ES2331681B1 - Metodo inmunocromatografico para detectar la presencia de alergenos en alimentos procesados. - Google Patents

Abstract

Método inmunocromatográfico para detectar la presencia de alérgenos en alimentos procesados.

La presente invención se refiere a un método inmunocromatográfico para la detección de alérgenos en alimentos procesados. Más particularmente, se refiere a la detección de proteínas lácteas o de huevo mediante la utilización de anticuerpos policlonales específicos de \beta-lactoglobulina u ovomucoide.

Description

Método inmunocromatográfico para detectar la presencia de alérgenos en alimentos procesados.

La presente invención se refiere a un método inmunocromatográfico para la detección de alérgenos en alimentos procesados. Más particularmente, se refiere a la detección de proteínas lácteas o de huevo mediante la utilización de anticuerpos policlonales específicos de \beta-lactoglobulina u ovomucoide.

Estado de la técnica anterior

Las proteínas de la leche y del huevo son muy utilizadas en la industria alimentaria debido a sus buenas propiedades funcionales, pero también constituyen una de las principales causas de alergia en alimentos. El tipo de población más afectada por estas alergias suele ser la infantil.

El único tratamiento eficaz de la alergia alimentaria es evitar la ingesta del alimento sensibilizante, mediante una dieta de eliminación estricta. Por ello, resulta muy importante para un individuo alérgico conocer si un alimento contiene el componente que le causa la alergia, para evitar su consumo.

Desde el año 2003, la Directiva Europea (2003/89/EC) obliga a indicar en la etiqueta de los alimentos todos los ingredientes, y especialmente los que pueden provocar alergias e intolerancias. Además, estos materiales pueden encontrarse en los alimentos como consecuencia de una contaminación durante el transporte de las materias primas o durante el procesado. Por ello, es necesario disponer de técnicas específicas, sensibles y rápidas para su detección, con el objetivo de asegurar que se cumple la legislación vigente y para proteger al consumidor alérgico.

La mayoría de los trabajos desarrollados para la determinación de alérgenos en alimentos están dirigidos a la detección de proteínas de cacahuete y de gluten, si bien existen algunos trabajos para la detección de otras proteínas alergénicas derivadas de otros alimentos como huevo, leche, pescado y algunos vegetales (Matsuda, R., et al., 2006, J. AOAC Int., vol. 89, pp. 1600-1608; Poms, R.E., et al., 2005, Food Addit. Contam., vol. 22, pp. 104-112).

Las técnicas más utilizadas para la detección de estos alérgenos, en alimentos, son las técnicas genéticas basadas en la detección de ADN y las técnicas inmunoquímicas basadas en la detección de proteínas. Estas últimas constituyen las técnicas de elección ya que las alergias están causadas por componentes de naturaleza proteica. Entre las técnicas inmunoquímicas más utilizadas se encuentran las técnicas de inmunoblotting previa separación de las proteínas por electroforesis y sobretodo, las técnicas de ELISA en placa (Poms, R.E., Klein, C.L., y Anklam, E., 2004, Food Addit. Contam. 21, 1-31). Algunos de los ensayos de ELISA se encuentran ya comercializados, o en fase de comercialización.

En los últimos años, la aplicación de las técnicas de inmunocromatografía para la detección de proteínas específicas está alcanzando un gran auge y desplazando a las técnicas de ELISA en placa en algunos campos como el ámbito de la medicina y en la detección de materiales transgénicos.

Explicación de la invención

La presente invención proporciona un test de inmunocromatografía, de gran rapidez y especificidad, para detectar la presencia de proteínas lácteas o de huevo en alimentos, y más particularmente en alimentos procesados, utilizando anticuerpos específicos frente a estas proteínas.

La elección de estas proteínas se realiza en base a su alta inmunogenicidad y a su alta termorresistencia, siendo esta última propiedad muy importante cuando se analizan alimentos procesados que han sido sometidos a tratamientos térmicos.

Por ejemplo, la \beta-lactoglobulina de la leche y el ovomucoide del huevo son proteínas solubles que se encuentran en una concentración considerable en dichos alimentos. El ovomucoide constituye un 11% de las proteínas de la clara del huevo y la \beta-lactoglobulina el 50% de las proteínas del lactosuero bovino. El ovomucoide es la proteína más termorresistente de la clara del huevo y la \beta-lactoglobulina junto con la \alpha-lactalbúmina (cuya concentración es 4 veces menor que la de la \beta-lactoglobulina) las más termorresistentes del lactosuero. La propiedad de estas proteínas de presentar una alta termorresistencia indica que mantienen su inmunorreactividad, es decir, su capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos obtenidos frente a ellas, al ser sometidas a un tratamiento
térmico.

Las técnicas de inmunocromatografía presentan las ventajas generales que tienen las técnicas inmunoquímicas convencionales, como son las de poseer una alta especificidad y sensibilidad y que la preparación de la muestra es muy sencilla. Además, las técnicas inmunocromatográficas presentan algunas ventajas adicionales importantes entre las que destaca la rapidez, con una duración total que es menor a 10 minutos y la sencillez operativa, ya que si se utiliza como método cualitativo, los resultados pueden observarse a simple vista y ser utilizados como pruebas de campo, incluso a nivel doméstico, no requiriendo en este caso la utilización de ningún equipamiento.

Existe también la posibilidad de determinar los resultados de forma semicuantitativa en un laboratorio utilizando un lector. Puede ser utilizado por personal no entrenado y es también susceptible de ser presentado en forma de kit, de modo que se simplifique al máximo la manipulación por la persona encargada del análisis. Este sistema permite además realizar el análisis de un número elevado de muestras.

Por ello, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la fabricación de conjugados, que han de ser adecuados para su uso en una técnica inmunocromatografica y que comprenden microesferas de poliestireno tapizadas con anticuerpos. Este método para la fabricación de conjugados comprende los siguientes pasos fundamentales:

\bullet

conjugar las microesferas de poliestireno con anticuerpos específicos de los antígenos a detectar y

\bullet

saturar los sitios de unión que no han reaccionado con los anticuerpos, con un bloqueante.

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Previamente, se seleccionan las proteínas de entre aquellas capaces de mantener en gran parte su inmunorreactividad, o sea su capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos, tras ser sometidas a un tratamiento térmico. Por ejemplo, las proteínas \beta-lactoglobulina bovina o el ovomucoide que además son cuantitativamente importantes en la leche y en el huevo.

Por ello, en una realización preferida de este método para la fabricación de conjugados, los anticuerpos son específicos frente al antígeno ovomucoide o \beta-lactoglobulina.

Una vez obtenidos los antisueros frente a las proteínas concretas, se aíslan los anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando un inmunoadsorbente que contenga la proteína insolubilizada.

Sin embargo, el paso más delicado se corresponde con el primer aspecto de la presente invención, que es el de la conjugación de los anticuerpos específicos con las microesferas de poliestireno coloreadas. En este sentido, se presentaron varias dificultades. En el caso de agregación de las esferas, visualizada mediante microscopía, se observó que éstas no ascendían por la membrana. Para solventar este inconveniente inicial, se sonica y microfiltra, de tal forma que con la agitación se disgregen parte de los agregados y los no disgregados se eliminen por filtración.

Sin embargo, en la filtración se puede producir una pérdida importante de las esferas al quedar retenidas en el filtro. Para evitar este problema, se adicionan tampones con diferente pH (entre 5.2 y 7.5) y diferente relación de volumen entre los reactivos y las esferas (entre 4/1 y 20/1) en las diferentes etapas de conjugación.

Otra realización preferida del método para la fabricación de conjugados se refiere a las microesferas de poliestireno, que son preferiblemente carboxiladas y coloreadas y su diámetro se encuentra en el rango de entre 0.1 \mum
y 0.4 mm.

Otro aspecto de la invención, se refiere a los conjugados obtenibles por el método de fabricación anteriormente descrito.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de análisis inmunocromatográfico para la detección de alérgenos en alimentos procesados que comprende:

a.

preparar un soporte inmunocromatográfico de nitrocelulosa con anticuerpos específicos y anticuerpos control. Por ejemplo, pero sin limitarse, los anticuerpos pueden ser específicos frente al antígeno de ovomucoide o de \beta-lactoglobulina y los anticuerpos control pueden ser anti-inmunoglobulinas de conejo.

b.

poner en contacto el soporte inmunocromatográfico obtenido en el paso (a) con la muestra de alimento a analizar y los conjugados obtenibles por el método de fabricación anteriormente descrito; y

c.

analizar los resultados.

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Por ejemplo, en el caso de que los anticuerpos sean específicos frente al antígeno ovomucoide o \beta-lactoglobulina, el análisis de los resultados sería el siguiente:

\bullet

dos bandas coloreadas indican la presencia de leche (\beta-lactoglobulina) o de huevo (ovomucoide) en la muestra; o

\bullet

una única banda coloreada, corresponde a la línea que contiene los anticuerpos control, preferiblemente anti-inmunoglobulinas de conejo inmovilizadas en el soporte, indica la ausencia de leche o de huevo en la muestra.

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Para llevar a cabo este método se deben obtener en primer término los antisueros frente a las proteínas específicas, por ejemplo mediante inoculación en conejos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de alérgenos en una muestra de alimento procesado, que comprende:

a.

Un soporte inmunocromatográfico de nitrocelulosa con anticuerpos específicos y anticuerpos control; y

b.

Los conjugados que comprenden microesferas de poliestireno tapizadas con anticuerpos tal y como se han descrito anteriormente.

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Este kit se utiliza para la detección de alérgenos en alimentos, preferiblemente para la detección de la presencia de leche o huevo en alimentos, preferiblemente pretratados.

Por otra parte, las membranas utilizadas en el soporte inmunocromatográfico pueden ser de nitrocelulosa o de nylon, utilizándose preferiblemente las de nitrocelulosa.

En cuanto a los bloqueantes utilizados con el objeto de saturar todos los puntos de unión a proteínas, se probó en primer lugar la saturación de la membrana de nitrocelulosa del soporte inmunocromatográfico y evitar así el background que queda tras pasar las esferas conjugadas, para ello se probaron diferentes bloqueantes incubando las membranas con albúmina sérica bovina (BSA), ovoalbúmina, caseína o gelatina de pescado, dependiendo de la proteína a detectar. Sin embargo el bloqueo impedía la subida de las esferas por capilaridad, para solucionar este inconveniente se pueden utilizar diferentes humectantes en la membrana tras el bloqueo, como metanol o SDS.

En cualquier caso, es necesaria además la adición de diferentes bloqueantes en la solución de dilución de las esferas ya tapizadas. En este sentido, se puede utilizar un amplia combinación de diferentes concentraciones de varios bloqueantes, como BSA u ovoalbúmina al 1%, así como de diferentes concentraciones de sal (en una concentración de entre 0 y 0.5 M) a diferentes pHs (entre 7.4 y 9.2).

De esta forma se consigue que las esferas tapizadas ascendieran por capilaridad a lo largo de la membrana sin producir background.

El método de la presente invención es capaz de detectar la presencia de proteínas de leche o de huevo en alimentos procesados hasta límites por debajo de 1 ppm.

Se entiende por "alimentos procesados" en esta descripción los alimentos finales obtenidos, tales como pasterizados, horneados o esterilizados, en las diferentes partes de la cadena de producción, tratamiento y/o transporte, tanto de las materias primas como del producto alimenticio final.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de método y kit de la invención.

Ejemplo 1

A.- Obtención de antisueros

A cada conejo se le inyectó por vía subcutánea 1 mg de \beta-lactoglobulina u ovomucoide comerciales, previamente purificados por cromatografía en Sephadex G-100, disueltos en 0,6 ml de tampón fosfato potásico 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4 y emulsionada con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Transcurrido un mes, se repitió la misma inoculación, pero utilizando adyuvante incompleto de Freund. A los 15 días se extrajo la sangre de los animales realizando una pequeña incisión en la vena marginal de la oreja. La sangre obtenida se dejó coagular espontáneamente a temperatura ambiente, se centrifugó a 500 g durante 10 minutos y el suero sanguíneo obtenido se congeló a -20ºC.

B.- Aislamiento de anticuerpos

Para aislar los anticuerpos específicos frente a la \beta-lactoglobulina o el ovomucoide presentes en los sueros sanguíneos se preparó previamente un inmunoadsorbente con \beta-lactoglobulina u ovomucoide insolubilizados en Sepharose 4B.

Para ello, a 2,5 g de Sepharose 4B activada se le añadieron 20 ml de HCl 1 mM. El gel obtenido se lavó con 1 l de HCl 1 mM y se equilibró con tampón bicarbonato sódico 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. A continuación, a 7 g de la Sepharose 4B lavada y escurrida se le añadieron 7 ml de una solución de \beta-lactoglobulina bovina o de ovomucoide (3 mg/ml) disuelta en el mismo tampón. La mezcla se incubó a 4ºC durante toda la noche en agitación moderada y, después, el gel se lavó con alícuotas del mismo tampón carbonato. El gel se incubó con 5 ml de etanolamina 1M, pH 8,0, durante 30 minutos para bloquear los grupos activos que no hubieran reaccionado con las proteínas y, finalmente, se lavó con tampón fosfato potásico 25 mM, NaCl 0,5 M pH 7,4.

Para aislar los anticuerpos anti-\beta-lactoglobulina o anti-ovomucoide, un volumen de 25 ml del antisuero se aplicó al inmunoadsorbente. La columna del inmunoadsorbente se lavó con tampón fosfato potásico 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4. Después, los anticuerpos se eluyeron con un tampón glicina-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,8. Las fracciones de anticuerpos eluídas se neutralizaron inmediatamente con tampón Tris 0,5 M, pH 8,0, se dializaron frente a tampón fosfato potásico 25 mM, pH 7,4, se concentraron por ultrafiltración y se congelaron a -20ºC.

C.- Conjugación de los anticuerpos con microesferas de poliestireno coloreadas

Los anticuerpos específicos frente a la \beta-lactoglobulina o frente al ovomucoide aislados por inmunoadsorción se conjugaron con microesferas de poliestireno de 0,3 \mum de diámetro carboxiladas y coloreadas. Para ello, 500 \mul de microesferas (10%) se lavaron cinco veces con 10 ml de tampón MES 10 mM, pH 6, y se centrifugaron durante 15 minutos a 13.000 g, repitiéndose esta operación cinco veces. Posteriormente, el pellet obtenido se resuspendío en 5 ml del mismo tampón y se le añadieron 50 mg de dimetil-aminopropil-carbodiimida HCl y 35 mg de N-hidroxisulfosuccinimida sódica, para activar los grupos carboxilo de las microesferas. La mezcla se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, las microesferas se lavaron cinco veces con 10 ml de tampón MES 10 mM pH 7,5, centrifugando tras cada lavado durante 15 minutos a 13.000 g.

El pellet obtenido se resuspendió en 2,5 ml de tampón MES 10 mM, pH 7,5 y se añadieron 2,5 ml de los anticuerpos específicos (1 mg/ml) previamente dializados en el mismo tampón. La mezcla se agitó durante toda la noche a 4ºC y a continuación, se realizaron cinco lavados con 10 mL de tampón MES 10 mM pH 7.5, centrifugando tras cada lavado durante 15 minutos a 13.000 g.

Para saturar los sitios de unión a proteínas que se encuentran libres, el pellet se redisolvió en 5 ml de una solución que contenía 1% de albúmina sérica bovina y etanolamina 30 mM disueltas en tampón MES 10 mM pH 7,5 y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras realizar tres lavados el pellet se resuspendió en 5 ml de una solución de albúmina sérica bovina al 0,1% en tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,4 y se mantuvo a 4ºC en agitación hasta su uso.

D.- Preparación del soporte inmunocromatográfico

El soporte inmunocromatográfico estaba constituido por una membrana de nitrocelulosa de dimensiones 3 cm x 4 mm y de 5-10 \mum de tamaño de poro que ha sido secada a 60ºC durante 5 minutos. A una distancia de 1,2 cm de la base, se aplicaron manualmente en una fina línea los anticuerpos específicos frente a la \beta-lactoglobulina o frente al ovomucoide (1 mg/ml en tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,4 que contiene un 3% de metanol) y a una distancia de 1,8 cm de la base, se aplicaron anticuerpos específicos frente a inmunoglobulinas de conejo en el mismo tampón. La membrana se dejó secar a temperatura ambiente durante 24 horas. Para bloquear la membrana, ésta se sumergió en una solución de caseína al 1% en tampón fosfato sódico 5 mM, pH 7.4 durante 15 minutos y después en una solución de SDS al 0.01% en el mismo tampón durante 30 minutos. Finalmente, la membrana se dejó secar a temperatura ambiente.

Después, se colocaron unas membranas absorbentes de celulosa en ambos extremos del soporte y se sujetaron con cinta adhesiva alrededor.

E.- Preparación de las muestras de alimento

A 3 g de la muestra de alimento triturado se le añadieron 30 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4 y la mezcla se mantuvo en agitación durante 15 minutos a 60ºC. El extracto se clarificó mediante centrifugación a 3.000 g durante 15 minutos.

F.- Realización del análisis inmunocromatográfico

En un tubo de ensayo se añadieron 45 \mul de las microesferas conjugadas con los anticuerpos específicos diluidas 1/20 en tampón fosfato potásico 10 mM, NaCl 0.5 M, pH 7,4, 10 \mul de albúmina sérica bovina al 5% y 45 \mul del extracto del alimento a analizar. A continuación, se introdujo el soporte inmunocromatográfico, preparado como se ha indicado anteriormente, y se esperaron 10 minutos hasta su observación.

Si la muestra a analizar contiene \beta-lactoglobulina u ovomucoide, las proteínas se unen a los anticuerpos específicos conjugados con las microesferas. El complejo formado asciende por capilaridad a lo largo del soporte y al llegar a la primera línea que contiene los anticuerpos específicos anti-\beta-lactoglobulina o anti-ovomucoide inmovilizados en el soporte, las proteínas del complejo se unen a dichos anticuerpos y, como consecuencia, aparece una banda coloreada. Los complejos no unidos continúan ascendiendo por capilaridad y al llegar a la línea que contiene los anticuerpos anti-inmunoglobulinas de conejo inmovilizados en el soporte se unen dando como resultado la aparición de otra banda coloreada. Si la muestra no contiene \beta-lactoglobulina u ovomucoide, sólo se visualiza color en la segunda línea.

Claims (9)

1. Método para la fabricación de conjugados que comprenden microesferas de poliestireno tapizadas con anticuerpos, adecuados para su uso en una técnica inmunocromatografica, que comprende:

\bullet

Conjugar las microesferas de poliestireno con anticuerpos específicos de los antígenos a detectar.

\bullet

Saturar los sitios de unión que no han reaccionado con los anticuerpos, con un bloqueante.

2. Método para la fabricación de conjugados según reivindicación 1, donde los anticuerpos son específicos frente al antígeno de ovomucoide o de \beta-lactoglobulina.

3. Método para la fabricación de conjugados según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde las microesferas de poliestireno son carboxiladas y coloreadas.

4. Conjugados obtenibles por el método de fabricación según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Método de análisis inmunocromatográfico para la detección de alérgenos en alimentos procesados que comprende:

a.

preparar un soporte inmunocromatográfico de nitrocelulosa con anticuerpos específicos y anticuerpos control;

b.

poner en contacto el soporte inmunocromatográfico obtenido en el paso (a) con la muestra de alimento a analizar y los conjugados según reivindicación 4; y

c.

analizar los resultados.

6. Método según la reivindicación anterior, donde los anticuerpos son específicos frente al antígeno de ovomucoide o de \beta-lactoglobulina.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los anticuerpos control son anti-inmunoglobulinas de conejo.

8. Kit para la detección de alérgenos en una muestra de alimento procesado, que comprende:

a.

Un soporte inmunocromatográfico de nitrocelulosa con anticuerpos específicos y anticuerpos control; y

b.

Los conjugados que comprenden microesferas de poliestireno tapizadas con anticuerpos según reivindicación 4.

9. Uso del kit según reivindicación 8 para la detección de alérgenos en alimentos que contengan leche o huevo.