ES2335167B1 - Uso de la metaloproteinasa de matriz-10 (mmp10) para tratamientos tromboliticos. - Google Patents
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Abstract
Uso de la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) para tratamientos
trombolíticos.
La presente invención se refiere al uso de la
metaloproteinasa de matriz MMP-10 en la preparación
de una composición farmacéutica útil para la terapia trombolítica,
pudiendo además contener dicha composición un activador del
plasminógeno. Adicionalmente, la presente invención se refiere a
dicha composición farmacéutica para el tratamiento de afecciones
trombóticas.
Description
Uso de la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) para tratamientos
trombolíticos.
Esta invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que incluyen la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10), y más
particularmente una combinación de MMP-10 y un
activador del plasminógeno, y a su uso para el tratamiento y
terapia trombolítica.
El sistema hemostático es el encargado de
mantener la fluidez circulatoria y prevenir la hemorragia en
respuesta a una agresión vascular. La hemostasia fisiológica está
controlada tanto por los mecanismos que promueven la coagulación y
la formación de fibrina, como por los que favorecen su degradación
o fibrinolisis. Una activación excesiva de la coagulación o un
defecto de la fibrinolisis desembocan en la formación de coágulos
que obstruyen los vasos sanguíneos (trombosis intravascular),
causando isquemia y necrosis. Sin embargo, una situación general de
hiperfibrinolisis favorecerá la aparición de hemorragias.
Las enfermedades cardiovasculares de naturaleza
aterotrombótica constituyen hoy la principal causa de
morbi-mortalidad. Dentro de este grupo de
enfermedades, los procesos trombóticos constituyen el principal
mecanismo desencadenante de los eventos cardiovasculares agudos de
mayor relevancia clínica, como el infarto agudo de miocardio (IM) o
el accidente cerebrovascular (ictus).
En consecuencia, todas las estrategias para el
tratamiento de accidentes cardiovasculares, y en general de los
eventos trombóticos, deben promover necesariamente la
recanalización rápida de la luz arterial obstruida por el trombo,
para restaurar el flujo sanguíneo hacia los tejidos y evitar así un
daño mayor. Es lo que se denomina comúnmente como terapia
trombolítica.
Puesto que la fibrinolisis es el proceso
bioquímico subyacente a la trombolisis, la terapia trombolítica
busca en primer lugar favorecer la degradación de la red de fibrina
que mantiene unido el coágulo.
Puesto que la plasmina es la enzima que cataliza
la lisis y la degradación de la fibrina, el primer objetivo para
lograr una rápida disolución del coágulo es maximizar la generación
de plasmina.
Con este propósito, a partir de 1980 se
introdujo el uso de los activadores del plasminógeno, capaces de
activar la conversión del plasminógeno (proenzima inactiva) en
plasmina activa: activador tisular del plasminógeno (tPA),
uroquinasa (uPA) u otros agentes similares.
Baker [Clin. Appl. Trombosis/Hemostasis, 2002;
8:291-314] realiza una revisión del estado de la
técnica en terapia trombolítica y de los agentes trombolíticos en
uso o desarrollo, su aplicación clínica, así como ventajas e
inconvenientes. En este documento Baker formula también las
características que un agente trombolltico ideal debería cumplir:
1) trombolisis rápida, para la pronta restauración del flujo
arterial o venoso; 2) especificidad por la fibrina, para que la
fibrinolisis se limite a las áreas de trombosis aguda con una
fibrinolisis sistémica reducida; 3) duración sostenida de su
acción; 4) especificidad por el trombo, para evitar efectos sobre
el fibrinógeno, otras proteínas de la coagulación y para no alterar
la hemostasis primaria; 5) ausencia de efectos secundarios; y 6)
bajo coste.
En el caso del infarto agudo de miocardio y de
la isquemia cerebrovascular aguda (ictus) el éxito del tratamiento
trombolítico conduce a un incremento en la supervivencia de los
pacientes y a una mejor recuperación de la función del tejido
isquémico [White HD et al.; N. Engl. J. Med., 1987;
317:850-855]; [Suwanwela N and Koroshetz WJ; Annu.
Rev. Med., 2007; 58:89-106]. Desafortunadamente, el
tratamiento fibrinolítico tiene fracasos y efectos secundarios.
Casi el 40% de los pacientes con infarto agudo
de miocardio no responden al tratamiento fibrinolítico y no
consiguen una óptima recanalización de la arteria obstruida por el
trombo [Armstrong PW and Collen D; Circulation, 2001;
103:2862-2866].
Para solucionar este problema actualmente, en
lugar de la trombolisis farmacológica, se utiliza la angioplastia
percutánea primaria como tratamiento de reperfusión, más eficaz que
el tratamiento trombolítico en términos de reducción de mortalidad,
reinfarto y hemorragia. Sin embargo en muchos casos no se puede
utilizar la angioplastia (no disponibilidad de laboratorios de
hemodinámica o distancia geográfica no asumible) y es entonces
cuando se realiza tratamiento trombolítico. Por consiguiente, es
deseable el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que
permitan mejorar la eficacia del tratamiento trombolítico, por
ejemplo programas de tratamiento fibrinolítico prehospitalario,
nuevos agentes trombolíticos (tenecteplase), o nuevas combinaciones
farmacológicas (por ejemplo, reducir el agente fibrinolítico a la
mitad de la dosis y añadir un agente bloqueante del receptor
plaquetar GP IIb/IIIa) [Brouwer MA et al.; Heart, 2004;
90:581-588]. Además existe una considerable
mortalidad asociada con el tratamiento fibrinolítico debido a
complicaciones hemorrágicas, sobre todo hemorragia del sistema
nervioso central y hemorragias mayores, con una incidencia que
oscila entre el 2 y 14%.
En el caso de la isquemia cerebrovascular aguda
el tratamiento trombolítico con tPA recombinante (tPA) en las tres
primeras horas siguientes al comienzo de los síntomas es el único
esquema que ha demostrado alguna eficacia. Desafortunadamente en el
25-30% de los casos el tratamiento fracasa, el
trombo no se lisa y la arteria bloqueada no se permeabiliza.
Además, el tratamiento con tPA presenta un porcentaje importante de
complicaciones hemorrágicas (hasta el 5% cursan con hemorragia
sintomática) y muchos médicos temen esta complicación, lo que
origina que la gran mayoría de pacientes que podrían beneficiarse
de este tratamiento no lo reciban. Otro problema asociado a la
administración de tPA, potencialmente más grave que el riesgo
hemorrágico, es la toxicidad sobre el sistema nervioso central que
muchas veces es la responsable de su fracaso terapéutico [Cheng T
et al.; Nat. Med., 2006; 12:1278-1285]. Por
lo tanto, reducir el riesgo hemorrágico de la administración de tPA
podría cambiar la percepción de la seguridad de este fármaco y
aumentar su uso. En consecuencia, sigue siendo necesaria la
selección de agentes y combinaciones terapéuticas que permitan
reducir la toxicidad del tPA, bien directamente o indirectamente,
disminuyendo la dosis necesaria para tratar el ictus.
Puesto que existen otras enzimas diferentes a la
plasmina que pueden degradar directamente el fibrinógeno y la
fibrina, también se está investigando su potencial uso para el
tratamiento trombolítico. Entre estas enzimas se incluyen proteasas
endógenas de leucocitos (elastasa y catepsina G), proteasas de
venenos de serpientes, o de sanguijuelas, o de algunas
bacterias.
En EP1060747 se describe el uso de
metaloproteinasas fibrinolíticas que exhiben una actividad
significativa para cortar proteolíticamente y degradar la fibrina y
el fibrinógeno. Entre estas metaloproteinasas fibrinolíticas se
incluyen la MMP-2 (gelatinasa A), la
MMP-3 (estromelisina 1), MMP-7
(matrilisina), MMP-9 y muy particularmente la
metaloproteinasa de membrana MMP-MT1. Meses más
tarde, Bini y colaboradores recogen y amplían estos mismos
hallazgos [Biochemistry, 1999; 38: 13928-13936]. Sin
embargo, ni en estos ni en otros trabajos posteriores se aportan
datos sobre la eficacia de estas metaloproteinasas fibrinolíticas
en la lisis y degradación de la fibrina que forma los coágulos,
bien sea para obtener una más rápida disolución del coágulo, o bien
sea proporcionando una mayor selectividad para la degradación de
la fibrina en el coágulo respetando el fibrinógeno sistémico.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar composiciones y combinaciones terapéuticas
alternativas para el tratamiento trombolítico, que favorezcan la
lisis de los coágulos mediante una degradación selectiva de la
fibrina, y que ayuden a minimizar los efectos adversos asociados a
otros tratamientos trombolíticos (hemorragias, toxicidad,
etc.).
Figura 1. Ensayo de turbidimetría del plasma
recalcificado expresado como los valores de absorbancia a 405 nm
frente al tiempo que dura el experimento en minutos. A: La
gráfica recoge las diferencias en la formación del coágulo
(absorbancia máxima) del plasma sólo (control) o en presencia de
MMP-10 (200 nM) ó MMP-3 (200 nM).;
B: La gráfica representa la formación y lisis del coágulo de
fibrina del plasma recalcificado en presencia de los activadores
del plasminógeno tPA (30 U/ml) y uPA (135 U/ml) solos, o combinados
con MMP-10 (200 nM) y también en presencia de una
dosis equivalente de la MMP-3 (200 nM) combinada
con tPA (30 U/ml).
Figura 2. Placa de fibrina polimerizada en la
que se muestran las áreas de lisis producidas por el tPA (1 U/ml)
y la MMP-10 (200 nM) solas o añadidas
conjuntamente.
Figura 3. Ensayo de turbidimetría que ilustra la
diferencia en el tiempo de lisis del coágulo de fibrina con
distintas dosis de tPA (20, 25 y 30 U/ml). La combinación de
MMP-10 (200 nM) con tPA (20 U/ml) acorta el tiempo
de lisis en relación al activador solo.
Figura 4. Ensayo de actividad de la
MMP-10 (100 nM) en plasma con un sustrato
fluorescente de las estromelisinas. La concentración de anticuerpo
monoclonal (MAb) que inhibe la actividad de la
MMP-10 en plasma se determinó mediante la reducción
en la pendiente en la formación del sustrato. Como control se
utilizó un anticuerpo control de isotipo (IgG).
Figura 5. Ensayo de turbidimetría del plasma
recalcificado con MMP-10 (200 nM) en presencia o
ausencia de un anticuerpo monoclonal (MAb) que inhibe la actividad
de la MMP-10, y de un anticuerpo control de isotipo
(IgG).
Figura 6. Placa de fibrina ilustrando las
diferencias en el área de lisis producida por el tPA (1 U/ml) y la
MMP-10 (200 nM) en presencia o ausencia de un
anticuerpo monoclonal que inhibe la actividad de la
MMP-10 (MAb) y el anticuerpo control de isotipo
(IgG).
La presente invención se refiere en primer lugar
al uso o empleo de la metaloproteinasa de matriz-10
(MMP-10) en la preparación de un medicamento para
tratamiento y terapia trombolitica.
La MMP-10 ó
estromelisina-2 se localiza en el cromosoma 11 y la
expresan diversos tipos celulares como las células endoteliales,
monocitos y fibroblastos [Madlener M and Werner S; Gene, 1997;
202:75-81]. Se sabe que puede ser activada por
plasmina, calicreína, triptasa, elastasa y catepsina G y puede
degradar un amplio rango de sustratos de la matriz extracelular,
como agrecano, elastina, fibronectina, gelatina, laminina,
tenascina-C, vitronectina y colágenos tipo II, III,
IV, IX, X, XI. Además, la MMP-10 puede activar
otras metaloproteinasas de matriz, como la
proMMP-1, -3, -7, -8 y -9 [Nakamura H et
al.; Eur. J. Biochem., 1998; 253:67-75].
Asimismo es conocido que la
MMP-10 participa en diversos procesos fisiológicos,
como el crecimiento óseo o la cicatrización de heridas. Además, se
halla sobreexpresada en córneas de pacientes con retinopatía
diabética y se ha relacionado con algunos tipos de carcinomas, así
como con tumores linfoides. Diversos estudios in vitro han
demostrado que, en cultivos de queratinocitos, la expresión de
MMP-10 puede inducirse tanto por factores de
crecimiento (factor de crecimiento epidérmico, de queratinocitos o
TGF-beta), como por citocinas proinflamatorias
(TNF-alfa, IL-1beta) [Rechardt O
et al.; J. Invest. Dermatol., 2000;
115:778-787]; [Li de Q et al.; Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44:2928-2936].
\vskip1.000000\baselineskip
Igualmente en divulgaciones anteriores a esta
invención se ha descrito que la MMP-10:
- puede constituir un biomarcador inflamatorio
de riesgo vascular [Montero I et al.; J. Am. Col. Cardiol.,
2006; 47:1369-1378] [Orbe J et al.; J.
Thromb. Haemost.; 2007; 5:91-97];
- se induce en células endoteliales que están
formando capilares en matrices de colágeno 3D y participa en la
regresión de la formación de capilares mediante la activación de la
MMP-1 [Saunders WB et al.; J. Cell Sci.,
2005; 118:2325-2340]; y que
- juega un papel fundamental en el mantenimiento
de las uniones intracelulares que preservan la integridad vascular
en los procesos de remodelado y angiogénesis [Chang S et
al.; Cell, 2006; 126:321-334].
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención se ha ensayado el
efecto de la MMP-10 y de la MMP-3
en la formación y lisis de coágulos sobre plasma humano, así como
en otros modelos in vitro de degradación de fibrina
polimerizada.
Los inventores han podido comprobar que la
MMP-10 no tiene una actividad trombolítica directa
y que no es capaz de degradar por si misma el fibrinógeno o la
fibrina. Han comprobado también que en presencia de agentes
activadores de la trombolisis, particularmente activadores del
plasminógeno, la MMP-10 favorece la disolución de
los coágulos de fibrina y reduce el tiempo de lisis. La
MMP-10 actúa por tanto como un facilitador o
adyuvante de la acción trombolítica de otros activadores de la
trombolisis.
Por el contrario, una metaloproteinasa de matriz
fibrinolítica como la MMP-3, con actividad
proteolítica directa sobre la fibrina y el fibrinógeno, no reduce
los tiempos de lisis del coágulo que por sí solos proporcionan los
activadores de la trombolisis.
En el contexto de la invención se entiende por
terapia trombolítica la que, en situaciones clínicas de isquemia
de origen trombótico, busca la reperfusión o restauración del flujo
sanguíneo mediante la lisis y rápida disolución de los coágulos que
obstaculizan la circulación y comprometen la función orgánica.
Estas situaciones clínicas incluyen en particular la terapia
trombolítica en el infarto agudo de miocardio, en las trombosis
cerebrales (más particularmente el infarto cerebral agudo o ictus),
así como otros tromboembolismos venosos (por ejemplo embolismo
pulmonar o trombosis venosa profunda) y trombosis arterial
periférica.
De un modo más particular la invención se
refiere al uso o empleo de la MMP-10 y de un
activador del plasminógeno en la preparación de un medicamento o
composición farmacéutica para tratamiento y terapia trombolítica,
mediante administración simultánea, separada o secuencial.
En el contexto de la invención, un activador del
plasminógeno es un compuesto que activa la conversión del
plasminógeno inactivo en plasmina, mediante la ruptura del enlace
peptídico entre Arg560 y Va1561 del plasminógeno. En particular se
incluyen entre estos activadores del plasminógeno: la uroquinasa
(uPA), el activador tisular del plasminógeno (tPA), la
estreptoquinasa y la estafiloquinasa.
En una realización particular de la invención el
activador del plasminógeno es tPA.
En otra realización particular el activador del
plasminógeno es uPA.
En otra realización particular adicional, como
activador del plasminógeno puede utilizarse un derivado o fragmento
de los activadores del plasminógeno mencionados que conserve su
capacidad de cortar y activar el plasminógeno y para el que el
efecto facilitador de la MMP-10 sea efectivo. El
experto en la materia podrá comprobar fácilmente dicho efecto, por
ejemplo mediante ensayos in vitro de formación y lisis de
coágulos como los que se describen en los ejemplos 1 a 4 de esta
invención. Longstaff y Thelwell [FEBS Letters, 2005; 579:
3303-3309] revisan algunos de los agentes
activadores del plasminógeno en uso o en desarrollo entre los que
el experto puede hacer una selección para su empleo en combinación
con la MMP-10 según la presente invención.
\newpage
Ventajosamente, la MMP-10 al no
interaccionar con el fibrinógeno/fibrina circulantes y ser capaz de
facilitar la acción de los activadores del plasminógeno, permitiría
reducir la dosis del trombolítico manteniendo la eficacia para
lisar el coágulo, pero sin inducir fibrinolisis sistémica, lo que
conllevaría una menor incidencia de complicaciones hemorrágicas.
Asimismo, permitiría reducir la toxicidad derivada del tratamiento
trombolítico con agentes como el tPA.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere también a una combinación farmacéutica que comprende,
separados o en una misma composición, MMP-10 y un
activador del plasminógeno, mezclados con excipientes o vehículos
farmacéuticamente aceptables. El activador del plásminógeno de la
combinación puede ser cualquiera de los mencionados
anteriormente.
Dicha combinación es útil para el tratamiento y
terapia trombolítica en mamíferos, particularmente en humanos, en
cualquiera de las situaciones clínicas ya mencionadas.
El origen de la MMP-10 y del
activador del plasminógeno de la combinación farmacéutica no
constituyen un aspecto crítico de la invención. Los principios
activos pueden obtenerse por extracción y purificación a partir de
fluidos o tejidos biológicos, mediante métodos de ingeniería
genética o recombinante, por procedimientos de síntesis o por
cualquier otra técnica convencional.
Dependiendo de las circunstancias, a determinar
en cada caso mediante los ensayos farmacológicos y clínicos
habituales, los ingredientes activos de la combinación farmacéutica
pueden administrarse simultáneamente, separadamente o
secuencialmente.
Según una realización de la invención, los
principios activos (MMP-10 y activador del
plasminógeno) pueden estar contenidos en una misma composición
farmacéutica. En otros casos, los principios activos pueden estar
contenidos en composiciones farmacéuticas separadas, cada uno de
ellos en su propio contenedor mezclado con excipientes o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas con los
principios activos, bien sea una o varias, pueden presentarse tanto
en forma sólida (p.ej. liofilizados en viales para posterior
reconstitución en una solución adecuada) o también en forma
líquida.
En una realización particular, estas
composiciones con los principios activos constituyen un kit para
tratamiento o terapia trombolítica, que opcionalmente puede incluir
otros componentes, como: contenedores con soluciones para la
reconstitución de los principios activos, cánulas, goteros con
suero fisiológico para aplicación intravenosa e instrucciones de
uso, etc.
Las composiciones farmacéuticas con los
ingredientes activos pueden administrarse por cualquier vía
apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica,
para lo cual incluirán los excipientes y vehículos
farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la
forma de administración deseada.
En una realización particular, la administración
se realiza por vía parenteral, por ejemplo mediante inyección
intravenosa, o por vía local mediante cateterización para
administración in situ en las proximidades del trombo.
Cuando la combinación farmacéutica sea para
administración separada, ambos ingredientes activos podrán estar
también contenidos en composiciones farmacéuticas adecuadas para
administración por vías diferentes.
Las cantidades de MMP-10 y de
activador del plaminógeno que pueden estar presentes en las
composiciones de la combinación farmacéutica proporcionada por esta
invención pueden variar dentro de un amplio intervalo, pero siempre
en cantidades terapéuticamente eficaces.
La dosificación para cada protocolo de
tratamiento trombolítico con las composiciones de la combinación
farmacéutica de la invención dependerá de numerosos factores,
incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la
situación clínica a tratar, la ruta y frecuencia de administración
y del activador del plasminógeno que en cada caso se vaya a
administrar.
En una realización típica, las cantidades y
dosificaciones del activador del plasminógeno serán menores a las
que se utilizarían para ese mismo activador del plasminógeno cuando
no se incluye MMP-10 en la combinación terapéutica.
Por otra parte, las cantidades de MMP-10 se
ajustarán en función del efecto que se desee conseguir: una mayor
eficiencia trombolítica manteniendo las dosis del activador del
plasminógeno; o una reducción de las dosis de activador del
plasminógeno manteniendo la eficiencia trombolítica.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere también a un método para tratamiento y terapia
trombolítica que comprende la administración al paciente de una
cantidad terapéuticamente eficaz de MMP-10. En una
realización particular, dicho método comprende también la
administración de un activador del plasminógeno, bien sea por
administración simultánea, sepárada o secuencial. Cualquiera de las
composiciones y combinaciones farmacéuticas mencionadas
anteriormente podrían utilizarse para este método.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos que ilustran los efectos sobre la
actividad fibrinolítica y trombolítica de las metaloproteinasas de
matriz MMP-10 y MMP-3, bien sea
directamente o en combinación con algunos activadores del
plasminógeno: uroquinasa (uPA) y activador tisular del plasminógeno
(tPA).
\vskip1.000000\baselineskip
Para los ejemplos se ha empleado:
- -
- MMP-10 recombinante, obtenida como pro-enzima de 58 kDa con un 20-30% de enzima maduro de 48 kDa (R&D Systems, 910-MP, Abingdon, UK), que fue reconstituida con tampón TCNB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl_{2}, 150 mM NaCl, 0,05% Brij35).
- -
- MMP-3 recombinante, obtenida como proenzima de 52 kDa (R&D Systems, 513-MP, Abingdon, UK), suministrada en una solución con 12,5 mM Tris, 5 mM CaCl_{2}, 0,025% Brij35 y 50% de glicerol.
- -
- Uroquinasa (uPA) (Vedim Pharma SA; 628602, Barcelona, España).
- -
- Activador tisular del plasminógeno (tPA) recombinante (Boerhinger Ingelheim; 985937 Actilyse®, Ingelheim, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de la actividad trombolítica
se utilizó un método turbidimétrico para monitorizar la formación y
lisis del coágulo de fibrina sobre muestras de plasma, de acuerdo
con el protocolo descrito previamente por von dern Borne y
colaboradores [Blood, 1995; 86:3035-3042].
Por otra parte, para evaluar la actividad sobre
la lisis de fibrina, realizaron ensayos en placas de fibrina,
siguiendo el procedimiento descrito por Edward [J. Clin. Path.,
1972; 25: 335-337].
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado anteriormente, mediante el
procedimiento descrito por von dern Borne y colaboradores, se
evaluó el efecto de la MMP-10 y de la
MMP-3 sobre el sistema hemostático. En este método
se valoran los cambios de turbidez/absorbancia durante la formación
y lisis de coágulos como indicador en el tiempo de ambos procesos.
La medida de la turbidez se realiza por lectura de la absorbancia
a 405 nm durante las fases de formación y lisis de coágulos,
utilizando un lector fotométrico, en nuestro caso un lector de
ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech). El incremento de
turbidez/absorbancia indica la formación del coágulo de fibrina
mientras que el descenso de este parámetro indica la lisis del
coágulo.
Para la formación del coágulo se mezclaron en un
pocillo de microplaca 75 \mul de plasma citratado, 75 \mul de
tampón HEPES (25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 6 mM
CaCl_{2}, 1.2 mM MgCl_{2}, y 0.1% BSA, pH=7.5) y 10 \mul de
CaCl_{2} 150 mM. La placa se incubó a 37ºC y se midió la
absorbancia a 405 nm durante 2 h, con lecturas cada 30
segundos.
Para estudiar el efecto de la
MMP-10 en la formación del coágulo, se añadió
MMP-10 activada (50, 100 y 200 nM) a la mezcla
inicial de plasma y tampón HEPES. Antes de su utilización en los
experimentos, la MMP-10 se activó mediante
tratamiento térmico a 37ºC durante 1 h.
En ensayos paralelos, se analizó también el
efecto sobre la formación del coágulo con la MMP-3
(200 nM). En este caso la MMP-3 se activó
previamente con 1 mM de acetato
p-aminofenilmercurio (APMA, 164610, EMD
Biosciences, La Jolla, USA) a 37ºC durante 24 h.
Como se observa en la Figura 1A, la
MMP-10 no indujo cambios ni en la velocidad de
formación del coágulo ni en el máximo de turbidez alcanzada con
ninguna de las dosis empleadas (Tabla 1). Sin embargo, la
MMP-3 indujo un descenso del 50% en el máximo de
absorbancia/turbidez del coágulo formado, probablemente por su
acción proteolítica directa sobre el fibrinógeno.
Estos resultados demuestran que la
MMP-10, a diferencia de lo descrito para la
MMP-3, no altera la tasa de formación del coágulo
por no presentar actividad fibrinolítica frente al fibrinógeno.
Posteriormente se estudió la tasa de lisis de
coágulo de fibrina y para ello, como en el apartado anterior, se
empleó plasma recalcificado en tampón HEPES al que simultáneamente
con la MMP-10 (o MMP-3 en su caso)
se añadió un activador del plasminógeno a elegir entre 30 U/ml de
activador tisular del plasminógeno (tPA), o 135 U/ml de uroquinasa
(uPA) al comienzo de la turbidimetría.
Las concentraciones de tPA y uPA a utilizar se
determinaron en estudios previos de dosis-respuesta,
donde la dosis de elección fue aquella que lisaba completamente el
coágulo de fibrina en el plazo de 2 h.
Como se observa en la Figura 1B y tabla 1, la
MMP-10 en ausencia de tPA y uPA no produjo la lisis
del coágulo de fibrina, mientras que en presencia de los
activadores tPA o uPA indujo un aumento significativo en la tasa de
lisis del coágulo de fibrina. Con la máxima dosis de
MMP-10 ensayada (200 nM) el acortamiento del tiempo
de lisis (tiempo al cual se lisa la mitad del coágulo) fue de 15
min (52,9 min vs 68,3 min, p<0.01) en presencia de tPA y
de 5 min en presencia de uPA (42 min vs 47.5 min, p<0,05).
Esta reducción del tiempo de lisis supone un porcentaje de
acortamiento de un 20% en presencia del tPA y de un 10% con el
uPA.
Por el contrario, la MMP-3 no
modificó la tasa de lisis del coágulo en presencia de tPA.
Estos resultados indican que la
MMP-10, a diferencia de la MMP-3,
no es capaz de digerir la fibrina pero sí aumenta el efecto
fibrinolítico de los activadores del plasminógeno y de la
fibrinolisis (tPA o uPA). La MMP-10, al no poseer
capacidad para actuar sobre la fibrinolisis endógena, evitaría o
atenuaría la aparición de hemorragias, lo que le convierte en un
buen candidato para su utilización como coadyuvante de la terapia
trombolítica.
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De acuerdo con el procedimiento de Edward
mencionado anteriormente, se estudió el efecto sobre la lisis de
fibrina midiendo el halo o área de lisis que se produce en una
placa de fibrina polimerizada.
Las placas de fibrina se preparan a partir de
una solución 6 mg/ml de fibrinógeno humano (Sigma, F3879, Sant
Louis, MO, USA) en tampón veronal (BioWhittaker,
12-624E, Cambrex, MD, USA) a 37ºC, que se filtra y
a la que se añade un volumen igual de CaCl_{2} (50 mM). Esta
solución (6 ml) se mezcla con 1 unidad internacional (NIH units) de
trombina (Enzyme Research Lab; HT1200a, Swansea, UK) y se deja
polimerizar durante 6 h.
Para valorar la capacidad fibrinolítica, sobre
distintas placas de fibrina se añadió: tPA (1 U/ml),
MMP-10 (200 nM), o una combinación de ambos.
Como se observa en la Figura 2, la
MMP-10 sola no produjo lisis sobre la fibrina
polimerizada, mientras que el tPA produjo una marcado halo. Sin
embargo, la combinación de tPA con MMP-10 aumentó
significativamente el área de lisis de fibrina polimerizada
(188,6%), hecho que confirma el efecto facilitador de la
fibrinolisis que presenta la MMP-10 en combinación
con activadores del plasminógeno como agentes fibrinolíticos.
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Dado el efecto de la MMP-10 en
la lisis inducida por tPA, se plantea conocer si es posible reducir
la dosis de tPA (que presenta problemas hemorrágicos y de toxicidad
neurológica) y emplear la MMP-10 como coadyuvante
para obtener el mismo efecto tromboiltico.
En el ensayo de turbidimetría realizado según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1, observamos que la
presencia de MMP-10 (200 nM) en combinación con el
tPA permite reducir la dosis de tPA un 33% (de 30 a 20 U/ml)
obteniendo el mismo tiempo de lisis de coágulo (Figura 3, tabla
1).
Este resultado indica que en un sujeto que
necesite terapia trombolítica, la MMP-10
proporciona la vía para aumentar la fibrinolisis y lisis del
coágulo reduciendo simultáneamente la dosis de tPA y, por tanto,
minimizando los problemas de hemorragias y toxicidad producidos por
este fármaco.
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De acuerdo con los resultados de los Ejemplos 1
y 2, se analizó la especificidad del efecto de la
MMP-10 sobre la lisis de fibrina en el coágulo
inducida por tPA añadiendo simultáneamente diferentes dosis de
MMP-10 activa, en presencia (relación 1:2) y
ausencia de un anticuerpo monoclonal que bloquea su actividad
(R&D Systems, MAB9101, Abingdon, UK), o de anticuerpo control
de isotipo murino IgG2B (eBioscience, 16-4732, San
Diego, CA, USA) a la misma concentración que el anticuerpo.
La relación de enzima:anticuerpo que bloquea la
actividad del enzima se analizó previamente en un ensayo de
actividad para la MMP-10 en una microplaca tapizada
con un anticuerpo anti-MMP-10
(R&D systems, Clon110343) y utilizando el sustrato fluorogénico
de estromelisinas
(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH_{2})
(R&D systems; ES002, Abingdon, UK) [Lombard et al.;
Biochimie, 2005; 87:265-272]. La fluorescencia (320
nm excitación y 405 nM emisión) se midió en un espectrofluorímetro
(SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA) durante 1 h
estableciéndose que la relación 1:2 inhibe completamente la
concentración de enzima activo (Figura 4).
Los resultados muestran que el efecto
coadyuvante sobre la fibrinolisis es específico de la
MMP-10, ya que se revierte en presencia del
anticuerpo anti-MMP-10. Este efecto
resulta muy destacable cuando dicho anticuerpo es añadido para
bloquear la actividad endógena de la MMP-10
plasmática (Figura 5). Los resultados establecen que la ausencia de
MMP-10 en el plasma impide la lisis del coágulo de
fibrina incluso en presencia de tPA o uPA (Tabla 1).
Estos resultados se corroboraron en los ensayos
sobre placa de fibrina polimerizada. Como se muestra en la Figura
6, en presencia del anticuerpo
anti-MMP-10 se reduce el área de
lisis producido por la combinación tPA:MMP-10
(91,2% vs 188,6%), mientras que el anticuerpo control no
tiene ningún efecto (184,6%). Estos datos confirman que el empleo
de un anticuerpo inhibidor de la MMP-10 bloquea la
disolución farmacológica de coágulos de fibrina.
Claims (16)
1. Uso de la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) en la
preparación de un medicamento útil para terapia trombolítica.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho medicamento además comprende un
activador del plasminógeno.
3. Uso según la reivindicación 2,
caracterizado porque dichos componentes del medicamento se
administran de forma simultánea, separada o secuencial.
4. Uso según la reivindicación 2,
caracterizado porque el activador del plasminógeno está
seleccionado entre: el activador del plasminógeno tisular tPA, la
uroquinasa uPA, la estreptoquinasa y la estafiloquinasa.
5. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado porque el activador del plasminógeno es
tPA.
6. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado porque el activador del plasminógeno es
uPA.
7. Una combinación farmacéutica para
administración simultánea, separada o secuencial,
caracterizada porque comprende metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) y un activador
del plasminógeno, mezclados con excipientes o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
8. Una combinación farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque dicha metaloproteinasa
de matriz-10 (MMP-10) y dicho
activador de plasminógeno se encuentran separados o en una misma
composición.
9. Una combinación farmacéutica según una de las
reivindicaciones 7 o 8, caracterizada porque el activador
del plasminógeno está seleccionado entre: el activador del
plasminógeno tisular tPA, la uroquinasa uPA, la estreptoquinasa y
la estafiloquinasa.
10. Una combinación farmacéutica según la
reivindicación 9, caracterizada porque el activador del
plasminógeno es tPA.
11. Una combinación farmacéutica según la
reivindicación 9, caracterizada porque el activador del
plasminógeno es uPA.
12. Un kit caracterizado porque comprende
la metaloproteinasa de matriz-10
(MMP-10) y un activador del plasminógeno, como
combinación farmacéutica para su administración simultánea,
separada o secuencial para tratamiento trombolitico.
13. Un kit según la reivindicación 12,
caracterizado porque la metaloproteinasa de
matriz-10 (MMP-10) y el activador
del plasminógeno se encuentran separados o en una misma
composición.
14. Un kit según la reivindicación 12,
caracterizado porque el activador del plasminógeno está
seleccionado entre: el activador del plasminógeno tisular tPA, la
uroquinasa uPA, la estreptoquinasa y la estafiloquinasa.
15. Un kit según la reivindicación 14,
caracterizado porque el activador del plasminógeno es
tPA.
16. Un kit según la reivindicación 14,
caracterizado porque el activador del plasminógeno es
uPA.
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