ES2336724T3 - Procedimiento para la reduccion enzimatica de derivados de alquino. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona α,β-insaturados de la fórmula general (1) **(Ver fórmula)** en la que R1 significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un resto aromático o no aromático, carbocíclico o heterocíclico, en caso dado substituido, R2significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, mediante la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa (i) que comprende al menos una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o (ii) con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.
Description
Procedimiento para la reducción enzimática de
derivados de alquino.
La invención se refiere a un procedimiento para
la reducción enzimática de derivados de alquino.
Hasta el presente no se conoce ningún
procedimiento destinado a la reducción enzimática de derivados de
alquino que no requiera trifosfato de adenosina ATP.
Los autores Takeshita, M. et al.
describen en la publicación Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic 5 (1998) 245-248 ensayos destinados a la
biotransformación asimétrica de derivados de fenilo con 4 átomos de
carbono con la fracción del hígado de rata S-9 y con
levadura de panificación. Según esta publicación no se transforma
significativamente la
4-fenil-3-butin-2-ona
de la fracción de hígado de rata en la correspondiente
buten-2-ona en comparación con los
controles. De igual modo, los ensayos con células de levadura
completas proporcionaban una cantidad insignificante (rendimiento
3%) de buten-2-ona. Por el
contrario, se formaron como componentes principales el
correspondiente
S-butan-2-ol (31%),
la correspondiente butan-2-ona (8%)
y el correspondiente
S-butin-2-ol (5%).
No pudo asociarse a estas biotransformaciones ninguna actividad
enzimática determinada puesto que los ensayos fueron llevados a
cabo con células completas de levadura. Por otra parte los ensayos
se llevaron a cabo obligatoriamente en presencia de cofactores
celulares, tal como por ejemplo el ATP.
Existía la tarea de proporcionar un
procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino,
que no necesitase ATP.
La tarea precedentemente indicada se resolvió
mediante el empleo de las reductasas OYE 1, 2 y 3 y los equivalentes
funcionales de las mismas para la reducción de los derivados de
alquino de la fórmula general (1).
En las figuras adjuntas muestran
la figura 1 la biotransformación de 20 mM de
4-fenil-3-butin-2-ona
con OYE 1-3 en presencia de fosfato del nucleótido
de nicotinamida y de adenina reducido NADPH (izquierda) o del
dinucleótido de nicotinamida NADH (derecha), el ácido
etilendiaminotetraacético EDTA y el isopropanol a pH 6,8 y 30ºC al
cabo de 1 hora. Los enzimas se sobreexpresaron en E. coli
TG10^{+}, el propio TG10^{+} sirvió como control;
la figura 2 las secuencias de aminoácidos de los
enzimas empleados OYE 1, 2 y 3;
la figura 3 el mapa del plásmido de pAgro4;
la figura 4 el mapa del plásmido de
pHSG575';
la figura 5 el mapa del plásmido de pDHE1658
OYE1;
la figura 6 el mapa del plásmido de pDHE1658
OYE2; y
la figura 7 el mapa del plásmido de pDHE1658
OYE3.
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La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona
de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona
\alpha,\beta-insaturados de la fórmula general
(1)
en la
que
- R^{1}
- significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un anillo aromático o no aromático, en caso dado substituido, carbocíclico o heterocíclico, y
- R^{2}
- significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono,
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por medio de la reducción de un compuesto de la
fórmula (1) en presencia de una reductasa
- (i)
- que comprende, al menos, una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o
- (ii)
- con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presente, al menos, un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.
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De manera preferente, se proporciona de
conformidad con la invención, de manera especial, la configuración
E de los compuestos de la fórmula 2,
en la
que
R^{1} y R^{2} tienen los
significados que han sido indicados precedentemente. De manera
especial, los compuestos de la fórmula 2 se presentan en más de un
50%, de manera especial en más de un 60, de un 70 o de un 80%, de
manera preferente sin embargo en más de un 90%, tal como por ejemplo
entre un 95 y un 99%, de manera especial aproximadamente en un 100%
en la configuración
E.
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Básicamente puede llevarse a cabo el
procedimiento de conformidad con la invención tanto con el enzima
propiamente dicho purificado o enriquecido así como también con
microorganismos, que expresen este enzima de manera natural o de
manera recombinante, con homogenatos celulares derivados de los
mismos o, cuando el microorganismo secrete el enzima en el medio
circundante, con el sobrenadante del cultivo. De manera especial,
una "reacción enzimática" abarca, en el sentido de la
invención, también una reacción en un medio circundante exento
esencialmente de ATP, es decir de manera preferente abarca una
reacción con preparados enzimáticos exentos de células, tales como
enzimas puros o enriquecidos o fracciones proteicas adecuadas, que
ya no contengan componentes celulares de bajo peso molecular tal
como especialmente el ATP.
Cuando no se indique otra cosa, significa:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
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El procedimiento, de conformidad con la
invención, puede llevarse a cabo de manera especial con alquinos de
la fórmula general (1), en los cuales R^{1} significa alquilo con
1 hasta 4 átomos de carbono en forma ramificada y no ramificada,
alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono en forma ramificada y en
forma no ramificada o fenilo en caso dado substituido.
Los substratos especialmente adecuados para el
procedimiento de conformidad con la invención son aquellos alquinos
de la fórmula general (1), en los cuales R^{1} significa fenilo en
caso dado substituido y R^{2} significa CH_{3}.
Las reductasas, empleadas de conformidad con la
invención, reducen ocasionalmente en parte, además del triple
enlace en la posición \alpha,\beta para dar la función
carbonilo, también la función carbonilo propiamente dicha, con lo
cual se forma entonces el alcohol correspondiente. De la misma
manera pueden ser reducidos los alquenos en parte para dar el
correspondiente alcano.
Las reductasas, adecuadas para el procedimiento
de conformidad con la invención, son todos aquellos enzimas que
sean capaces de reducir a la
4-fenil-3-butin-2-ona
en una reacción dependiente del NAD(P)H y, de manera
preferente, independiente del ATP, para dar la
E-4-fenil-3-buten-2-ona.
Esta reacción se denomina a continuación también reacción
modelo.
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Por otra parte, las reductasas, que son
adecuadas para el procedimiento de conformidad con la invención (que
se denominan a veces también como
enoato-reductasas) tienen una secuencia de
polipéptido según SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o una secuencia de
polipéptido que presenta al menos un 80%, tal como por ejemplo un
90%, o al menos un 95% y, de manera especial, al menos un 97%, un
98% o un 99% de identidad secuencial con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o
9.
Se conoce un polipéptido con la SEQ ID NO:1 con
la denominación de OYE1 a partir de Saccharomyces
carlsbergensis (genoteca Q02899).
Se codifica un polipéptido con la SEQ ID NO:2
del gen OYE2 a partir de la levadura de panificación
(Saccharomyces cerevisiae locus del gen YHR179W) (genoteca
Q03558).
Se codifica un polipéptido con la SEQ ID NO:3
del gen OYE3 a partir de lavadura de panificación (Saccharomyces
cerevisiae locus del gen YPL171C) (genoteca P 41816).
Las secuencias según SEQ ID NO: 5, 7 y 9
corresponden a la SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y se diferencian de las mismas
únicamente por un resto de metionina adicional
N-terminal.
La determinación de la identidad secuencial se
llevará a cabo, para las finalidades aquí descritas, por medio del
programa de ordenador "GAP" del Genetics Computer Group (GCG)
de la University of Wisconsin, debiéndose emplear la versión 10.3
con utilización de los parámetros patrón recomendados por el
GCG.
Las reductasas de este tipo pueden ser obtenidas
a partir de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o 9 por medio de
procedimientos de mutagénesis conocidos por el técnico en la materia
específicos o estadísticos. Sin embargo, de manera alternativa,
también pueden buscarse reductasas en microorganismos, de manera
preferente en aquellos de los géneros Alishewanella,
Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga,
Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts),
Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea,
Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia,
Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera,
Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium,
Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus,
Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia,
Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia,
Xenorhabdus, Yersinia o Yokenella, cuyas reductasas
catalicen la reacción modelo, que ha sido citada precedentemente, y
cuya secuencia de aminoácidos presente ya la identidad secuencial
necesaria con respecto a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7 o 9 o que sea
obtenida por medio de procedimientos de mutagénesis.
La reductasa puede ser empleada en forma
purificada o en forma parcialmente purificada o puede ser empleada
incluso en forma del propio microorganismo. El técnico en la materia
conoce ampliamente los procedimientos destinados a la obtención y a
la purificación de las dehidrogenasas a partir de
microorganismos.
De manera preferente se lleva a cabo la
reducción enantioselectiva con la reductasa en presencia de un
cofactor adecuado (denominado también cosubstrato). A título de
cofactores para la reducción de la cetona sirven, de manera usual,
el NADH y/o el NADPH. Al mismo tiempo pueden ser empleadas las
reductasas como sistemas celulares, que contengan un cofactor
inherente, o a las que se aportan alternativamente mediadores Redox
(A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcohols"
en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis
2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH,
Weinheim).
De manera preferente, se lleva a cabo la
reducción enantioselectiva con la reductasa, así mismo, en presencia
de un agente reductor adecuado, que regenere el cofactor oxidado en
el transcurso de la reducción. Ejemplos de agentes reductores
adecuados son los azúcares, especialmente las hexosas, tales como la
glucosa, la manosa, la fructosa y/o los alcoholes oxidables,
especialmente el etanol, el propanol o el isopropanol, así como los
formiatos, los fosfitos o el hidrógeno molecular. Para la oxidación
del agente reductor y, relacionado con la misma, para la
regeneración del coenzima puede ser aportada una segunda
dehidrogenasa, tal como por ejemplo la
glucosa-dehidrogenasa cuando se utilice la glucosa
como agente reductor o la formiato-dehidrogenasa
cuando se utilice el formiato como agente reductor. Éstos pueden ser
empleados en forma de enzima libre o inmovilizado o en forma de
células libres o inmovilizadas. Su obtención puede llevarse a cabo
tanto independientemente así como, también, por medio de la
coexpresión en una cepa de reductasa (recombinante).
Una forma preferente de realización del
procedimiento reivindicado consiste en la regeneración de los
cofactores por medio de un sistema enzimático, en el que se utiliza
una segunda dehidrogenasa, de manera especialmente preferente una
glucosadehidrogenasa.
Por otra parte, puede ser conveniente aportar
otros aditivos que favorezcan la reducción tales como, por ejemplo,
las sales metálicas o los formadores de quelatos tal como por
ejemplo el EDTA.
Las reductasas, empleadas de conformidad con la
invención, pueden ser empleadas en forma libre o en forma
inmovilizada. Se entenderá por un enzima inmovilizado aquél enzima
que esté fijado sobre un soporte inerte. Los materiales de soporte,
adecuados, así como los enzimas inmovilizados sobre los mismos son
conocidos por las publicaciones
EP-A-1149849,
EP-A-1 069 183 y por la publicación
DE-OS 10019377 así como por las referencias
bibliográficas citadas en dichas publicaciones. Se hace referencia
en toda su extensión de manera correspondiente a la divulgación de
estas publicaciones. A los materiales de soporte adecuados
pertenecen, por ejemplo, las arcillas, los minerales arcillosos
tales como la caolinita, la tierra de diatomeas, la perlita, el
dióxido de silicio, el óxido de aluminio, el carbonato de sodio, el
carbonato de calcio, el polvo de celulosa, los materiales
intercambiadores de aniones, los polímeros sintéticos tales como el
poliestireno, las resinas acrílicas, las resinas de
fenolformaldehído, los poliuretanos y las poliolefinas, tales como
el polietileno y el polipropileno. Los materiales de soporte son
empleados de manera usual en una forma finamente dividida, en una
forma de partículas para la obtención de los enzimas soportados,
siendo preferentes las formas porosas. De manera usual, el tamaño
de las partículas del material de soporte no es mayor que 5 mm, de
manera especial no es mayor que 2 mm (curva granulométrica). De
manera análoga, puede elegirse una forma libre o una forma
inmovilizada cuando se utilice la dehidrogenasa como catalizador
para la célula completa. Los materiales de soporte son, por ejemplo,
el alginato de Ca y el Carrageenan. Así mismo pueden humectarse
directamente con glutaraldehído los enzimas así como también las
células (reticulación para dar CLEAs). Procedimientos de
inmovilización correspondientes y otros han sido descritos por
ejemplo en la publicación de los autores J. Lalonde y A. Margolin
"Immobilization of Enzymes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme
Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III,
991-1032, Wiley-VCH, Weinheim.
La reacción puede llevarse a cabo en medios de
reacción acuosos o no acuosos o en sistemas de bifásicos o en
(micro)emulsiones. Los medios de reacción acuosos están
constituidos de manera preferente por soluciones tampón, que
presentan por regla general un valor del pH comprendido entre 4 y 8,
de manera preferente comprendido entre 5 y 8. El disolvente acuoso
puede contener, además de agua, también al menos un alcohol, por
ejemplo el etanol o el isopropanol o el sulfóxido de dimetilo.
Se entenderán por medios de reacción no acuosos
aquellos medios de reacción que contengan menos de un 1% en peso,
de manera preferente menos de un 0,5% en peso de agua, referido al
peso total del medio líquido de la reacción. De manera especial la
reacción puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico.
Los disolventes orgánicos adecuados son, por
ejemplo, los hidrocarburos alifáticos, de manera preferente con 5
hasta 8 átomos de carbono, tales como el pentano, el ciclopentano,
el hexano, el ciclohexano, el heptano, el octano o el ciclooctano,
los hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o
con dos átomos de carbono, tales como el diclorometano, el
cloroformo, el tetracloruro de carbono, el dicloroetano o el
tetracloroetano, los hidrocarburos aromáticos tales como el
benceno, el tolueno, los xilenos, el clorobenceno o el
diclorobenceno, los éteres o alcoholes alifáticos acíclicos y
cíclicos, preferentemente con 4 hasta 8 átomos de carbono tales
como el etanol, el isopropanol, el dietiléter, el
metil-terc.-butiléter, el
etil-terc.-butiléter, el dipropiléter, el
diisopropiléter, el dibutiléter, el tetrahidrofurano o los ésteres
tales como el acetato de etilo o el acetato de
n-butilo o las cetonas tal como la
metilisobutilcetona o el dioxano o mezclas de los mismos. De manera
especialmente preferente son empleados los éteres que han sido
citados precedentemente, de manera especial el
tetrahidrofurano.
A título de ejemplo, la reducción puede llevarse
a cabo con la reductasa en un medio de reacción
acuoso-orgánico, tal como por ejemplo
agua/isopropanol, en una relación de mezcla arbitraria, tal como por
ejemplo de 1:99 hasta 99:1 o de 10:90 hasta 90:10, o puede llevarse
a cabo en un medio de reacción acuoso.
El substrato (1) es empleado en la reducción
enzimática preferentemente en una concentración comprendida entre
0,1 g/l y 500 g/l, de manera especialmente preferente entre 1 g/l y
50 g/l y puede ser reajustado de manera continua o de manera
discontinua.
La reducción enzimática se lleva a cabo, por
regla general, a una temperatura de la reacción situada por debajo
de la temperatura de desactivación de la reductasa empleada y por
encima de -10ºC. De manera especialmente preferente la temperatura
está situada en el intervalo comprendido entre 0 y 100ºC, de manera
especial está situada en el intervalo comprendido entre 15 y 60ºC y
de manera especial está situada en el intervalo comprendido entre
20 y 40ºC, por ejemplo es de aproximadamente 30ºC.
Para la realización puede disponerse
inicialmente, por ejemplo, el substrato (1) con la reductasa, con el
disolvente y, en caso dado, con los coenzimas, en caso dado con una
segunda dehidrogenasa para la regeneración del coenzima y/o con
otros agentes reductores y se remueve la mezcla, por ejemplo por
medio de agitadores o de vibradores. Sin embargo es posible también
efectuar la inmovilización de la reductasa en un reactor, por
ejemplo en una columna, y conducir a través del reactor una mezcla
que contiene al substrato y, en caso dado, al coenzima y/o al
cosubstrato. Con esta finalidad, puede conducirse la mezcla en
circuito cerrado a través del reactor hasta que se alcance la
conversión deseada.
En este caso, se reduce el triple enlace en la
posición \alpha,\beta con respecto a la función carbonilo para
dar un doble enlace; ocasionalmente se verifica también una
reducción de la función carbonilo propiamente dicha para dar la
función alcohólica. Por regla general se conduce la reducción hasta
una conversión del 70% como mínimo, de manera especialmente
preferente del 85% como mínimo y, de manera especial, del 95% como
mínimo, con relación al substrato contenido en la mezcla. El avance
de la reacción, es decir la reducción secuencial del doble enlace
puede seguirse en este caso con ayuda de los métodos usuales tales
como la cromatografía gaseosa o la cromatografía líquida a alta
presión.
En el ámbito de la presente invención los
"equivalentes funcionales" o los análogos de los enzimas
divulgados de manera concreta son sus diversos polipéptidos, que
tienen todavía la actividad biológica deseada, tal como por ejemplo
la especificidad con respecto al substrato. De este modo, se
entiende por ejemplo bajo el concepto de "equivalentes
funcionales", aquellos enzimas que catalizan la reacción modelo y
que presentan al menos el 20%, de manera preferente el 50%, de
manera especialmente preferente el 75%, de manera muy especialmente
preferente el 90% de la actividad de un enzima y que abarcan las
secuencias de aminoácidos que han sido indicadas en SEQ ID NO:1, 2
o 3. De la misma manera, los equivalentes funcionales son estables
de manera preferente entre pH 4 y 10 y tienen ventajosamente un
óptimo de pH comprendido entre pH 5 y 8 así como un óptimo de
temperatura situado en el intervalo comprendido entre 20ºC y
80ºC.
Se entiende por el concepto de "equivalentes
funcionales" de conformidad con la invención, de manera especial,
también aquellos mutantes, que presenten al menos en una posición
de la secuencia de las secuencias de aminoácidos que han sido
citadas precedentemente un aminoácido diferente de los aminoácidos
que han sido citados de manera concreta pero que, a pesar de ello,
tengan una de las actividades biológicas que han sido citadas
precedentemente. Por consiguiente, los "equivalentes
funcionales" abarcan los mutantes que pueden ser obtenidos por
medio de adiciones, substituciones, deleciones y/o inversiones de
uno o de varios aminoácidos, pudiéndose presentar las
modificaciones citadas en cualquier posición de la secuencia en
tanto en cuanto conduzcan a un mutante con el perfil de propiedades
de conformidad con la invención. Así mismo, la equivalencia
funcional se da, de manera especial, cuando coincida desde el punto
de vista cualitativo el modelo de reactividad entre el mutante y el
polipéptido no modificado, es decir por ejemplo cuando se hagan
reaccionar substratos iguales con velocidades diferentes.
\newpage
Ejemplos de substituciones de aminoácidos
adecuadas pueden verse en la tabla siguiente:
Los "equivalentes funcionales" en el
sentido precedente son así mismo los "precursores" de los
polipéptidos descritos así como los "derivados
funcionales".
Los "precursores" son, en este caso,
precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la
actividad biológica deseada.
Los "derivados funcionales" de los
polipéptidos, de conformidad con la invención, pueden ser preparados
igualmente sobre grupos laterales de aminoácidos funcionales o
sobre sus extremos N-terminales o
C-terminales con ayuda de técnicas conocidas. Tales
derivados abarcan, por ejemplo, los ésteres alifáticos de los grupos
de los ácidos carboxílicos, las amidas del grupo de los ácidos
carboxílicos, que pueden ser obtenidas por medio de la reacción con
amoniaco o con una amina primaria o secundaria; los derivados
N-acilados de grupo amino libres, preparados
mediante la reacción con grupos acilo; o los derivados
O-acilados de los grupos hidroxi libres preparados
mediante la reacción con grupos acilo.
En el caso de una posible glicosilación de la
proteína, los "equivalentes funcionales" de conformidad con la
invención abarcan las proteínas del tipo que ha sido indicado
precedentemente en forma desglicosilada o bien en forma glicosilada
así como las formas modificadas que pueden ser obtenidas mediante la
modificación del modelo de glicosilación.
Naturalmente los "equivalentes funcionales"
abarcan así mismo los polipéptidos que pueden ser obtenidos a
partir de otros organismos, así como las variantes de origen
natural. De manera ejemplificativa, pueden determinarse regiones
secuenciales homólogas por medio de una comparación secuencial de
las regiones y pueden ser localizados enzimas equivalentes de
conformidad con las especificaciones concretas de la invención.
Los "equivalentes funcionales" abarcan así
mismo fragmentos, de manera preferente dominios individuales o
motivos secuenciales, de los péptidos de conformidad con la
invención, que presenten por ejemplo la función biológica
deseada.
Los "equivalentes funcionales" son, así
mismo, proteínas de fusión, que presentan una de las secuencias de
polipéptido que han sido citadas precedentemente o equivalentes
funcionales, derivados de las mismas, y, al menos, otra secuencia
heteróloga, diferente de la secuencia funcional en enlace
N-terminal o C-terminal funcional
(es decir sin interferencia funcional esencial mutua entre las
partes de la proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de las
secuencias heterólogas de este tipo son, por ejemplo, los péptidos
de señal o los enzimas.
Los homólogos de las proteínas, de conformidad
con la invención, pueden ser identificados mediante rastreo de
bancos combinatorios de mutantes, tales como por ejemplo mutantes de
acortamiento. A título de ejemplo puede generarse un banco
diversificado de variantes proteicas mediante mutagénesis
combinatoria en el plano de los ácidos nucleicos, tal como por
ejemplo por medio de una ligadura enzimática de una mezcla de
oligonucleótidos sintéticos. Existe un gran número de
procedimientos que pueden ser empleados para la obtención de bancos
de homólogos potenciales a partir de una secuencia degenerada de
oligonucleótido. La síntesis química de una secuencia génica
degenerada puede llevarse a cabo en dispositivos automáticos para la
síntesis del ADN y el gen sintético puede ser ligado a continuación
en un vector de expresión adecuado. El empleo de un juego de genes
degenerados posibilita la preparación de todas las secuencias en una
mezcla que codifiquen el juego deseado en secuencias proteicas
potenciales. El técnico en la materia conoce procedimientos para la
síntesis de oligonucleótidos degenerados (por ejemplo Narang, S.A.
(1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev.
Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike
et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
En el estado de la técnica se conocen varias
técnicas para llevar a cabo el rastreo de productos génicos de
bancos combinatorios, que han sido preparados mediante mutaciones
puntuales o mediante acortamientos y para llevar a cabo el rastreo
de bancos de ADNc en productos génicos con una propiedad
seleccionada. Estas técnicas pueden ser adaptadas al rastreo rápido
de las genotecas, que han sido preparadas mediante mutagénesis
combinatoria de los homólogos de conformidad con la invención. Las
técnicas empleadas de una manera más frecuente para el rastreo de
grandes genotecas, que están sometidas a un análisis con un elevado
caudal, abarcan la clonación de genotecas en vectores de expresión
replicables, la transformación de las células adecuadas con el banco
de vectores resultante y la expresión de los genes combinatorios
bajo condiciones en las que se facilite la identificación de la
actividad deseada, el aislamiento del vector, que codifica el gen,
cuyo producto ha sido identificado. La mutagénesis recursiva en
conjunto
Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM),
una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales
en los bancos, puede ser empleada en combinación con los ensayos de
rastreo con objeto de identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992)
PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993)
Protein Engineering 6(3):327-331).
El objeto de la invención está constituido así
mismo por secuencias de ácidos nucleicos (secuencias de ADN y
secuencias de ARN de una sola hebra o de doble hebra, tales como por
ejemplo ADNc y ARNm), que codifican un enzima con actividad de
reductasa de conformidad con la invención. Son preferentes las
secuencias de los ácidos nucleicos que codifiquen por ejemplo
secuencias de aminoácidos de conformidad con las SEQ ID NO:1, 2 o 3
o secuencias parciales características de las mismas.
Todas las secuencias de ácidos nucleicos, aquí
citadas, pueden ser preparadas en forma en sí conocida por medio de
síntesis química a partir de los componentes nucleótidos, tal como
por ejemplo mediante condensación de fragmentos de componentes de
los ácidos nucleicos individuales complementarios, que se solapan,
de la doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos
puede llevarse a cabo por ejemplo en forma conocida, de acuerdo con
los métodos a la fosforamidita (Voet, Voet, 2ª edición, Wiley Press
New York, páginas 896-897). La adición de
oligonucleótidos sintéticos y el relleno de espacios con ayuda de
fragmentos de Klenow de la ADN-polimerasa y las
reacciones de ligadura así como los procedimientos generales de
clonación están descritos en la publicación de Sambrook et
al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Otras configuraciones para la realización del
procedimiento enzimático de reducción de conformidad con la
invención son:
Las reductasas, empleadas de conformidad con la
invención, pueden ser empleadas en el procedimiento de conformidad
con la invención en forma de enzima libre o de enzima
inmovilizado.
\newpage
El valor del pH en el procedimiento de
conformidad con la invención se mantiene de manera ventajosa entre
pH 4 y 12, de manera preferente se mantiene entre pH 4,5 y 9, de
manera especialmente preferente se mantiene entre pH 5 y 8.
Para el procedimiento de conformidad con la
invención pueden ser empleadas células lavadas, que contengan los
ácidos nucleicos, constructos de ácidos nucleicos o vectores, que
codifiquen la reductasa. Así mismo pueden ser empleadas células en
reposo o células digeridas. A título de ejemplo, debe entenderse por
células digeridas aquellas células que se han vuelto permeables por
medio de un tratamiento por ejemplo con disolventes, o aquellas
células que han sido digeridas por medio de un tratamiento
enzimático, por medio de un tratamiento mecánico (por ejemplo
prensa French o ultrasonidos) o por medio de otro método. Los
extractos en bruto, obtenidos de este modo, son adecuados
ventajosamente para el procedimiento de conformidad con la
invención. Así mismo, los enzimas purificados o semipurificados
pueden ser empleados para el procedimiento. De la misma manera, son
adecuados los microorganismos o los enzimas inmovilizados, que
pueden encontrar aplicación ventajosamente en la
reacción.
reacción.
El procedimiento de conformidad con la invención
puede llevarse a cabo según una forma de trabajo en tandas, en
semi-tandas o de manera continua.
La realización del procedimiento puede llevarse
a cabo ventajosamente en biorreactores tales como por ejemplo los
que han sido descritos en la publicación Biotechnology, tomo 3, 2ª
edición, Rehm et al Hrsg., (1993) especialmente en el
Capítulo II.
Los ejemplos siguientes ponen de manifiesto la
invención sin limitarla en modo alguno. En este caso se hará
referencia a las figuras adjuntas. Parte experimental
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando no se diga otra cosa, pueden llevarse a
cabo en el ámbito de la presente invención las etapas de clonación,
tales como por ejemplo las disociaciones por restricción, la
electrofóresis en gel de agarosa, la purificación de los fragmentos
de ADN, la transferencia de ácidos nucleicos sobre nitrocelulosa y
sobre membranas de Nylon, el enlace de los fragmentos de ADN, la
transformación de microorganismos, el cultivo de microorganismos, la
multiplicación de fagos y el análisis secuencial del ADN
recombinante, como se ha descrito en la publicación de Sambrook
et al. (1989) a.a.O.
La cepa recombinante
Escherichia-coli TG10^{+}(OYE) se
construyó de la manera siguiente:
E. coli TG10 se ha derivado de E.
coli TG1 (Stratagene). El TG10 es una cepa resistente a la
tetraciclina y auxótrofa con la ramnosa. El TG10^{+} se deriva
del TG10 mediante introducción de los plásmidos siguientes:
- a)
- pAgro4 (chaperona + resistente a la estreptomicina) (véase la figura 3) y
- b)
- pHSG575 (chaperona + resistente al cloranfenicol) (véase la figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
El pAgro4 es un descendiente de los vectores pZ
con genes groELS-chaperonina de E. coli. A su
vez el pZ es un derivado del plásmido pACYC. El pAgro4 está
descrito, por ejemplo, en la publicación Nucleic Acids Res., 1997,
25, 1203, Mol. Microbiol., 2001, 40, 397. El pHSG575 es un
descendiente del pSC101 con gen represor laclq de E. coli y
que está descrito, por ejemplo, en la publicación Gene, 1987, 61,
63, Mol. Microbiol., 2001, 40, 397.
El TG10^{+}(OYE) se derivó del
TG10^{+} por medio de la inserción de otro plásmido:
- \quad
- pDHE 1650 (promotor de ramnosa lento + resistente a la ampicilina + un gel oye).
- \quad
- pDHE1650 es un descendiente de pJOE2702 en el que ha sido clonado el gen para el, enzima amarillo antiguo -"old yellow enzymes"- entre los puntos de restricción NdeI y PstI o bien HindIII de pJOE2702. A su vez se preparó el pJOE2702 amplificándose la secuencia rhaB de E. coli JM109 y clonándose en los puntos de restricción SphI o bien EcoRI del descendiente de pBR322 constituido por el pBTAC1. Los puntos de enlace de los ribosomas de pET11a así como un punto de restricción NdeI se obtuvieron con oligonucleótidos sintéticos y se establecieron entre los puntos de restricción BämHI/EcoRI de pBTAC1. El plásmido ha sido descrito, por ejemplo, en la publicación Methods Enzymol., 1992, 216, 457, Mol. Microbiol., 1996, 21,1037.
\newpage
Se clonaron los siguientes genes del enzima
amarillo antiguo (oye):
- a)
- oye 1: Saccaromyces carlsbergensis (genoteca Q02899)
- b)
- oye 2: Saccaromyces cerevisiae (genoteca Q03558)
- c)
- oye 3: Saccaromyces cerevisiae (genoteca P41816).
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso se obtuvieron los siguientes
plásmidos:
- \quad
- pDHE1650 OYE1 (véase la figura 5)
- \quad
- pDHE1650 OYE2 (véase la figura 6)
- \quad
- pDHE1650 OYE3 (véase la figura 7)
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas recombinantes se cultivaron en medio
Luria-Broth (10 g/l de triptona, 10 g/l de NaCl y 5
g/l de extracto de levadura), que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 20 \mug/ml de
cloranfenicol. La sobreexpresión de proteína se indujo con 0,1 mM de
IPTG para las dos chaperonas y con 0,5 g/l de
L-ramnosa para OYE. Los cultivos se sacudieron con
120 revoluciones por minuto durante 22 horas a 37ºC. Las células
recolectadas se conservaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las biotransformaciones se llevaron a cabo en un
volumen de reacción de 1 ml bajo agitación magnética a 30ºC durante
un período de tiempo de 1 hora. Las concentraciones iniciales en la
mezcla de la reacción eran las siguientes: 10 g de masa seca
celular/litro, 10% de isopropanol [volumen/volumen], 20 mM de
4-fenil-3-butin-2-ona,
5 mM de EDTA, 2 mM de NADP^{+}, 1 U/ml de glucosadehidrogenasa
procedente de Thermoplasma acidophilum, 50 mM de
D-glucosa, 50 mM de tampón MES, ajustado con KOH a
pH 6,8. Para las biotransformaciones con NADH se empleó el sistema
de regeneración de NADPH (NADP^{+}, glucosa dehidrogenasa y
glucosa) por medio de 15 mM de NADH.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de la reacción se extrajeron con
cloroformo y los extractos se detectaron mediante cromatografía
gaseosa capilar (GC) con empleo de una Varian Star 3400 GC con una
columna capilar Supelco BPX5 (25 m x 0,32 mm de diámetro interno
con un espesor de película de la fase estacionaria de 0,5 \mum) y
detección por medio de FID. La identidad de los productos se
demostró por medio de co-elución de patrones de
muestras y por medio de los datos GC/MS. La GC/MS se llevó a cabo
en un cromatógrafo de gas Hewlett-Packard 5890,
Serie II, conectado con un espectrómetro de masas
Hewlett-Packard 5972 TID mediante la utilización de
una columna capilar Restek RTX-5MS (30 m x 0,25 mm
de diámetro interno con un espesor de la película de la fase
estacionaria de 0,25 \mum). Los cromatogramas y las relaciones
m/z se analizaron con ayuda del programa de ordenador MSD
ChemStation de la firma Agilent Technologies. Además se exploraron
bancos de datos con las muestras de fragmentación con ayuda de la
Wiley6 Library para llevar a cabo la identificación de los
compuestos desconocidos. Se utilizó un dispositivo Bruker 300 MHz
GYRO NMR para llevar a cabo la determinación de la configuración cis
y de la configuración trans del producto formado constituido por la
4-fenil-3-buten-2-ona.
Se utilizó el programa de ordenador 1D-WINNMR para
el análisis de los datos y los espectros obtenidos se compararon con
un patrón de la
trans-4-fenol-3-buten-2-ona
con una pureza del 99%.
Los resultados obtenidos por medio de los
ensayos, expresados mediante la productividad inicial (mM/h) están
reunidos en la figura 1 adjunta. Se observa una formación
sorprendentemente específica de la
E-4-fenil-3-buten-2-ona.
Claims (11)
1. Procedimiento para la obtención enzimática
de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de
derivados de alquinona \alpha,\beta-insaturados
de la fórmula general (1)
en la
que
- R^{1}
- significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un resto aromático o no aromático, carbocíclico o heterocíclico, en caso dado substituido,
- R^{2}
- significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono,
- \quad
- mediante la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa
- (i)
- que comprende al menos una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o
- (ii)
- con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la reducción se lleva a cabo con NADPH o
con NADH a título de cofactor, independientemente del ATP.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el cofactor empleado es regenerado por
vía enzimática.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque la regeneración del cofactor se lleva a
cabo por medio de glucosa-dehidrogenasa.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reducción se lleva a cabo en un medio de reacción acuoso,
acuoso-alcohólico o alcohólico.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reductasa está presente en forma inmovilizada.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el enzima se elige entre las
reductasas procedentes de Saccharomyces carlsbergensis
(genoteca Q02899), Saccharomyces cerevisiae (genoteca Q03558)
y Saccharomyces cerevisiae (genoteca P41816).
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que se hace reaccionar un
compuesto de la fórmula (1), en el que R^{1} significa arilo, en
caso dado substituido, y R^{2} significa alquilo con 1 hasta 6
átomos de carbono.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que se obtiene el isómero E de
los compuestos de la fórmula (2).
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se lleva a cabo
a una temperatura situada en el intervalo comprendido entre 0 y
45ºC y/o a un valor del pH situado en el intervalo comprendido
entre 6 y 8.
11. Empleo de un compuesto de la fórmula (2),
preparado según un procedimiento de conformidad con una de las
reivindicaciones precedentes, como producto intermedio para la
síntesis química o enzimática de principios activos.
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