ES2335767T3

ES2335767T3 - Metodos para la deteccion directa de metabolitos de metotrexato individuales.

Info

Publication number: ES2335767T3
Application number: ES04716493T
Authority: ES
Inventors: Thierry Dervieux; Russell Richerson
Original assignee: Prometheus Laboratories Inc
Current assignee: Prometheus Laboratories Inc
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2010-04-05
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: ATE447174T1; CA2517709A1; DE602004023824D1; EP1604203B1; EP1604203A2; WO2004081521A3; HK1079571A1; EP2148199A1; US20040175834A1; US6921667B2; CA2517709C; AU2004219711B2; EP1604203A4; AU2004219711A1; DK1604203T3; JP2006520914A; WO2004081521A2

Abstract

Método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato (MXTPG) en un extracto celular, caracterizado por: (a) la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución para resolver al menos un MTXPG; (b) irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto; y (c) detectar dicho al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, determinando de ese modo el nivel de dicho MTXPG, en el que la detección de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto se produce sin fraccionamiento de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto a partir de otras especies de MTXPG.

Description

Métodos para la detección directa de metabolitos de metotrexato individuales.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a métodos para monitorizar el tratamiento con fármacos y, más específicamente, a métodos para monitorizar la eficacia y la toxicidad del tratamiento farmacológico con metotrexato.

Antecedentes de la invención

El folato (ácido fólico) es una vitamina que es esencial para los procesos que mantienen la vida de síntesis, replicación y reparación de ADN. El folato también es importante para la biosíntesis de proteínas, otro proceso que es fundamental para la viabilidad de las células. El compuesto de pteridina, metotrexato (MTX), es estructuralmente similar al folato y como resultado puede unirse a los sitios activos de una serie de enzimas que normalmente usan folato como coenzima para la biosíntesis de precursores de nucleótidos de purina y pirimidina del ADN y para la interconversión de aminoácidos durante la biosíntesis de proteínas. A pesar de su similitud estructural con el ácido fólico, el metotrexato no puede usarse como cofactor por las enzimas que requieren folato, y en su lugar compite con el cofactor folato por los sitios de unión a enzimas, inhibiendo de este modo la biosíntesis de proteínas y ADN y, por tanto, la división celular.

La capacidad del metotrexato para inhibir la división celular se ha aprovechado en el tratamiento de una serie de enfermedades y estados que se caracterizan por un crecimiento celular rápido o aberrante. Como ejemplo, las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por una respuesta inmunitaria inapropiada dirigida contra los tejidos autólogos (propios) normales y están mediadas por células B o células T que se replican rápidamente. Las enfermedades autoinmunitarias que se han tratado con metotrexato incluyen, sin limitación, artritis reumatoide y otras formas de artritis, psoriasis, esclerosis múltiple, la fase autoinmunitaria de la diabetes mellitus (diabetes tipo 1 o de aparición juvenil), uveorretinitis autoinmunitaria, miastenia grave, tiroiditis autoinmunitaria y lupus eritematoso sistémico.

Puesto que muchas células malignas proliferan más rápidamente que las células normales, el metotrexato también puede usarse para afectar de manera selectiva al crecimiento de células cancerosas. Como consecuencia, el metotrexato es un agente antineoplásico usado ampliamente, empleado, por ejemplo, en el tratamiento de leucemia linfocítica aguda, cáncer de mama, cánceres epidermoides de cabeza y cuello, micosis fungoide avanzada, cáncer de pulmón, linfomas no de Hodgkins, coriocarcinoma gestacional, mola invasiva y molas hidatiformes.

A pesar de su eficacia terapéutica para una amplia variedad de enfermedades y estados, el tratamiento con metotrexato puede presentar un riesgo para el paciente. En particular, dado que el metotrexato interfiere en los procesos requeridos para la replicación y división de células normales así como enfermas, niveles inapropiadamente altos del fármaco pueden conducir a la destrucción de tejidos no diana que proliferan activamente tales como la médula ósea y la mucosa intestinal. Se ha asociado al metotrexato con la toxicidad renal y hepática cuando se administra en el "régimen de dosis altas" que se requiere para algunos estados. Además, el tratamiento con metotrexato a dosis bajas puede conducir a toxicidad y efectos secundarios no deseados en algunos pacientes, cuando la dosificación no es apropiada debido a la variabilidad individual en los parámetros farmacocinéticos que influyen, por ejemplo, en la absorción, selección como diana y aclaramiento del fármaco. Esta situación es especialmente problemática en el tratamiento de estados crónicos tales como la artritis reumatoide, en la que el metotrexato puede administrarse durante un periodo de muchos años.

Puesto que las diferencias individuales en los parámetros farmacocinéticos pueden ser difíciles de predecir, las estrategias seguras y eficaces de tratamiento con metotrexato requieren que se monitoricen los niveles de metotrexato o metabolitos de metotrexato en los pacientes en tratamiento. Se han desarrollado una variedad de métodos para monitorizar las concentraciones farmacológicas de metotrexato en plasma que incluyen bioensayos, ensayos cromatográficos y de detección inmunológicos. Tales métodos de detección en plasma han sido útiles para monitorizar el tratamiento con metotrexato a dosis altas en algunas aplicaciones clínicas. Sin embargo, debido a las limitaciones en su sensibilidad, estos métodos de detección en plasma no han sido útiles para monitorizar el tratamiento con metotrexato a dosis bajas, para el que deben analizarse los niveles intracelulares de los metabolitos de metotrexato.

El metotrexato se metaboliza tras la captación por las células de mamífero, de manera que se añaden uno o más restos de glutamilo al metotrexato dando una mezcla de poliglutamatos de metotrexato (MTXPG). El número de restos de glutamilo que pueden añadirse al MTX generalmente varía de dos a siete. Los MTXPG no se liberan fácilmente de las células y por tanto pueden ejercer sus efectos citotóxicos durante largos periodos de tiempo. Se ha demostrado que los niveles de MTXPG intracelulares son mayores en pacientes que respondieron al tratamiento con metotrexato en comparación con los niveles intracelulares en pacientes que no respondieron. Los métodos disponibles actualmente para medir los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato se basan en un ensayo con la enzima dihidrofolato reductasa en el que los niveles de poliglutamatos de metotrexato se calculan basándose en su capacidad para inhibir a la enzima dihidrofolato reductasa. Sin embargo, el alcance de la inhibición de la enzima en estos ensayos depende del número de restos de glutamilo unidos al metotrexato, haciendo imposible una determinación exacta de los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato mediante este método. La variabilidad de los ensayos basados en la hidrofolato reductasa puede agravarse además en algunas situaciones porque los folatos, que están presentes en diferentes cantidades dependiendo de la respuesta de un individuo al tratamiento con metotrexato y la cantidad de folato aportada por la dieta, también influyen en los resultados del ensayo actual con la enzima.

La publicación PCT número WO 2004/020622 describe un método para determinar de manera indirecta los niveles de MTXPG convirtiendo en primer lugar los MTXPG en MTX y cuantificando después los niveles de MTX, en el que los niveles cuantificados de MTX se correlacionan con los niveles de MTXPG.

Brouwer et al. (FASEB J., 14:A720 (2000)) describe un método para cuantificar los niveles de MTXPG usando el fraccionamiento de los MTXPG de glóbulos rojos (GR). El método no detecta los MTXPG de GR en una única ejecución, sino que requiere dos etapas de separación en columna: (1) separación para elución total de las especies de MTXPG mediante cromatografía de afinidad, seguida por (2) otra separación para fraccionar y recoger los MTXPG en un único tubo antes de la fotólisis.

Por tanto, existe una necesidad de nuevos métodos para determinar los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato y para monitorizar la eficacia y la toxicidad del tratamiento con metotrexato incluyendo el tratamiento con metotrexato a dosis bajas. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular caracterizado por la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para resolver al menos un MTXPG en el extracto celular; irradiar el al menos un MTXPG, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto; y detectar el al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, determinando de ese modo un nivel del MTXPG. Un método de la invención puede ser útil, por ejemplo, para determinar un nivel de MTXPG_{3}, MTXPG_{4} o MTXPG_{5}, o para determinar un nivel de cada una de las especies de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} presentes en el extracto celular.

El método de la invención puede usarse para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato administrado a un ser humano seleccionando un fármaco o una dosificación que debe administrarse posteriormente al ser humano basándose en el nivel del MTYPG resuelto. Una dosificación de metotrexato administrada al ser humano puede alterarse posteriormente, por ejemplo, reduciendo o aumentando una dosificación de metotrexato administrada posteriormente al ser humano, o alterando una dosis de ácido fólico, o un derivado del mismo, administrada posteriormente al ser humano.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las estructuras del metotrexato y los poliglutamatos de metotrexato. (A) La estructura química del metotrexato. (B) La estructura química para los poliglutamatos de metotrexato, en la que n se refiere al número de glutamatos unidos al metotrexato.

La figura 2 muestra un cromatograma del metotrexato y los poliglutamatos de metotrexato en agua y los espectros de excitación de los productos fotolíticos de estos analitos. (A) Cromatograma de un patrón en agua que contiene los siete poliglutamatos de metotrexato a una concentración final de 25 nmol/l cada uno. (B) Espectros de excitación de los productos fotolíticos de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} en agua.

La figura 3 muestra cromatogramas de muestras de glóbulos rojos control y complementadas homogenizadas y tratadas con ácido perclórico. La longitud de onda de excitación era de 274 nm y la longitud de onda de emisión de 464 nm. (A) Cromatograma típico de la muestra de glóbulos rojos control. (B) Cromatograma típico de una muestra de glóbulos rojos complementada con MTXPG_{1} a MTXPG_{7} purificados a una concentración final de 25 nmol/l cada uno. Las ecuaciones que describen las curvas patrón eran: MTXPG_{1}, y = 0,493x + 0,245; MTXPG_{2}, y = 0,540x + 0,130; MTXPG_{3}, y = 0,561x + 0,125; MTXPG_{4}, y = 0,568x + 0,112; MTXPG_{5}, y = 0,668x + 0,01; MTXPG_{6}, y = 0,710x + 0,07; y MTXPG_{7}, y = 0,430x + 0,316, en las que y es el área del pico y x es la concentración comple-
mentaria.

La figura 4 muestra el cromatograma de una muestra de glóbulos rojos de un paciente tratado con tratamiento con metotrexato a dosis bajas. (A) Cromatograma de un paciente con 17,5 mg semanales de metotrexato durante al menos 3 meses. Las concentraciones eran tal como sigue: MTXPG_{5} 39 nmol/l; MTXPG_{4} 50 nmol/l; MTXPG_{3} 64 nmol/l; MTXPG_{2} 10 nmol/l; y MTXPG_{1} 27 nmol/l. No se detectaron MTXPG_{6} ni MTXPG_{7} en esta muestra. (B) Espectros de excitación de cada producto fotolítico de poliglutamatos de metotrexato detectado a partir de la muestra del paciente en A en comparación con los espectros de excitación del producto fotolítico de metotrexato en agua. El valor de coincidencia era mayor que 900 para cada una de las cinco comparaciones de los espectros.

La figura 5 muestra concentraciones de MTXPG_{1} a MTXPG_{5} individuales promedio en 14 pacientes con artritis reumatoide. No se detectaron MTXPG_{6} ni MTXPG_{7}.

Descripción detallada de la invención

Tal como se da a conocer en el presente documento, se desarrolló un ensayo de cromatografía de líquidos de fase inversa para la cuantificación de concentraciones de poliglutamatos de metotrexato individuales en extractos de glóbulos rojos preparados a partir de individuos sometidos a tratamiento con metotrexato a dosis bajas. Tal como se da a conocer en el ejemplo I, el ensayo incluye el tratamiento de la muestra con ácido perclórico y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de HPLC compuesto por una columna de fase inversa C18, con tampón acetato de amonio/acetonitrilo (pH 6,5) como fase móvil. A diferencia de los métodos enzimáticos descritos previamente para evaluar metabolitos de metotrexato, los poliglutamatos de metotrexato se detectaron de manera fluorimétrica tras la fotooxidación posterior a la columna en presencia de peróxido de hidrógeno. Tal como se da a conocer en el ejemplo I, los coeficientes de variación para la precisión dentro de un día y entre días fueron inferiores al 10% para las concentraciones tanto altas como bajas de poliglutamatos de metotrexato. Además, se detectaron tan sólo 5 nmol de poliglutamato de metotrexato por litro de glóbulos rojos empaquetados. Tal como se da a conocer adicionalmente en el presente documento, las concentraciones de poliglutamatos de metotrexato se determinaron en muestras de glóbulos rojos de 14 pacientes con artritis que recibían tratamiento con metotrexato a dosis bajas (mediana de la dosis de fármaco de 16 mg/semana).

A diferencia de metodologías más antiguas, los métodos de la invención pueden usarse para detectar metabolitos de poliglutamatos de metotrexato a los niveles bastante bajos en los que se producen en pacientes tratados con tratamiento con metotrexato a dosis bajas y pueden ser útiles para detectar de manera exacta cada uno de los poliglutamatos individuales, de MTXPG_{1} a MTXPG_{7}. Los métodos de la invención además pueden ponerse en práctica convenientemente sin la necesidad de radiomarcaje o analizar múltiples fracciones.

Basándose en los hallazgos descritos anteriormente, la presente invención proporciona un método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular caracterizado por la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de HPLC para resolver al menos un MTXPG en un extracto celular obtenido de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato; irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto y detectar al menos un MTXPG resuelto, determinando de ese modo un nivel del MTXPG resuelto, en el que la detección de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto se produce sin el fraccionamiento de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto a partir de otras especies de MTXPG. Un método de la invención puede ser útil, por ejemplo, para determinar un nivel de MTXPG_{3}, MTXPG_{4} o MTXPG_{5}, o para determinar un nivel de cada una de las especies de poliglutamato de metotrexato MTXPG_{1} a MTXPG_{7} presentes en el extracto celular. En una realización, la etapa de detección no incluye detección electroquímica. En otra realización, la etapa de detección no incluye detección electroquímica ni espectrofotometría UV-visible.

Una variedad de extractos celulares de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato pueden ser útiles en un método de la invención incluyendo, sin limitación, extractos de glóbulos rojos y extractos de leucocitos. En realizaciones particulares, un extracto celular útil en la invención se deriva de un ser humano que tiene una enfermedad autoinmunitaria tal como artritis, lupus eritematoso sistémico o psoriasis, o de un ser humano que tiene cáncer.

Los métodos de la invención pueden ser útiles para la detección de niveles intracelulares bajos de poliglutamatos de metotrexato. En una realización, un método de la invención tiene una sensibilidad de menos de 500 nmol de cada una de las especies de MTXPG individuales por litro de glóbulos rojos empaquetados. En otra realización, un método de la invención tiene una sensibilidad de menos de 50 nmol de cada una de las especies de MTXPG individuales por litro de glóbulos rojos empaquetados.

Un método de la invención puede ser útil para detectar, por ejemplo, menos de 250 nmol, 100 nmol, 50 nmol, 20 nmol o 5 nmol de cada una de las especies de MTXPG individuales por litro de glóbulos rojos empaquetados.

Los extractos celulares útiles en un método de la invención incluyen, aunque no están limitados a, extractos de glóbulos rojos y extractos de leucocitos. Los extractos celulares útiles en la invención incluyen además aquellos de seres humanos sometidos a tratamiento con metotrexato, y de seres humanos que tienen cualquiera de una variedad de enfermedades autoinmunitarias o cánceres. En una realización, un método de la invención tiene una sensibilidad de menos de 500 nmol de cada una de las especies de MTXPG individuales por litro de glóbulos rojos empaquetados.

Según, la invención, se resuelve un MTXPG usando cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Puede detectarse un MTXPG resuelto, por ejemplo, usando fluorimetría, espectrofotometría o espectrometría de masas, o una combinación de estas técnicas.

Los métodos de la invención para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular son útiles para analizar niveles intracelulares de metabolitos de metotrexato en individuos sometidos a tratamiento con metotrexato. Tal como se usa en el presente documento, el término metotrexato es sinónimo de MTX y significa una molécula que tiene la estructura mostrada en la figura 1A. El metotrexato incluye, en parte, un resto de anillo de pterina 2,4-diamino- sustituido unido en la posición 6 al grupo amino de un resto de p-aminobenzoílo, teniendo el resto de p-aminobenzoílo un grupo amino metilado y estando unido mediante un enlace amida a un resto de ácido glutámico. Compatible con la nomenclatura de los poliglutamatos de metotrexato descrita más adelante, "MTXPG_{1}" es sinónimo de metotrexato.

El metotrexato se conoce bien en la técnica como inhibidor de la dihidrofolato reductasa (DHFR), que actúa reduciendo la producción de tetrahidrofolato (THF) a partir de dihidrofolato (DHF). Como consecuencia, el metotrexato inhibe de manera indirecta la síntesis de purina y timidina y la interconversión de aminoácidos. El metotrexato también presenta actividad antiproliferativa a través de la inhibición de la síntesis de timidilato, que se requiere para sintetizar el ADN (Calvert, Semin. Oncol. 26:3-10 (1999)). El metotrexato y su síntesis y propiedades se describen con más detalle en las patentes estadounidenses números 2.512.572; 3.892.801; 3.989.703; 4.057.548; 4.067.867; 4.079.056; 4.080.325; 4.136.101; 4.224.446; 4.306.064; 4.374.987; 4.421.913; y 4.767.859. Los métodos de uso de metotrexato para tratar el cáncer se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 4.106.488, 4.558.690 y 4.662.359.

El metotrexato, que es útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades autoinmunitarias y cánceres, puede administrarse mediante las vías oral o parenteral. El fármaco se distribuye fácilmente a los tejidos del organismo, donde se transporta a las células mediante un sistema transportador específico que incluye componentes tales como el transportador de folato reducido, RCF1, y el receptor de folato. Debido a su alta polaridad a pH fisiológico, el metotrexato no atraviesa fácilmente la membrana celular y la mayor parte del fármaco entra en las células por medio de transportadores específicos. Una vez dentro de la célula, el metotrexato se convierte en poliglutamatos de metotrexato mediante enzimas específicas tales como la folilpoli-gamma-glutamato sintetasa, que añade uno o más restos de ácido glutámico, unidos mediante enlaces isopeptídicos al \gamma-carboxilo del metotrexato tal como se describe, por ejemplo, en Kamen, Semin. Oncol. S18:30-39 (1997).

Los métodos de la invención sirven para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato. Tal como se usa en el presente documento, el término "poliglutamato de metotrexato" es sinónimo de "MTXPG" y significa un derivado de metotrexato que tiene dos o más glutamatos que están unidos mediante enlace amida al resto de p-aminobenzoílo del metotrexato tal como se muestra en la estructura generalizada de la figura 1B. El número de glutamatos en un poliglutamato de metotrexato varía de dos a siete o más; el número de restos de glutamato puede indicarse mediante "n" usando la nomenclatura MTXPG_{n} de modo que, por ejemplo, MTXPG_{2} es MTXPG que tiene dos glutamatos, MTXPG_{3} es MTXPG que tiene tres glutamatos, MTXPG_{4} es MTXPG que tiene cuatro glutamatos, MTXPG_{5} es MTXPG que tiene cinco glutamatos, MTXPG_{6} es MTXPG que tiene seis glutamatos, MTXPG_{7} es MTXPG que tiene siete glutamatos, y MTXPG_{2-7} es una mezcla que contiene MTXPG_{2}, MTXPG_{3}, MTXPG_{4}, MTXPG_{5}, MTXPG_{6} y MTXPG_{7} con la razón de las formas de poliglutamatos individuales en la mezcla sin definir.

Los métodos de la invención son útiles para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular. El término "nivel", tal como se usa en el presente documento, significa la cantidad o la concentración del poliglutamato de metotrexato en el extracto celular. Se entiende que un nivel puede ser un nivel absoluto tal como una concentración molar o un peso o un nivel relativo tal como un por ciento o una fracción en comparación con una o más otras moléculas en el extracto celular. Se excluyen específicamente de la definición de "nivel", tal como se usa en el presente documento, las estimaciones o mediciones basadas en actividad enzimática, tal como la inhibición de la dihidrofolato reductasa u otra enzima dependiente de folato diferente.

Tal como se usa en el presente documento en referencia a un poliglutamato de metotrexato, el término "resuelto" significa separado suficientemente de otras moléculas para permitir la determinación de un nivel del poliglutamato de metotrexato. Por tanto, una especie de poliglutamato de metotrexato que tiene una propiedad observable se resuelve separando suficientemente la especie de MTXPG de otras moléculas que tienen la misma propiedad. Como ejemplo no limitativo, una especie de MTXPG detectable mediante fluorescencia a una longitud de onda de excitación y emisión particular puede resolverse separándola de otras moléculas que tienen excitación y emisión considerables a la misma longitud de onda; la especie de MTXPG puede separarse o no de una variedad de otras moléculas que tienen longitudes de onda de excitación y emisión diferentes. En vista de lo anterior, se entiende que si un poliglutamato de metotrexato se resuelve o no se determina, en parte, mediante los medios de detección utilizados en el
método.

Tal como se da a conocer en el presente documento, los poliglutamatos de metotrexato se resolvieron cromatográficamente de otros componentes celulares usando cromatografía de fase inversa tal como se expone en los ejemplos I y II y se cuantificaron posteriormente, por ejemplo, mediante la comparación con uno o más patrones de referencia conocidos. Tal como se demuestra en el presente documento, la resolución cromatográfica de los poliglutamatos de metotrexato puede llevarse a cabo haciendo pasar una mezcla de poliglutamatos de metotrexato en un extracto celular a través de una columna de fase inversa C18 en una fase móvil que consiste en un gradiente lineal de 20 minutos de desde el 2% de acetonitrilo/el 98% de fase móvil A hasta el 12,5% de acetonitrilo/el 87,5% de fase móvil A, en el que la fase móvil A es acetato de amonio 10 mM, pH 6,5, con peróxido de hidrógeno a una concentración final del 0,2% (ejemplos I y II).

Una columna de fase inversa útil para resolver una mezcla de MTXPG en un extracto celular puede tener, por ejemplo, dimensiones de 25 cm x 4,6 mm, tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento. Se entiende que las columnas que tienen diámetros, longitudes o ambos más grandes o más pequeños también pueden usarse, por ejemplo, para alojar tamaños de muestra más grandes o más pequeñas. Las velocidades de flujo pueden variar, sin limitación, desde 0,2 hasta 2,5 ml/minuto. Tal como se demuestra en el presente documento, la velocidad de flujo para la fase móvil era de 1 ml/minuto. Sin embargo, la velocidad de flujo de la fase móvil puede alterarse según se desee. Una velocidad de flujo más lenta, tal como 0,8 ml/minuto, 0,5 ml/minuto o 0,2 ml/minuto, puede usarse, por ejemplo, con una columna más pequeña o para aumentar los tiempos de retención de los poliglutamatos de metotrexato. Alternativamente, una velocidad de flujo más rápida, tal como 1,5 ml/minuto o 2,0 ml/minuto, puede usarse, por ejemplo, con una columna más grande o para reducir los tiempos de retención de los poliglutamatos de metotrexato.

Un poliglutamato de metotrexato se resuelve de los componentes de un extracto celular mediante el método cromatográfico de HPLC. Los ejemplos de métodos cromatográficos incluyen, pero no se limitan a, métodos cromatográficos de fase líquida y gaseosa tales como, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel, electroforesis capilar, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa y cromatografía de afinidad. Los métodos espectrométricos a modo de ejemplo son espectrometría de masas, espectrometría de masas en tándem y espectrometría de masas preparativa con ionización por electrospray. Como ejemplo no limitativo, las moléculas solubles pueden separarse de proteínas y otros materiales precipitados tras la lisis de las células y la precipitación con ácido perclórico, seguido por la cromatografía de líquidos de alta resolución de las moléculas solubles.

Un extracto celular derivado de células o un individuo tratado con metotrexato contiene normalmente una mezcla de especies de poliglutamatos de metotrexato, que difieren en el número de restos de glutamato unidos. Tal como se usa en el presente documento, el término "extracto celular" significa una mezcla que contiene una pluralidad heterogénea de componentes celulares. Un extracto celular útil en la invención puede contener, por ejemplo, una pluralidad heterogénea de compuestos, proteínas y metabolitos celulares solubles y puede derivarse de un único tipo celular, mezcla de tipos celulares o fuente de tejidos. La heterogeneidad de un extracto celular puede caracterizarse mediante diversos criterios. Según uno de los criterios, un extracto celular útil en la invención es heterogéneo con respecto a la variedad de componentes celulares presentes en el extracto; un extracto celular de este tipo puede contener, sin limitación, al menos 100, 1000, 1 x 10^{4} ó 1 x 10^{5} ó más componentes celulares diferentes, por ejemplo, al menos 100, 1000, 1 x 10^{4} o 1 x 10^{5} o más proteínas celulares diferentes. La heterogeneidad también puede expresarse como porcentaje del número total de componentes diferentes de la célula a partir de la cual se deriva el extracto. Como ejemplo, un extracto celular puede contener componentes celulares que representan al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% o 75% de la variedad de componentes presentes en la célula a partir de la cual se derivó el extracto. La heterogeneidad también puede determinarse basándose en el porcentaje de uno cualquiera de los componentes celulares en un extracto celular en comparación con la totalidad de otros componentes en el extracto celular. Por tanto, un extracto celular útil en la invención puede ser una mezcla en la que uno cualquiera de los componentes celulares representa como máximo el 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 25% o 10% de la totalidad de otros componentes celulares en peso en el extracto. Un extracto celular útil en un método de la invención puede contener mezclas de componentes tales como proteínas, componentes que son más grandes que 100 Da o componentes que absorben radiación entre aproximadamente 303 nm y 313 nm o a aproximadamente 370 nm.

Un extracto celular útil en un método de la invención puede ser cualquier extracto celular que contiene uno o más poliglutamatos de metotrexato. Se entiende que pueden añadirse poliglutamatos de metotrexato exógenos adicionales, si se desea, a un extracto celular. La adición de uno o más MTXPG exógenos en un extracto celular puede ser útil para determinar una curva patrón para la cuantificación o para optimizar las condiciones de detección. Un extracto celular que contiene poliglutamatos de metotrexato puede obtenerse añadiendo metotrexato a las células y permitiendo que la poliglutamación se produzca in vitro. Por tanto, un método de la invención puede usarse para monitorizar o determinar la actividad de poliglutamación de una célula o un componente de la misma, tal como la folilpoli-gamma-glutamato sintetasa. Los extractos celulares también pueden prepararse a partir de una célula aislada de un individuo al que se ha administrado metotrexato mediante cualquier vía.

Los extractos celulares útiles en la invención pueden prepararse a partir de una célula o un tejido usando métodos bien conocidos en la técnica. Aquellos expertos en la técnica conocerán o podrán determinar un método apropiado para obtener células fuente basándose en su ubicación y características. Como ejemplo, los glóbulos rojos y otras células sanguíneas pueden obtenerse recogiéndose a través de vías intravenosas. Las células también pueden retirarse de tejidos, tales como tejidos cancerosos, usando métodos de biopsia conocidos que incluyen, por ejemplo, aquéllos que utilizan una incisión quirúrgica abierta, aguja de biopsia o endoscopio. Las células pueden lisarse mediante cualquiera de una variedad de medios que dependen, en parte, de las propiedades de la célula. Como ejemplos no limitativos, las células pueden lisarse mediante alteración mecánica con perlas de vidrio, un homogeneizador Dounce, prensa francesa o sonicación; alteración enzimática con lisozima u otra enzima que degrada la pared celular; alteración osmótica o una combinación de estos métodos.

Un extracto celular útil en un método de la invención puede ser un extracto parcialmente purificado, que puede estar, por ejemplo, enriquecido con poliglutamatos de metotrexato. Como ejemplo, un extracto puede purificarse parcialmente mediante centrifugación para eliminar material insoluble tal como membranas y estructuras celulares grandes (véase el ejemplo I). La purificación parcial para separar componentes celulares incluyendo los poliglutamatos de metotrexato o análogos de los mismos de otros componentes celulares puede incluir, sin limitación, centrifugación, precipitación de proteínas, extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida o cromatografía tal como cromatografía de fase inversa, cromatografía por apareamiento de iones o cromatografía de intercambio iónico, tal como se describe, por ejemplo, en Rubino, J. Chromatog. 764:217-254 (2001). Los métodos adicionales que pueden usarse para obtener y purificar parcialmente extractos celulares se conocen bien en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3^{a} edición, Springer- Verlag, Nueva York (1994) y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (2000).

En un método de la invención, material proteínico se precipita separándose de los poliglutamatos de metotrexato y otros metabolitos, y el sobrenadante agotado en proteínas se somete a procedimientos de separación adicionales. Tal como se usa en el presente documento, el término "ácido" se refiere a un reactivo que puede efectuar la precipitación preferencial de material proteínico desde una disolución, sin precipitar los poliglutamatos de metotrexato. Un experto en la técnica entiende que un ácido útil en la invención no destruye, degrada o afecta de otra manera sustancialmente a la detección de los poliglutamatos de metotrexato. Los ácidos a modo de ejemplo útiles en la invención incluyen, sin limitación, ácido perclórico; ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético glacial. Los ácidos adicionales útiles en la invención pueden identificarse mediante la capacidad para producir un nivel sustancialmente similar de poliglutamatos de metotrexato para una muestra particular, en comparación con una muestra en contacto con ácido perclórico al 70%.

Los métodos de la invención se adaptan bien para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto de glóbulos rojos tal como se demuestra en los ejemplos I y II. Las condiciones mostradas a modo de ejemplo en el presente documento también pueden aplicarse fácilmente a otros tipos de extractos celulares con el fin de determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato. Se entiende que el extracto celular puede ser de una célula que es una diana para el tratamiento con metotrexato o de lo contrario es una célula indicativa de la eficacia o la toxicidad del tratamiento con metotrexato. Los ejemplos no limitativos de extractos celulares que son útiles en la invención incluyen extractos preparados a partir de biopsias de tejidos, eritrocitos, neutrófilos y leucocitos. Los extractos celulares adicionales útiles en la invención incluyen, sin limitación, extractos de células neoplásicas o cancerosas tales como aquéllos obtenidos de cualquiera de los cánceres específicos expuestos más adelante. Los extractos celulares útiles en un método de la invención incluyen además, pero no se limitan a, extractos de células eucariotas, extractos de células de mamífero, extractos de células de primate, extractos de células humanas, extractos de células de primate no humanas, extractos de células de rata, extractos de células de ratón, extractos de células de gato, extractos de células de perro, extractos de células de ave y extractos de células de caballo.

Un extracto celular útil en la invención puede obtenerse, por ejemplo, de las células de cualquier individuo tratado con tratamiento con metotrexato, incluyendo tratamiento a dosis bajas o dosis altas. En una realización, un extracto celular útil en un método de la invención es de un ser humano que tiene una enfermedad autoinmunitaria. Tal como se usa en el presente documento, el término "enfermedad autoinmunitaria" significa una enfermedad que resulta de una respuesta inmunitaria contra un tejido o un componente del tejido propio e incluye una respuesta con anticuerpos o una respuesta mediada por células propia. El término enfermedad autoinmunitaria, tal como se usa en el presente documento, abarca enfermedades autoinmunitarias de órganos específicos, en las que una respuesta autoinmunitaria se dirige contra un único tejido, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, diabetes mellitus tipo I, miastenia grave, vitíligo, enfermedad de Grave, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison y gastritis autoinmunitaria; y hepatitis autoinmunitaria. El término enfermedad autoinmunitaria también abarca enfermedades autoinmunitarias no específicas de órganos, en las que una respuesta autoinmunitaria se dirige contra un componente presente en varios o muchos órganos en todo el organismo. Tales enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, enfermedad reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica progresiva y variantes, polimiositis y dermatomiositis. Las enfermedades autoinmunitarias adicionales incluyen pero no están limitadas a, anemia perniciosa, gastritis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, trombocitopenia autoinmunitaria, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple y psoriasis. Un experto en la técnica aprecia que las enfermedades autoinmunitarias expuestas anteriormente se han tratado con tratamiento con metotrexato o pueden tratarse con tratamiento con metotrexato y además reconoce que los métodos de la invención pueden usarse con un extracto celular obtenido de un ser humano u otro mamífero que tiene cualquiera de las anteriores u otra enfermedad autoinmunitaria.

En una realización, un extracto celular útil en un método de la invención se obtiene de un ser humano que tiene artritis. Tal como se usa en el presente documento, el término "artritis" significa un estado inflamatorio que afecta a las articulaciones. La artritis puede ser, sin limitación, de origen infeccioso, autoinmunitario o traumático; el término artritis incluye, pero no se limita a, artritis aguda, artritis gotosa aguda, artritis bacteriana, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa (artrosis), artritis infecciosa, artritis juvenil, artritis micótica, artritis neuropática, poliartritis, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artritis reumatoide juvenil, artritis venérea y artritis viral.

En una realización adicional, un extracto celular útil en un método de la invención se obtiene de un ser humano que tiene artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad sistémica crónica principalmente de las articulaciones, generalmente poliarticular, marcada por cambios inflamatorios en las membranas sinoviales y las estructuras articulares y por la atrofia de los músculos y la rarefacción de los huesos. El metotrexato se usa ampliamente en el tratamiento de la artritis reumatoide, y un experto en la técnica reconoce que los métodos de la invención pueden ponerse en práctica con un extracto celular de un ser humano u otro mamífero que tiene artritis reumatoide u otra forma de artritis.

En otra realización, un método de la invención se pone en práctica con un extracto celular de un ser humano que tiene cáncer. Tal como se usa en el presente documento, el término "cáncer" pretende significar cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células aberrantes. El término incluye todos los cánceres y estados neoplásicos conocidos, ya se caractericen como malignos, benignos, de tejido blando o sólidos, y cánceres de todos los estadios y grados incluyendo cánceres antes y después de la metástasis. El término cáncer abarca, sin limitación, leucemias tales como leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda; linfomas; coriocarcinomas; cánceres de cabeza y cuello; y sarcomas osteogénicos, cada uno de los cuales se tratan ampliamente con metotrexato. El término cáncer incluye además, pero no se limita a, cánceres digestivos y gastrointestinales tales como cáncer anal, cáncer del conducto biliar, tumores carcinoides gastrointestinales y cáncer de colon; cáncer esofágico, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer rectal, cáncer de apéndice, cáncer de intestino delgado y cáncer de estómago (gástrico); cáncer de mama; cáncer ovárico; cáncer de pulmón; cáncer renal; cáncer del sistema nervioso central; y cáncer de piel. En una realización, un método de la invención se pone en práctica con un extracto celular obtenido de un ser humano que tiene leucemia.

La artritis reumatoide y una variedad de otros trastornos autoinmunitarios tales como psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad injerto contra huésped normalmente se tratan con tratamiento con metotrexato a dosis bajas, que también se usa en algunos regímenes de tratamiento del cáncer. En una realización, un método de la invención se pone en práctica con un extracto celular de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato a dosis bajas. Tal como se usa en el presente documento, el término "tratamiento con MTX a dosis bajas" significa la administración de metotrexato a un ser humano a una dosis que es inferior a 40 mg/m^{2} de superficie corporal por semana. Normalmente, el tratamiento con metotrexato a dosis bajas se administra por vía oral a una dosis en el intervalo de 2,5 a 40 mg/m^{2} de superficie corporal por semana, por ejemplo, de 2,5 a 25 mg/m^{2} de superficie corporal por semana dependiendo del estado que esté tratándose.

Los métodos de la invención también pueden ser útiles para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato a dosis altas. Tal como se usa en el presente documento, el término "tratamiento con MTX a dosis altas" significa la administración de metotrexato a un individuo a una dosis que es al menos de 40 mg/m^{2} de superficie corporal por día, por ejemplo al menos de 100, 500, 1000, 1500, 3000 mg/m^{2} o 5000 mg/m^{2} de superficie corporal por día. Un experto en la técnica entiende que el tratamiento con metotrexato a dosis altas se usa con frecuencia como tratamiento contra el cáncer y puede administrarse a dosis de hasta 5 g/m^{2} de superficie corporal por día o superiores dependiendo del estado o la enfermedad que esté tratándose. Un experto en la técnica reconoce que las dosis de metotrexato usadas normalmente en el tratamiento con MTX a dosis altas pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa o por vía oral y que tal tratamiento con metotrexato a dosis altas generalmente requiere un periodo de recuperación, que puede incluir el rescate con leucovorina u otra forma de reemplazo de folato.

Se entenderá que los intervalos de dosificación de metotrexato expuestos anteriormente en las definiciones del tratamiento con metotrexato a dosis altas y bajas se generalizan con respecto al tratamiento de una variedad de enfermedades y que el intervalo de dosis de metotrexato que se administra para una enfermedad puede diferir del intervalo administrado para otra. Por consiguiente, una dosis de 40 mg/m^{2} de superficie corporal por día, aunque generalmente considerada tratamiento con MTX a dosis altas, puede considerarse por los expertos en la técnica del tratamiento del cáncer como una dosis relativamente baja para tratar el cáncer. De manera similar, una dosis de 30 mg/m^{2} de superficie corporal por día, aunque generalmente considerada tratamiento con MTX a dosis bajas, puede considerarse por los expertos en la técnica de la reumatología como una dosis relativamente alta para tratar la artritis reumatoide.

Los métodos de la invención también pueden usarse para detectar metabolitos de un análogo de metotrexato u otro antifolato susceptible de poliglutamilación. Tal como se usa en el presente documento, el término "antifolato" significa una molécula que tiene similitud estructural con el folato y actividad como un antagonista del folato contra una o más enzimas dependientes de folato. Los antifolatos susceptibles de poliglutamilación son antifolatos que pueden poliglutamilarse en una célula por una enzima tal como la folilpoli-gamma-glutamato sintetasa. Los ejemplos de antifolatos susceptibles de poliglutamilación incluyen, sin limitación, aminopterina, raltitrexed, lometrexol, antifolato multidiana (MTA), AQA, MTX y análogos de los mismos. La aminopterina, por ejemplo, tiene un hidrógeno en lugar de un grupo metilo en la posición N-10 en comparación con la estructura del metotrexato. El raltitrexed es un inhibidor selectivo de la timidilato sintasa tal como se describe, por ejemplo, en Kamen, Semin. Oncol. S18:30-39 (1997). El lometrexol inhibe de manera selectiva la glicinamida ribonucleótido formiltransferasa, que es la primera enzima implicada en la ruta de síntesis de novo de purinas tal como se describe, por ejemplo, en Calvert, citado anteriormente, 1999. El antifolato multidiana es un inhibidor de múltiples enzimas dependientes de folato, tales como dihidrofolato reductasa, timidilato sintasa y glicinamida ribonucleótido formiltransferasa (véase, por ejemplo, Calvert, citado anteriormente, 1999).

En una realización, los métodos de la invención son útiles para detectar formas poliglutaminadas de un análogo de metotrexato. Tal como se usa en el presente documento, el término "análogo de metotrexato" significa una molécula que tiene similitud estructural y funcional con el metotrexato. Los análogos de metotrexato se caracterizan de manera funcional, en parte, por su actividad inhibidora contra la dihidrofolato reductasa. Un análogo de metotrexato útil en la invención actúa como sustrato para la poliglutamación en una célula por una enzima tal como la folilpoli-gamma-glutamato sintetasa. Los análogos de metotrexato incluyen, pero no se limitan a, derivados 4-amino con sustitución halógena en el resto para- aminobenzoico, tal como diclorometotrexato (véase, por ejemplo, Frei et al., Clin. Pharmacol. Therap. 6:160-71 (1965); MTX 7-metil-sustituido (véase, por ejemplo, Rosowsky y Chen, J. Med. Chem. 17:1308-11 (1974)); 3',5'-difluoro-MTX, (véase, por ejemplo, Tomcuf, J. Organic Chem 26:3351 (1961)); derivados 2' y 3'-monofluorados de aminopterina (véase, por ejemplo, Henkin y Washtien, J. Med. Chem. 26:1193-1196 (1983)); y 7,8-dihidro-8-metil-MTX (véase, por ejemplo, Chaykovsky, J. Org. Chem. 40:145-146 (1975)). El experto en la técnica entiende que los métodos de la invención pueden usarse para optimizar o monitorizar la eficacia o toxicidad asociada con el tratamiento con análogos de metotrexato u otro tratamiento con antifolatos susceptibles de poliglutamilación de la misma manera que se da a conocer en el presente documento para monitorizar el tratamiento con metotrexato.

Según la invención, un MTXPG se resuelve usando cromatografía de líquidos de alta resolución. En un método de la invención, el MTXPG puede irradiarse, por ejemplo, usando irradiación con UV. En una realización, el MTXPG se irradia con rayos UV en un disolvente que tiene del 0,05% al 1% de H_{2}O_{2}. En otra realización, el MTXPG se irradia con rayos UV en un disolvente que tiene del 0,1% al 0,3% de H_{2}O_{2}. En una realización adicional, el MTXPG se irradia con rayos UV usando radiación que tiene una longitud de onda en el intervalo de 225 nm a 275 nm, por ejemplo, una longitud de onda de 254 nm. La irradiación puede tener una duración, por ejemplo, de 0,5 a 60 segundos o de 0,5 a 15 segundos.

En un método de la invención, detectar un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto puede implicar, por ejemplo, detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm. En realizaciones particulares, se detecta la fluorescencia tras la excitación con radiación UV en el intervalo de 240 nm a 300 nm, por ejemplo, tras la excitación con radiación UV a 274 nm. En otra realización, se detecta la fluorescencia tras la excitación con radiación UV en el intervalo de 360 nm a 410 nm. Se entiende que se detecta la fluorescencia a una longitud de onda de emisión apropiada, tal como una longitud de onda de emisión en el intervalo de 320 nm a 550 nm o una longitud de onda de emisión en el intervalo de 440 nm a 500 nm. En una realización, se detecta la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 464 nm. En una realización adicional, la fluorescencia se detecta tras la excitación con radiación UV a 274 nm y a una longitud de onda de emisión de 464 nm.

Una variedad de extractos celulares pueden ser útiles en un método de la invención incluyendo, sin limitación, extractos de células humanas, extractos de glóbulos rojos y extractos de leucocitos. Tales extractos celulares pueden derivarse de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato, incluyendo, pero no limitado a, un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato a dosis bajas. En realizaciones particulares, el extracto celular se deriva de un ser humano que tiene una enfermedad autoinmunitaria tal como artritis, artritis reumatoide, poliartritis, lupus eritematoso sistémico o psoriasis, o de un ser humano que tiene cáncer. Un método de la invención puede tener una sensibilidad, por ejemplo, de menos de 500 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados, o menos de 50 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

Tal como se da a conocer en el presente documento, los productos fotolíticos de MTXPG fluorescentes pueden producirse mediante la irradiación de los poliglutamatos de metotrexato. El término "producto fotolítico", tal como se usa en el presente documento, significa que una molécula que se produce mediante la escisión de los enlaces en un poliglutamato de metotrexato, que se excita electrónicamente mediante la radiación. El procedimiento de producción de un producto fotolítico se denomina fotólisis. La fotólisis de uno o más MTXPG para producir uno o más "productos fotolíticos de MTXPG" puede llevarse a cabo, por ejemplo, con luz UV, que es un término entendido en la técnica que incluye luz de cualquier longitud de onda en el intervalo de aproximadamente 200 a 400 nm. Se entiende además que cualquier fuente de luz que produce luz UV puede ser útil para irradiar los poliglutamatos de metotrexato en un método de invención que incluye, por ejemplo, una lámpara tal como una lámpara de arco o una lámpara halógena de cuarzo, o un láser. Tal como se demuestra en el ejemplo II, los productos fotolíticos de MTXPG fluorescentes se produjeron irradiando MTXPG con una lámpara UV de mercurio, que emite radiación en el intervalo de 225 a 275 nm con una salida pico a 254 nm. Se entiende que pueden irradiarse selectivamente los MTXPG con una longitud de onda particular en el intervalo de UV usando una fuente de luz apropiada, filtro óptico o la combinación de estos componentes según sus características ópticas conocidas.

En un método de la invención que implica detectar un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, al menos se irradia un MTXPG durante un periodo de tiempo apropiado para dar un producto fotolítico de MTXPG fluorescente. En realizaciones particulares, se pone en práctica un método de la invención irradiando al menos un MTXPG durante de 0,5 a 60 segundos, o durante de 0,5 a 15 segundos. Como ejemplos no limitativos, puede ponerse en práctica un método de la invención irradiando al menos un MTXPG durante de 0,1 a 100 segundos, de 0,2 a 60 segundos, de 0,5 a 60 segundos, de 0,5 a 45 segundos, de 0,5 a 30 segundos, de 0,5 a 20 segundos, de 0,5 a 15 segundos, de 0,5 a 10 segundos, de 1 a 20 segundos, de 1 a 10 segundos, de 2 a 20 segundos o de 2 a 10 segundos. Como ejemplos no limitativos adicionales, puede ponerse en práctica un método de la invención irradiando al menos un MTXPG durante de 0,5 a 6 segundos, de 0,5 a 5 segundos, de 0,5 a 4 segundos, de 1 a 6 segundos, de 1 a 5 segundos, de 1 a 4 segundos o de 2 a 4 segundos. En realizaciones particulares, se pone en práctica un método de la invención irradiando al menos un MTXPG durante de 0,5 a 60 segundos, de 0,5 a 15 segundos o de 2 a 4 segundos.

Tal como se da a conocer en el presente documento, la irradiación de los poliglutamatos de metotrexato durante tres segundos con una lámpara ultravioleta de mercurio de baja presión a 254 nm produjo productos fotolíticos de MTXPG fluorescentes con espectros de excitación que se superponen, fácilmente detectables, por ejemplo, tras la excitación con radiación UV con una longitud de onda de 274 nm y a una longitud de onda de emisión de 464 nm. Véase, por ejemplo, el ejemplo I y la figura 2B. Se entiende que puede variarse el tiempo de irradiación para producir el producto fotolítico de MTXPG fluorescente deseado que tiene las propiedades características que se desean para una aplicación particular. Un producto fotolítico fluorescente particular puede tener, por ejemplo, una o más propiedades características, tales como excitación de fluorescencia característica y máximos de picos de emisión, y niveles de intensidad de fluorescencia característicos que dependen, por ejemplo, del pH y la cantidad de acetonitrilo presente durante la detección.

La fotólisis de los poliglutamatos de metotrexato puede llevarse a cabo en presencia de peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) u otro peróxido. Como un ejemplo no limitativo, cuando se añade peróxido de hidrógeno durante la irradiación de MTXPG_{5}, la concentración final puede ser de aproximadamente el 0,03% o superior. En realizaciones particulares, la concentración final de peróxido de hidrógeno durante la fotólisis de MTXPG está en el intervalo del 0,05% al 1%, del 0,1% al 1%, del 0,1% al 0,5% o del 0,1% al 0,3%.

Un nivel de un poliglutamato de metotrexato particular en un extracto celular puede determinarse basándose en el nivel del producto fotolítico de MTXPG fluorescente correspondiente. Como un ejemplo, la cantidad y la concentración del producto fotolítico de MTX fluorescente puede determinarse basándose en la intensidad de fluorescencia del producto fotolítico tal como se ilustra en los ejemplos mencionados a continuación. Tal como se usa en el presente documento, el término "fluorescencia" significa una emisión de fotones en la región ultravioleta (UV), visible (VIS) o infrarroja (IR) del espectro, en respuesta a la excitación electrónica por la radiación. El término "fluorescencia", cuando se usa en referencia a un producto fotolítico de MTXPG, significa un producto fotolítico que emite fotones en la región UV, VIS o IR del espectro en respuesta a la excitación electrónica por la radiación. Por tanto, un producto fotolítico de MTXPG fluorescente es un producto fotolítico que se deriva de un poliglutamato de metotrexato que emite fotones en la región UV, VIS o IR del espectro en respuesta a la excitación electrónica por la radiación. Un producto fotolítico de MTXPG fluorescente puede caracterizarse, por ejemplo, como que emite fotones con un rendimiento cuántico de al menos 0,01 cuando se excita con la radiación en la disolución. En realizaciones particulares, un producto fotolítico de MTXPG fluorescente se caracteriza por un rendimiento cuántico de fluorescencia que es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o superior cuando se excita mediante la radiación en la disolución.

Una molécula fluorescente, tal como un producto fotolítico de MTXPG fluorescente, también puede caracterizarse con respecto a su longitud de onda de emisión máxima o longitud de onda de excitación máxima. En realizaciones particulares, un método de la invención implica detectar un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, que tiene una longitud de onda de excitación máxima en la región infrarroja, roja, naranja, amarilla, verde, azul, violeta o ultravioleta del espectro. En realizaciones adicionales, se pone en práctica un método de la invención detectando un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto que tiene una longitud de onda de emisión máxima en la región infrarroja, roja, naranja, amarilla, verde, azul, violeta o ultravioleta del espectro.

La fluorescencia puede detectarse en un método de la invención que usa cualquiera de una variedad de fuentes de excitación y detectores de emisión. La excitación de un producto fotolítico de MTXPG fluorescente puede conseguirse, por ejemplo, con una fuente de excitación tal como una lámpara o láser incluyendo, sin limitación, cualquiera de aquéllas descritas anteriormente con respecto a la fotólisis. La excitación a una longitud de onda particular o en un intervalo de longitud de onda particular puede conseguirse en un método de la invención que usa, por ejemplo, un láser que se ajusta a la longitud de onda deseada o una lámpara que tiene una salida que incluye el intervalo de longitud de onda deseado. Puede colocarse un filtro óptico apropiado entre la fuente de excitación y el producto fotolítico de MTXPG fluorescente para limitar aun más el intervalo de longitudes de onda que se ponen en contacto con el producto fotolítico de MTXPG fluorescente, si se desea. Tal como se muestra en la figura 2B y se explica en el ejemplo I, cada uno de los siete productos fotolíticos de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} fluorescentes tienen dos picos de excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm, incluyendo un pico de desde aproximadamente 240 nm hasta 300 nm, y un pico de desde aproximadamente 360 nm hasta 410 nm. En realizaciones particulares de la invención, un producto fotolítico de MTXPG fluorescente puede detectarse mediante la excitación a una longitud de onda en el intervalo de aproximadamente 24 0 nm a 420 nm, de aproximadamente 240 nm a 300 nm o de aproximadamente 360 nm a 410 nm. Si se desea, los métodos de la invención pueden incluir excitación a o cerca del pico de 274 nm o en un intervalo cerca de este pico incluyendo, por ejemplo, excitación a una longitud de onda en el intervalo de 250 nm a 300 nm o de 260 nm a 285 nm. La excitación a o cerca del pico de 385 nm o en un intervalo cerca de este pico también puede ser útil en un método de la invención incluyendo, por ejemplo, la excitación a una longitud de onda en el intervalo de 360 nm a 400 nm o de 375 nm a 395 nm.

La emisión puede detectarse a partir de un producto fotolítico de MTXPG fluorescente usando cualquiera de una variedad de detectores tales como, sin limitación, un tubo fotomultiplicador, un diodo, una red de diodos o una cámara con dispositivo acoplado por carga. Un detector que detecta luz a una longitud de onda particular o en un intervalo de longitud de onda particular puede ser útil en un método de la invención. Si se desea, puede colocarse un filtro óptico entre el producto fotolítico de MTXPG fluorescente y el detector para limitar el intervalo de longitudes de onda detectadas. Tal como se da a conocer en el presente documento, los productos fotolíticos de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} fluorescentes emiten desde aproximadamente 320 nm hasta 550 nm y tienen un pico de emisión primaria de desde aproximadamente 440 nm hasta 520 nm. En realizaciones particulares de la invención, la emisión desde un producto fotolítico de MTXPG fluorescente puede detectarse a una longitud de onda en el intervalo de aproximadamente 320 nm a 550 nm o de aproximadamente 440 nm a 520 nm. Si se desea, los métodos de la invención pueden incluir la detección de la emisión a o cerca del pico de 464 nm o en un intervalo cerca de este pico incluyendo, por ejemplo, la emisión a una longitud de onda en el intervalo de 430 nm a 510 nm o de 450 nm a 480 nm.

El contenido de una disolución que se usa para detectar un MTXPG resuelto, o un producto fotolítico del mismo, puede variarse, por ejemplo, con respecto al pH o al contenido en acetonitrilo. El pH al que un MTXPG, o un producto fotolítico del mismo, se detecta en un método de la invención puede estar en el intervalo de, por ejemplo, aproximadamente pH 2 a 8 o en el intervalo de aproximadamente pH 4 a 7. En realizaciones particulares, un MTXPG, o un producto fotolítico del mismo, puede detectarse, por ejemplo, a pH 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 ó 7. La cantidad de acetonitrilo presente durante la detección del MTXPG, o un producto fotolítico del mismo, puede estar en el intervalo de, por ejemplo, aproximadamente el 0% al 20% o de aproximadamente el 10% al 20%. En realizaciones particulares, la cantidad
de acetonitrilo presente puede ser, por ejemplo, del 5%, 10% o 20%, o del 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13% o 13,5%.

También puede detectarse un poliglutamato de metotrexato resuelto en un método de la invención basándose en una o más de otras propiedades características observables del poliglutamato de metotrexato incluyendo, por ejemplo, las propiedades de absorción de luz visible o ultravioleta, la fluorescencia, las propiedades electroquímicas o la masa. Como ejemplos no limitativos, puede detectarse un MTXPG resuelto con espectroscopia de absorción UV/Vis, fluorimetría, detección electroquímica o espectrometría de masas. Los expertos en la técnica conocerán o podrán determinar un medio apropiado para detectar poliglutamatos de metotrexato basándose en la exactitud y la sensibilidad deseadas, y en presencia de sustancias potencialmente interferentes en el extracto celular particular que está analizándose.

Los niveles intracelulares suficientes de poliglutamatos de metotrexato pueden asociarse con la eficacia, y niveles más altos pueden asociarse con la toxicidad. Determinando el nivel intracelular de uno o más poliglutamatos de metotrexato, los métodos de la invención pueden ser útiles para ajustar la cantidad o frecuencia del tratamiento con metotrexato con el fin de que los poliglutamatos de metotrexato permanezcan dentro del intervalo terapéutico, de modo que puedan evitarse efectos secundarios tóxicos indeseables mientras se logra la eficacia.

Por tanto, la presente invención es útil para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato administrado a un ser humano seleccionando un fármaco o una dosificación que debe administrarse posteriormente al ser humano basándose en el nivel del MTXPG resuelto. Una dosificación de metotrexato administra al ser humano puede alterarse, por ejemplo, reduciendo o aumentando una dosificación de metotrexato administrada posteriormente al ser humano, o alterando una dosis de ácido fólico, o un derivado del mismo, administrado posteriormente al ser humano.

Los extractos celulares útiles en un método de la invención incluyen, pero no se limitan a, extractos de glóbulos rojos; extractos de leucocitos; extractos de células de seres humanos sometidos a tratamiento con metotrexato; y extractos de células de seres humanos que tienen cualquiera de una variedad de enfermedades autoinmunitarias o cánceres. Los extractos celulares útiles en la invención incluyen, sin limitación, los derivados de un ser humano que tiene una enfermedad autoinmunitaria tal como artritis, artritis reumatoide, poliartritis, lupus eritematoso sistémico o psoriasis, o de un ser humano que tiene cáncer. En una realización, un método de la invención tiene una sensibilidad de menos de 500 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados. En otra realización, un método de la invención tiene una sensibilidad de menos de 50 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

Cualquiera de una variedad de tipos de extractos celulares tales como los descritos anteriormente en el presente documento puede ser útil en un método de la invención. Los extractos celulares pueden prepararse a partir de cualquier célula o tejido que es indicativo de la eficacia o toxicidad del tratamiento con metotrexato, tal como una célula o tejido enfermo, una célula diana para el tratamiento con metotrexato o una célula que es representativa de la cantidad de fármaco en las células enfermas. Tal como se usa en el presente documento, el término "célula diana para el tratamiento con metotrexato" significa una célula para la que se desea la captación de metotrexato para tratar una enfermedad o un estado. Como ejemplos no limitativos, los extractos celulares pueden prepararse a partir de glóbulos rojos, leucocitos, neutrófilos, células cancerosas y biopsias de tejido.

Una dosificación de metotrexato administrada al ser humano puede alterarse posteriormente basándose en el nivel determinado de poliglutamatos de metotrexato. Cuando el nivel determinado de uno o más poliglutamatos de metotrexato está por debajo de un intervalo terapéutico, puede aumentarse la dosis o la frecuencia de metotrexato administrado al ser humano. De manera similar, cuando el nivel determinado de uno o más poliglutamatos de metotrexato está por encima de un intervalo terapéutico, la dosis o la frecuencia de metotrexato administrado al ser humano puede reducirse para evitar la toxicidad. Un intervalo terapéutico puede determinarse a partir de la información de dosis-respuesta para un estado o una enfermedad particular y, si se desea, para la edad, género o estado médico del ser humano que está siendo tratado. Como ejemplo, un nivel de un MTXPG determinado en un extracto de glóbulos rojos puede compararse con la información de dosis-respuesta, correlacionando los niveles de poliglutamato de metotrexato en los glóbulos rojos con la reducción de un síntoma de la artritis. También puede obtenerse información de dosis-respuesta usando procedimientos clínicos bien conocidos, pertinentes para el estado patológico particular.

En una realización particular de la invención, un extracto celular útil en un método de la invención para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato puede obtenerse a partir de una célula no diana para el tratamiento con metotrexato. Tal como se usa en el presente documento, el término "célula no diana para el tratamiento con metotrexato" significa una célula para la que no se desea la captación de metotrexato. Una célula no diana de este tipo puede ser una célula normal que es sensible a los niveles de MTX o que está predispuesta a captar el metotrexato administrado mediante una vía particular. Un experto en la técnica entiende que un nivel de MTXPG en extractos celulares de las células no diana puede ser representativo del nivel en las células diana y, por tanto, puede ser útil para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato.

El tratamiento con metotrexato puede provocar una variedad de efectos adversos que imitan la deficiencia del folato incluyendo, por ejemplo, intolerancia gastrointestinal, estomatitis, alopecia y citopenia. Muchos efectos adversos del tratamiento con metotrexato son dependientes de la dosis y pueden aliviarse mediante la administración de dosis de compensación de ácido fólico, ácido folínico o un análogo de ácido fólico. Por consiguiente, un método de la invención para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato puede incluir además, si se desea, alterar la dosis de folato o de un análogo de ácido fólico administrado posteriormente al ser humano basándose en el nivel determinado de poliglutamatos de metotrexato intracelular. Los análogos de ácido fólico en la invención incluyen, sin limitación, ácido fólico, ácido dihidrofólico, ácido tetrahidrofólico, ácido 5-formil-tetrahidrofólico y ácido 10-metil-tetrahidrofólico.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la presente invención.

Ejemplo I Un sistema de HPLC adecuado para la detección de poliglutamatos de metotrexato en muestras de individuos sometidos a tratamiento con metotrexato a dosis bajas

Este ejemplo describe un sistema cromatográfico, las condiciones y los reactivos adecuados para la separación de poliglutamatos de metotrexato en muestras de células.

A. Preparación de los reactivos

Se adquirió ácido 4-amino-10-metilpteroilglutámico (metotrexato; MTXPG_{1}) de SIGMA (St. Louis, MO). Se adquirieron ácido 4-amino-10-metilpteroildi-glutámico (MTXPG_{2}), ácido 4-amino-10-metilpteroiltri-glutámico
(MTXPG_{3}), ácido 4-amino-10-metilpteroiltetra-glutámico (MTXPG_{4}), ácido 4-amino-10-metilpteroilpenta-glutámico (MTXPG_{5}), ácido 4-amino-10-metilpteroilhexa-glutámico (MTXPG_{6}) y ácido 4-amino-10-metilpteroilhepta-glutámico (MTXPG_{7}) como sales de amonio de Schircks Laboratories (Jona, Suiza). Se adquirió acetonitrilo de calidad para HPLC de Fischer Chemicals (Fair Lawn, NJ); el peróxido de hidrógeno (30%, v/v), el hidróxido de amonio y el ácido acético glacial se obtuvieron de Sigma.

El metotrexato y cada uno de los poliglutamatos de metotrexato purificados se disolvieron en hidróxido de potasio 0,1 N. Tras la disolución, se confirmó la concentración de los patrones usando un espectrofotómetro Hitachi U-2000 y los coeficientes de extinción molar UV (\varepsilon256 nm = 23.000). Se diluyeron los patrones de poliglutamato de metotrexato purificado individuales hasta una concentración final de 100 \muM en agua y se almacenaron a -70ºC, a los que eran estables durante al menos 6 meses.

B. Sistema cromatográfico y separación

El cromatógrafo de líquidos era un sistema ChemStation de HPLC Agilent 1100 compuesto por una bomba cuaternaria, un controlador del sistema, un autoinyector, un enfriador de muestras mantenido a 4ºC y un fluorómetro. Los cromatogramas se adquirieron y analizaron en un ordenador Hewlett-Packard Vector XA. Se detectaron los poliglutamato de metotrexato con la derivatización posterior a la columna usando una unidad de reactor fotoquímico (Aura Industries; Nueva York, NY), equipado con una lámpara ultravioleta alargada de mercurio de baja presión de 254 nm y que contiene un sistema de tubos de TEFLON^{tm} con un diámetro externo de 1/16'' (diámetro interno de 0,25 mm) ensamblado como una bobina reticulada y conectada en línea entre la columna analítica y el fluorómetro. La bobina reticulada se extendió longitudinalmente a través de la unidad del reactor fotoquímico; todo excepto una parte de la lámpara alargada se tapó con papel metalizado de modo que se irradió sólo un segmento de la bobina reticulada. En particular, la lámpara se enmascaró de tal manera que sólo 1 metro de la bobina se irradió con la lámpara, que a una tasa de flujo de 1 ml/min. correspondía a 3 segundos de irradiación. Los productos fotolíticos de poliglutamato de metotrexato se midieron a una longitud de onda de excitación de 274 nm y una longitud de onda de emisión de 464 nm, a menos que se indique lo contrario. Los tiempos de retención descritos en el presente documento se midieron a partir del tiempo de inyección hasta el tiempo de detección en el fluorómetro de la unidad posterior al reactor.

La separación mediante HPLC se llevó a cabo en una columna C18 X Terra MS 18 de 25 cm x 4,6 mm (Waters; Milford, MA), 5 \mum de tamaño de partícula, protegida por una columna de protección. El sistema también incluía una precolumna C18 que se cambió cada 200 inyecciones. La fase móvil A consistía en acetato de amonio (10 mM) a pH 6,50 con peróxido de hidrógeno (30% v/v) a una concentración final del 0,2%. La fase móvil B consistía en acetonitrilo. Las muestras se eluyeron a una tasa de flujo de 1 ml/minuto, con un gradiente lineal de 20 minutos de desde el 2 hasta el 12,5% de acetonitrilo. Tras 20 minutos, la fase móvil se devolvió al 100% de fase móvil A y volvió a equilibrarse durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron a 4ºC y se inyectaron cada 30 minutos con un autoinyector. La columna analítica no mostró deterioro de su rendimiento hasta las 500 inyecciones.

Se analizaron los productos fotolíticos de poliglutamato de metotrexato a una longitud de onda de excitación de 274 nm y una longitud de onda de emisión de 464 nm. La identificación espectral usando los espectros de excitación del producto fotolítico posterior a la columna de poliglutamato de metotrexato en los extractos de glóbulos rojos se llevó a cabo mediante la comparación con los espectros de excitación del producto fotolítico posterior a la columna de metotrexato en agua.

C. Calibración y preparación de las curvas patrón

La calibración y las curvas patrón se realizaron esencialmente tal como sigue. Se prepararon curvas patrón complementando cantidades conocidas de MTXPG_{1}, MTXPG_{2}, MTXPG_{3}, MTXPG_{4}, MTXPG_{5}, MTXPG_{6} y MTXPG_{7} purificados a un hemolizado preparado de un conjunto de glóbulos rojos aislados de donantes sanos (Banco de sangre; San Diego, CA). Estos patrones con glóbulos rojos "complementados" contenían concentraciones de poliglutamato de metotrexato que oscilan desde 5 hasta 50 nmol/l de glóbulos rojos empaquetados. Las curvas patrón se ajustaron mediante regresión lineal usando un área de pico frente a la concentración.

D. Precisión, exactitud y recuperación

La precisión, la exactitud y la recuperación de los ensayos se determinaron tal como sigue. La exactitud y la precisión en un día y entre días se determinaron analizando concentraciones altas y bajas de poliglutamato de metotrexato complementados con cantidades conocidas en los hemolizados de glóbulos rojos. Los análisis en un día se llevaron a cabo con 10 duplicados complementados, y la evaluación entre días se evaluó con 5 duplicados en 5 días diferentes. La exactitud se calculó como el porcentaje de error de las concentraciones medidas de las muestras complementadas en relación con la concentración diana (concentración medida/concentración diana x 100%). Se determinó la precisión determinando el coeficiente de variación. Las recuperaciones para los poliglutamatos de metotrexato se determinaron comparando la altura del pico de las muestras de glóbulos rojos complementadas con aquéllas de las muestras preparadas con agua a las mismas concentraciones dentro del intervalo validado.

E. Tratamiento de las muestras de los pacientes

Se extrajeron muestras de sangre (5 ml) de pacientes que recibían tratamiento con metotrexato a dosis bajas, tras un consentimiento informado por escrito. Se centrifugaron las muestras durante 10 minutos para separar el plasma y la capa leucocítica de los glóbulos rojos. Se lavaron los glóbulos rojos con dos volúmenes de solución salina y luego se almacenaron a -70ºC hasta el análisis.

Se homogenizó una alícuota de 100 \mul de hemolizado de GR brevemente con 150 \mul de agua en un tubo eppendorf antes de la adición de 25 \mul de ácido perclórico al 70% a la mezcla, agitando con vórtex durante 10 segundos y centrifugando durante 5 minutos. Se inyectó un volumen total de 80 \mul de sobrenadante de glóbulos rojos directamente en el sistema de HPLC.

Los resultados se expresaron como nmol/l de glóbulos rojos empaquetados, y los resultados de los pacientes se expresaron como un promedio más o menos el error estándar de la media (\pmEEM). La identificación espectral del producto fotolítico posterior a la columna de poliglutamato de metotrexato se llevó a cabo mediante la comparación de los espectros de excitación del producto fotolítico posterior a la columna del metotrexato purificado en agua.

Ejemplo II Cuantificación de la concentración de poliglutamato de metotrexato en extractos de glóbulos rojos mediante fluorometría de HPLC con derivatización posterior a la columna

Este ejemplo describe la determinación de la concentración intracelular de poliglutamatos de metotrexato en pacientes tratados con tratamiento con metotrexato a dosis bajas.

A. Separación y detección de metotrexato y poliglutamatos de metotrexato en muestras celulares

En la figura 2A se presenta un cromatograma de un patrón que contiene los siete poliglutamatos de metotrexato a una concentración final de 25 nmol/l cada uno en agua. Los tiempos de retención de los poliglutamatos de metotrexato individuales en el sistema de HPLC descrito anteriormente eran los siguientes: MTXPG_{7}: 12,5 minutos; MTXPG_{6}: 13,0 minutos; MTXPG_{5}: 13,7 minutos; MTXPG_{4}: 14,5 minutos; MTXPG_{3}: 15,7 minutos; MTXPG_{2}: 17,5 minutos; y MTXPG_{1}: 19,8 minutos. Tal como se muestra en la figura 2B, en la que los espectros de excitación de los productos fotolíticos de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} se superponen, los espectros de los diferentes productos fotolíticos son esencialmente idénticos. Tal como se muestra además en la figura 2B, los productos fotolíticos de MTXPG_{1} a MTXPG_{7} presentaban una longitud de onda de excitación máxima a 274 nm.

En las figuras 3A y B se muestran cromatogramas típicos de los extractos de glóbulos rojos control o extractos de glóbulos rojos complementados con cantidades conocidas de poliglutamatos de metotrexato purificados. Los hemolizados control (figura 3A) y complementados (figura 3B) se homogeneizaron y trataron con ácido perclórico tal como se describió anteriormente. Las curvas patrón demostraron una relación lineal entre el área del pico y la concentración, con coeficientes de correlación mayores de 0,995 para los siete analitos.

La exactitud y la precisión en un día y entre días del ensayo se resumen en la tabla I. Los coeficientes de variación para la precisión en un día y entre días eran menores del 15% a concentraciones altas y bajas de los analitos. La exactitud oscilaba desde el 88 hasta el 112% para los siete MTXPG. Las recuperaciones de extracción promedio fueron las siguientes: el 60% de MTXPG_{1}; el 66% de MTXPG_{2}; el 65% de MTXPG_{3}; el 66% de MTXPG_{4}; el 79% de MTXPG_{5}; el 80% de MTXPG_{6} y el 60% de MTXPG_{7}. Los límites de detección, definidos como tres veces la razón señal-ruido, fueron de 2 nmol/l de glóbulos rojos empaquetados. El límite de cuantificación para los siete poliglutamatos de metotrexato fue de 5 nmol/l de glóbulos rojos empaquetados.

B. Detección de metotrexato y poliglutamatos de metotrexato en muestras de glóbulos rojos de pacientes

Se obtuvieron muestras de glóbulos rojos de 14 pacientes con poliartritis que recibieron metotrexato a dosis bajas semanalmente durante al menos tres meses. Las dosis semanales de metotrexato oscilaron desde 10,0 hasta 25,0 mg con una mediana de la dosis de 16,2 mg por semana. La figura 4A muestra un cromatograma típico de un paciente que recibió 17,5 mg/semana de metotrexato. La figura 4B muestra que los espectros de excitación de los productos fotolíticos de poliglutamato de metotrexato resueltos de la muestra de un paciente eran muy similares a los espectros de los productos fotolíticos de metotrexato en agua.

En los 14 pacientes que recibieron de 10,0 a 25,0 mg/semana de metotrexato, la concentración de poliglutamato de metotrexato total osciló desde 69 hasta 221 nmol/l de GR, con una mediana de 135 nmol/l de GR (véase la figura 5). MTXPG_{6} y MTXPG_{7} no fueron detectados (<5 nmol/l) en todas las 14 muestras de pacientes, mientras que MTXPG_{5} se detectó en 8 de 14 de las muestras de pacientes. La concentración de poliglutamato de cadena larga promedio total (MTXPG_{4} + MTXPG_{5}) fue de 31\pm5,7 nmol/l y representó un promedio del 23% del total de poliglutamatos de metotrexato. MTXPG_{3} fue el principal poliglutamato de metotrexato detectado en las muestras de los pacientes, representando un promedio del 55% del total de poliglutamatos de metotrexato.

El término "que comprende" tal como se usa en el presente documento pretende ser abierto, incluyendo no sólo los elementos referidos, sino abarcando además cualquier elemento adicional.

Claims

1. Método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato (MXTPG) en un extracto celular, caracterizado por:

(a): la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución para resolver al menos un MTXPG;

(b): irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto; y

(c): detectar dicho al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, determinando de ese modo el nivel de dicho MTXPG,

en el que la detección de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto se produce sin fraccionamiento de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto a partir de otras especies de MTXPG.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha precipitación de material proteínico es precipitación con ácido perclórico.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía de líquidos de alta resolución se lleva a cabo en una columna de fase inversa.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía de líquidos de alta resolución se lleva a cabo en una columna de fase inversa C18 con un tampón acetato de amonio/acetonitrilo.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente tiene dos picos de excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm, incluyendo un pico de desde 240 nm hasta 300 nm, y un pico de desde 360 nm hasta 410 nm, y un pico de emisión en el intervalo de 440 nm a 520 nm.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende irradiar con UV dicho al menos un MTXPG resuelto.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha irradiación con UV utiliza radiación que tiene una longitud de onda en el intervalo de 225 nm a 275 nm.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha irradiación con UV utiliza radiación que tiene una longitud de onda de 254 nm.

9. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo irradiando dicho al menos un MTXPG resuelto en un disolvente que tiene del 0,05% al 1% de H_{2}O_{2}.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la etapa (b) se lleva a cabo irradiando dicho al menos un MTXPG resuelto en un disolvente que tiene del 0,1% al 0,3% de H_{2}O_{2}.

11. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto durante de 0,5 a 60 segundos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la etapa (b) comprende irradiar dicho al menos un MTXPG durante de 0,5 a 15 segundos.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 240 nm a 300 nm.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación con radiación UV a 274 nm.

16. Método según la reivindicación 13, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 360 nm a 410 nm.

17. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión en el intervalo de 320 nm a 550 nm.

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18. Método según la reivindicación 17, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión en el intervalo de 440 nm a 500 nm.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 464 nm.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación con radiación UV a 274 nm y a una longitud de onda de emisión de 464 nm.

21. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de células humanas.

22. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato.

23. Método según la reivindicación 1, en el que el dicho extracto celular es de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato a dosis bajas.

24. Método según la reivindicación 22 ó 23, que comprende seleccionar un fármaco o una dosificación que debe administrarse posteriormente a dicho ser humano basándose en dicho nivel de MTXPG.

25. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar un nivel de MTXPG_{3}, MTXPG_{4} o MTXPG_{5}.

26. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar un nivel de cada uno de MTXPG_{1} a MTXPG_{7}.

27. Método según la reivindicación 24, que comprende alterar una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

28. Método según la reivindicación 27, que comprende reducir una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

29. Método según la reivindicación 27, que comprende aumentar una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

30. Método según la reivindicación 24, que comprende alterar una dosis de ácido fólico, o un derivado del mismo, administrada posteriormente a un ser humano.

31. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de glóbulos rojos.

32. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de leucocitos.

33. Método según la reivindicación 1, que puede detectar menos de 500 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

34. Método según la reivindicación 1, que puede detectar menos de 50 nmol de cada especie de MXTPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

35. Método según la reivindicación 22 ó 23, en el que dicho ser humano tiene una enfermedad autoinmunitaria.

36. Método según la reivindicación 35, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis.

37. Método según la reivindicación 35, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, poliartritis, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

38. Método según la reivindicación 22 ó 23, en el que dicho ser humano tiene cáncer.

39. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende fluorimetría.

40. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende espectrofotometría

41. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende espectrometría de masas.