínicas solapantes con otras formas de
metabolización de fármacos y tolerancia alterada a fármacos en
pacientes con mutaciones en el gen CYP2B6 abarcan por ejemplo,
análisis de haplotipo, análisis de polimorfismos de conformación de
cadena sencilla (SSCA), PCR y secuenciación directa. En base a la
caracterización clínica completa de muchos pacientes los fenotipos
se pueden correlacionar después con estas mutaciones así como con
mutaciones que se han descrito anteriormente para otros CYP.
Como es evidente para el experto en la materia
este nuevo conocimiento genético molecular se puede usar ahora para
caracterizar exactamente el genotipo del paciente inicial donde un
fármaco determinado tiene un efecto poco común y de su familia.
Durante los últimos 20 años, cada vez se ha
reconocido más la heterogeneidad genética como una fuente
significativa de variación en la respuesta a fármacos. Muchas
comunicaciones científicas (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37
(1997), 269-296 y West, J. Clin. Pharmacol. 37
(1997), 635-648) han mostrado claramente que algunos
fármacos funcionan mejor o pueden incluso ser muy tóxicos en
algunos pacientes que en otros y que estas variaciones en las
respuesta de los pacientes a fármacos se pueden relacionar a una
base molecular. Este concepto "farmacogenómico" descubre
correlaciones entre las respuestas a fármacos y perfiles genéticos
del paciente (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997),
954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997),
1249-1252). En este contexto de variabilidad de la
población con respecto al tratamiento farmacológico, se ha propuesto
la farmacogenómica como una herramienta útil en la identificación y
selección de pacientes que pueden responder a un fármaco particular
sin efectos secundarios. Esta identificación/selección se puede
basar en el diagnóstico molecular de polimorfismos genéticos
mediante genotipado de ADN de leucocitos en la sangre de un
paciente, por ejemplo, y caracterización de la enfermedad (Bentz,
Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J.
Chromatogra. B. Biomed. Appl, 678 (1996), 93-103).
Para los que proporcionan asistencia sanitaria, tales como las
organizaciones de mantenimiento de la salud en los EE. UU. y los
servicios públicos de salud gubernamentales en muchos países
europeos, este planteamiento farmacogenómico puede representar un
modo tanto de mejorar la asistencia sanitaria como de reducir
gastos generales porque hay un gran coste en tratamientos
innecesarios, fármacos ineficaces y fármacos con efectos
secundarios.
Las mutaciones en el gen CYP2B6 variante
encontradas por los inventores producen deleción(es),
inserción(es) y en particular sustitución(es) de
aminoácidos solos o en combinación. Por supuesto, también es posible
manipular genéticamente tales mutaciones en genes naturales u otras
formas mutantes. Los métodos para introducir tales modificaciones
en la secuencia de ADN del gen CYP2B6 los conoce bien el experto en
la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
Para investigar la naturaleza de los cambios en
la secuencia de aminoácidos de las proteínas CYP2B6 se pueden usar
programas de ordenador tales como RAMSOL que se pueden obtener de la
Internet. Además, se pueden realizar simulaciones de plegamiento y
rediseño por ordenador de motivos estructurales usando otros
programas de ordenador adecuados (Olszewski, Proteins 25 (1996),
286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995),
675-679). Se pueden usar ordenadores para el
análisis conformacional y energético de modelos detallados de
proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995),
995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995),
37-45). Estos análisis se pueden usar para
identificar la influencia de una mutación particular en la unión y/o
metabolización de fármacos.
Normalmente, dicha sustitución de aminoácido en
la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el
polinucleótido aplicado en los métodos y usos de la invención se
debe a una o más sustituciones de nucleótidos. Preferiblemente,
dicha sustitución de nucleótidos produce una sustitución de
aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón
9 del gen CYP2B6.
El polinucleótido aplicado en los métodos y usos
de la invención puede comprender además al menos una deleción,
adición y/o sustitución de nucleótido y opcionalmente de aminoácido
en su proteína codificada deferentes a las especificadas aquí
anteriormente. Esta forma de realización de la presente invención
permite el estudio de efectos sinergísticos de las mutaciones en el
gen CYP sobre el perfil farmacológico de fármacos en pacientes que
tienen tales formas mutantes de estos genes o formas mutantes
similares que se pueden mimetizar mediante las proteínas descritas
anteriormente. Se espera que el análisis de dichos efectos
sinergísticos proporcione conocimientos más profundos en fenotipos
tolerantes o sensibles a fármacos de ciertas formas de cáncer y
otras enfermedades. De ese conocimiento más profundo se beneficiará
mucho el desarrollo de composiciones diagnósticas y farmacéuticas
relacionadas con cáncer.
La sustitución de nucleótidos en el
polinucleótido aplicado en los métodos y usos de la invención
produce expresión alterada del gen CYP2B6 variante comparado con el
gen natural correspondiente.
El polinucleótido aplicado en los métodos y usos
de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
una variante molecular de la proteína citocromo P450 (CYP)2B6
por medio de al menos una sustitución de aminoácido en una posición
de aminoácido correspondiente al residuo de aminoácido Gln172 en el
exón 4 y/o Arg487 en el exón 9 del gen CYP2B6.
El polinucleótido aplicado en los métodos y usos
de la invención puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ADN genómico,
ARN, o ADN o ARN producidos sintéticamente o una molécula quimérica
de ácido nucleico recombinantemente producida que comprende
cualquiera de esos polinucleótidos solos o en combinación.
Preferiblemente, dicho polinucleótido puede ser parte de un vector,
particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos usados
convencionalmente en ingeniería genética que comprende un
polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden comprender
genes adicionales tales como genes marcadores que permiten la
selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y en
condiciones adecuadas.
Se prefiere además que el vector o
polinucleótido esté operativamente unido a secuencias de control de
la expresión que permitan la expresión en células procariotas o
eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la
transcripción del polinucleótido, preferiblemente en un ARNm
traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en
células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, los conoce
bien el experto en la materia. Normalmente comprenden secuencias
reguladoras que aseguran la iniciación de la transcripción y
opcionalmente señales poli-A que aseguran la
terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito.
Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores
transcripcionales así como traduccionales. Posibles elementos
reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas
comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o
tac en E. coli y ejemplos de elementos reguladores que
permiten la expresión en células huésped eucariotas son los
promotores AOX1 ó GAL1 en levadura o el promotor de
CMV, SV40 o RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV,
potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y
otros animales. Además de elementos que son responsables de la
iniciación de la transcripción tales elementos reguladores pueden
comprender también señales de terminación de la transcripción, tales
como el sitio poli-A de SV40 o el sitio
poli-A de la tk, después del polinucleótido. En este
contexto, en la técnica se conocen vectores de expresión adecuados
tales como el vector de expresión de ADNc de
Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV,
pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferiblemente,
dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de
transferencia génica o direccionador. Los vectores de expresión
derivados de virus tales como retrovirus, virus de la vacuna, virus
adenoasociados, virus del herpes, o virus del papiloma bovino, se
pueden usar para la distribución de los polinucleótidos o vector de
la invención en una población de células diana. Se pueden usar
métodos que conoce bien el experto en la materia para construir
vectores virales recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas
descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley
Interscience, N.Y. (1994). De forma alternativa, los polinucleótidos
y vectores de la invención se pueden reconstituir en liposomas para
la distribución a células diana.
También se describen células huésped
transformadas con un polinucleótido o vector según se describe aquí.
Dicha célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota;
véase, anteriormente. El polinucleótido o vector que está presente
en la célula huésped se puede integrar en el genoma de la célula
huésped o se puede mantener de forma extracromosómica. A este
respecto, también se debe entender que la molécula de ADN
recombinante de la invención se puede usar para "direccionamiento
génico" y/o "reemplazo génico", para restaurar un gen
mutante o para crear un gen mutante a través de recombinación
homóloga, véase, por ejemplo, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A
Practical Approach, Oxford University Press.
La célula huésped puede ser cualquier célula
procariota o eucariota, tales como una célula bacteriana, de
insecto, fúngica, vegetal, animal o humana. Las células fúngicas
preferidas son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en
particular las de la especie S. cerevisiae. El término
"procariota" se pretende que incluya todas las bacterias que
se pueden transformar o transfectar con un polinucleótido para la
expresión de una proteína CYP2B6 variante o un fragmento de la
misma. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram
negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E.
coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y
Bacillus subtilis. Se puede usar un polinucleótido que
codifica una forma mutante de proteínas CYP2B6 variantes para
transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las
técnicas normalmente conocidas por el experto en la materia. Los
métodos para preparar genes fusionados operativamente unidos y
expresarlos en bacterias o células animales son bien conocidos en
la técnica (Sambrook, supra). Se pueden utilizar las
construcciones genéticas y métodos descritos en el mismo para la
expresión de proteínas CYP2B6 variantes en, por ejemplo, huéspedes
procariotas. En general, se usan vectores de expresión que contienen
secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficaz del
polinucleótido insertado en relación con el huésped. El vector de
expresión típicamente contiene un origen de replicación, un promotor
y un terminador, así como genes específicos que son capaces de
proporcionar selección fenotípica de las células transformadas. Los
huéspedes procariotas transformados se pueden hacer crecer en
fermentadores y cultivar según métodos conocidos en la técnica para
alcanzar crecimiento celular óptimo. Las proteínas de la invención
se pueden aislar del medio de cultivo, lisados celulares o de
fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación de los
polipéptidos de la invención expresados microbiológicamente o de
otra manera puede ser por cualquier medio convencional tales como,
por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y
separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de
anticuerpos monoclonales o policlonales.
De esta manera, también se describe aquí un
método para la producción de proteínas CYP2B6 variantes y fragmentos
de las mismas que comprende cultivar una célula huésped como se ha
definido anteriormente en condiciones que permiten la expresión de
la proteína y recuperar la proteína o fragmento producido del
cultivo.
Además aquí se describe un método para producir
células capaces de expresar un gen CYP2B6 variante que comprende
células genéticamente manipuladas con el polinucleótido o con el
vector como se describe aquí. Las células obtenibles por el método
de la invención se pueden usar, por ejemplo para probar fármacos
según los métodos descritos en Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989).
Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour
Laboratory press, Cold Spring Harbour; Peyronneau, Eur J Biochem 218
(1993), 355-61; Yamazaki, Carcinogenesis 16 (1995),
2167-2170. Además, las células se pueden usar para
estudiar la capacidad de fármacos conocidos y derivados
desconocidos de los mismos para complementar pérdida de eficacia de
fármacos producida por mutaciones en el gen CYP2B6. Para estos
fines las células huésped preferiblemente carecen de un alelo
natural, preferiblemente ambos alelos del gen CYP2B6 y/o tienen al
menos una forma mutada del mismo. Alternativamente, se puede usar
una fuerte sobreexpresión de un alelo mutado sobre el alelo normal y
comparar con una línea celular recombinante que sobreexpresa el
alelo normal a un nivel similar como un sistema de cribado y
análisis. Las células obtenibles mediante el método descrito
anteriormente también se pueden usar para métodos de cribado.
\newpage
Además, aquí se describen proteínas CYP2B6
variantes y fragmentos de las mismas codificadas por un
polinucleótido descrito aquí u obtenible mediante el método
descrito anteriormente o a partir de células producidas por el
método descrito anteriormente.
Además, en los métodos y usos de la invención se
pueden aplicar moléculas de ácido nucleico que representan o
comprenden la hebra complementaria de cualquiera de los
polinucleótidos descritos anteriormente o una parte de los mismos,
que comprende así al menos una diferencia en nucleótidos comparado
con las secuencias de nucleótidos del gen CYP2B6 natural
correspondiente especificadas por las sustituciones de nucleótidos
descritas anteriormente. Tal molécula puede ser un ácido
desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico. Tales moléculas
comprenden, por ejemplo, ARN antisentido.
Con los polinucleótidos y proteínas CYP2B6
variantes y vectores descritos aquí ahora es posible estudiar in
vivo e in vitro la eficacia de fármacos en relación a
mutaciones particulares en el gen CYP2B6 de un paciente y el
fenotipo afectado. Además, las proteínas CYP2B6 variantes descritas
aquí se pueden usar para determinar el perfil farmacológico de
fármacos y para la identificación y preparación de fármacos
adicionales que pueden ser más eficaces para el tratamiento de, por
ejemplo, cáncer, en particular para la mejoría de ciertos fenotipos
causados por las mutaciones respectivas tales como las descritas
anteriormente.
La presencia o expresión de genes CYP2B6
variantes se puede seguir mediante el uso de un par de cebadores
que híbrida específicamente con cualquiera de las secuencias de
ácido nucleico correspondientes y llevando a cabo una reacción de
PCR según procedimientos estándar. La hibridación específica de las
sondas o cebadores mencionados anteriormente preferiblemente sucede
en condiciones rigurosas de hibridación. El término "condiciones
rigurosas de hibridación" es bien conocido en la técnica; véase,
por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual" segunda ed., CSH Press, Cold Spring Harbor,
1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach",
Hames y Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985. Además, el ARNm,
ARNc, ADNc o ADN genómico obtenido del sujeto se puede secuenciar
para identificar mutaciones que pueden ser huellas características
de mutaciones en el gen CYP2B6. La presente invención comprende
además métodos en donde se puede generar tal huella mediante RFLP
de ADN o ARN obtenido del sujeto, opcionalmente el ADN o ARN se
puede amplificar antes del análisis, los métodos para lo cual son
bien conocidos en la técnica. Las huellas de ARN se pueden realizar
mediante, por ejemplo, digestión de una muestra de ARN obtenida del
sujeto con una enzima de ARN adecuada, por ejemplo RNasa T_{1},
RNasa T_{2} o similar o una ribozima y, por ejemplo, separación
electroforética y detección de los fragmentos de ARN como se
describe anteriormente.
El experto en la materia puede imaginar
fácilmente modificaciones adicionales de la forma de realización de
la invención anteriormente mencionada, sin experimentación excesiva
a partir de esta divulgación; véase, por ejemplo, los ejemplos.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, los métodos descritos anteriormente comprenden
PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión con enzimas de
restricción, secuenciación directa.
Se puede recuperar bibliografía adicional
respecto a cualquiera de los métodos, usos y compuestos de la
presente invención de bibliotecas públicas, usando por ejemplo
dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base
de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por
ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/
medline.html. El experto en la materia conoce bases de datos y direcciones adicionales, tales como http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, y también se pueden obtener usando, por ejemplo, http://www.lycos.com. Se da una visión de conjunto de información de patentes en biotecnología y un estudio de fuentes relevantes de información de patentes útil para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
medline.html. El experto en la materia conoce bases de datos y direcciones adicionales, tales como http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, y también se pueden obtener usando, por ejemplo, http://www.lycos.com. Se da una visión de conjunto de información de patentes en biotecnología y un estudio de fuentes relevantes de información de patentes útil para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Figura 1: Variantes alélicas del gen CYP2B6
humano. Los exones que contienen mutaciones que producen cambios de
aminoácidos se muestran como cajas negras, los exones que producen
la secuencia de aminoácidos wt se muestran en blanco. La numeración
de bases y la designación de alelos se hicieron según las
recomendaciones publicadas para la nomenclatura de alelos humanos
(Antonarakis, 1998; http://www.imm.ki.se/CYPalleles/criteria.htm).
Sólo se muestran los alelos para los que se pudo obtener una
estructura de haplotipo definitiva.
Figura 2: Cebadores y polimorfismos nuevos en la
secuencia 5' flanqueante de CYP2B6 (Número de acceso de la
secuencia en Genbank AC023172).
Figura 3: Estructura del gen CYP2B6 humano y
estrategia de PCR. Los exones se muestran como cajas con el tamaño
de exón en pb y el tamaño del intrón mostrado en kb [UT = región no
traducida). La posición y tamaño de los fragmentos amplificados por
PCR se muestran debajo. Las secuencias de cebadores usados para PCR
se resumen en la tabla 1.
Figura 4: Análisis de la expresión de proteína
CYP2B6 (A) y la función enzimática (B). La proteína CYP2B6 se
determinó mediante inmunotransferencia y la
N-desmetilación de S-mefenitoina a
nirvanol se midió en 92 muestras de microsomas de hígado. Se
determinaron las 5 mutaciones no sinónimas de CYP2B6 en el ADN de
los mismos 92 individuos. Wt indica el grupo de 30 individuos con
genotipo natural homocigoto; 487 R/C y 487 C/C muestran los
resultados para individuos heterocigotos u homocigotos para la
mutación del exón 9, respectivamente. Los demás genotipos mutantes
se muestran de forma colectiva. La expresión y actividad medias de
cada grupo se muestran como una línea horizontal. Se evaluó la
significación estadística mediante la prueba t en comparación con
el grupo Wt:
* P<0,025; ** P<0,01.
* P<0,025; ** P<0,01.
Figura 5: Análisis de la expresión del ARNm de
CYP2B6 en hígado humano. Se determinó el ARNm de CYP2B6 mediante un
ensayo RT-PCR Taqman específico y se midió en 102
muestras de microsomas de hígado. Las 5 mutaciones no sinónimas de
CYP2B6 se determinaron en ADN de los mismos 102 individuos. La
figura muestra los resultados para el grupo de 31 individuos
homocigotos para el alelo natural (WT) y 26 individuos heterocigotos
para las mutaciones 172 y 262. Las medias se muestran como líneas
horizontales. La diferencia entre ambos grupos era estadísticamente
significativa (prueba de Mann-Whitney: ***
P<0,001).
La invención se describirá ahora mediante
referencia a los siguientes ejemplos que son solamente ilustrativos
y no se deben interpretar como una limitación del ámbito de la
presente invención.
Se aisló el ADN de leucocitos mediante métodos
estándar de 35 individuos alemanes blancos. Para asegurar la
amplificación de CYP2B6 frente al pseudogen CYP2B7 la amplificación
se hizo con pares de cebadores de PCR específicos de intrón y
específicos de la región 5' corriente arriba (tabla 1). Las
reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 \mul
con 100 ng de ADN genómico, KCl 50 mM, Tris-HCl 10
mM pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, Tween 20 al 0,5%, seroalbúmina bovina
al 0,01%, dNTP 200 \muM, 2 pMol de cada cebador y 0,5 U de
Taq-polimerasa (Promega, Madison). Después de 5
minutos de desnaturalización a 95ºC, las muestras se sometieron al
siguiente programa de amplificación: 95ºC durante 30 s,
50-60ºC durante 30 s y 72ºC durante 30
s-2 min durante 30 ciclos con un último paso
retrasado de 10 minutos a 72ºC. Se sometieron alícuotas de cada
producto de PCR a electroforesis en gel de agarosa para asegurar la
amplificación adecuada. Se digirieron alícuotas de cada muestra de
PCR con endonucleasas de restricción en condiciones según las
instrucciones del fabricante y los fragmentos resultantes se
analizaron en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
Los productos de PCR se secuenciaron
directamente usando cebadores anidados marcados con
infrared-800 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) con
el kit de secuenciación de ciclo de cebador marcado fluorescente
Thermo Sequenase (Amersham Life Science, Little Chalfont,
Inglaterra). Las secuencias de nucleótidos se muestran en la tabla
1. El análisis de secuencia se realizó en un secuenciador automático
de ADN (Licor 4200, MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) usando el
software de recogida de datos Base ImagIR y de análisis de imagen
4.00.
Detección de mutaciones de
CYP2B6 mediante
PCR-RFLP
Se realizaron las reacciones de PCR en un
volumen total de 50 \mul con 100 ng de ADN genómico, dNTP 200
\muM, 2 pmol del cebador CYP2B6-1F y el cebador
CYP2B6-1R (tabla 1), Tris-HCl 10 mM
pH 7,0, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tween 20 al 0,5%,
seroalbúmina bovina al 0,01% y 2,5 U de ADN
Taq-polimerasa (Promega Corporation, Madison, EE.
UU.). Después de 5 minutos de desnaturalización a 95ºC, las mezclas
de PCR se sometieron a las siguientes condiciones: 30 segundos a
95ºC, 30 segundos a 50ºC y 1 minuto a 72ºC durante 30 ciclos con un
último paso retrasado de 10 minutos a 72ºC en un ciclador térmico
PTC200 (MJ Research Inc. Watertown, Massachusetts). Los productos
de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR Quiaquick
(Qiagen, Hilden, Alemania). Se digirieron alícuotas de cada muestra
con Hae II (Roche, Basilea, Suiza) y los fragmentos resultantes se
analizaron en un gel de agarosa al 2% (Gibco-BRL,
Eggenstein, Alemania) teñido con bromuro de etidio. La digestión
con Hae II del ADN natural produce fragmentos de 333 y 390 pb,
mientras que el ADN que contiene la mutación C64T no se digiere y
produce un fragmento sin cortar de 723 pb.
Para la amplificación del exón 4, se usó el par
de cebadores CYP2B6-4F/4R con las mismas condiciones
de ciclo y análisis que para el exón 1, excepto que se usó 56ºC
como temperatura de alineamiento y el paso de extensión se redujo a
40 segundos. Los productos de PCR purificados se digirieron con la
enzima de restricción BsrI (New England Biolabs, Beverly, EE. UU.)
durante 1 hora a 60ºC. El ADN natural produjo tres fragmentos de 241
pb, 268 pb y 17 pb, mientras que los productos de PCR mutantes
produjeron dos fragmentos de 509 pb y 17 pb.
El exón 5 se amplificó con los cebadores
CYP2B6-5F y CYP2B6-5R de nuevo con
las mismas condiciones de ciclo que para el exón 1 aparte de que la
temperatura de alineamiento fue 60ºC. La mutación se pudo detectar
mediante digestión con la enzima de restricción Hae II que deja el
ADN mutado en la posición 777 sin digerir. Los fragmentos de PCR
naturales son de 140, 196 y 304 pb, mientras que en las muestras
mutadas se pudo detectar un fragmento adicional de 500 pb.
Se pudo analizar el mismo fragmento de PCR que
para la mutación C777A para otra mutación en el exón 5. La mutación
A785G destruye una secuencia de reconocimiento para la enzima de
restricción Sty I (Roche, Basilea, Suiza). La digestión del ADN
natural produce fragmentos de 56, 116, 171 y 297 pb. La mutación
A785G crea un fragmento de 468 pb. Los fragmentos se analizaron en
un gel de agarosa al 2,5% MetaPhor (FMC, Rockland, EE. UU.) donde
no se pudieron resolver los fragmentos de 56 y 116 pb.
El exón 9 se amplificó con los cebadores
CYP2B6-9F y el cebador CYP2B6-9R
usando las mismas condiciones que para el exón 1 con la excepción
de un paso de extensión prolongado de un 1 minuto y 30 segundos y un
paso de alineamiento aumentado a 60ºC. La mutación C1459T introduce
un sitio para la enzima de restricción Bgl II (Roche, Basilea,
Suiza) que produce fragmentos de 216 y 1185 pb. El ADN natural
produce un fragmento de PCR sin cortar de 1401 pb. Los fragmentos
se separaron en un gel de agarosa al 1,5% y se pudieron detectar
después de tinción con bromuro de etidio.
Se desarrolló una estrategia específica de
secuenciación directa de ADN para amplificar 2,5 kb de la región
5'-flanqueante de CYP2B6. La figura 2 muestra
la secuencia 5'-flanqueante y la localización de los
cebadores usados para su amplificación y secuenciación específicas
(véase también la tabla 1). Se identificaron cinco mutaciones
nuevas mediante análisis completo de secuencia del ADN de 35
individuos. Estas son: T-82C,
T-750C, C-1185G,
T-1455C y A-1777G (tabla 2). Las
frecuencias de estas mutaciones variaron entre el 1,4 y el 54,2%
(tabla 2).
Se usaron secuencias genómicas del locus CYP2B6
humano que se elucidaron en el curso del proyecto del genoma humano
y se hicieron públicamente disponibles a través de internet
http://www-bio.llnl.gov/genome/genome.html
(Comentario: Haga clic en "Genomic sequencing of regions of chr
19", e introduzca el clon id22376 en la casilla de consulta en
la parte inferior del formulario. Esto lleva al esquema de
solapamientos, con la lista (ordenada del centrómero al telómero)
de clones secuenciados y enlaces a sus secuencias y accesos (cuando
están disponibles) en Genbank. El cósmido F22373 abarca el gen
CYP2B6 entero y está actualmente secuenciado pero todavía está en
la fase de anotación) para diseñar cebadores oligonucleotídicos para
amplificar el ADN genómico que contiene las regiones codificantes
de CYP2B6 (tabla 1). Se mostró mediante comparación de secuencias
que los segmentos amplificados habían derivado específicamente del
gen CYP2B6 y no de CYP2B7 en todos los casos.
Para buscar polimorfismos, se amplificó ADN
genómico de 35 individuos blancos sanos, seleccionados al azar con
todos los pares de cebadores específicos de CYP2B6 y los fragmentos
amplificados se secuenciaron completamente en ambas direcciones. Se
detectaron un total de 5 mutaciones no sinónimas en los exones 1, 4,
5 y 9, que se produjeron con diferentes frecuencias y en diferentes
combinaciones de heterocigotos y homocigotos (tabla 2). El análisis
de ligamiento produjo la elucidación de 7 alelos diferentes
resumidos en la tabla 3 y la figura 1. El análisis de los datos
obtenidos de los 35 individuos secuenciados completamente reveló un
total de 6 alelos mutantes además del alelo natural (tabla 3).
Se desarrollaron pruebas de diagnóstico para
detectar fácilmente cada una de las cinco mutaciones en el ADN
genómico. Se pudo mostrar que cada mutación abolía o creaba un sitio
de restricción enzimática (tabla 2). Fue así posible desarrollar en
todos los casos un ensayo basado en 1) la amplificación específica
de CYP2B6 del fragmento génico que contiene la mutación y 2) la
digestión con una enzima de restricción adecuada. Se estimó la
frecuencia de cada mutación en una población alemana representativa
usando la prueba diagnóstica diseñada para ello (tabla 2).
Se investigó el significado funcional de las
mutaciones en el gen CYP2B6 (tabla 2) analizando la expresión y
actividad enzimática de CYP2B6 en un gran banco hepático humano. Se
usó un anticuerpo monoclonal específico, MAB-2B
(Gentest Corp., Woburn, MA, EE. UU.) para inmunocuantificar CYP2B6
microsómica. Se midió la N-desmetilación de
S-mefenitoina a nirvanol como una vía bastante
específica de CYP2B6. Se determinaron las cinco mutaciones no
sinónimas en todas las muestras. Comparados con los homocigotos
naturales, que expresaban de media 23,5\pm16,3 pmol/mg de CYP2B6,
se midieron niveles significativamente reducidos para los portadores
de la mutación C1459T (R487C) (alelos *5 y *7): los heterocigotos
expresaron 9,7\pm7,5 pmol/mg (P=0,006, N=13) y los homocigotos
sólo 3,05\pm1,4 pmol/mg (P=0,005, N=6, prueba t; Fig. 4A). De esta
manera, comparado con el homocigoto natural, la expresión de
proteína CYP2B6 de portadores homocigotos de la mutación R487C en el
exón 9 estaba reducida casi ocho veces. Las actividades enzimáticas
medias de los portadores heterocigotos (25,9\pm15,2 pmoles de
nirvanol formados/min*mg, P=0,02, prueba t) y homocigotos de R487C
(22,2\pm8,4, P=0,008, prueba t) también estaban
significativamente reducidas comparadas con el grupo Wt
(49,2\pm49,4; Fig. 4B).
También se encontró una diferencia significativa
en la expresión de proteína para individuos con mutaciones
diferentes que la mutación del exón 9, que expresaron 16,9\pm18
pmol/mg, que era significativamente menor comprada con el
homocigoto natural (P=0,016; figura 4A).
Por último, se realizó la cuantificación de los
transcritos del ARNm de CYP2B6 usando un ensayo de PCR a tiempo
real recién desarrollado en ARN total preparado de hígados humanos.
Como se muestra en la figura 5, hubo una diferencia significativa
en la expresión del ARNm entre los homocigotos naturales y el grupo
de individuos que eran heterocigotos para las mutaciones 172
Gln>His y 262 Lys>Arg, que expresaron sólo alrededor del 50%
de los transcritos (P<0,001). La disminución en la expresión del
ARNm también está influida por el ligamiento a la mutación del
promotor T-750C, que está presente en alrededor del
54% y que afecta a un sitio putativo de unión consenso del factor
nuclear hepático 1 (hNF1).
Se ha mostrado que los polimorfismos genéticos
en las enzimas que metabolizan fármacos son uno de los factores
principales de variaciones interindividuales en la respuesta a
fármacos. Los polimorfismos genéticos pueden afectar la expresión
génica, la estabilidad del ARNm y proteína, la actividad enzimática
y/o la especificidad de sustrato para un producto génico
determinado y producir así variaciones complejas en el modo en que
el organismo actúa sobre el fármaco. Las consecuencias precisas que
puede tener una mutación dependen del fármaco en cuestión, por
ejemplo, si es un profármaco o no o si los metabolitos formados son
ellos mismos activos o tóxicos.
Se ha mostrado que un número de fármacos
clínicamente importantes son sustratos para CYP2B6, incluyendo los
profármacos anticáncer ciclofosfamida e ifosfamida, el
antiestrogénico tamoxifeno, el inactivador de agregación
plaquetaria clopidogrel, pero también drogas adictivas incluyendo
nicotina y éxtasis (tabla 4).
CYP2B6 está implicada en la activación e
inactivación metabólica de un número de fármacos clínicamente
importantes tales como agentes antineoplásicos de uso frecuente
ciclofosfamida e ifosfamida, el antiestrógeno tamoxifeno, el
inhibidor más nuevo de agregación plaquetaria clopidogrel, pero
también tóxicos medioambientales y drogas recreativas como nicotina
y éxtasis (tabla 4).
Mediante el análisis de secuencias genómicas, se
ha obtenido evidencia para un total de 7 alelos distintos que
contienen entre una y tres mutaciones de aminoácidos. Algunos de
estos alelos se producen con alta frecuencia en la población
normal. Las propiedades bioquímicas de la proteína CYP2B6 tales como
estabilidad, actividad proteica o especificidad de sustrato cambian
por estas mutaciones y producirán diferencias interindividuales en
el metabolismo de fármacos.
El uso de pruebas diagnósticas para las
mutaciones recién identificadas ayudará a predecir la eficacia
terapéutica y/o la toxicidad de fármacos relacionadas con fármacos
metabolizados por CYP2B6. Además, puesto que también se mostrado
que CYP2B6 participa en el metabolismo de nicotina, el diagnóstico
genético de CYP2B6 ayudará a predecir los hábitos de fumador
(Pianezza, Nature 393 (1998), 750).
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<213> Homo sapiens
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Claims (5)
1. Un método de diagnóstico de hipersensibilidad
a fármacos relacionada con la presencia de una variante molecular
del gen CYP2B6 que comprende determinar en una muestra de un sujeto
la presencia de un polinucleótido seleccionado del grupo que
consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene una T en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1;
en donde la presencia de dicho polinucleótido o
fragmento del mismo se considera indicativa de dicha
hipersensibilidad a fármacos en dicho método.
2. El método de la reivindicación 1 que
comprende PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión con
enzimas de restricción, secuenciación directa, técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación o
inmunoensayos.
3. Uso de un oligo- o polinucleótido para
diagnosticar la hipersensibilidad a fármacos relacionada con la
presencia de una variante molecular del gen CYP2B6 que comprende
determinar en una muestra de un sujeto la presencia de un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido CYP2B6 o un fragmento del mismo, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de Gln172 a His en el exón 4 y/o Arg487 a Cys en el exón 9 del polipéptido CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874; y
- (b)
- un polinucleótido capaz de hibridar con el gen CYP2B6, en donde dicho polinucleótido tiene una T en una posición correspondiente a la posición 516 ó 1459 del gen CYP2B6 que tiene el número de acceso M29874, en donde el nucleótido A en la posición 7 se ha numerado como +1.
4. Un método in vitro para el desarrollo
de un perfil farmacodinámico de fármacos que son sustratos del
producto del gen CYP2B6 para un paciente o para mejorar la terapia
de trastornos con fármacos del producto del gen CYP2B6 que
comprende usar el polimorfismo de nucleótido único del gen CYP2B6 en
la posición 516 ó 1459 como se define en la reivindicación 1.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
dicho trastorno es cáncer.
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