ES2198645T3 - Procedimiento mejorado para diagnosticos de alergia. - Google Patents
Procedimiento mejorado para diagnosticos de alergia.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento mejorado para diagnósticos alérgicos, particularmente para diagnósticos alimentarios de alergia, caracterizado porque los anticuerpos IgE obtenidos de individuos son expuestos a un agente que convierte a los anticuerpos IgE esencialmente incapaces de reaccionar con un epitomo sacárido de un material del mencionado antígeno; y/o a una parte digerida de la proteasa del mencionado material antigénico; y a un nativo, por ejemplo la parte no digerida del mencionado material antigénico; sobre la cual se detecta la formación de complejos antigénicos IgE y evalúa respecto a la determinación de los antígenos no reaccionados y/o complejos IgE/ antígeno clínicamente relevantes en el cual el anticuerpo IgE se une a un epítomo esencialmente peptídico de un antígeno. La presente invención también se refiere a un kit de diagnóstico para ser usado en uno o en más de uno de los procedimientos anteriormente mencionados, particularmente para diagnósticos alimentariosde alergia in vitro o in vivo. Y a un procedimiento para determinar una respuesta alérgica de un individuo a un material antigénico que puede ingerirse por vía oral o nasal, por medio de un ensayo mejorado de piel.
Description
Procedimiento mejorado para diagnósticos de
alergia.
La presente invención se ubica en el campo de
diagnósticos de alergia y proporciona un procedimiento mejorado para
diagnosticar con más exactitud factores relevantes clínicamente de
alergias graves y menos graves, particularmente de alergias a
alimentos. Además se refiere a un kit de prueba para llevar a cabo
la determinación del diagnóstico.
Las enfermedades alérgicas que incluyen alergias
a alimentos han aumentado mucho a lo largo de las últimas décadas.
El término ``alergia'' tal y como se usa en la presente invención
se referirá a una alteración inmunológica mediada por anticuerpos
IgE, una alergia denominada tipo I, a no ser que se defina o derive
de la descripción otra cosa. Los síntomas inducidos por agentes
alérgenos o ingredientes alimenticios alérgenos pueden variar mucho
respecto a la gravedad así como al órgano diana que está afectado.
Los síntomas leves normalmente están restringidos a la cavidad oral-
faringea: hinchazón de labios y lengua, picor en boca y garganta,
etc. Este tipo de alergia a alimentos a menudo se denomina como el
síndrome de alergia oral (SAO) (1). Los síntomas más graves
normalmente son sistémicos y pueden variar desde urticaria
generalizada y alteraciones gastrointestinales hasta shock
anafiláctico. En el último caso, la alergia a los alimentos es una
amenaza para la vida. Son ejemplos conocidos de tales alergias a
los alimentos peligrosas las alergias a los cacahuetes y a las
gambas. Afortunadamente, son más comunes las alergias leves a
alimentos. A menudo tienen lugar en pacientes alérgicos al polen. Un
ejemplo bien conocido es la alergia a frutas como la manzana y el
melocotón en pacientes con alergia al polen de abedul (2). Se ha
demostrado que la base de tales conexiones es la reactividad cruzada
de los anticuerpos IgE: estructuras relacionadas en polen y
alimentos son reconocidas por los mismos anticuerpos IgE. Algunas
de estas estructuras reactivas cruzadas son reconocidas por
anticuerpos IgE, pero no inducen alergia clínica a alimentos. Esto
se ha demostrado por anticuerpos IgE dirigidos a determinantes
carbohidrato en glicoproteínas en alimentos vegetales (3), que
incluyen el kiwi (11).
El diagnóstico de alergia a alimentos se lleva a
cabo de varias formas, parcialmente complementarias. Se tiene que
registrar una profunda anamnesis. El diagnóstico además puede
respaldarse por medidas in vivo y ensayos in vitro.
La más común de las técnicas in vivo es una prueba de piel
con extractos de alérgenos de alimentos. A veces es necesaria una
provocación oral para determinar qué componentes alimenticios son
los agentes causantes de la alergia observada. Las pruebas in
vitro más comunes son el RAST y el ELISA. En estos ensayos,
extractos de material antigénico, alérgico potencialmente, se
inmovilizan en una fase sólida (por ejemplo, Sefarosa, partículas
magnéticas, placas de poliestireno, etc.) Después de la incubación
de la fase sólida con suero de una probanda o paciente, se mide
normalmente la unión de anticuerpos IgE específicos. Para la
detección, se usan más frecuentemente técnicas basadas en
radiactividad y/o enzimas. Todos estos ensayos determinan niveles o
actividades de anticuerpos IgE específicos. No dan, sin embargo,
información sobre la apariencia y relevancia clínica de los
complejos alérgeno-IgE determinados. Similares
resultados de prueba de piel o prueba in vitro de diferentes
pacientes pueden acompañarse por síntomas leves en un paciente y
por síntomas graves en otro. La alergia clínica puede incluso estar
totalmente ausente. El valor de una prueba de diagnóstico
aumentaría enormemente si distinguiera entre respuestas de IgE sin
importancia clínica, anticuerpos IgE relacionados con síntomas
leves y anticuerpos IgE relacionados con alergia grave. Tal
distinción diagnóstica por supuesto aumentaría considerablemente la
fiabilidad y eficacia de las recomendaciones dietéticas o de
comportamiento. Es un objetivo principal de la presente invención
proporcionar tal procedimiento.
La potencia alergénica total de un material
antigénico puede determinarse aproximadamente como la suma de las
potencias alergénicas de sus componentes antigénicos de unión a IgE.
Esto implica que el perfil IgE individual es un factor crucial para
que el sistema inmune de una persona produzca una respuesta alérgica
contra un material antigénico con el que ha entrado en contacto. Se
ha observado que, por ejemplo, una sustancia A antigénica que se
da, por ejemplo, en alimentos se ha reconocido por un sistema
inmune de un individuo como un agente alergénico y produce síntomas
serios, mientras que otra sustancia B, que puede incluso conocerse
por provocar reacciones alergénicas en mucha gente, produce
solamente síntomas suaves o quizás ningún síntoma en ese individuo.
Incluso a pesar de que los fenómenos en torno a la alergia no se
han entendido todavía completamente por lo menos se conocen dos
factores que están implicados: la naturaleza bioquímica del epítopo
del antígeno reconocido por IgE, y la estabilidad química de la
estructura o determinante antigénico de unión a IgE. Si una cadena
lateral de carbohidrato en una glicoproteína es una parte esencial
del epítopo entonces el material antigénico, por ejemplo, alimento,
que contiene tales glicoproteínas se tolera bien normalmente (3).
Para la inducción de síntomas alérgicos relevantes clínicamente, el
reconocimiento de IgE de epítopos antigénicos de naturaleza
peptídico esencialmente parece ser importante.
Las estructuras carbohidrato de unión a IgE son
extremadamente estables: son insensibles al calor, a proteasas, etc.
En contraste, varias proteínas alergénicas de reacción cruzada son
muy lábiles (4). Esto explica la mala calidad de muchos diagnósticos
de alergia a alimentos: estructuras carbohidrato antigénicas
irrelevantes clínicamente conservan su capacidad de unión a IgE,
mientras que estructuras peptídicas relevantes la pierden
fácilmente. Algunos agentes o componentes antigénicos con epítopos
peptídicos son, sin embargo, extremadamente resistentes a proteasas
(5). Su estructura de unión a IgE se mantiene incluso después de una
exposición prolongada a pepsina. Si tal proteína es insensible a la
digestión con pepsina, es más probable que esté implicada en
alergia a alimentos grave. Los alérgenos
pepsina-estables son capaces de alcanzar los
intestinos en su conformación de unión a IgE. Los alérgenos
pepsina-lábiles se digieren en el estómago,
limitando esencialmente su alcance alergénico a la cavidad
oral-faringea. Las mejoras de diagnósticos de
alergias, particularmente los diagnósticos de alergia a alimentos,
proporcionados por esta invención, se dirigen a una evitación
selectiva de una detección de anticuerpos IgE dirigidos a
determinantes carbohidrato irrelevantes clínicamente por un lado y/o
a una detección selectiva de anticuerpos IgE contra alérgenos
pepsina-estables por el otro lado.
La presente invención proporciona un
procedimiento mejorado de diagnósticos de alergia para evitar o
reducir el número de resultados falsos positivos y/o para aumentar
la selectividad de detección de factores alergénicos relevantes
clínicamente. Así, se facilita un diagnóstico más exacto, aumentando
por ello la calidad de vida y la seguridad de los pacientes
alérgicos, particularmente alérgicos a alimentos.
La mejora comprende evitar la detección de
anticuerpos IgE específicos de carbohidrato y/o la detección
selectiva de alérgenos pepsina-estables. Ambas
modificaciones se aplican al mismo tipo de ensayo: inmunoensayos
para la medida de anticuerpos IgE
alérgeno-específicos in vitro e in
vivo. La presente invención por tanto se refiere a un
procedimiento mejorado para diagnósticos de alergia,
particularmente para diagnósticos de alergia a alimentos, que
comprende la reacción de uno o más anticuerpos IgE de un individuo
con material antigénico para que se pruebe para potencial
alergénico, y consecutivamente determinar la formación de complejos
IgE/antígeno, caracterizada porque los anticuerpos IgE,
preferiblemente una muestra de suero que contiene anticuerpos IgE,
que se obtiene de dicho individuo se exponen
a) a un agente que convierte los anticuerpos IgE
en substancialmente incapaces de reaccionar con un epítopo sacárido
de un antígeno de dicho material antigénico; y/o
b) a una porción digerida por proteasa de dicho
material antigénico; y
c) a una porción natural, es decir, no digerida
de dicho material antigénico; con lo que
d) la formación de complejos IgE/antígeno se
detecta y se evalúa respecto a la determinación de antígenos no
unidos y/o complejos IgE/antígeno relevantes clínicamente en la que
el anticuerpo IgE se une a un epítopo esencialmente peptídico de un
antígeno presente en dicha porción digerida por proteasa y/o no
digerida del material antigénico.
El término ``natural'' tal y como se usa en la
presente invención se refiere a material antigénico no digerido, es
decir, a material antigénico que no se ha sometido a tratamiento
proteolítico con proteasa, por ejemplo, enzimático.
La invención se refiere a un procedimiento tal y
como se define anteriormente, en el que dicho agente aplicado en la
etapa a) comprende un inhibidor que se adhiere o une a y/o bloquea
el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad
para antígenos con epítopos sacáridos. Dicho agente se elige del
grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, extracto
de alimento vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la
estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula
sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la
misma composición y estructura que tiene lugar en un extracto de
polen o en un extracto de alimento vegetal.
Se prefiere también que el material antigénico se
proporcione en la forma de un extracto alimenticio, un extracto de
planta o un extracto de fruta, particularmente en la forma de un
extracto vegetal o de un alimento animal invertebrado, por ejemplo,
de gamba.
Ventajosamente, la digestión de proteína del
material antigénico se lleva a cabo con al menos una proteasa que
se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente con
pepsina, mientras que el extracto de polen se digiere
preferiblemente usando proteinasa K o pronasa.
La detección de complejos de IgE/antígeno y/o
antígenos que no reaccionan se lleva a cabo por procedimientos bien
conocidos en la materia, particularmente por inmunoensayos tales
como ELISA (ensayo de inmunoabsorbencia de unión a enzima) o RAST
(prueba absorbente radio-alergo), o procedimientos
quimiluminiscentes.
En otra forma de realización la prueba de alergia
de la presente invención se aplica como una prueba de piel en la que
los anticuerpos IgE que se dan o se liberan a las capas de piel
superiores de un individuo se someten a las etapas mencionadas
anteriormente a) a d).
La presente invención se refiere también a un kit
de diagnóstico para uso en uno o más de los procedimientos
mencionados anteriormente, particularmente para diagnósticos de
alergia a alimentos in vitro o in vivo. Dichos kits de
pruebas comprenden
- una muestra de un material antigénico natural,
es decir, no digerido, para probarlo para potencial alergénico;
y
- un agente que convierte anticuerpos IgE en
substancialmente incapaces de reaccionar con un epítopo sacárido de
un antígeno del material antigénico, y/o una porción de dicho
material antigénico digerida por proteasa, preferiblemente digerida
por pepsina.
En dichos kits de pruebas, el agente
anteriormente mencionado se elige del grupo formado por extracto de
polen digerido por proteasa, extracto alimenticio vegetal digerido
por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza
antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un
epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura
que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento
vegetal. Se prefiere también que el material antigénico digerido por
proteasa se digiera al menos por una proteasa que se da en el
estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente por
pepsina.
La presente invención además se refiere al uso de
una muestra de un material antigénico natural, no digerido para
probarla para potencial alérgico junto con una porción de la misma
digerida por proteasa y/o junto con un inhibidor que se adhiere o
se une y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una
especificidad para antígenos con epítopos sacáridos, para la
elaboración de una composición para determinar una respuesta
alérgica de un individuo a un material antigénico ingerible por vía
oral o nasal por medio de una prueba de piel.
Se prefiere que según este uso el material
antigénico digerido por proteasa que se use estuviera digerido por
al menos una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal
humano, preferiblemente por pepsina.
Dicho agente para convertir anticuerpos IgE en
substancialmente incapaces de reaccionar con epítopos esencialmente
sacáridos de moléculas antigénicas se elige del grupo formado por
extracto de polen digerido por proteasa, un extracto alimenticio
vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o
naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que
comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición
y estructura que se da en un extracto de polen o en un extracto de
alimento vegetal.
En este contexto el término ``epítopo sacárido''
tal y como se usa en la presente invención se referirá a un
determinante antigénico de una molécula orgánica, particularmente de
una proteína o glicoproteína, en el que dicho determinante está
sustancialmente o completamente compuesto por moléculas de
carbohidrato y/o derivados de los mismos.
Del mismo modo, el término ``epítopo peptídico''
se referirá a un determinante antigénico de una molécula orgánica,
particularmente de una proteína o glicoproteína, en el que dicho
determinante está sustancialmente o completamente compuesto por
moléculas de aminoácidos y/o derivados de los mismos, al menos
algunas de ellas unidas por unión por péptido.
Las Figs. 1A, 1B, 1C muestran la influencia de la
digestión de la proteinasa K sobre los contenidos de tres
principales alérgenos en extracto de polen de hierba. Los
principales alérgenos purificados marcados radiactivamente se
sometieron a RIA competitivo usando extracto de polen de hierba
digerido y no digerido como agentes competidores (``inhibidores'')
contra anticuerpos IgE monoclonales alérgeno- específicos como las
dianas de unión. Los resultados se expresan en % de unión de
alérgeno marcado radiactivamente.
La Fig. 2 muestra un RAST con extracto de polen
de hierba no digerido y digerido con proteinasa K con 4 sueros de
pacientes alérgicos al polen de hierba. Los sueros I y II reconocen
claramente antígenos presentes todavía en extracto de polen
digerido, a pesar de que hay un descenso significativo comparado con
el extracto de polen no digerido. Esta diferencia se produce por
una pérdida de epítopos peptídicos. Los sueros III y IV no se unen
al extracto de polen digerido, indicando que la reactividad de los
anticuerpos IgE de esos sueros con extracto de polen está
exclusivamente dirigida a epítopos peptídicos.
La Fig. 3 demuestra la influencia del tratamiento
de periodato de extractos de polen y de alimentos en un RAST con
extractos no tratados (-) y tratados (+). Para el suero PB, el
tratamiento de periodato no tuvo un efecto significativo en la
unión a IgE. Para el suero VW, la unión a IgE desapareció casi
completamente después de un tratamiento de periodato indicando que
este suero contiene anticuerpos IgE reactivos principalmente con
determinantes carbohidrato periodato-sensibles.
La Fig. 4 describe la unión de IgE específicos de
carbohidrato a glicoproteínas no relacionadas. Se realizó un RAST
con 4 sueros que contienen anticuerpos IgE que son reactivos con
extractos de polen digeridos con proteasa. Se incluyó un suero de
un paciente alérgico al polen (suero 5) que no mostró reactividad
IgE con extractos de polen digeridos. Se probaron cinco proteínas
no relacionadas en absoluto: bromelaína de pedúnculo de piña,
peroxidasa de rábano picante (HRP), Lolp11 de polen de hierba
Lolium perenne, fitohemaglutinina-L
(PHA-L) de Phaseolus vulgaris, y fosfolipasa
A_{2} (PLA_{2}) de veneno de abeja. Los 4 sueros
carbohidrato-reactivos se unen a todas las 5
glicoproteínas, el suero control es no reactivo. La explicación para
esta observación es que estas proteínas y antígenos no relacionados
presentes en el extracto de polen tienen estructuras carbohidrato
muy similares en sus epítopos de unión a IgE.
La Fig. 5 describe cuanto se inhibe la actividad
de unión de los anticuerpos IgE a extracto de polen digerido por
proteasa acoplada a sefarosa (en este caso polen de abedul) por la
adición de extracto de polen de abedul, peroxidasa de rábano
picante (HRP) y la glicoproteína humana transferrina. La última
proteína se usó como una glicoproteína control con un
N-glicano que es diferente de los típicos N-
glicanos de planta. Tanto el extracto del polen digerido como el HRP
inhibieron casi completamente la unión. Con transferrina, sin
embargo, no se observó inhibición.
La Fig. 6 muestra los resultados obtenidos cuando
un suero que contiene anticuerpos IgE contra determinantes
carbohidrato, y otro suero que contiene anticuerpos IgE contra
profilina se probaron en un RAST con diferentes extractos de polen y
alimentos vegetales. Según solo estos resultados RAST es
prácticamente imposible distinguir entre estos dos tipos de
suero.
Las Figs. 7A, 7B, 7C muestran los resultados de
un RAST modificado para evitar la detección de anticuerpos IgE
irrelevantes clínicamente contra determinantes carbohidrato. Se hizo
una comparación entre un RAST convencional (no modificado) y el RAST
modificado (es decir, en presencia de extracto de polen digerido por
proteasa) según la presente invención. Para este propósito se usó
suero de tres pacientes típicos: 1) un paciente alérgico al polen
con un RAST positivo a alimentos vegetales sin ningún síntoma
relacionado de alergia a alimentos (asintomático); 2) un paciente
alérgico a polen de abedul con síntomas leves de alergia a alimentos
(síndrome de alergia oral), basado en alérgenos de reacción cruzada
de polen-alimentos vegetales; 3) un paciente
alérgico al polen de hierba con alergia a fruta más grave
(anafilaxis), pero sin reactividad cruzada entre polen y alimentos
vegetales. Se demuestra que el RAST convencional produce un
resultado falso positivo para el paciente asintomático mientras que
el RAST modificado da una imagen mucho más realista sobre la amenaza
alérgica potencial.
La Fig. 8 muestra resultados de RAST usando un
extracto de melocotón tratado con pepsina como una fuente de
alérgeno. El extracto de melocotón se digirió con la pepsina
durante diferentes periodos de tiempo (1 min a 1 h). Después de la
digestión, se acoplaron a Sefarosa muestras del extracto para
aplicación en un RAST. El análisis RAST se realizó con suero de un
paciente con una alergia a la fruta leve relacionada con polen de
abedul (SAO) y con un suero de un paciente que sufría una alergia a
la fruta más grave (anafilaxis). Mientras que los anticuerpos de
ambos pacientes son reactivos con extracto de melocotón no
digerido, virtualmente no se observó reactividad IgE del paciente 1
(SAO) con extracto de melocotón digerido con pepsina. Este efecto
tuvo también lugar con extracto de melocotón que se había tratado
con pepsina durante sólo 1 minuto. Para el otro paciente el valor
RAST no cambió significativamente, no incluso cuando se usó un
extracto de melocotón que se había sometido a un tratamiento con
pepsina 1 hora. Esto indica que los anticuerpos IgE del segundo
paciente reconocen un alérgeno que es extremadamente resistente al
tratamiento con pepsina. En otras palabras, reconocen y se unen a
una molécula alergénica que muy probablemente pasará el estómago en
una conformación de unión a IgE.
La Fig. 9 se refiere a un RAST de inhibición con
extracto de melocotón no digerido y tratado con pepsina (durante 1
hora). Se usaron suero de un paciente con una alergia leve (SAO) y
otro suero de un paciente con alergia grave (anafilaxis). Después
de la digestión con pepsina, la potencia inhibitoria del extracto no
cambió para el suero del paciente con alergia grave, lo que indica
que los anticuerpos IgE del paciente reconocen selectivamente y se
unen a un epítopo que no se destruye por el tratamiento con
pepsina. Para el suero del paciente con SAO se observó una
disminución de al menos un orden de magnitud lo que indica que los
anticuerpos IgE del paciente se unen a un epítopo peptídico que
está presente en el extracto de melocotón no digerido pero que está
ausente en el extracto de melocotón digerido debido a la división
por pepsina.
Las Figs. 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, 10F muestran
resultados obtenidos del análisis RAST de varios extractos de
alimentos naturales (es decir, no digeridos) y digeridos con
pepsina. Para varios tipos de frutos secos y fruta se ha
investigado la reactividad de un suero que contiene anticuerpos IgE
contra alérgeno(s) insensible(s) a pepsina y un suero
que contiene anticuerpos IgE contra alérgeno(s)
sensible(s) a pepsina. El RAST modificado según la presente
invención distingue claramente entre ambos tipos de suero.
La Fig. 11 muestra el resultado de un RAST con
extracto de alérgeno de gamba no digerido y digerido por pepsina.
Para dos sueros de pacientes que sufren alergia grave relacionada
con las gambas se demuestra que las estructuras de unión a IgE son
insensibles a la digestión por pepsina.
Los ensayos para la medida de la IgE específica
tienen las siguientes características. El material antigénico
deseado, por ejemplo, un supuesto o conocido agente alergénico tal
como un extracto de alimento, se inmoviliza en una fase sólida, ya
sea por unión covalente a una fase sólida activada químicamente (por
ejemplo, Sefarosa, gotas magnéticas, discos de papel, etc.) o por
unión no covalente (por ejemplo, a placas de micropocillos de
poliestireno). El suero obtenido de un individuo, normalmente de un
paciente alérgico o potencialmente alérgico, se incuba con la fase
sólida para dejar que los anticuerpos IgE
alérgeno-específicos se unan a los alérgenos
inmovilizados. En algunos ensayos, el material antigénico se
hapteniza (por ejemplo, biotinilado) y se incuba con suero, antes
de la adición de una fase sólida que contiene ligandos (por
ejemplo, estreptavidina) con afinidad por el hapteno. En este caso,
la inmovilización de los antígenos tiene lugar después de la
formación de complejos IgE antígeno- específico. Todos los ensayos
tienen en común que la incubación de suero y material antigénico es
seguida por varias etapas de lavado para retirar los componentes de
suero no unidos. Consecutivamente, se lleva a cabo una segunda
incubación con anticuerpos dirigidos a IgE humano. Estos
anticuerpos están marcados para permitir la detección de
anticuerpos unidos tras la incubación. El marcado se puede conseguir
de muchas formas como con radiactividad, con enzimas (por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o con marcas
fluorescentes o quimiluminiscentes. La segunda incubación es
seguida de nuevo de varias etapas de lavado para retirar los
anti-IgE marcados no unidos. La detección de la
marca unida se realiza con las técnicas apropiadas bien conocidas
en la materia.
Para evitar la detección de anticuerpos IgE
específicos de carbohidrato con diagnósticos de alérgenos de
alimentos, se añade un inhibidor soluble en la primera etapa de
incubación (suero más antígeno). El inhibidor soluble reacciona con
y bloquea los anticuerpos IgE específicos de carbohidrato,
previniéndoles por tanto de unirse a la fase sólida. Este inhibidor
soluble puede ser un extracto de polen digerido por proteasa. La
digestión con proteasa, por ejemplo, proteinasa K o pronasa resulta
en la destrucción de las cadenas principales del péptido de las
(glico)proteínas, pero deja estructuras carbohidrato
intactas (6). Los pólenes son la primera elección como fuente de
epítopos sacáridos, porque la inducción de los anticuerpos IgE
específicos de carbohidrato tiene lugar principalmente por
inhalación de polen (2). Estos anticuerpos IgE son reactivos
cruzados con estructuras carbohidrato relacionadas estrechamente en
alimentos vegetales. Por lo tanto, los extractos de alimentos
vegetales digeridos con proteasa pueden servir como inhibidores
alternativos. Finalmente, pueden usarse también péptidos sintéticos
que imitan epítopos sacáridos (7, 8).
Para detectar selectivamente anticuerpos IgE
dirigidos a alérgenos que sobreviven el paso a través del estómago y
así producir alergias graves, el material antigénico se somete a
digestión con pepsina. En el caso de extracto alimenticio de masa
seca congelada (que se usa normalmente en diagnósticos de alergia a
alimentos) como el material antigénico el extracto se somete a una
hora de digestión con pepsina a 37ºC. La pepsina puede ser soluble
o inmovilizarse en una matriz sólida como agarosa. La digestión se
lleva a cabo en HCl 10mMol/L a concentraciones de proteína
(extracto de alérgeno) de aproximadamente 1 a 5 mg/ml y
concentraciones de pepsina de 0,35% (peso/volumen). Después de 1
hora, se para la digestión por la adición de un \textonehalf
volumen de K_{2}HPO_{4} 0,5 Mol/L (pH 8,2). La digestión es
seguida por una diálisis sobre un medio adecuado para uso adicional
del extracto de alérgeno digerido (por ejemplo, acoplamiento a fase
sólida). Según el mejor modo de la invención la detección selectiva
de anticuerpos IgE dirigidos a epítopos IgE estables, es decir,
resistentes a pepsina de naturaleza peptídica se combina con la
adición de un inhibidor de IgE que permite evitar la detección de
anticuerpos IgE dirigidos a epítopos similarmente estables pero
irrelevantes clínicamente.
En pruebas de piel convencionales, el material
antigénico, por ejemplo, un extracto alimenticio, se inyecta en la
piel para medir la respuesta alérgica inmediata inducida por IgE.
Esta respuesta está mediada por el entrecruzamiento de los
anticuerpos IgE unidos al mastocito. Esto requiere el reconocimiento
de al menos dos epítopos en una única molécula de alérgeno. En el
extracto de polen digerido con proteasa los epítopos sacáridos son
entidades de unión a IgE monovalentes libres. No actuarán, por
tanto, como un agente entrecruzador pero bloquearán los anticuerpos
IgE unidos al mastocito con especificidad carbohidrato. Cualquier
reacción posible de la piel mediada por estos anticuerpos IgE se
inhibirá por tanto si el extracto de polen digerido con proteasa se
añade al material de la prueba de la piel.
Cuando se usa material antigénico digerido con
pepsina solamente los alérgenos insensibles a pepsina serán capaces
de inducir una reacción de la piel. Los materiales de la prueba de
piel tratados con pepsina son, por lo tanto, reagentes adecuados
para probar in vivo las respuestas de IgE a alérgenos
estables, incluyendo alérgenos de alimentos estables, que se
introducen en el cuerpo de un individuo vía la ruta oral.
Para que la invención descrita en el presente
documento se pueda entender mejor, se ponen los siguientes
ejemplos. Los ejemplos tienen sólo propósitos ilustrativos y no
deben interpreten como limitantes en ningún sentido de esta
invención. En particular, el experto en la materia entenderá que
los resultados informados de aquí en lo sucesivo para alérgenos
alimenticios pueden bien extrapolarse a cualquier otro material
antigénico ingerido oralmente de naturaleza química similar o
comparable.
Los extractos de polen se digirieron con
proteinasa K o pronasa por una incubación durante la noche a 50ºC.
Para la digestión de 25 mg de proteínas de polen, se usaron
aproximadamente 3 unidades de proteinasa K o pronasa
respectivamente, siguiendo un procedimiento descrito en (6). Es
esencial comprobar si la cadena principal del péptido de las
proteínas (alergénicas) se ha digerido suficientemente para asegurar
que virtualmente todos (>99,9%) los epítopos peptídicos se han
destruido, es decir, se han partido o de otra manera se han hecho
inactivos. Para este propósito los contenidos de tres alérgenos
principales únicos, denominados alérgeno grupo 1 (Fig. 1A),
alérgeno grupo 5 (Fig. 1B) y alérgeno grupo 11 (Fig. 1C), se
midieron con inmunoensayos basados en anticuerpos IgE monoclonales.
Las Figuras 1A, 1B y 1C ilustran el elevado grado de digestión de
proteína de estos tres alérgenos principales en extracto de polen
de hierba tratado con proteinasa K, como se determina en los RIA
competitivos: cuando se usa extracto de polen de hierba digerido con
proteinasa K como el agente competidor (``inhibidor'') las
concentraciones de los principales alérgenos marcados
radiactivamente purificados unidos a IgE permanecen virtualmente sin
afectar, es decir, constantes a los niveles iniciales, incluso al
aplicar las más elevadas concentraciones de inhibidor. Por otro
lado, cuando se usa extracto de polen no digerido, los alérgenos
naturales contenidos en él compiten con los alérgenos purificados
marcados radiactivamente para unirse a los anticuerpos IgE
alérgeno-específicos, lo que resulta en una
inhibición dependiente de dosis y así en una disminución de
alérgenos marcados radiactivamente unidos a IgE detectables. Estos
resultados indican que en los tres casos al menos el 99% de la
actividad original, es decir, de los epítopos peptídicos de unión a
IgE originales de los alérgenos principales probados, se
destruyeron. Como un segundo control de la digestión eficaz, se
analizaron por SDS-PAGE conjuntamente con teñido
con plata, extractos no digeridos y digeridos. Los extractos
digeridos carecían virtualmente de todas las bandas de proteínas
presentes originalmente en los extractos.
Se acopló extracto de polen de hierba digerido
con proteasa a Sefarosa para aplicación en un RAST. La cantidad de
extracto de polen de hierba digerido acoplado a sefarosa era
equivalente a la cantidad no digerida (4mg peso seco en 100 mg
Sefarosa) acoplada a la misma para una prueba rutinaria. La Fig. 2
ilustra que algunos sueros reconocieron extracto de polen digerido
y no digerido, mientras que otros solo reconocieron extracto de
polen no digerido. Esto era una primera indicación de que el primer
grupo podía haber reconocido epítopos sacáridos. La Fig. 3 muestra
que la unión a IgE se perdió después de tratamiento de periodato de
extractos de alérgeno, indicando la implicación de determinantes
azúcar. Lo que es más, los sueros que eran activos en la unión de
IgE a extractos de polen digerido también reconocieron
glicoproteínas purificadas no relacionadas en absoluto con las que
tenían solamente un N- glicano similar en común (Fig. 4). El RAST a
una muestra de extracto de polen digerido se inhibió completamente
por dicha glicoproteína no relacionada (Fig. 5). Juntos, estos
datos demuestran que un RAST positivo para extractos de polen
digeridos por proteasa se explica por la unión de IgE a
determinantes carbohidrato.
Sueros de pacientes con anticuerpos IgE
carbohidrato-específicos mostraron tener un RAST
positivo para un amplio espectro de alimentos vegetales (2). Por
inhibición RAST estos anticuerpos IgE mostraron ser muy reactivos
cruzados. Sin embargo, no todos los sueros con dicho amplio espectro
de reactividad cruzada de IgE tienen anticuerpos
anti-carbohidrato. En algunos casos los anticuerpos
IgE mostraron estar implicados en la elevada reactividad cruzada de
alérgeno profilina (1, 2, 9). Es muy difícil distinguir entre ambos
tipos de suero según RASTs de alimentos habituales (Fig. 6). La
reactividad con profilina se reconoce, sin embargo, que indica una
elevada probabilidad de desarrollar alergia clínica a alimentos en
muchos casos, en donde los sujetos con IgE anticarbohidrato carecen
de síntomas de alergia relacionada con alimentos.
Un grupo de pacientes alérgicos al polen de
hierba (n=173) se discriminó en un RAST para anticuerpos IgE contra
cacahuetes (3). Casi 1/3 (n=50) tuvo un RAST de cacahuete positivo
claro. Ninguno de estos pacientes, sin embargo, desarrolló síntomas
de alergia clínica relacionada con el cacahuete. Cuando se probaron
los anticuerpos IgE contra estructuras carbohidrato, más del 90%
fueron positivos, lo que sugiere que los anticuerpos con esta
especificidad eran en gran medida responsables de los resultados de
RAST de cacahuete falsos positivos. Esto se confirmó en un ensayo de
inhibición RAST de cacahuete. El RAST de cacahuete se inhibió
completamente por extracto de polen de hierba digerido. Este no fue
el caso para el suero de los pacientes con una alergia a cacahuetes
clínica. Estos datos implican que los anticuerpos IgE contra
determinantes carbohidrato son inductores pobres, si llegan, de una
liberación de moléculas mediadoras que inician una reacción
alérgica y que se liberan desde células efectoras, principalmente
células mastocitos y basófilas. Esto se confirmó tanto in
vivo como in vitro.
Las pruebas de pinchazo de piel con extracto de
cacahuete son negativas en sujetos no sintomáticos. La liberación de
histamina de basófilos de individuos no sintomáticos puede
inducirse pero solamente a concentraciones de extracto de cacahuete
aproximadamente 1000 veces mayores que aquellas que se requieren
para una estimulación correspondiente de basófilos de individuos
sintomáticos. Este hallazgo confirma que los anticuerpos IgE
carbohidrato-específicos tienen actividad biológica
pobre y la detección de dichos anticuerpos no es indicativa de una
probabilidad para desarrollar una alergia clínica a alimentos.
Como se señala, el procedimiento mejorado se
dirige a evitar la detección de anticuerpos IgE
carbohidrato-específicos en pruebas de diagnóstico
para alergia a alimentos. Esto puede conseguirse por la adición de
extracto de polen digerido por proteasa soluble. A una
concentración de 50 \mug por prueba los RAST de cacahuete falsos
positivos se inhibieron completamente, mientras que las pruebas
positivas relevantes clínicamente permanecieron positivas (3). Este
enfoque se probó también para otros alimentos vegetales. En la Fig.
7A se muestran dos ejemplos de la inhibición de un RAST falso
positivo para alimentos vegetales. Como control, se probaron sueros
tomados de pacientes que sufrían síntomas de alergia clínica usando
los procedimientos RAST convencional y mejorado (Fig. 7B, Fig. 7C).
Se observó que la exposición de estos sueros a extracto de polen de
hierba digerido con proteasa según la presente invención no
resultaron en una inhibición de los anticuerpos IgE lo que confirma
la asunción de que en estos casos los anticuerpos IgE se dirigen a
los epítopos peptídicos más relevantes clínicamente de los
alérgenos alimenticios probados.
Era importante darse cuenta de que la reactividad
de IgE con los alimentos vegetales no es necesariamente o
completamente anti-carbohidrato o
anti-péptido. Los sueros pueden contener y
normalmente lo hacen poblaciones mezcladas de anticuerpos IgE con
especificidades contra diferentes componentes antigénicos de
alimentos vegetales. Esto significa que la inhibición de un RAST con
extractos de polen digeridos por proteasa puede también ser
parcial. El objetivo del procedimiento mejorado según la presente
invención es reducir o prevenir totalmente la detección de
anticuerpos IgE que se dirigen a epítopos sacáridos de moléculas
antigénicas.
Como se menciona anteriormente la aparición
clínica de alergia a ingredientes alimenticios, particularmente de
alimentos vegetales, puede diferir muy considerablemente. Los
pacientes alérgicos al polen de abedul con alergia a frutas como la
manzana y el melocotón normalmente demuestran síntomas locales leves
(SAO). La base para la coincidencia de la alergia por inhalación y
la alergia a alimentos se encuentra en la presencia de alérgenos
relacionados en el polen y la fruta (2). Los anticuerpos IgE de
reacción cruzada dirigidos al alérgeno del polen de abedul Bet v 1
y al alérgeno del polen profilina reconocen homólogos en frutas.
Pacientes con síntomas más graves por consumo de frutas como
manzana y melocotón no tienen necesariamente alergia al polen (10).
La alergia a las frutas en este caso es independiente de una
sensibilización al polen.
Los alérgenos en fruta que producen formas más
graves de alergia a alimentos son extremadamente resistentes a la
digestión con pepsina. Los alérgenos de reacción cruzada típicos
relacionados con el polen se digieren completamente en minutos. La
estabilidad se probó usando muestras de extracto de melocotón,
expuestas durante tiempos diferentes a pepsina, en un RAST con
muestras de suero de un paciente alérgico leve a la fruta
(reacción cruzada con polen) y uno grave (no reactivo con polen)
(Fig. 8). El suero de estos pacientes se usó también en una
inhibición RAST de melocotón con extracto de melocotón digerido con
pepsina y no digerido. Después de 1 hora de digestión con pepsina,
solo el RAST del paciente con síntomas más graves se inhibió (Fig.
9).
Para medir selectivamente anticuerpos IgE
dirigidios a alérgenos insensibles a pepsina, se trataron extractos
de alimentos con pepsina antes de la inmovilización en sefarosa.
Este enfoque se probó con varios extractos de alérgenos de
alimentos: manzana, melocotón, avellana, nuez, cacahuete y almendra.
Además, el enfoque se probó también para extractos de alimentos de
origen animal que se conocía que producían alergias graves a
alimentos, particularmente para extractos obtenidos de animales
invertebrados tales como gambas. Este enfoque era para probar
diferentes tipos de pacientes con alergia leve a alimentos
relacionada con polen y con alergia a alimentos ``real'' más grave
y para descubrir si la digestión con pepsina resultaría en una
detección selectiva de anticuerpos IgE en el último grupo (es decir,
aquellos con síntomas de alergia más grave).
En las Figuras 10A a 10F se ilustra que el
enfoque de hecho distingue entre ambos tipos de pacientes. Algunos
sueros tienen un RAST positivo con extractos digeridos y no
digeridos, otros solo con no digeridos. También probamos varios
sueros obtenidos de pacientes con alergia conocida a las gambas (lo
que es una importante representación de animales invertebrados que
son parte de muchos platos y creaciones alimenticias) usando tanto
extractos digeridos como no digeridos. Aquí no encontramos ninguna
disminución significativa en la unión a IgE después del tratamiento
con pepsina (Fig. 11). Esto confirma la estabilidad y la
alergenicidad potencial de los alérgenos alimenticios que se da en
gambas y probablemente en invertebrados relacionados del mismo
tipo.
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Claims (8)
1. Un procedimiento para diagnósticos de alergia,
particularmente para diagnósticos de alergia a alimentos, que
comprende la reacción de uno o más anticuerpos IgE de un individuo
con material antigénico para probarlo para potencial alergénico, y
consecutivamente determinar la formación de complejos IgE/antígeno,
caracterizados porque los anticuerpos IgE, preferiblemente
una muestra de suero que contiene anticuerpos IgE, obtenidos de
dicho individuo se exponen a
a) un inhibidor que se adhiere o une a y/o
bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una
especificidad para antígenos con epítopos sacáridos, en el que el
inhibidor se elige del grupo formado por extracto de polen digerido
por proteasa, extracto de alimento vegetal digerido por proteasa, un
péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un
glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido
de esencialmente la misma composición y estructura que se da en un
extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal, convirtiendo
por ello anticuerpos IgE en sustancialmente incapaces de reaccionar
con un epítopo sacárido de un antígeno de dicho material antigénico;
y/o a
b) una porción digerida por proteasa de dicho
material antigénico; y a
c) una porción no digerida de dicho material
antigénico; con lo que la formación de complejos IgE/antígeno se
detecta y se evalúa respecto a la determinación de complejos
IgE/antígeno relevantes clínicamente en los que el anticuerpo IgE se
une a un epítopo esencialmente peptídico de un antígeno que se da
en dicha porción digerida por proteasa de dicho material antigénico
y/o en dicha porción no digerida.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el material antigénico es un extracto
alimenticio, un extracto de planta o un extracto de fruta,
particularmente un extracto de alimento vegetal o animal.
3. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la digestión de
proteína del material antigénico se lleva a cabo con al menos una
proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano,
preferiblemente con pepsina.
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el inhibidor es un extracto
alimenticio vegetal o de polen digerido por proteinasa K o
pronasa.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la detección
de los complejos IgE/antígeno y/o de los antígenos no unidos se
lleva a cabo por inmunoensayos tales como ELISA (ensayo de
inmunoabsorbencia de unión a enzima) o RAST (prueba de absorbencia
radio- alergo), o por procedimientos quimiluminiscentes.
6. Un kit de diagnóstico que comprende
a) una muestra de material antigénico natural, no
digerido para probarlo para potencial alergénico; y
b) un inhibidor que se adhiere o se une a y/o
bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una
especificidad para antígenos con un epítopo sacárido y que
convierten anticuerpos IgE en sustancialmente incapaces de
reaccionar con epítopos sacáridos presentes en una porción digerida
por proteasa y/o no digerida de dicho material antigénico, en el
que el inhibidor se elige del grupo formado por extracto de polen
digerido por proteasa, un extracto alimenticio vegetal digerido por
proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza
antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un
epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y
estructura que la que se da en un extracto de polen o en un
extracto de alimento vegetal; y/o
c) una porción digerida por proteasa,
preferiblemente digerida por pepsina, de dicho material antigénico,
que permite una estimación de la gravedad esperada de la respuesta
alérgica o una detección selectiva de los anticuerpos IgE en
pacientes con síntomas de alergia más graves;
para uso en un procedimiento según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Uso de una muestra de un material antigénico
natural, no digerido para probarlo para potencial alérgico junto
con una porción digerida por proteasa del mismo y/o junto con un
inhibidor que se adhiere o se une a y/o bloquea el paratopo de los
anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con
epítopos sacáridos, en el que el inhibidor se elige del grupo
formado por extracto de polen digerido por proteasa, un extracto
alimenticio vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la
estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula
sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la
misma composición y estructura que la que se da en un extracto de
polen o en un extracto de alimento vegetal, para la elaboración de
una composición para determinar una respuesta alérgica de un
individuo a un material antigénico ingerible por vía oral o nasal
para aplicarse en una prueba de piel.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el
material antigénico digerido por proteasa se digiere por al menos
una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano,
preferiblemente por pepsina.
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