ES2327912T3 - Agentes de contraste para formacion de imganes de resonancia magnetica y metodos relacionados con los mismos. - Google Patents

Abstract

Un método para generar una imagen de un material objeto que comprende: proporcionar un material objeto que comprende una pluralidad de células, en el que un subconjunto de las células sobre-expresa o expresa ectópicamente una cantidad detectable por IRM de una proteína ferritina recombinante, donde dicha ferritina está en complejo con hierro endógeno y formar imágenes de las células mediante formación de imágenes de resonancia magnética.

Description

Agentes de contraste para formación de imágenes de resonancia magnética y métodos relacionados con los mismos.

Las herramientas que permiten visualizar expresión génica in vivo son de importancia fundamental para el futuro de la medicina y las ciencias biológicas. El campo emergente de medicina genética requiere métodos de formación de imágenes no invasivos que puedan indicar dónde, cuándo y si se han administrado genes terapéuticos y si la proteína deseada se ha expresado. En la esfera de la investigación biológica básica, la capacidad de formar imágenes del momento y el emplazamiento de la expresión génica in vivo es una necesidad fundamental.

Los científicos típicamente supervisan la expresión génica incorporando un gen marcador que se expresa junto con el gen de interés, con frecuencia como una fusión transcripcional o traduccional. La detección de los productos del gen marcador se consigue con mayor frecuencia usando preparaciones histológicas (por ejemplo, usando un ensayo de \beta-galactosidasa) o usando microscopía de fluorescencia (por ejemplo, usando proteína fluorescente verde o GFP). Ninguno de estos métodos permite formación de imágenes no invasiva de tejidos u otros conjuntos macroscópicos de células. Los marcadores que requieren preparación histológica no se pueden detectar sin sacrificar el material objeto. Se pueden formar imágenes de los marcadores fluorescentes en células vivas, pero incluso con las tecnologías ópticas más sofisticadas disponibles, no es posible formar imágenes en profundidades tisulares que superen aproximadamente 500 \mum. Se han usado otros métodos tales como PET (tomografía de emisión de positrones), cámaras gamma y SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotones individuales) para detectar expresión génica in vivo, pero todos estos sufren de resolución espacial limitada, que está en el orden de milímetros cúbicos o mayor.

La IRM es una herramienta de diagnóstico clínico usada ampliamente que permite la formación de imágenes no invasiva de sujetos ópticamente opacos y proporciona contraste entre tejidos blandos a resolución espacial elevada. En la mayoría de aplicaciones clínicas, la señal de IRM se obtiene a partir de protones de las moléculas de agua presentes en los materiales de los cuales se están formando imágenes. La intensidad de imagen de tejidos se determina mediante varios factores. Las propiedades físicas de un tejido específico, tales como la densidad protónica, el tiempo de relajación longitudinal (T1) y el tiempo de relajación trasversal (T2) con frecuencia determinan la cantidad de señal disponible.

Se han desarrollado varias composiciones denominadas "agentes de contraste" para proporcionar contraste mejorado entre tejidos diferentes. Los agentes de contraste comúnmente afectan T1, T2 o ambos. En general, los agentes de contraste se hacen potentes por la incorporación de metales con electrones d o f no apareados. Por ejemplo, los agentes de contraste de T1 con frecuencia incluyen un ión metálico de lantánido, habitualmente Gd^{3+}, que está quelado a una molécula de bajo peso molecular para limitar la toxicidad. Los agentes de T2 con frecuencia consisten en partículas pequeñas de magnetita (FeO-Fe_{2}O_{3}) que están recubiertas con dextrano. Ambos tipos de agentes interaccionan con agua móvil en tejido para producir contraste; los detalles de esta interacción microscópica difieren dependiendo del tipo de agente.

Los agentes de contraste más ampliamente usados son exógenos, lo que significa que el agente de contraste se produce externamente y después se administra al tejido o células de los que se tienen que formar imágenes. Los agentes de contraste exógenos generalmente se administran a través del sistema vascular, típicamente tienen una distribución no selectiva y son fisiológicamente inertes. Los agentes de contraste exógenos se usan para resaltar la anatomía con poco contraste intrínseco, así como para visualizar diversas patologías que alteran el flujo vascular normal o provocan una ruptura en la barrera hematoencefálica. Ninguno de estos agentes atraviesa las membranas celulares fácilmente y, por lo tanto, es difícil adaptar la tecnología existente para el análisis de acontecimientos intracelulares.

Se necesita una generación nueva de agentes de contraste de IRM para adaptar esta tecnología de formación de imágenes poderosa a las necesidades de medicina molecular e investigación biológica.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

También se describen agentes de contraste para formación de imágenes de resonancia magnética que se sintetizan en un material objeto dirigido mediante una secuencia de ácidos nucleicos. Los agentes de contraste se hacen potentes mediante el secuestro de átomos metálicos disponibles, típicamente átomos de hierro. En determinados aspectos, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de unión a metal que actúa, directamente o indirectamente, para impartir un efecto de contraste a la célula en la que se produce. La invención se refiere además a métodos para generar y emplear los agentes de contraste objeto.

En determinadas realizaciones, la invención se refiere a métodos para generar una imagen de un material objeto formando imágenes de un material objeto que comprenda una pluralidad de células donde un subconjunto de células sobre-expresa o expresa ectópicamente una cantidad detectable por IRM de proteína de contraste, siendo dicha proteína de contraste ferritina recombinante en complejo con hierro endógeno. En realizaciones preferidas, la cantidad de proteína de contraste presente en células diferentes se puede distinguir y, opcionalmente, células que comprenden cantidades medibles de proteína de contraste se distinguen de células u otros componentes del material que no comprenden la cantidad medible de proteína de contraste.

En otra realización, los métodos de la invención comprenden detectar expresión génica formando imágenes de una célula que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de ferritina, donde dicha célula sobre-expresa o expresa ectópicamente ferritina y donde dicha ferritina está en complejo con hierro endógeno. La detección de la proteína de contraste mediante formación de imágenes de resonancia magnética indica que el ácido nucleico que codifica la proteína de contraste se expresa y/o se ha expresado. Las proteínas de unión a metal preferidas de la invención incluyen proteínas de unión a metal que son idénticas en al menos el 60%, opcionalmente al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 99% o el 100% a una secuencia como se muestra en cualquiera de SEC ID Nº: 2 y 4.

Los métodos descritos en este documento se pueden usar básicamente con cualquier material capaz de generar el agente de contraste in situ. Por ejemplo, el material objeto puede ser una célula, opcionalmente una célula que sea parte de un cultivo celular, parte de un tejido in vitro o parte de un organismo multicelular, tal como, por ejemplo, un hongo, una planta o un animal. En realizaciones preferidas, el material objeto es un mamífero vivo tal como un ratón o un ser humano.

En este documento también se describen vectores para transfección de un organismo multicelular que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un agente de contraste. El agente de contraste puede ser una proteína de unión a metal. Opcionalmente, el vector es un vector viral obtenido a partir de un virus seleccionado entre el grupo: un adenovirus, un virus asociado a adenovirus, un virus de herpes simple, un retrovirus, un alfavirus, un poxvirux, un arena virus, un virus vaccinia, un virus influenza, un virus de polio y un híbrido de cualquiera de los anteriores.

También se describen sistemas de administración para introducir ácidos nucleicos de la invención en el material objeto, tales como partículas virales adecuadas para trasfectar una célula de mamífero, que comprenden un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de un agente de contraste, tal como un agente de contraste descrito anteriormente. Opcionalmente, la partícula viral se obtiene a partir de uno o más de los siguientes: un adenovirus, un virus asociado a adenovirus, un virus de herpes simple, un retrovirus, un alfavirus, un poxvirus, un arena virus, un virus vaccinia, un virus influenza y un virus de polio. Además se describen suspensiones coloidales adecuadas para transfectar una célula de mamífero que comprenden un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de un agente de contraste, tal como un agente de contraste descrito anteriormente. Los tipos opcionales de suspensiones coloidales incluyen una o más de las siguientes: un complejo de macromolécula, una nanocápsula, una microesfera, una perla, unas emulsiones de aceite-en-agua, una micela, una micela mixta y liposomas.

También se describen células, cultivos celulares, cultivos celulares organizados, tejidos, órganos y organismos no humanos que comprenden un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia codificante de un agente de contraste, tal como un agente de contraste descrito anteriormente. El organismo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en: un ratón, una rata, un perro, un mono, un cerdo, una mosca de la fruta, un gusano nemátode y un pez o como alternativa una planta u hongo. Las células, cultivos celulares, cultivos celulares organizados, tejidos, órganos y organismos no humanos pueden comprender un vector como se ha descrito anteriormente.

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la especialidad de la técnica. Tales técnicas se explican en su totalidad en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed por Sambrook, Fristch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984; Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc, 1987); Immobilized Cell And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Labotatory); Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu et al. eds.). Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986): Manipulating the Mouse Embryo. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N. Y., 1986).

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Las reivindicaciones proporcionadas más adelante se incorporan por este medio en esta sección como referencia.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Correlación entre aumento de ferritina y 1/T_{1} (a) y 1/T_{2} (b) en tumores simulados. La línea continua se ajusta por mínimos cuadrados a través de los datos (guía para el ojo). Los valores se normalizan para dar un aumento de ferritina sobre el valor de línea basal medio del gránulo de control, que es 1,5 mg/ml de ferritina; las muestras experimentales se incubaron con concentraciones diversas de citrato de amonio férrico (FAC) y las muestras de control se incubaron en ausencia de FAC. Las barras de error representan la desviación típica para N=4 rondas experimentales.

Figura 2. Datos que muestran el porcentaje del número total de células restantes después del periodo de 16 horas de carga de ferritina. Para cada concentración de FAC (y control), se realizó el recuento de células antes y después del periodo de incubación 3 veces usando un hemocitómetro y los resultados se promediaron. Las barras de error representan la desviación típica de los experimentos de incubación separados (N=4).

Figura 3. Imagen de IRM de tres muestras de tumor simulado. Aquí, (a) es el control y (b) y (c) son las muestras que contienen un aumento de ferritina de 2,7 y 4, respectivamente. El contraste entre estas muestras es fácilmente evidente en esta imagen potenciada con T_{2}. Las imágenes se adquirieron simultáneamente usando un sistema de IRM Bruker 7-Tesla con TE/TR = 45/2000 ms, 128\times128 puntos de imagen y un corte de 1 mm de espesor. El tamaño del gránulo fue aproximadamente 4 mm de diámetro.

Figura 4: Imagen de IRM a través de células de glioma 9L granuladas transfectadas con proteínas de contraste de cadena ligera (LF) y pesada (HF) de ferritina. La muestra de la izquierda es el control (sin ADN añadido durante la incubación). El contraste de imagen es fácilmente evidente entre los dos gránulos. La expresión del informador vuelve a las células oscuras en la imagen de RM. Esta imagen se adquirió usando un sistema de IRM 11.7 Tesla con una secuencia de pulso 2DFT potenciada con T_{2} convencional. Esta imagen se adquirió a 4ºC.

Figura 5: Imagen de IRM a través de células 9L granuladas infectadas con proteínas de contraste de cadena ligera (LF) y pesada (HF) de ferritina mediante un adenovirus. La muestra de la izquierda es el control (células no infectadas). El contraste de imagen es fácilmente evidente entre los dos gránulos. (Se observa que los puntos oscuros intensos en los gránulos son artefactos de burbujas). Esta imagen se adquirió usando un sistema de IRM 11.7 Tesla y una secuencia de pulso 2DFT potenciada con T_{2} convencional. Esta imagen se adquirió a 4ºC.

Figura 6: Secuencia de ADNc de cadena pesada de ferritina humana (BC016009) (SEC ID Nº: 1). La región codificante está subrayada.

Figura 7: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de ferritina humana (AAH16009) (SEC ID Nº: 2).

Figura 8: Secuencia de ADNc de cadena ligera de ferritina humana (XM_050469) (SEC ID Nº: 3). La región codificante está subrayada.

Figura 9: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de ferritina humana (XP_050469) (SEC ID Nº: 4).

Figura 10: Secuencia de ADNc de cadena pesada de ferritina de mus musculus (NM_010239.1) (SEC ID Nº: 5). La región codificante está subrayada.

Figura 11: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de ferritina de mus musculus (NP_034369.1) (SEC ID Nº: 6).

Figura 12: Secuencia de ADNc 1 de cadena ligera de ferritina de mus musculus (NM_010240.1) (SEC ID Nº: 7). La región codificante está subrayada.

Figura 13: Secuencia de aminoácidos 1 de cadena ligera de ferritina de mus musculus (NP_034370.1) (SEC ID Nº: 8).

Figura 14: Secuencia de ADNc 2 de cadena ligera de ferritina de mus musculus (NM_008049.1) (SEC ID Nº: 9). La región codificante está subrayada.

Figura 15: Secuencia de aminoácidos 2 de cadena ligera de ferritina de mus musculus (NP_032075.1) (SEC ID Nº: 10).

Figura 16: Secuencia de ADNc de subunidad H de ferritina de rattus norvegicus (NM_012848.1) (SEC ID Nº: 11). La región codificante está subrayada.

Figura 17: Secuencia de aminoácidos de subunidad H de ferritina de rattus norvegicus (NP_036980.1) (SEC ID Nº: 12).

Figura 18: Secuencia de ADNc de cadena ligera 1 de ferritina de rattus norvegicus (NM_022500.1) (SEC ID Nº: 13). La región codificante está subrayada.

Figura 19: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera 1 de ferritina de rattus norvegicus (NP_071945.1) (SEC ID Nº: 14).

Figura 20: Secuencia de ADNc de receptor de transferrina de homo sapiens (NM_003234) (SEC ID Nº: 15). La región codificante está subrayada.

Figura 21: Secuencia de aminoácidos de receptor de transferrina de homo sapiens (NP_003225) (SEC ID Nº: 16).

Figura 22: Secuencia de ADNc de receptor 2 de transferrina de homo sapiens (NM_003227) (SEC ID Nº: 17). La región codificante está subrayada.

Figura 23: Secuencia de aminoácidos de receptor 2 de transferrina de homo sapiens (NM_003218) (SEC ID Nº: 18).

Figura 24: Secuencia codificante de receptor de transferrina de mus musculus (NM_011638) (SEC ID Nº: 19).

Figura 25: Secuencia aminoácidos de receptor de transferrina de mus musculus (NP_035768) (SEC ID Nº: 20).

Figura 26: Secuencia de ácidos nucleicos de receptor 2 de transferrina de mus musculus (NM_015799) (SEC ID Nº: 21). La región codificante está subrayada.

Figura 27: Secuencia de aminoácidos 2 de receptor de transferrina de mus musculus (NP_056614) (SEC ID Nº: 22).

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

"Secuencia codificante" se usa en este documento para referirse a la parte de un ácido nucleico que codifica una proteína particular. Una región codificante puede estar interrumpida por intrones y otras secuencias no codificantes que, en última instancia, se retiran antes de la traducción.

"Suspensión coloidal" se usa en este documento para referirse a una suspensión coloidal que comprende uno o más ácidos nucleicos para administración a células. El material en una suspensión coloidal generalmente se diseña para proteger ácidos nucleicos y para facilitar la administración de ácidos nucleicos a través de membranas celulares. Las suspensiones coloidales ilustrativas incluyen, pero sin limitación, micelas lipídicas, tubos, balsas, sándwiches y otras estructuras lipídicas, que con frecuencia comprenden lípidos catiónicos. Otras suspensiones coloidales incluyen nanocápsulas, microperlas y estructuras poliméricas de unión a ácidos nucleicos pequeñas, etc.

La expresión "agente de contraste" se usa en este documento para referirse a una molécula que genera un efecto contrastante in vivo, sea el efecto directo o indirecto o ambos. En realizaciones ilustrativas, "agente de contraste" se usa de forma intercambiable con "proteína de contraste" o "polipéptido de contraste". En el caso de un efector directo, la proteína de contraste típicamente formará un complejo que influye en los tiempos de relajación T1, T2 o T2*. Con frecuencia las proteínas de contraste directo forman complejos de metaloproteínas. Las categorías ilustrativas de proteínas de contraste incluyen, por ejemplo, proteínas de unión a metales y/o agentes que estimulan la producción de una o más proteínas de unión a metales, etc. Los efectores indirectos incluyen moléculas que provocan que una célula produzca una proteína de contraste directo y/o module una característica funcional, bioquímica y/o biofísica de una proteína de contraste directo, creando de ese modo un efecto de contraste. Las categorías ilustrativas de efectores indirectos incluyen, por ejemplo, proteínas y/o ácidos nucleicos que influyen en la expresión de una proteína de contraste directo, modulan la actividad de una proteína de contraste directo, modulan la unión a metal de una proteína de unión a metal, modulan la expresión de una proteína reguladora de hierro y/o modulan la actividad de una proteína reguladora de hierro, etc.

La expresión "efecto de contraste", como se usa en este documento con respecto a IRM, incluye cualquier alteración en la señal de IRM que vuelve diferente a una célula o tejido de otro de forma detectable. Un efecto de contraste puede implicar efectos sobre T1, T2 y/o T2*. En IRM, un sujeto que contiene agua móvil generalmente se coloca en un campo magnetostático grande. El campo tiende a alinear algunos de los momentos magnéticos (espines) de los núcleos de hidrógeno en el agua a lo largo de la dirección del campo. El tiempo de relajación longitudinal (T1) es la constante de tiempo de una población de núcleos colocados en un campo magnético que se tienen que equilibrar a lo largo de la dirección del campo magnético. T1 es la constante de tiempo de la transferencia de energía desde el sistema de espín al entorno (el entramado). El tiempo de relajación transversal (T2) es la constante de tiempo para que la precesión de núcleos en la frecuencia de Larmor permanezca en fase entre sí. Como alternativa, T2 se denomina el tiempo de memoria de fase de espín. Esta pérdida de coherencia de fases se atribuye a fluctuaciones de baja frecuencia del campo magnético que se deben comúnmente a interacciones entre espines. El tiempo de relajación T2* se define como 1/T2* = 1/T2 + \gamma\DeltaB, donde \gamma es la proporción giromagnética nuclear y \DeltaB es la inhomogeneidad de campo magnetostático externo.

Las expresiones "gen de contraste" o "ácido nucleico de contraste" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de una proteína de contraste.

Un "promotor regulado externamente" es un ácido nucleico que influye en la transcripción en respuesta a condiciones que se pueden proporcionar de una manera controlada por un especialista en la técnica. Los promotores regulados externamente se pueden regular mediante sustancias químicas específicas, tales como tetraciclina o IPTG o mediante otras condiciones tales como temperatura, pH, estado de oxidación, etc, que se controlan fácilmente de forma externa al sitio de trascripción.

La expresión "proteína Ferritina" tiene por objeto incluir cualquiera de un grupo de proteínas de dihierro-carboxilato caracterizadas por la tendencia a formar una estructura multimérica con hierro unido y que tiene una estructura de haz de hélice que comprende un residuo Glu coordinador de hierro en una primera hélice y un motivo Glu-X-X-His en una segunda. Determinadas ferritinas mantienen hierro unido en un estado principalmente Fe(III). Las bacterioferritinas tienen tendencia a ser hemoproteínas. Las ferritinas de vertebrados tienen tendencia a ensamblarse a partir de dos o más subunidades y las ferritinas de mamífero con frecuencia se ensamblan a partir de una cadena pesada y una cadena ligera. Muchas ferritinas forman estructuras huecas con un agregado con alto contenido de hierro en el interior. Las ferritinas ilustrativas se presentan en la Tabla 1 más adelante.

"Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología y la identidad se pueden cada una determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear con propósitos de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo o un residuo de aminoácido similar (por ejemplo, de naturaleza estérica y/o electrónica similar), entonces las moléculas se pueden denominar homólogas (similares) en esa posición. La expresión como un porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos idénticos o similares en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Una secuencia que está "no relacionada" o es "no homóloga" comparte una identidad de menos del 40%, aunque preferiblemente una identidad de menos del 25% con una secuencia de la presente invención.

El término "homología" describe una comparación basada matemáticamente de similitudes de secuencia que se usa para identificar genes o proteínas con funciones o motivos similares. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención se pueden usar como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia, secuencias relacionadas u homólogas. Tales búsquedas se pueden realizar usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al (1990) J Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación= 100, longitud de palabra= 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación= 50, longitud de palabra= 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se ha descrito en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y BLAST). Véase http://www.ncbi.nim.nih.gov.

Como se usa en este documento, "identidad" se refiere al porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos en posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar la correspondencia de secuencia, es decir, tomando en cuenta huecos e inserciones. La identidad se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, que incluyen, pero sin limitación, los que se describen en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed Oxford University Press, Nueva York, 1998; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 y Sequence Analysis Primer, Griskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991 y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1998). Los métodos para determinar identidad se diseñan para dar la mayor concordancia entre las secuencias ensayadas. Además, los métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles al público. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa BLAST X está disponible al público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).

La expresión "proteína de unión a hierro" como se usa en este documento tiene por objeto incluir proteínas que se unen a hierro en condiciones fisiológicamente pertinentes. Determinadas proteínas de unión a hierro interaccionan con hierro a través de un cofactor tal como hemo. En este documento también se describen muchos otros cofactores ilustrativos. Otras proteínas de unión a hierro forman un sitio de unión a hierro con los aminoácidos apropiados, que incluyen pero sin limitación, histidina, aspartato, glutamato, asparagina y glutamina. Aunque las proteínas de unión a hierro de la invención se unen a hierro, las mismas también se unen probablemente a otros metales. Por consiguiente, "proteínas de unión a hierro" como se usa en este documento no pretende indicar que la proteína se une a hierro exclusivamente o incluso que la proteína se une a hierro más fuertemente que a otros metales.

Una "proteína reguladora de hierro" se refiere a una proteína que está implicada en la utilización, procesamiento y/o acumulación de hierro en una célula. Las proteínas reguladoras de hierro incluyen, por ejemplo, proteínas que regulan la homeostasis del hierro, proteínas que regulan el tráfico de hierro hacia dentro y hacia fuera de una célula, proteínas implicadas en la regulación de la producción de elementos relacionados con hierro, tales como, por ejemplo, ferritina y transferrinas, etc. Las proteínas reguladoras de hierro pueden o no unirse directamente al hierro.

Como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). También se debería entender que la expresión incluye análogos de ARN o ADN hechos a partir de análogos de nucleótidos (incluyendo análogos con respecto a la base y/o la estructura, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de manitol, etc) y, aplicándolo a la realización que se está describiendo, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido), bicatenarios o de orden mayor.

La expresión "unido operativamente" se usa en este documento para referirse a la relación entre una secuencia reguladora y un gen. Si la secuencia reguladora está colocada con relación al gen de manera que la secuencia reguladora sea capaz de ejercer un efecto medible sobre la cantidad del producto génico producido, entonces la secuencia reguladora está unida operativamente al gen.

Un "polienlazador" es un ácido nucleico que comprende al menos dos y preferiblemente tres, cuatro o más sitios de restricción para escisión por una o más enzimas de restricción. Los sitios de restricción pueden ser solapantes. Cada sitio de restricción tiene preferiblemente cinco, seis, siete, ocho o más nucleótidos de longitud.

Un "ácido nucleico auxiliar recombinante" o más sencillamente "ácido nucleico auxiliar" es un ácido nucleico que codifica componentes funcionales que permiten que un segundo ácido nucleico se encapside en una cápside. Típicamente, en el contexto de la presente invención, el plásmido auxiliar u otro ácido nucleico, codifica funciones y proteínas estructurales virales que permiten que un vector viral recombinante se encapside dentro de una cápside. En una realización preferida, un ácido nucleico auxiliar de virus adeno-asociado (AAV) recombinante es un plásmido que codifica polipéptidos AAV y que carece de las regiones ITR de AAV. Por ejemplo, en una realización, el plásmido auxiliar codifica el genoma de AAV, con la excepción de las regiones ITR de AAV, que se reemplazan con secuencias ITR de adenovirus. Esto permite la replicación y encapsidación del vector recombinante sin capacidad de replicación AAV, mientras que previene la generación de virus AAV de tipo silvestre, por ejemplo, por recombinación.

Un "ácido nucleico regulador" o "secuencia reguladora" incluye cualquier ácido nucleico que pueda ejercer un efecto sobre la trascripción de una fase de lectura abierta unida operativamente. Un ácido nucleico regulador puede ser un promotor de núcleo, un elemento potenciador o represor, una región reguladora transcripcional completa o una parte funcional de cualquiera de los anteriores. Versiones mutantes de los anteriores también se pueden considerar ácidos nucleicos reguladores.

Una "fusión transcripcional" es una construcción de ácido nucleico que provoca la expresión de un ARNm que comprende al menos dos regiones codificantes. En otras palabras, se pueden organizar dos o más fases de lectura abiertas en una fusión transcripcional de manera que ambas fases de lectura abiertas se expresen como parte de un ARNm único y después den origen, según se especifique mediante la célula hospedadora, a polipéptidos separados. Las fases de lectura abiertas en una fusión transcripcional tienen tendencia a estar sujetas a la misma regulación transcripcional, pero los polipéptidos codificados pueden estar sujetos a destinos post-traduccionales diferentes (por ejemplo, degradación, etc). Una "fusión transcripcional" se puede contrastar con una "fusión traduccional" en la que dos o más fases de lectura abiertas están conectadas de manera de dar origen a un polipéptido único. Los polipéptidos fusionados en una "fusión traduccional" tienen tendencia a experimentar regulación transcripcional, traduccional y post-traduccional similar.

Como se usa en este documento, el término "transfección" se refiere a la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, en una célula receptora y tiene por objeto incluir términos usados comúnmente tales como "infecto" con respecto a un virus o vector viral. El término "transducción" generalmente se usa en este documento cuando la transfección con un ácido nucleico es por administración viral del ácido nucleico. "Transformación", como se usa en este documento, se refiere a un proceso en el que el genotipo de una célula cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de un polipéptido o, en el caso de expresión antisentido a partir del gen transferido, altera la expresión de una forma de origen natural de la proteína recombinante.

Como se usa en este documento, el término "transgen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se ha introducido en una célula. Células hijas que se obtienen a partir de una célula en la que se ha introducido un transgen también se dice que contienen el transgen (a menos que se haya suprimido). Un transgen puede codificar, por ejemplo, un polipéptido, parcialmente o completamente heterólogo, es decir, extraño, para el animal o célula transgénica en la que se introduce. Opcionalmente, un polipéptido codificado por transgen puede ser homólogo a un gen endógeno del animal o célula transgénica en la que se introduce, pero puede estar diseñado para insertarse o se inserta, en el genoma de una manera tal que altera el genoma de la célula en la que se inserta (por ejemplo, se inserta en un emplazamiento que difiere del del gen natural). Alternativamente, un transgen también puede estar presente en un episoma. Un transgen puede incluir una o más secuencias reguladoras transcripcionales y cualquier otro ácido nucleico, (por ejemplo, intrón), que pueda ser necesario para expresión óptima de una secuencia codificante seleccionada. Un transgen también puede no contener región codificante de polipéptido, pero en tales casos generalmente dirigirá la expresión de un ARN funcionalmente activo, tal como un ARNr, ARNt, ribozima, etc. Un "transgen terapéutico" es un transgen que se introduce en una célula, tejido y/u organismo con el propósito de alterar una función biológica de una manera que sea beneficiosa para un sujeto.

"Transfección transitoria" se refiere a los casos en los que se retiene ácido nucleico exógeno durante un periodo de tiempo relativamente corto, con frecuencia cuando el ácido nucleico no se integra en el genoma de una célula transfectada, por ejemplo, donde el ADN episomal se transcribe en ARNm y se traduce en proteína. Una célula se ha "transfectado de forma estable" con una construcción de ácido nucleico que comprende regiones codificantes virales cuando la construcción de ácido nucleico se ha introducido dentro de la membrana celular y las regiones codificantes virales son capaces de heredarse a células hijas.

"Partícula viral" es un conjunto de al menos un ácido nucleico y una cubierta que comprende al menos una proteína viral. En general, las partículas virales para uso en la administración de ácidos nucleicos a células conservarán la capacidad de insertar el ácido nucleico en una célula, pero pueden no tener capacidad para muchas otras funciones, tales como autorreplicación.

2. Métodos Ilustrativos

En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos, como se han definido anteriormente, para realizar IRM usando un agente de contraste intracelular que se genera in situ a través de instrucciones genéticas y que se ha hecho potente por el secuestro de átomos metálicos. Estos átomos metálicos secuestrados son átomos de hierro. En determinadas realizaciones, los métodos de la invención comprenden poner en contacto material objeto con un ácido nucleico que codifica instrucciones para la síntesis de un agente de contraste intracelular, tal como una proteína de unión a metal. En una realización de este tipo, tras la interiorización mediante una célula apropiada, el ácido nucleico dirige la producción de proteína de unión a metal que se vuelve potente como un agente de contraste mediante la unión a átomos metálicos disponibles. En otra realización, los métodos de la invención comprenden poner en contacto material objeto con una proteína o ácido nucleico que influya indirectamente en el contraste, por ejemplo, aumentando la cantidad de metal en la célula o influyendo en la expresión y/o actividad de una proteína de unión a metal. Los agentes de contraste intracelulares descritos en este documento se pueden emplear en la formación de imágenes de básicamente cualquier material biológico que sea capaz de producir un agente de este tipo, incluyendo pero sin limitación: células cultivadas, tejidos y organismos vivos que varían desde organismos unicelulares hasta organismos multicelulares (por ejemplo, seres humanos, mamíferos no humanos, otros vertebrados, plantas superiores, insectos, nemátodos, hongos, etc). Mientras que la mayoría de los sistemas biológicos contienen una diversidad de metales que tienen efectos de contraste potentes, se entiende que el hierro es generalmente el único metal de este tipo que está lo suficientemente concentrado para ser útil para volver potente a un agente de contraste intracelular. Sin embargo, si se desea, el material del que se van a formar imágenes se puede complementar con átomos metálicos exógenos y tales protocolos preferiblemente se optimizarán para reducir efectos nocivos causados por los átomos metálicos exógenos.

En determinadas realizaciones, la tecnología de contraste novedosa descrita en este documento se puede emplear para investigar la regulación de expresión génica in situ. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste se puede introducir en una célula, tejido y/o sujeto de interés. Esas células que tienen condiciones intracelulares apropiadas para expresión de la proteína de contraste se pueden distinguir por IRM de las células que no producen la proteína de contraste. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican la proteína de contraste están unidos operativamente a una secuencia reguladora constitutivamente activa. En realizaciones adicionales, la proteína de contraste está unida operativamente a una secuencia reguladora de forma que la producción de la proteína de contraste se pueda regular mediante la aplicación de una o más condiciones controladas exógenamente, tales como cambios de temperatura, concentración de un inductor o represor, etc. En otra realización, la actividad de la secuencia reguladora es, al menos, parcialmente desconocida. En una realización adicional, el ácido nucleico que codifica una proteína de contraste no está unido operativamente a una secuencia reguladora (o está unido operativamente a un promotor débil). Este tipo de construcción "sin promotor" se puede usar para identificar secuencias exógenas que suministren actividad reguladora de una manera análoga a un "potenciador trampa".

En determinadas realizaciones ilustrativas, los métodos de la invención se usan para supervisar la expresión de un transgen de interés, tal como un transgen terapéutico. El material objeto se pone en contacto con tanto un transgen de interés, tal como un transgen terapéutico, como con una construcción de ácido nucleico que comprenda la secuencia codificante de una proteína de contraste que esté unida operativamente a una secuencia reguladora. En una variación, la producción del transgen de interés y producción de la proteína de contraste están ambas moduladas por secuencias reguladoras funcionalmente similares (opcionalmente idénticas). Por ejemplo, si se ha puesto en contacto material objeto con un transgen bajo la dirección de un promotor constitutivo fuerte, tal como determinados promotores de repeticiones terminales virales, entonces la expresión del gen que codifica la proteína de contraste también estaría bajo la dirección del mismo promotor o un promotor diseñado para tener un patrón de expresión similar. En algunas variaciones, el transgen de interés se introduce en primer lugar y después, en un momento posterior, se introduce el ácido nucleico que codifica la proteína de contraste. En otras variaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de contraste se introduce al mismo tiempo que el transgen de interés y, opcionalmente, el ácido nucleico de contraste y el transgen de interés se localizan en el mismo vector. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico de contraste se expresa como una fusión transcripcional con el transgen de interés. En realizaciones adicionales, el gen de contraste y el transgen de interés (o una segunda copia de los mismos) se pueden expresar como una proteína de fusión. El enfoque de proteína de fusión puede ser deseable cuando se piense que la eficacia del transgen terapéutico está influida por regulación post-transcripcional. Se pueden formar imágenes del material objeto por IRM y se pueden detectar células que tengan la proteína de contraste y diferenciarlas de células que no tengan la proteína de contraste. En realizaciones preferidas, el nivel de contraste detectado por IRM estará correlacionado con o, será indicativo de, el nivel de expresión del transgen de interés.

En realizaciones ilustrativas adicionales, los métodos de la invención se pueden usar para investigar la actividad reguladora in situ de una secuencia reguladora de interés. El material objeto se pone en contacto con un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste, donde el ácido nucleico está unido operativamente a la secuencia reguladora de interés. Una vez que se ha interiorizado dentro de una célula apropiada, el gen de contraste se expresa en un nivel que está regulado por la secuencia reguladora de interés. En realizaciones preferidas, el nivel de contraste detectado por IRM estará correlacionado con el nivel de actividad de la secuencia reguladora de interés. La secuencia reguladora de interés puede ser básicamente cualquier secuencia reguladora, que incluya pero sin limitación un promotor, un potenciador, una región promotor/potenciador entera, una forma mutada o alterada de los anteriores o una o más partes de los anteriores.

En realizaciones adicionales ilustrativas, los métodos descritos en este documento se pueden usar para determinar si una secuencia reguladora fisiológicamente importante es activa in situ. Por ejemplo, la proteína p53 es un regulador ampliamente reconocido de proliferación y apoptosis celular que ejerce sus influencias reguladoras en parte como respuesta a daño de ADN. Por lo tanto, una construcción que comprenda una secuencia reguladora sensible a p53 unida operativamente a un ácido nucleico que codifique una proteína de contraste permitiría la detección de células, in situ, en las que se ha activado la ruta reguladora de p53. De forma similar, los métodos de la invención se pueden emplear para investigar, por ejemplo, el estado de rutas de señalización pro-proliferativas (por ejemplo, para identificar células cancerosas o precancerosas) o para evaluar el estado de rutas inflamatorias (por ejemplo, en tejidos de hospedador y/o donador en o próximos a órganos trasplantados) o para formar imágenes de forma no invasiva de la activación de promotor durante el ciclo de desarrollo, etc. Considerando esta descripción, un especialista en la técnica será capaz de desarrollar una miríada de métodos relacionados.

Se puede trazar una analogía entre los ensayos de gen informador tradicionales realizados rutinariamente por biólogos, tales como ensayos que emplean \beta-galactosidasa (\beta-Gal) o proteína fluorescente verde (GFP) y determinadas realizaciones de la presente invención. Por consiguiente, se pueden usar determinados métodos de la invención como una alternativa para otros métodos de exploración celular usados comúnmente. Por ejemplo, un método para evaluar farmacéuticos candidatos puede implicar tradicionalmente poner en contacto el farmacéutico candidato con una célula que porte una construcción informativa de gen informador. Ahora, el gen informador convencional se puede reemplazar con un gen de contraste y el sistema de detección convencional se puede reemplazar con un sistema de IRM. Aunque se pueden usar determinadas realizaciones en la invención para sustituir ensayos de gen informador tradicionales, estos ensayos tradicionales están mucho más limitados en su utilidad. Por ejemplo, Los ensayos tradicionales usan tecnologías de lectura basadas en óptica que son ineficaces para visualizar la expresión génica profundamente dentro de tejido intacto y con frecuencia requieren procesamiento histológico de los materiales biológicos. Por el contrario, determinadas realizaciones de la presente invención emplean un agente de contraste de IRM como un gen informador, que permite la lectura de señal profundamente dentro de tejidos ópticamente opacos por IRM y, si se desea, se pueden obtener lecturas con muy poca o ninguna alteración de la función biológica del material objeto.

En otra realización ilustrativa, los métodos de la invención se pueden usar para evaluar la distribución de un vector que se ha administrado a un material objeto. Por ejemplo, un vector diseñado para transfectar un organismo puede incluir un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste unido operativamente a un promotor adecuado. Opcionalmente, se seleccionará un promotor para proporcionar niveles detectables de expresión en un amplio intervalo de tipos de tejido. Por ejemplo, se podría seleccionar un promotor constitutivo fuerte. Se forman imágenes por IRM del material biológico transfectado para identificar células que se han transfectado con el vector. Este método ilustrativo se puede acoplar con numerosos métodos diferentes de administración del vector (por ejemplo, introducción en una región anatómica u órgano de interés particular, introducción en el sistema circulatorio, el sistema linfático, etc) y se puede usar para comparar la distribución del vector y los niveles de trascripción obtenidos con cada uno de estos enfoques. En el caso de sistemas de administración que se dirigen a un tejido particular, la metodología ilustrativa se puede usar para confirmar u optimizar especificidad de tejido. Como otra ilustración, los presentes métodos se pueden emplear para optimizar o desarrollar un protocolo de terapia génica permitiendo a un investigador determinar el emplazamiento y, opcionalmente, el nivel de expresión génica obtenido después de la administración de un sistema de terapia génica particular.

La invención se refiere a la generación de un agente de contraste intracelular artificialmente inducido. En muchas de las realizaciones anteriores, la producción del agente de contraste intracelular se consigue introduciendo un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste directo. En general, la producción del agente de contraste se puede conseguir por métodos alternativos. Por ejemplo, la producción in situ de un agente de contraste intracelular se puede estimular introduciendo un ácido nucleico que codifica un agente de contraste indirecto. Un agente de contraste indirecto puede ser, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico que regule la homeostasis del hierro, regule la expresión de un gen endógeno que codifica un agente de contraste directo y/o regule la actividad de una proteína endógena que pueda actuar como un agente de contraste directo, tal como, por ejemplo, ferritina. Como otro ejemplo, la producción del agente de contraste se puede provocar poniendo en contacto el material objeto con una composición que provoque la producción del agente de contraste. Por ejemplo, se pueden poner células en contacto con un agente, tal como una fuente de hierro, que provoque que las células produzcan ferritina, que es un agente de contraste eficaz. Por consiguiente, se aprecia que la invención abarca agentes que son agentes de contraste no directo y pueden no ser ácidos nucleicos ni proteínas pero que, sin embargo, son útiles para inducir producción in situ de un agente de contraste intracelular.

En determinados aspectos, los ácidos nucleicos de la invención se pueden introducir en material biológico usando cualquiera de una diversidad de vectores, generales o específicos de tipo de organismo/tejido/célula y en combinación con cualquiera de una diversidad de sistemas de administración, tales como, por ejemplo, liposomas, partículas virales, electroporación, etc. En aspectos adicionales, las proteínas de la invención también se pueden administrar directamente a células en una diversidad de maneras, tales como fusión de liposoma, electroporación, unión a un resto que se interioriza por las células, etc.

En determinadas realizaciones donde un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste se introduce en las células, puede ser deseable tener ese gen activo o presente en las células sólo durante un periodo de tiempo corto u, opcionalmente, durante un periodo de tiempo regulado. Si se desea, se puede usar un sistema de transfección transitorio y, preferiblemente, un vector que permita la expresión durante, en promedio, menos de uno o dos días. Como alternativa o en conjunto, la expresión génica se puede controlar usando un promotor regulado externamente o como un ejemplo adicional, el gen de contraste o una parte del mismo se puede situar con respecto a uno o más sitios de recombinación de manera que la activación de una recombinasa provoque inactivación (o, si se prefiere, activación) del ácido nucleico que codifica la proteína de contraste.

Muchas realizaciones de la invención implican el uso de ácidos nucleicos que codifican múltiples proteínas de contraste, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican cadenas pesada y ligera de una ferritina de mamífero o ácidos nucleicos que codifican un receptor de ferritina y uno de transferrina.

En determinadas realizaciones, el agente de contraste intracelular se elegirá por seguridad en el material objeto y cuando el sujeto es un sujeto humano, el agente de contraste intracelular preferiblemente es seguro para uso en seres humanos.

3. Agentes de Contraste

En muchos aspectos, como se ha descrito anteriormente, los métodos de la invención emplearán una o más proteínas de contraste que generen contraste de IRM in vivo. La proteína de contraste impartirá contraste de IRM directamente o indirectamente, provocando que la célula produzca una proteína o proteínas secundarias que impartan contraste de IRM. En el caso de un efector directo, la proteína de contraste típicamente formará un complejo que crea un cambio en al menos uno de los tiempos de relajación T1, T2 y/o T2*, donde el cambio conduce a un efecto de contraste durante la IRM. Con frecuencia las proteínas de contraste directo forman complejos de metaloproteína. En el caso de efectores indirectos, el agente de contraste puede ser, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico que regule la homeostasis del hierro, regule la expresión de un gen endógeno que codifica un agente de contraste directo y/o regule la actividad de una proteína endógena que pueda actuar como un agente de contraste directo, produciendo de ese modo un efecto de contraste. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en este documento pueden implicar agentes de contraste tanto directo como indirecto. En una realización ilustrativa, los métodos y/o composiciones descritos en este documento comprenden un agente de contraste indirecto que influye en la homeostasis del hierro y un agente de contraste directo, tal como una proteína de unión a metal.

En aspectos de la invención que emplean un polipéptido de unión a metal como un agente de contraste directo, la proteína de unión a metal preferiblemente se unirá a uno o más metales que proporcionen contraste eficaz. Una diversidad de metales son eficaces como elementos de un agente contrastante, particularmente aquellos con electrones no apareados en la órbitas d o f, tales como, por ejemplo, hierro (Fe), cobalto (Co), manganeso (Mn), níquel (Ni), gadolinio (Gd), etc. Como se ha indicado anteriormente, el hierro es de particular interés debido a que está presente en niveles relativamente altos en mamíferos y la mayoría de otros organismos y, por lo tanto, se pueden generar acumulaciones detectables de hierro sin la ayuda de complementación con hierro exógeno. Por consiguiente, las proteínas de unión a metal de la invención son proteínas de unión a hierro. En esas realizaciones que emplean un agente de contraste de T2, la geometría de unión a metal no es importante, pero el contraste tendrá tendencia a ser mayor cuando se concentren cantidades mayores de metal juntas. En determinadas realizaciones preferidas, el metal eficaz debe estar unido en un agregado con alto contenido de metal, opcionalmente un agregado similar a cristal, con un diámetro mayor de 10 picómetros, opcionalmente mayor de 100 picómetros, mayor de 1 nanómetro, mayor de 10 nanómetros o mayor de 100 nanómetros de diámetro. Alternativamente, el agregado con alto contenido de metal debe estar en el intervalo de 1-100 nanómetros de diámetro dentro del complejo de polipéptido. En una realización particularmente preferida, el agregado con alto contenido de metal muestra propiedades de súper paramagnetismo. Cuando se usa un polipéptido de unión a hierro, es preferible si el polipéptido conserva el hierro en el estado de oxidación no tóxico Fe(III). Fe(II) también es un agente de contraste eficaz, pero Fe(TI) puede participar en la reacción de HaberWeiss catalizada por hierro que produce radicales hidroxilo potencialmente dañinos.

En una realización preferida, una proteína de contraste directo de la invención tiene las siguientes propiedades: ensamblaje de proteína intracelular y carga de metal rápida, la tendencia a promover formación de un agregado con alto contenido de metal que tenga una susceptibilidad paramagnética grande y la capacidad de conservar el metal en una forma relativamente no tóxica (por ejemplo, en el caso del hierro, el estado Fe(III)).

En determinados aspectos, los polipéptidos de unión a metal también pueden cambiar las propiedades de contraste de una célula alterando el metabolismo metálico y estimulando la expresión de polipéptidos de unión a metal endógenos que tienen efectos de contraste. Esto también puede conducir a una acumulación o agotamiento de un metal particular en la célula. Por ejemplo, la expresión transitoria de proteínas de unión a hierro de afinidad alta puede crear una disminución temporal en la combinación de hierro lábil intracelular y estimular la producción de receptor de transferrina, aumentando de ese modo la captación de hierro neta en la célula.

Aunque la afinidad de unión exacta de una proteína de unión a metal para metales diferentes no es crítica, generalmente se espera que los polipéptidos con una afinidad subnanomolar por uno o más metales eficaces puedan ser útiles y, opcionalmente, el polipéptido tendrá una constante de disociación menor de 10^{-15} M, 10^{-20} M o menos para uno o más metales eficaces.

Se aprecia que muchas proteínas de unión a metal se unirán a más de un tipo de metal. Por ejemplo, lactoferrina formará complejos con metales tales como manganeso y cinc. Generalmente se espera que los complejos ferritina-hierro contengan algunas cantidades pequeñas (tal vez infinitesimales) de otros metales. En general, las proteínas de unión a hierro son propensas a unirse a metales tales como manganeso, cobalto, cinc y cromo, aunque in vivo la concentración y abundancia de hierro es tan mucho más alta que la de estos otros metales que una proteína de unión a hierro se asociará principalmente con hierro.

Se proporcionan varios polipéptidos de unión a metal ilustrativos de la invención. De ninguna manera esto tiene por objeto ser una lista exhaustiva y, considerando los contenidos en este documento, un especialista en la técnica será capaz de identificar o diseñar otros polipéptidos de unión a metal útiles.

Se usan una o más ferritinas como una proteína de contraste. Las ferritinas de la invención incluyen cualquiera de un grupo de proteínas dihierro-carboxilato caracterizadas por la tendencia a formar una estructura dimérica o multimérica con hierro unido y que tiene una estructura de haz de hélice que comprende un residuo Glu coordinador de hierro en una primera hélice y un motivo Glu-X-X-His en una segunda. Determinadas ferritinas mantienen hierro unido en una forma principalmente Fe(III). Se proporciona una lista de ferritinas ilustrativas en la Tabla 1. Esta lista tiene por objeto proporcionar ejemplos y no tiene por objeto ser exhaustiva. No se incluyen muchas ferritinas conocidas y se entiende que la mayoría de especies de vertebrados tendrá una forma de ferritina que se puede usar como un agente de contraste. Considerando esta memoria descriptiva, un especialista en la técnica será capaz de identificar homólogos de ferritina adicionales. Una ferritina para uso como agente de contraste puede tener una identidad de al menos el 60% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 y/o SEC ID Nº: 4 y, opcionalmente, una identidad de al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 y/o SEC ID Nº: 4.

En muchas realizaciones, las metodologías de la invención emplearán una ferritina de vertebrado como un agente de contraste. Las ferritinas de vertebrado típicamente forman un complejo grande que se ensambla en una cáscara para delimitar una cavidad donde el hierro se acumula en una forma mineral y compacta. La mayoría de las ferritinas de mamífero están compuestas de dos tipos de subunidad, las cadenas H y L. Típicamente, los ARNm endógenos para las dos cadenas tienen elementos sensibles a hierro casi idénticos (IRE) próximos a los extremos 5' que regulan la traducción de ferritina mediante unión a proteínas reguladoras de hierro (IRP). Cuando se diseñan construcciones de ácidos nucleicos para expresión ectópica de ferritinas, con frecuencia será deseable omitir o, de otra manera, alterar las secuencias de IRE. Poner en contacto células cultivadas con una concentración de hierro elevada típicamente provocará una regulación positiva marcada de las cadenas tanto L como H, mientras que el tratamiento con agentes quelantes de hierro, tales como desferrioxamina, suprime la producción de ferritina. Las ferritinas preferidas de la invención catalizan tanto una etapa de oxidación de hierro de la forma Fe(II) a la forma Fe(III) como también catalizan la nucleación y crecimiento de un núcleo mineral de hierro. En el caso de ferritinas compuestas de subunidades múltiples, típicamente será deseable expresar todas las subunidades en una estequiometría que se aproxime a la observada en los complejos nativos. Sin embargo, es de notar que una amplia variedad de proporciones de subunidad típicamente serán eficaces. Por ejemplo, la cadena H humana es capaz de formar un homopolímero que se une al hierro. El exceso de ferritina que se produce como resultado de la sobre-expresión típicamente se degrada dentro de la célula y el principal producto de desintegración son depósitos de hemosiderina; los mismos también son eficaces como agentes de contraste.

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TABLA 1 Proteínas y Ácidos Nucleicos de Ferritina Ilustrativos

1

2

También se describe una proteína de unión a metal que es un aceptor metálico, definida como una proteína que se une a metal con afinidad muy alta a través de un sideróforo. Tales proteínas se pueden usar como agentes de contraste. Aunque sin desear estar ligado a un mecanismo, se espera que tales proteínas actúen principalmente como agentes de contraste indirecto. Por ejemplo, proteínas aceptoras de hierro expresadas en una célula pueden aceptar y unirse firmemente a hierro a partir de la combinación de hierro lábil dentro del espacio intracelular. Por tanto, el contraste de IRM se puede potenciar mediante una combinación del quelato unido a hierro en sí mismo y el hierro adicional que se secuestra y almacena como resultado de los mecanismos de regulación de hierro propios de la célula. Los sideróforos ilustrativos que pueden estar presentes en proteínas aceptoras de metales incluyen hemoglobina y cualquier otro agente que proporcione una esfera de coordinación octaédrica para el hierro, habitualmente formada por 6 átomos de oxígeno. En general, los mismos caen en dos categorías: (a) catecoles tales como enterobactina que comprende una estructura cíclica compuesta de tres moléculas de 2,3-dihidroxi-N-benzoil serina. Ejemplos adicionales incluyen agentes en los que la serina se sustituye con una glicina o una treonina. En este documento también se incluyen sideróforos de catecol que tienen estructuras lineales en lugar de cíclicas tales como pseudobactina; (b) hidroxamatos que comprenden un grupo grande y variable que tiene péptidos cíclicos o lineales que contienen diversos tipos de ácidos hidroxámicos. Los ejemplos comunes incluyen ferricromo, ferrioxiamina y aerobactina. Los ejemplos adicionales incluyen sideróforos de planta tales como fitosideróforo. Las proteínas aceptoras de metal ilustrativas incluyen proteínas de unión férricas de la familia siderofilina, tales como transferrinas, ovotransferrina, lactoferrinas, melanotransferrina, transferrina de sertoli, neurotransferrina y transferrina mucosal de mamífero y transferrinas bacterianas, tales como las que se encuentran en Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.

Adicionalmente se describe una proteína reguladora de hierro (IRP) como una proteína de contraste. Las IRP son proteínas de unión a ARN reguladoras de hierro que modulan la síntesis de proteínas que funcionan en la captación (por ejemplo, receptores de transferrina), utilización (por ejemplo, 5-aminolevulinato sintetasa eritroide) o almacenamiento (por ejemplo, H-ferritina y L-ferritina) de hierro. Las proteínas reguladas por IRP están codificadas por ARNm que incluyen uno o más motivos de tallo-bucle, denominados un Elemento Sensible al Hierro (IRE). En condiciones de hierro bajo, las IRP se unen a IRE y modulan la estabilidad o traducción del ARNm afectado. En general, cuando un IRE está localizado en la región 5' UTR de un ARNm (por ejemplo, las ferritinas), la IRP bloquea la traducción, provocando producción de proteína disminuida en condiciones de hierro bajo. Cuando un IRE se coloca en la 3' UTR (por ejemplo, receptor de transferrina), la IRP típicamente estabiliza el ARNm, aumentando de ese modo la producción del producto génico en respuesta a condiciones de hierro bajo. Ratones que tienen una supresión dirigida del gen que codifica IRP2 muestran acumulaciones significativas de hierro en tejidos neurales (LaVaute et al., 2001, Nat. Genet. 27(2): 209-14). Por consiguiente, la manipulación de IRP mediante, por ejemplo, metodologías antisentido o de ARNi puede proporcionar efectos de contraste. Las IRP de la invención típicamente tendrán la capacidad de unirse a IRE de una manera regulada por hierro. Las IRP preferidas de la invención serán IRP de vertebrado tales como: IRP1 humana (Nº de Ent. P21399 y Z1159), IRP2 humana (Nº de Ent. AAA69901 y M58511), IRE-BP1 de rata (Nº de Ent. Q63270 y L23874), IRE-BP1 de ratón (Nº de Ent. P28271 y X61147), IRE-BP de pollo (Nº de Ent. Q90875 y D16150), etc. En general, será deseable emplear una IRP que se una a los IRE del material biológico objeto y, en determinadas realizaciones, esto se puede conseguir usando una IRP que se obtenga de las especies objeto. En determinados aspectos de la invención, una proteína de contraste comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 60% a IRP1 y/o IRP2 humana y, opcionalmente, una identidad de al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 100%.

Una proteína de contraste adicional descrita de la invención es una que altera la homeostasis de hierro celular. Por ejemplo, una proteína receptora de transferrina y/o una molécula que regule la expresión y/o función de una proteína receptora de transferrina, se puede usar como un agente de contraste. El receptor de transferrina media la endocitosis mediada por receptor de la proteína portadora de hierro transferrina y, de ese modo, media la captación de hierro celular. Por lo tanto, el nivel y/o actividad de un receptor de transferrina en células diana se pueden modular para producir un aumento en la captación de hierro celular provocando, de ese modo, que la célula produzca ferritina. El resultado final será una acumulación de exceso de ferritina que producirá contraste de IRM. Los receptores de transferrina ilustrativos incluyen SEC ID Nº: 16, 18, 20 y 22. Una proteína de contraste de este tipo puede comprender una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 60% a la del receptor 1 de transferrina humana y/o receptor 2 de transferrina humana y, opcionalmente, una identidad de al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 100% y preferiblemente conserva actividad de receptor de transferrina.

En realizaciones adicionales, las proteínas de contraste de la invención se pueden modificar por ingeniería genética, por ejemplo, empleando técnicas de biología molecular. Por ejemplo, es posible modificar la estructura de las proteínas de contraste objeto con propósitos tales como potenciar la eficacia de contraste, estabilidad, (por ejemplo, resistencia aumentada o disminuida a degradación proteolítica in vivo), antigenicidad o seguridad, entre otras características. Tales proteínas modificadas se pueden producir, por ejemplo, mediante sustitución, supresión o adición de aminoácidos. Además, se pueden obtener variantes sencillas de cualquiera de las proteínas descritas en este documento mediante sustitución conservativa. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con glutamato, una treonina con una serina o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (es decir, mutaciones conservativas) no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Los reemplazos conservativos son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se pueden dividir en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato y glutamato; (2) básicos = lisina, arginina e histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptofano y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. Fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces se clasifican en conjunto como aminoácidos aromáticos. De forma similar, el repertorio de aminoácidos se puede agrupar como (1) ácidos = aspartato y glutamato; (2) básicos = lisina, arginina e histidina, (3) alifáticos = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina y treonina, con serina y treonina opcionalmente estando agrupadas por separado como alifáticos-hidroxilo; (4) aromáticos = fenilalanina, tirosina y triptofano; (5) amida = asparagina y glutamina y (6) que contienen azufre = cisteína y metionina (véase, por ejemplo, Biochemistry, 2ª ed., Ed. por L. Stryer, W. H. Freeman y Co., 1981).

Esta invención considera además métodos para generar conjuntos de mutantes combinatorios de las proteínas de contraste objeto, así como mutantes funcionales de truncamiento. El propósito de explorar tales bibliotecas combinatorias es generar, por ejemplo, proteínas de contraste modificadas por ingeniería genética con cualquier número de cualidades deseables tales como las mencionadas anteriormente.

Existen muchas maneras mediante las cuales se puede generar la biblioteca de proteínas de contraste modificadas por ingeniería genética potenciales. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede realizar en un sintetizador de ADN automático y los genes sintéticos después se pueden ligar en un gen apropiado para expresión. El propósito de un conjunto degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias de proteínas de contraste potenciales. Tales técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véase, por ejemplo, Scott et al., (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89: 2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249; 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las Patentes de Estados Unidos Nº 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Como alternativa, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, se pueden generar proteínas de contraste por ingeniería genética y aislarse a partir de una biblioteca mediante selección usando, por ejemplo, mutagénesis mediante alanina y similares (véase, por ejemplo, Ruf et al., (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 3095-3099; Balint et al., (1993)), por mutagénesis mediante enlazador (Gustin et al., (1993) Virology 193: 653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232: 316); mediante mutagénesis por saturación (Meyers et al., (1986) Science 232: 613); mediante mutagénesis por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19) o mediante mutagénesis aleatoria, incluyendo mutagénesis química, etc., (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY y Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7: 32-34).

Se puede determinar fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido da como resultado un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido variante de, por ejemplo, unir el metal deseado, producir suficiente contraste de IRM en células y producir toxicidad celular reducida.

En aspectos adicionales, se puede emplear cualquier combinación de proteínas de contraste para obtener los efectos de contraste deseados.

4. Construcciones y Vectores

También se describen vectores y construcciones de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos que codifican uno o más agentes de contraste. Otras características del vector o construcción se diseñarán generalmente para suministrar características deseables dependiendo de cómo se va a generar y usar el agente de contraste. Las características deseables ilustrativas incluyen, pero sin limitación, expresión génica en un nivel deseado, expresión génica que refleja la expresión de un gen diferente, clonabilidad sencilla, expresión génica transitoria o estable en células objeto, etc.

En determinados aspectos, es deseable usar un vector que proporcione expresión transitoria del agente de contraste. Tales vectores generalmente serán inestables dentro de una célula, de manera que los ácidos nucleicos necesarios para expresión del agente de contraste se pierden después de un periodo de tiempo relativamente corto. Opcionalmente, la expresión transitoria se puede lograr mediante represión estable. Los vectores de expresión transitoria ilustrativos se pueden diseñar para proporcionar expresión génica durante un tiempo promedio de horas, días, semanas o, tal vez, meses. Con frecuencia los vectores de expresión transitoria no se recombinan para integrarse con el genoma estable del hospedador. Los vectores de expresión transitorios ilustrativos incluyen: vectores obtenidos de adenovirus, virus adenoasociados, vectores obtenidos de herpes simple, vectores virales híbridos adenoasociados/herpes simple, vectores virales de influenza, especialmente los que se basan en virus influenza A y alfavirus, por ejemplo, los virus Sinbis y de los bosques semliki.

Un vector o construcción puede comprender un ácido nucleico fácilmente clonable que codifica una proteína de contraste. Por ejemplo, la secuencia codificante puede estar flanqueada por un polienlazador en uno o ambos lados. Los polienlazadores son útiles para permitir a un especialista en la técnica insertar fácilmente la secuencia codificante en una diversidad de vectores y construcciones diferentes según se requiera. En otro ejemplo, la secuencia codificante puede estar flanqueada por uno o más sitios de recombinación. Una diversidad de sistemas de clonación disponibles en el mercado usan sitios de recombinación para facilitar el movimiento del ácido nucleico deseado en diferentes vectores. Por ejemplo, la tecnología Invitrogen Gateway^{TM} utiliza una enzima recombinasa de fago lambda para recombinar ácidos nucleicos diana con un segundo ácido nucleico. Cada ácido nucleico está flanqueado por secuencia de reconocimiento lambda apropiada, tal como attL o attB. En otras variaciones, se puede usar una recombinasa tal como topoisomerasa I con ácidos nucleicos flanqueados por los sitios de reconocimiento apropiados. Por ejemplo, la proteína topoisomerasa I de virus vaccinia reconoce una secuencia (C/T)CCTT. Estos sistemas de recombinación permiten transposición rápida de casetes flanqueados de un vector a otro según sea necesario. Una construcción o vector puede incluir tanto polienlazadores flanqueantes como sitios de recombinación flanqueantes, según se desee.

En determinados aspectos, el gen de contraste está unido operativamente a un promotor. El promotor puede, por ejemplo, ser un promotor fuerte o constitutivo, tal como los promotores tempranos y tardíos de SV40 o promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus. Opcionalmente, puede ser deseable usar un promotor regulado externamente, tal como un promotor tet, promotores regulados por IPTG (GAL4, Plac) o el sistema trp. Considerando esta memoria descriptiva, un especialista en la técnica identificará fácilmente otros promotores útiles dependiendo del uso cadena abajo. Por ejemplo, la invención puede utilizar promotores ilustrativos tales como el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la ARN polimerasa de T7, las regiones principales de operador y promotor de fago lambda, las regiones de control para proteínas de cubierta fd, el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento-a de levadura, el promotor poliédrico del sistema de báculovirus y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Además, como se ha indicado anteriormente, puede ser deseable tener un gen de contraste unido operativamente a un promotor que proporcione información útil acerca de la condición de la célula en la que está situado. En determinadas realizaciones, se prevé que será deseable conseguir una concentración de proteína de contraste dentro de las células diana que permita la detección por encima del ruido de fondo y con determinados sistemas de detección esto se traducirá en una concentración de proteína de al menos 1 nM o al menos 10 nM.

Los vectores pueden ser básicamente cualquier ácido nucleico diseñado para introducir y/o mantener un gen de contraste en una célula o virus. Los vectores obtenidos de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores, se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección de resistencia a fármaco tanto en células procariotas como eucariotas. Como alternativa, se pueden usar derivados de virus tales como el virus de papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, obtenido de pREP y p205). Más adelante se describen otros sistemas de vector adecuados para terapia génica.

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5. Células, Cultivos Celulares Organizados y Tejidos

En este documento también se describen células, cultivos celulares organizados y tejidos que comprenden un ácido nucleico que codifica un agente de contraste. Los métodos para generar células transformadas o transfectadas se conocen ampliamente en la técnica y se prevé que los métodos descritos en este documento se pueden usar básicamente con cualquier tipo de célula de interés, que incluye, pero sin limitación, células bacterianas, fúngicas, de plantas y animales, tales como células de mamífero. Las células de interés particular pueden incluir células transformadas u otras células que sean parte de un tumor o sean útiles como un modelo de cáncer in vitro, células madre o progenitoras y células preparadas para una terapia celular para un paciente. Las células de la invención pueden ser células cultivadas, líneas celulares, células situadas en tejidos y/o células que sean parte de un organismo.

Además se prevé que se pueden usar células para generar cultivos celulares organizados (es decir, cultivos celulares que desarrollen una estructura no aleatoria) y para generar órganos o estructuras similares a órganos para trasplantes en sujetos. Puede ser útil supervisar de forma no invasiva algún aspecto de la expresión génica en tales células o proporcionar de otra manera contraste de IRM en tales células. Por ejemplo, se pueden usar células progenitoras de músculo para desarrollar órganos similares a músculo para administración a músculo lesionado o para administración como un paquete de células que produzca una proteína terapéutica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.399.346; 6.207.451 y 5.538.722). Se han usado otros métodos de cultivo celular para producir tejido neural, pancreático, de hígado y muchos otros tipos de órganos para trasplante (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.146.889; 6.001.647; 5.888.705 y 5.851.832 y publicaciones PCT Nº WO 00/36091; WO 01/53461 y WO 01/21767). Las células de esta naturaleza se pueden transfectar de forma estable con un gen de contraste en una etapa temprana de cultivo o el cultivo organizado se puede transfectar de forma transitoria o estable en un momento posterior del cultivo para evaluar algún aspecto de la función celular. Las células transfectadas se pueden administrar a sujetos para suministrar un producto génico y esta metodología es eficaz como una terapia génica ex vivo o método de terapia celular. En tales células se puede introducir un ácido nucleico que codifique una proteína de contraste y administrarse a un sujeto para supervisar la expresión génica o viabilidad de las células administradas. Se han administrado células transfectadas con el gen de adenosin deaminasa a pacientes como una terapia génica ex vivo de cura para Sín-
drome de Inmunodeficiencia Combinada Grave (SCID) (Cavazzana-Calvo et al., 2000, Science 288(5466): 669-72).

6. Ácidos nucleicos para administración a organismos y tejidos in vitro

En lugar de la modificación ex vivo de células, en muchas situaciones se puede desear modificar las células in vivo. Para este propósito, se han desarrollado diversas técnicas para modificación de tejido diana y células in vivo. Se han desarrollado varios vectores virales, tales como los descritos anteriormente, que permiten la transfección y, en algunos casos, la integración del virus en el hospedador. Véase, por ejemplo, Dubensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda et al., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-17293 y Ferry, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381. El vector se puede administrar por inyección, por ejemplo, por vía intravascular o intramuscular, inhalación u otro modo parenteral. También se pueden usar métodos de administración no viral tales como la administración del ADN a través de complejos con liposomas o por inyección, catéter o biolística. En general, en sujetos humanos, será preferible diseñar el ácido nucleico y/o el sistema de administración para proporcionar expresión transitoria del ácido nucleico que codifica el agente de contraste.

En general, la forma de introducir el ácido nucleico dependerá de la naturaleza del tejido, la eficacia de la modificación celular requerida, el número de oportunidades para modificar las células particulares, la accesibilidad del tejido a la composición de ácido nucleico que se tiene que introducir y similares. La introducción de ADN no necesita dar como resultado integración. De hecho, la no integración con frecuencia da como resultado la expresión transitoria del ADN introducido y la expresión transitoria con frecuencia es suficiente o incluso preferida.

Cualquier medio para la introducción de polinucleótidos en mamíferos, humanos o no humanos, se puede adaptar a la práctica de esta invención para la administración de las diversas construcciones de la invención al receptor pretendido. En una realización de la invención, las construcciones de ácido nucleico se administran a células por transfección, es decir, por administración de ácido nucleico "desnudo" o en un complejo con un sistema de dispersión coloidal. Un sistema coloidal incluye complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ilustrativo de esta invención es un ADN en complejo con lípidos o formulado con liposomas. En el primer enfoque, antes de la formulación de ADN, por ejemplo, con lípidos, en primer lugar se puede optimizar experimentalmente para expresión un plásmido que contenga un transgen que porte las construcciones de ADN deseadas, por ejemplo, inclusión de un intrón en la región no traducida 5' y eliminación de secuencias innecesarias (Felgner, et al., Ann NY Aca Sci 126-139, 1995). La formulación de ADN, por ejemplo, con diversos materiales lipídicos o de liposoma, se puede lograr después usando métodos y materiales conocidos y administrarse al mamífero receptor. Véase, por ejemplo, Canonico et al. Am. J Respir Cell Mol Biol 10: 24-29, 1994; Tsan et al, Am J. Physiol 268; Alton et al., Nat Genet. 5: 135-142, 1993 y Patente de Estados Unidos Nº 5.679.647 por Carson et al.

Opcionalmente, se fijan como dianas liposomas u otros sistemas de dispersión coloidal. La dirección se puede clasificar basándose en factores anatómicos y mecanísticos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico de órgano, específico de célula y específico de organelo. La dirección mecanística se puede distinguir basándose en si es pasiva o activa. La dirección pasiva utiliza la tendencia natural de liposomas de distribuirse a células del sistema retículo endotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. Por otra parte, la dirección activa implica alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína o cambiando la composición o tamaño del liposoma para conseguir la dirección a órganos y tipos celulares diferentes a los sitios de localización de origen natural.

La superficie del sistema de administración dirigido se puede modificar en una diversidad de maneras. En el caso de un sistema de administración liposomal dirigido, se pueden incorporar grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el ligando de dirección en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden usar diversos grupos enlazadores para unir las cadenas lipídicas al ligando de dirección. Se puede conseguir un determinado nivel de dirección a través del modo de administración seleccionado.

En determinadas variantes de la invención, las construcciones de ácidos nucleicos se administran a células y, particularmente, células en un organismo o un tejido cultivado, usando vectores virales. El transgen se puede incorporar en cualquiera de una diversidad de vectores virales útiles en terapia génica, tales como retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), vectores obtenidos de herpes simple, vectores híbridos adenoasociados/herpes simple, vectores virales de influenza, especialmente los basados en virus influenza A y alfavirus, por ejemplo, los virus Sinbis y de los bosques semliki o plásmidos bacterianos o eucariotas recombinantes. La siguiente guía adicional acerca de la elección y uso de vectores virales puede ser útil para el practicante. Como se ha descrito con mayor detalle a continuación, tales realizaciones de las construcciones de expresión objeto se contemplan específicamente para uso en diversos protocolos de terapia génica in vivo y ex vivo.

A. Sistemas de Herpes Virus

Se ha desarrollado una diversidad de vectores basados en herpes virus para introducción de genes en mamíferos. Por ejemplo, el virus de herpes simple de tipo 1 (HSV-1) es un virus neurotrópico humano de interés particular para la transferencia de genes al sistema nervioso. Después de infección de células diana, los herpes virus con frecuencia siguen un ciclo de vida lítico o un ciclo de vida latente, persistiendo como un episoma intranuclear. En la mayoría de los casos, las células infectadas de forma latente no son rechazadas por el sistema inmune. Por ejemplo, neuronas infectadas de forma latente con HSV-1 funcionan normalmente y no son rechazadas. Algunos herpes virus poseen promotores específicos de tipo celular que se expresan incluso cuando el virus está en una forma latente.

Un genoma de herpes virus típico es una molécula de ADN bicatenaria lineal que varía de 100 a 250 kb. HSV-1 tiene un genoma de 152 kb. El genoma puede incluir regiones largas y cortas (denominadas UL y US, respectivamente) que están unidas en cualquier orientación mediante secuencias de repetición interna (IRL e IRS). En el extremo sin enlazador de las regiones únicas existen repeticiones terminales (TRL y TRS). En HSV-1, aproximadamente la mitad de los 80-90 genes son no esenciales y la supresión de genes no esenciales crea espacio para aproximadamente 40-50 kb de ADN ajeno (Glorioso et al. 1995). Se han identificado dos promotores activos de latencia que conducen la expresión de transcritos activados de latencia y pueden ser útiles para expresión transgénica de vector (Marconi et al, 1996).

Los vectores de HSV-1 están disponibles en formas de virus de amplicones y recombinantes de HSV-1. Los amplicones son plásmidos producidos de forma bacteriana que contienen OriC, un origen de replicación de Escherichia coli, OriS (el origen de replicación de HSV-1), la secuencia de encapsidación de HSV-1, el transgen bajo el control de un promotor temprano inmediato y un marcador seleccionable (Federrof et al, 1992). El amplicón se transfecta en una línea celular que contiene un virus auxiliar (un mutante sensible a temperatura) que proporciona todos los genes estructurales y reguladores ausentes en trans. Los amplicones más recientes incluyen una secuencia obtenida del virus de Epstein-Barr para mantenimiento episomal de plásmido (Wang & Vos, 1996). Los virus recombinantes se hacen sin capacidad de replicación mediante la supresión de uno de los genes tempranos inmediatos, por ejemplo ICP4, que se proporciona en trans. La supresión de varios genes tempranos inmediatos reduce sustancialmente la citotoxicidad y permite la expresión a partir de promotores que estarían silenciados en el virus latente de tipo silvestre. Estos promotores se pueden usar para dirigir expresión génica a largo plazo. Los mutantes condicionales a replicación se replican en líneas celulares permisivas. Las líneas celulares permisivas suministran una enzima celular para complementar una deficiencia viral. Los mutantes incluyen timidina quinasa (During et al, 1994), ribonucleasa reductasa (Kramm et al, 1997), UTPasa o el factor de neurovirulencia g34.5 (Kesari et al, 1995). Estos mutantes son particularmente útiles para el tratamiento de cánceres, eliminando las células neoplásicas que proliferan más rápido que otros tipos celulares (Andreansky et al, 1996, 1997). Se ha usado un vector de HSV-1 de replicación limitada para tratar mesotelioma maligno humano (Kucharizuk et al. 1997). Además de neuronas, el HSV-1 de tipo silvestre puede infectar otros tipos celulares no neuronales, tales como la piel (Al-Saadi et al, 1983) y los vectores obtenidos de HSV pueden ser útiles para administrar transgenes a una amplia variedad de tipos celulares. Otros ejemplos de vectores de herpes virus se conocen en la técnica (Patente de Estados Unidos Nº 5.631.236 y el documento WO 00/08191).

B. Vectores Adenovirales

Un sistema de administración génica viral útil en la presente invención utiliza vectores obtenidos de adenovirus. El conocimiento de la organización genética de adenovirus, un virus de ADN bicatenario de 36 kb y lineal, permite la sustitución de un trozo grande de ADN viral con secuencias ajenas de hasta 8 kb. A diferencia de retrovirus, la infección de ADN adenoviral en células hospedadoras no da como resultado la integración cromosómica debido a que el ADN adenoviral se puede replicar de una manera episomal sin genotoxicidad potencial. También, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado re-arreglo del genoma después de amplificación extensiva. El adenovirus puede infectar prácticamente todas las células epiteliales independientemente de su etapa de ciclo celular. Además, la transfección de células mediada por vectores adenovirales con frecuencia es un acontecimiento transitorio. Una combinación de respuesta inmune y silenciamiento de promotor parece limitar el tiempo a lo largo del cual se expresa un transgen o un vector de adenovirus introducido.

Los adenovirus son particularmente adecuados para uso como vectores de transferencia génica debido a su genoma de tamaño mediano, facilidad de manipulación, título alto, intervalo de células diana amplio e infectividad elevada. La partícula de virus es relativamente estable y susceptible a la purificación y concentración y, como anteriormente, se puede modificar para influir en el espectro de infectividad. Adicionalmente, el adenovirus es fácil de cultivar y manipular y muestra intervalo de hospedador amplio in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en títulos altos, por ejemplo, 10^{9}-10^{11} unidades formadoras de placa (UFP)/ml y los mismos son altamente infectivos. Además, la capacidad portadora del genoma adenoviral de ADN ajeno es grande (hasta de 8 kilobases) con relación a otros vectores de administración génica (Berkner et al., anteriormente; Haj-Ahmand y Graham. (1986) J. Virol. 57: 267). La mayoría de los vectores adenovirales sin capacidad de replicación actualmente en uso y, por lo tanto, favorecidos por la presente invención se suprimen para todo o parte de los genes E1 y E3 virales pero conservan tanto como el 80% del material genético adenoviral (véase, por ejemplo, Jones et al., (1979) Cell 16: 683; Berkner et al., anteriormente y Graham. et al., en Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. págs. 109-127). La expresión del polinucleótido insertado de la invención puede estar bajo el control de, por ejemplo, el promotor E1A, el promotor tardío principal (MLP) y secuencias líderes asociadas, el promotor E3 viral o secuencias promotoras añadidas de forma exógena.

El genoma de un adenovirus se puede manipular de manera que codifique un producto génico de interés, pero está inactivado en términos de su capacidad de replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal (véase, por ejemplo, Berkner et al., (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al., (1991) Science 252: 431-434 y Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143-155). Los vectores adenovirales adecuados obtenidos a partir de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

Los adenovirus pueden ser específicos de tipo celular, es decir, infectar sólo tipos limitados de células y/o expresar un transgen sólo en tipos limitados de células. Por ejemplo, los virus se pueden modificar por ingeniería genética para comprender un gen bajo el control transcripcional de una región de inicio de transcripción regulada específicamente por células hospedadoras diana, como se ha descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.698.443 por Henderson y Schuur, expedida el 16 de diciembre de 1997. Por tanto, los adenovirus con capacidad de replicación se pueden limitar a determinadas células, por ejemplo, insertando un elemento de respuesta específico de células para regular una síntesis de una proteína necesaria para la replicación, por ejemplo, E1A o E1B.

Las secuencias de ADN de varios tipos de adenovirus están disponibles en Genbank. Por ejemplo, el adenovirus humano de tipo 5 tiene Nº de Entrada de GenBank M73260. Las secuencias de ADN de adenovirus se pueden obtener a partir de cualquiera de los 42 tipos de adenovirus humanos identificados actualmente. Diversas cepas de adenovirus están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland o mediante solicitud a partir de varias fuentes comerciales y académicas. En este documento se describe un transgen que se puede incorporar en cualquier vector adenoviral y protocolo de administración, mediante digestión de restricción, ligamiento de enlazador o llenado de extremos y ligamiento.

Las líneas celulares productoras de adenovirus pueden incluir una o más secuencias de ADN de los genes adenovirales de E1, E2a y E4, para vectores de adenovirus de encapsidación en los que uno o más de estos genes se han mutado o suprimido como se ha descrito, por ejemplo, en los documentos PCT/US95/15947 (WO 96/18418) por Kadan et al.; PCT/US95/07341 (WO 95/346671) por Kovesdi et al.; PCT/FR94/00624 (WO94/28152) por Imler et al.; PCT/FR94/00851 (WO 95/02697) por Perrocaudet et al. y PCT/US95/14793 (WO96/14061) por Wang et al.

C. Vectores de AAV

Otro sistema de vector viral útil para la administración de los polinucleótidos objeto es el virus adenoasociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus sin capacidad de replicación de origen natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpes virus, como un virus auxiliar para la replicación eficaz y un ciclo de vida productivo. (Para una revisión, véase Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158: 97-129).

El AAV no se ha asociado con la causa de ninguna enfermedad. AAV no es un virus transformador u oncogénico. La integración de AAV en cromosomas de líneas celulares humanas no provoca ninguna alteración significativa en las propiedades de crecimiento o características morfológicas de las células. Estas propiedades de AAV también lo recomiendan como un vector de terapia génica humana potencialmente útil.

AAV también es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células que no se dividen, por ejemplo, células epiteliales pulmonares y muestra una frecuencia elevada de integración estable (véase, por ejemplo, Flotte et al., (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356; Samulski et al., (1989) J. Virol. 63: 3822-3828 y McLaughlin et al., (1989) J. Virol. 62: 1963-1973). Los vectores que contienen tan poco como 300 pares de bases de AAV se pueden empaquetar y se pueden integrar. El espacio para ADN exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Se puede usar un vector de AAV tal como el que se ha descrito en Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 para introducir ADN en células. Se ha introducido una diversidad de ácidos nucleicos en diferentes tipos celulares usando vectores de AAV (véase, por ejemplo, Hermonat et al., (1984) PNAS USA 81: 6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51: 611-619 y Flotte; et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790).

El vector de expresión basado en AAV que se tiene que usar típicamente incluye las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV de 145 nucleótidos flanqueando un sitio de restricción que se puede usar para subclonación del transgen, usando directamente el sitio de restricción disponible o por escisión del transgen con enzimas de restricción seguido de formación de extremos romos, ligamiento de enlazadores de ADN apropiados, digestión de restricción y ligamiento en el sitio entre las ITR. La capacidad de los vectores de AAV es habitualmente aproximadamente 4,4 kb (Kotin, R.M., Human Gene Therapy 5: 793-801, 1994 y Flotte, et al. J. Biol. Chem. 268: 3781-3790, 1993).

Se pueden producir reservas de AAV como se ha descrito en Hermonat y Muzyczka (1984) PNAS 81: 6466, modificadas usando el pAAV/Ad descrito por Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822. La concentración y purificación del virus se puede conseguir mediante métodos indicados tales como formación de bandas en gradientes de cloruro de cesio y se usó para el informe inicial de expresión de vector de AAV in vivo (Flotte, et al. J. Biol. Chem. 268: 3781-3790, 1993) o purificación cromatográfica, como se ha descrito en O'Riordan et al., en el documento WO97/08298. Los métodos para encapsidación in vitro de vectores de AAV también están disponibles y tienen la ventaja de que no hay limitación de tamaño del ADN encapsidado en las partículas (véase, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.688.676, por Zhou et al., expedida el 18 de noviembre de 1997). Este procedimiento implica la preparación de extractos de encapsidación sin células.

D. Vectores Híbridos Adenovirus-AAV

Se han generado vectores híbridos de adenovirus-AAV y típicamente están representados por una cápside de adenovirus que contiene un ácido nucleico que comprende una parte de un adenovirus y secuencias de repetición terminal invertida 5' y 3' de un AAV que flanquean un transgen seleccionado bajo el control de un promotor. Véase, por ejemplo, Wilson et al, Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 96/13598. Este vector híbrido se caracteriza por administración de transgen de título alto a una célula hospedadora y la capacidad de integrar de forma estable el transgen en el cromosoma de la célula hospedadora en presencia del gen rep. Este virus es capaz de infectar virtualmente todos los tipos celulares (conferido por sus secuencias de adenovirus) y de integración de transgen a largo plazo estable en el genoma de la célula hospedadora (conferido por sus secuencias de AVV).

Las secuencias de ácidos nucleicos de adenovirus empleadas en este vector pueden variar desde una cantidad de secuencia mínima, que requiere el uso de un virus auxiliar para producir la partícula de virus híbrida, hasta sólo supresiones seleccionadas de genes de adenovirus, genes suprimidos cuyos productos se pueden administrar en el proceso viral híbrido por una célula empaquetadora. Por ejemplo, un virus híbrido puede comprender las secuencias de repetición terminal invertida 5' y 3' (ITR) de un adenovirus (que funcionan como orígenes de replicación). La secuencia de secuencia terminal izquierda (5') del genoma de Ad5 que se puede usar se extiende desde el pb 1 hasta aproximadamente el 360 del genoma de adenovirus convencional (también denominada unidades de map 0-1) e incluye la ITR 5' y el dominio de encapsidación/potenciador. Las secuencias de adenovirus 3' del virus híbrido incluyen la secuencia de ITR 3' terminal derecha que es aproximadamente de 580 nucleótidos (aproximadamente desde el pb 35.353 hasta el extremo del adenovirus, denominadas unidades map 98,4-100).

Para directrices detalladas adicionales de tecnología de adenovirus y de híbrido adenovirus-AAV que pueden ser útiles en la práctica de la invención objeto, que incluye métodos y materiales para la incorporación de un transgen, la propagación y purificación de virus recombinante que contiene el transgen y su uso para transfectar células y mamíferos, véase también Wilson et al, los documentos WO 94/28938, WO 96/13597 y WO 96/26285 y referencias citadas en los mismos.

E. Retrovirus

Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico de interés en el genoma viral en el lugar de determinadas secuencias virales para producir un virus que no tenga capacidad de replicación. Para producir viriones, se construye una línea celular de encapsidación que contenga los genes gag, pol y env pero sin los componentes de LTR y psi (Mann et al. (1983) Cell 33: 153). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con las secuencias LTR y psi retrovirales en esta línea celular (por ejemplo, mediante precipitación de fosfato de calcio), la secuencia psi permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que después se secretan en el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein (1988) "Retroviral Vectors", en: Rodríguez y Denhardt ed. Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses. Stoneham: Butterworth; Temin, (1986) "Retrovirus Vectors for Gene Transfer: Efficient Integration into and Expression of Exogenous DNA in Vertebrate Cell Genome", en: Kucherlapati ed. Gene Transfer. Nueva York: Plenum Press; Mann et al., 1983, anteriormente). Después, el medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, opcionalmente se concentra y se usa para transferencia génica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares. La integración y expresión estable requiere la división de células hospedadoras (Paskind et al. (1975) Virology 67: 242). Este aspecto es particularmente importante para el tratamiento de PVR ya que estos vectores permiten la dirección selectiva de células que proliferan, es decir, dirección selectiva de las células en la membrana epirretinal, ya que estas son las únicas que proliferan en los ojos de sujetos con PVR.

Un pre-requisito principal para el uso retrovirus es asegurar la seguridad de su uso, particularmente con respecto a la posibilidad de la propagación de virus de tipo silvestre en la población celular. El desarrollo de líneas celulares especializadas (denominadas "células de encapsidación") que producen sólo retrovirus sin capacidad de replicación ha aumentado la utilidad de retrovirus para terapia génica y los retrovirus sin capacidad de replicación están bien caracterizados para uso en transferencia génica con propósitos de terapia génica (para una revisión véase Miller, AD. (1990) Blood 76: 271). Por tanto, se pueden construir retrovirus recombinantes en los que parte de la secuencia codificante retroviral (gag, pol, env) se ha reemplazado por ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención, por ejemplo, un activador transcripcional, volviendo al retrovirus sin capacidad de replicación. El retrovirus sin capacidad de replicación después se empaqueta en viriones que se pueden usar para infectar una célula diana mediante el uso de un virus auxiliar por técnicas convencionales. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus se puede observar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son conocidos por los especialistas en la técnica. Un vector retroviral preferido es un pSR MSVtkNeo (Muller et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11: 1785) y pSR MSV(XbaI) (Sawyers et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 307) y derivados de los mismos. Por ejemplo, los sitios BamHI únicos en ambos de estos vectores se pueden retirar fijando como diana los vectores con BamHI, llenándolos con Klenow y religándolos para producir pSMTN2 y pSMTX2, respectivamente, como se ha descrito en el documento PCT/US96/09948 por Clackson et al. Los ejemplos de líneas de virus de encapsidación adecuadas para preparar sistemas retrovirales tanto ecotrópicos como anfotrópicos incluyen Crip, Cre, 2 y Am.

Se han usado retrovirus, incluyendo lentivirus, para introducir una diversidad de genes en muchos tipos de células diferentes, que incluyen células neurales, células epiteliales, células retinianas, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula de ósea, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, revisión por Federico (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10: 448; Eglitis et al., (1985) Science 230: 1395-1398; Danos y Mulligan, (1988) PNAS USA 85: 6460-6464; Wilson et al., (1988) PNAS USA 85: 3014-3018; Armentano et al., (1990) PNAS USA 87: 6141-6145; Huber et al., (1991) PNAS USA 88: 8039-8043; Ferry et al., (1991) PNAS USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al., (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem et al., (1992) PNAS USA 89: 7640-7644; Kay et al., (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al., (1992) PNAS USA 89: 10892-10895; Hwu et al., (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115; Patente de Estados Unidos Nº 4.868.116; Patente de Estados Unidos Nº 4.980.286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345 y Solicitud PCT WO 92/07573).

Adicionalmente, se ha demostrado que es posible limitar el espectro de infección de retrovirus y, en consecuencia, de vectores basados en retrovirus, modificando las proteínas de encapsidación viral en la superficie de la partícula viral (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO93/25234, WO94/06920 y WO94/11524). Por ejemplo, las estrategias para la modificación del espectro de infección de vectores retrovirales incluyen: acoplar anticuerpos específicos para antígenos de superficie celular a la proteína env viral (Roux et al., (1989) PNAS USA 86: 9079-9083; Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73: 3251-3255 y Goud et al., (1983) Virology 163: 251-254) o acoplar ligandos de superficie celular a las proteínas env virales (Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143-14146). El acoplamiento puede ser en forma del entrecruzamiento químico con una proteína u otra variedad (por ejemplo, lactosa para convertir la proteína env en una asialoglicoproteína), así como generando proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de cadena única anticuerpo/env). Esta técnica, es útil para limitar o dirigir de otra manera la infección a determinados tipos de tejido y también se puede usar para convertir un vector ecotrópico en un vector anfotrópico.

F. Otros Sistemas Virales

Otros sistemas de vectores virales que se pueden usar para administrar un polinucleótido de la invención se han obtenido a partir de virus vaccinia, alfavirus, poxvirus, arena virus, virus de polio y similares. Tales vectores ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamífero. (Ridgeway (1988) en: Rodriguez R L, Denhardt D. T., ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth; Balchwal y Sugden (1986) En: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. Nueva York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene, 68: 1-10; Walther y Stein (2000) Drugs 60: 249-71; Timiryasova et al. (2001) J Gene Med 3: 468-77; Schlesinger (2001) Expert Opin Biol Ther 1: 177-91; Khromykh (2000) Curr Opin Mol Ther 2: 555-69; Friedmann (1989) Science, 244: 1275-1281; Ridgeway, 1988, anteriormente; Baichwal y Sugden, 1986, anteriormente; Coupar et al., 1988; Horwich et al. (1990) J.Virol., 64: 642-650).

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7. Animales transgénicos

Aunque las técnicas descritas en este documento se pueden usar para administrar ácidos nucleicos a sujetos humanos o animales, están disponibles otros métodos para generar animales transgénicos no humanos incorporando un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de contraste.

Los "animales no humanos transgénicos" descritos anteriormente se pueden producir introduciendo transgenes en la línea germinal del animal no humano. Se pueden usar células diana embrionarias en diversos estados de desarrollo para introducir transgenes. Se usan diferentes métodos dependiendo de la etapa de desarrollo de la célula diana embrionaria. La línea o líneas específicas de cualquier animal usadas para practicar la invención se seleccionan de acuerdo a buena salud general, buenas producciones embrionarias, buena visibilidad pronuclear en el embrión y buena capacidad reproductiva. Además, el haplotipo es un factor significativo. Por ejemplo, cuando se van a producir ratones transgénicos, con frecuencia se usan cepas tales como C57BL/6 o líneas FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Se pueden seleccionar cepas preferidas tales como C57BL/6 o DBA/1. La línea o líneas usadas para practicar esta invención pueden en sí mismas ser transgénicas y/o pueden ser knockouts (es decir, obtenidas a partir de animales que tienen uno o más genes parcialmente o completamente suprimidos).

La construcción que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de contraste se puede introducir en un embrión de etapa única. El cigoto es la mejor diana para microinyección. En el ratón, el pro-núcleo masculino alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro que permite inyección reproducible de 1-2 pl de solución de ADN. El uso de cigotos como una diana para transferencia génica tiene una ventaja principal en que en la mayoría de los casos el ADN inyectado se incorporará en el gen hospedador antes de la primera escisión (Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438-4442). Como consecuencia, todas las células del animal transgénico portarán el transgen incorporado. Esto en general también se reflejará en la transmisión eficaz del transgen a la descendencia del fundador ya que el 50% de las células germinales portará el transgen.

Normalmente, se incuban embriones fertilizados en medios adecuados hasta que aparecen los pronúcleos. Aproximadamente en este momento, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgen se introduce en el pronúcleo femenino o masculino como se describe más adelante. En algunas especies tales como ratones, se prefiere el pronúcleo masculino. Lo más preferido es que el material genético exógeno se añada al complemento de ADN masculino del cigoto antes de que el mismo se procese por el núcleo del óvulo o el pronúcleo del cigoto femenino. Se piensa que el núcleo del óvulo o pronúcleo femenino libera moléculas que influyen en el complemento de ADN masculino, tal vez reemplazando las protaminas del ADN masculino con histonas, facilitando de ese modo la combinación de los complementos de ADN femenino y masculino para formar el cigoto diploide.

Por tanto, se prefiere que el material genético exógeno se añada al complemento masculino de ADN o cualquier otro complemento de ADN antes de que el pronúcleo femenino influya sobre él. Por ejemplo, el material genético exógeno se añade al pronúcleo masculino temprano, tan pronto como sea posible después de la formación del pronúcleo masculino, que es cuando los pronúcleos masculino y femenino están bien separados y ambos están localizados próximos a la membrana celular. Como alternativa, el material genético exógeno se podría añadir al núcleo del espermatozoide después de que se ha inducido a experimentar decondensación. Después, el espermatozoide que contiene el material genético exógeno se puede añadir al óvulo o el espermatozoide decondensado se podría añadir al óvulo añadiendo las construcciones de transgen tan pronto como sea posible a partir de entonces.

La introducción de la secuencia de nucleótidos del transgen en el embrión se puede conseguir por cualquier medio conocido en la técnica tal como, por ejemplo, microinyección, electroporación o lipofección. A continuación de la introducción de la secuencia de nucleótidos del transgen en el embrión, el embrión se puede incubar in vitro durante cantidades variables de tiempo o reimplantarse en el hospedador sustituto o ambos. La incubación in vitro hasta la madurez está dentro del alcance de esta invención. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie y después reimplantarlos en el hospedador sustituto.

Un cigoto es básicamente la formación de una célula diploide que es capaz de desarrollarse en un organismo completo. Generalmente, el cigoto estará comprendido de un huevo que contiene un núcleo formado natural o artificialmente, por la fusión de dos núcleos haploides a partir de un gameto o gametos. Por tanto, los núcleos del gameto tienen que ser unos que sean compatibles naturalmente, es decir, aquellos que produzcan como resultado un cigoto viable capaz de experimentar diferenciación y desarrollarse en un organismo funcional. Generalmente, se prefiere un cigoto euploide. Si se obtiene un cigoto aneuploide, entonces el número de cromosomas no debería variar en más de uno con respecto al número euploide del organismo del cual cualquiera de los gametos se originó.

Además de consideraciones biológicas similares, las físicas también rigen la cantidad (por ejemplo, volumen) de material genético exógeno que se puede añadir al núcleo del cigoto o al material genético que forma una parte del núcleo del cigoto. Si no se retira material genético, entonces la cantidad de material genético exógeno que se puede añadir está limitada por la cantidad que se absorberá sin ser físicamente perjudicial. Generalmente, el volumen de material genético exógeno insertado no excederá aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de la adición no deben ser tan importantes como para destruir físicamente la viabilidad del cigoto. El limite biológico del número y variedad de secuencias de ADN variará dependiendo del cigoto particular y funciones del material genético exógeno y será fácilmente evidente para un especialista en la técnica, debido a que el material genético, que incluye el material genético exógeno, del cigoto resultante tiene que ser biológicamente capaz de iniciar y mantener la diferenciación y desarrollo del cigoto en un organismo funcional.

El número de copias de las construcciones de transgen que se añaden al cigoto depende de la cantidad total de material genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que ocurra la transformación genética. Teóricamente, se requiere sólo una copia; sin embargo, generalmente, se utilizan numerosas copias, por ejemplo, 1.000-20.000 copias de la construcción de transgen, para asegurar que una copia sea funcional. Con respecto a la presente invención, con frecuencia existirá una ventaja en tener más de una copia funcional de cada una de las secuencias de ADN exógeno insertadas para potenciar la expresión fenotípica de las secuencias de ADN exógeno.

Cualquier técnica que permita la adición de material genético exógeno en material genético nucleico se puede utilizar siempre y cuando no sea destructiva para las células, la membrana celular u otras estructuras celulares o genéticas existentes. El material genético exógeno preferiblemente se inserta en el material genético nucleico por microinyección. La microinyección de células y estructuras celulares se conoce y se usa en la técnica.

La reimplantación se consigue usando métodos convencionales. Habitualmente, el hospedador sustituto se anestesia y los embriones se insertan en el oviducto. En número de embriones implantados en un hospedador particular variará según la especie, pero habitualmente, será comparable con el número de descendientes que la especie produce naturalmente.

Los descendientes transgénicos del hospedador sustituto se pueden seleccionar para determinar la presencia y/o expresión del transgen mediante cualquier método adecuado. La selección se consigue con frecuencia por análisis de transferencia Southern o de transferencia Northern, usando una sonda que sea complementaria a al menos una parte del transgen. El análisis de transferencia Western usando un anticuerpo frente a la proteína codificada por transgen se puede emplear como un método alternativo o adicional para seleccionar según la presencia de producto de transgen. Típicamente, se prepara ADN a partir de tejido de la cola y se analiza por análisis Southern o PCR para el transgen. Como alternativa, los tejidos o células que se cree que expresan el transgen en los niveles más elevados se ensayan para determinar la presencia y expresión del transgen usando análisis Southern o PCR, aunque se puede usar cualquiera de los tejidos o tipos celulares para este análisis.

Los métodos alternativos o adicionales para evaluar la presencia del transgen incluyen, sin limitación, ensayos bioquímicos adecuados tales como ensayos enzimáticos y/o inmunológicos, tinciones histológicas para determinar marcadores particulares o actividades enzimáticas, análisis citométricos de flujo y similares. También puede ser útil el análisis de sangre para detectar la presencia del producto de transgen en la sangre, así como para evaluar el efecto del transgen sobre los niveles de diversos tipos de células sanguíneas y otros constituyentes sanguíneos. Como alternativa, se puede usar IRM para visualizar la expresión transgénica.

Un método alternativo para generar animales transgénicos implica la transfección in vivo o ex vivo (in vitro) de células germinales animales masculinas con un ácido nucleico deseado (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.316.692). En un enfoque, el ácido nucleico se administra in situ a la gónada del animal (transfección in vivo). Se deja que las células germinales transfectadas se diferencien en su propio entorno y después se seleccionan los animales que muestren integración del ácido nucleico en las células germinales. Los animales seleccionados se pueden aparear o utilizar su esperma para inseminación o fertilización in vitro para producir progenie transgénica. La selección puede tener lugar después de la biopsia de una o ambas gónadas o después del examen del eyaculado del animal para confirmar la incorporación de la secuencia de ácido nucleico deseada. Como alternativa, se pueden aislar células germinales masculinas a partir de un animal donador y transfectarse o alterarse genéticamente in vitro. A continuación de esta manipulación genética, las células germinales transfectadas se seleccionan y transfieren a los testículos de un animal receptor adecuado. Antes de la transferencia de las células germinales, los testículos de receptor generalmente se tratan en una o una combinación de varias maneras para inactivar o destruir células germinales endógenas, incluyendo por radiación gamma, por tratamiento químico, por medio de agentes infecciosos tales como virus o por agotamiento autoinmune o por combinaciones de los mismos. Este tratamiento facilita la colonización de los testículos del receptor por las células donadoras alteradas. Se puede permitir que los animales que portan células espermáticas modificadas adecuadamente se apareen naturalmente o, como alternativa, sus espermatozoides se usan para inseminación o fertilización in vitro.

Un animal transgénico se puede producir mediante infección in vitro de un embrión de célula única con un vector lentiviral. Véase, por ejemplo, Lois et al., Science 295: 868-872 (2002).

La infección retroviral también se puede usar para introducir el transgen en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo se puede cultivar in vitro hasta la etapa de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para la infección retroviral (Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260-1264). La infección eficaz del blastómero se obtiene mediante tratamiento enzimático para retirar la zona pelúcida (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El sistema de vector viral usado para introducir el transgen típicamente es un retrovirus sin capacidad de replicación que porta el transgen (Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148-6152). La transfección se obtiene fácilmente y eficazmente cultivando los blastómeros en una monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, anteriormente; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383-388). Como alternativa, la infección se puede realizar en una etapa posterior. Los virus o células productoras de virus se pueden inyectar en el blastocele (Jahner et al. (1982) Nature 298: 623-628). La mayoría de las fundadoras serán un mosaico del transgen ya que la incorporación sucede sólo en un subconjunto de células que formaron el animal no humano transgénico. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovirales del transgen en diferentes posiciones en el genoma que generalmente se separarán en los descendientes. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal mediante infección retroviral intrauterina del embrión de gestación intermedia (Jahner et al. (1982) anteriormente).

Un cuarto tipo de célula diana para introducir el transgen es la célula madre embrionaria (ES). Las células ES se obtienen a partir de embriones de pre-implantación cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069 y Robertson et al. (1986) Nature 322: 445-448). Los transgenes se pueden introducir eficazmente en las células ES mediante transfección de ADN o por transducción mediada por retrovirus. Tales células ES transformadas se pueden combinar a partir de entonces con blastocistos de un animal no humano. A partir de entonces las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante. Para una revisión véase Jaenisch, R (1988) Science 240: 1468-1474.

En general, se puede obtener progenie de animales transgénicos apareando los animales transgénicos con un compañero adecuado o por fertilización in vitro de huevos y/o esperma obtenido a partir del animal transgénico. Cuando se realiza el apareamiento con un compañero, el compañero puede o no ser transgénico y/o un knockout; cuando es transgénico, puede contener el mismo transgen o uno diferente o ambos. Como alternativa, el compañero puede ser una línea parental. Cuando se usa la fertilización in vitro, el embrión fertilizado se puede implantar en un hospedador sustituto o incubarse in vitro o ambos. Usando cualquier método, la progenie se puede evaluar para determinar la presencia de transgen usando métodos descritos anteriormente u otros métodos apropiados.

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Los animales transgénicos producidos incluirán material genético exógeno que codifica un agente de contraste. Además, la secuencia preferiblemente estará unida a una secuencia reguladora que permita la expresión del transgen. El agente de contraste producido in situ se puede visualizar por IRM.

8. Metodologías de IRM

En general, los agentes de contraste de la invención están diseñados para uso en sistemas de detección de IRM. En la puesta en práctica más común de IRM, se observa el núcleo de hidrógeno (protón) en moléculas de agua móvil contenidas en materiales objeto. El material objeto se coloca en un campo magnetostático grande. El campo tiene tendencia a alinear el momento magnético asociado con el núcleo de hidrógeno en agua a lo largo de la dirección del campo. El equilibrio de los núcleos se altera mediante radiación de frecuencia de radio pulsada (RF) ajustada en la frecuencia de Larmor, que es una frecuencia característica proporcional a la fuerza del campo magnético donde los protones absorben energía de forma resonante. Tras retirar la RF, los núcleos inducen un voltaje transitorio en una antena receptora; este voltaje transitorio constituye la señal de resonancia magnética nuclear (NMR). La información espacial se codifica tanto en la frecuencia como en la fase de la señal de NMR mediante aplicación selectiva de gradientes de campo magnético que se sobreponen en el campo estático grande. Los voltajes transitorios se digitalizan de forma general y después estas señales se pueden procesar mediante, por ejemplo, el uso de un ordenador para producir imágenes.

Ejemplos Ejemplo 1 NMR de Células K562 que Sobre-Expresan Ferritina: Estudios de Tumor Simulado

Se describen datos que muestran la fiabilidad de usar una sobre-expresión de polipéptidos de unión a metal intracelular como un agente de contraste de IRM potente. Estos resultados iniciales se enfocan en ferritina en células vivas de leucemia mieloide humana (K562).

Para investigar la sensibilidad de ferritina para modular las propiedades de NMR de células K562, se sintetizaron muestras de "tumor" simulado. Las mismas consistían en células K562 que se estimularon para producir cantidades variables de ferritina intracelular en exceso in vitro. Después las células se suspendieron en agarosa de bajo punto de fusión para formar gránulos pequeños. La tasa de relajación longitudinal (1/T_{1}) y la tasa de relajación transversal (1/T_{2}) se midió en los gránulos para cuantificar el impacto de ferritina (la modulación de estos tiempos de relajación da origen a contraste de imagen en IRM). En las mismas células usadas para las muestras, se ensayó el contenido de ferritina total usando ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima).

Para el experimento, las muestras consistían en células K562 que se estimularon para sobre-expresar ferritina mediante una incubación de 16 horas con concentraciones variables de citrato de amonio férrico (FAC) en medio de cultivo RPMI complementado con suero fetal bovino al 2%. Después de la incubación, las células se lavaron. Para cada concentración de FAC, se recontaron 10^{7} células para la muestra de NMR y 10^{6} células se dejaron a un lado para el ensayo de ELISA (Alpha Diagnostics Int. Inc., San Antonio, TX). Las células usadas para las muestras de NMR se resuspendieron en 50 \mul de agarosa de bajo punto de fusión en un tubo de plástico pequeño. Las mediciones de 1/T_{1} y 1/T_{2} se realizaron a temperatura ambiente usando un relaxómetro Bruker Minispec (Bruker Instruments, Billerica, MA). Las células usadas para ELISA se trataron con tampón de lisis y se confirmó la consistencia de la cantidad total de proteína liberada usando un ensayo de cuantificación de proteína de ácido bicinconinico (Pierce Inc., Rockford, IL). La concentración de ferritina se calculó como un promedio sobre el volumen de gránulo celular.

La correlación entre los cambios de NMR y contenido de ferritina se muestra en la Figura 1. Los resultados muestran cambios sustanciales en los tiempos de relajación con aumentos moderados en la expresión de ferritina sobre el fondo; estos cambios se observan fácilmente usando IRM (más adelante). Estos tumores simulados tienen una densidad celular de 200 células/n1.

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Ejemplo 2 Estudios de Toxicidad

La síntesis de ferritina altera temporalmente el metabolismo de hierro de la célula. Aunque los efectos secundarios de esto sobre la salud a largo plazo de la célula todavía no se han determinado completamente in vivo, indicios de diversos experimentos in vitro han demostrado que la sobre-expresión de ferritina no es dañina en una diversidad de líneas celulares, especialmente, para expresión transitoria. Esto se confirmó en los experimentos en células K562 descritos en el Ejemplo 1 anteriormente. Para cada concentración de FAC (y control), se recontaron las células antes y después del periodo de incubación 3 veces usando un hemocitómetro y los resultados se promediaron. La Figura 2 muestra el porcentaje de células restantes después del periodo de 16 horas de carga de ferritina. En los tumores simulados, los aumentos de ferritina de más de 10 veces sobre los niveles de línea basal sólo dieron como resultado una pérdida celular del orden del 20%. El aumento de ferritina necesario para proporcionar contraste de IRM observable sólo es de orden 2-4.

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Ejemplo 3 IRM de Tumores Simulados

La sobre-expresión de ferritina en los tumores simulados se visualiza fácilmente usando IRM. La Figura 3 muestra un corte de una imagen de IRM a través de tres gránulos usados en los experimentos de NMR. En esta imagen, el contraste está predominantemente potenciado con T_{2}. En la Figura 3 (a) es el control y (b)-(c) son las muestras que contienen un aumento de ferritina de 2,7 y 4, respectivamente (véase la Figura 1). La imágenes se adquirieron simultáneamente usando un sistema de IRM Bruker 7-Tesla con TE/TR = 45/2000 ms, 128x128 puntos de imagen y 1 corte de 1 mm de espesor. El tamaño del gránulo fue aproximadamente 4 mm de diámetro.

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Ejemplo 4 Estudios de IRM de Células que Comprenden Ferritina Recombinante

Se introdujeron transgenes de ferritina tanto ligera como pesada, denominados LF y HF, respectivamente, en una diversidad de líneas celulares (por ejemplo, K562 y gliosarcoma de rata 9L) usando métodos de transfección basados en lípidos y usando virus. Los resultados se analizaron usando ELISA, NMR e IRM. Los resultados típicos se muestran en las Figuras 4 y 5. Se usaron ADNc de ferritina de cadena ligera y pesada humana que tenían elementos reguladores de hierro defectuosos. Usando técnicas de biología molecular convencionales ambos transgenes se colocaron bajo el control del promotor temprano inmediato del CMV. La integridad de los transgenes se confirmó por electroforesis de fragmentos de ADN a continuación de la digestión con diversas enzimas de restricción y mediante secuenciación de ADN.

Introducción de Ferritina a través de Transfección

Células 9L (gliosarcoma de rata de Fischer 344) se incubaron en DMEM complementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), penicilina, estreptomicina y glutamina. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos un día antes de la transfección para conseguir confluencia del 60-80%. Las células se enjuagaron con DMEM sin suero y después se cubrieron con la misma solución. Se preparó una mezcla de ADN de la forma siguiente: el reactivo lipofectamine^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) se combinó con cantidades iguales de ADN de LF y HF en DMEM sin suero. El reactivo Plus^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) se añadió a la solución de ADN para aumentar la eficacia de transfección. La mezcla de ADN se añadió a las células y después se incubó durante 3 horas a 37ºC, después de lo cual se añadió DMEM que contenía FBS al 10%. Las células se recogieron 48 ó 96 horas después de la transfección y se recontaron. Además, se prepararon muestras de control incubando células 9L en condiciones idénticas a las anteriores, excepto que no se añadió ADN a la mezcla de lipofectamine^{TM}-Plus^{TM}-DMEM. Después de la recolección después de 48 ó 96 horas no se observaron diferencias significativas en números celulares entre muestras incubadas con los informadores de ADN y las muestras de control. Por tanto, no hubo toxicidad aparente asociada con las proteínas de contraste.

Para ensayar el aumento de ferritina después de la transfección, se prepararon células 9L como se ha descrito anteriormente. Las proteínas intracelulares se extrajeron usando el Reactivo de extracción M-PER^{TM} (Pierce Biotechnology, Mountain View, CA) y el contenido de ferritina se ensayó usando un kit de ELISA (Alpha diagnostics, San Antonio, TX). Los resultados típicamente mostraron una concentración de ferritina \sim 3 ng/ml en las células transfectadas y una cantidad insignificante (-0,0 ng/ml) de ferritina humana en las células no transfectadas. (La línea de células 9L es de rata y el anticuerpo usado en el ELISA sólo detecta ferritina humana sin reactividad cruzada).

El contenido de hierro intracelular se midió en células transfectadas y de control para confirmar una captación de hierro aumentada con expresión transgénica. Para estos experimentos se sembraron 20 x 10^{6} células y se transfectaron usando los métodos descritos anteriormente. También se prepararon células de control como se ha descrito anteriormente sin ADN añadido a la solución de incubación. Las células se recogieron 96 horas después de la transfección y se recontaron. Usando métodos convencionales [2001 Blood 97(9), 2863] se lavaron las células en PBS y los gránulos se disolvieron en una solución ácida y se trataron con una solución de sulfonato de batofenan trolina. La absorción de luz de la solución se leyó a 535 nm usando un espectrofotómetro y se calculó la concentración de hierro. Los resultados indican un factor de aumento de \sim 1,5 en el contenido de hierro neto de las células transfectadas en comparación con el control.

Se realizó la medición de 1/T_{2} en gránulos de células transfectadas. Se transfectaron células (20 x 10^{6}) con los transgenes como se ha descrito anteriormente. Las células se recogieron 96 horas después de la transfección, se lavaron dos veces con PBS y se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 0,2 ml. Las células se centrifugaron de nuevo y el sobrenadante se descartó. Se realizaron mediciones de NMR en los gránulos a 4ºC usando un analizador de NMR Bruker Minispec de 20 MHz (Bruker Instruments, Billerica, MA). Los resultados típicamente muestran un factor de aumento del \sim 15% en 1/T_{2}en las células transfectadas sobre el control.

Usando los mismos gránulos de células que se prepararon para los experimentos de NMR anteriores, se confirmó que el cambio de 1/T_{2} debido a la expresión de las proteínas de contraste proporcionó contraste satisfactorio en imágenes de RM. Los tubos de microcentrífuga que contenían los gránulos se colocaron en un aparato de IRM y se formaron imágenes usando una secuencia de impulso espín-eco Fourier transformada de dos dimensiones potenciada con T_{2} convencional (2DFT). La Figura 4 presenta datos típicos y muestra un corte IRM de alta resolución a través de dos gránulos adquiridos simultáneamente; el gránulo de la izquierda es el control y el gránulo de la derecha contiene células que expresan las proteínas de contraste. El contraste de imagen es claramente evidente entre las dos muestras.

Introducción de Ferritina a través de un Vector Viral

También se han introducido proteínas de contraste en células a través de un vector viral. Las células infectadas se caracterizaron usando ELISA, NMR e IRM. Los datos de IRM muestran contraste claro entre células infectadas con las proteínas de contraste y células no infectadas (control). Para estos experimentos, cada uno de los transgenes de LF y HF se incorporaron en adenovirus sin capacidad de replicación separados. Estos virus se construyeron usando el sistema de expresión Adeno-X^{TM} disponible en el mercado (Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La expresión de transgen se controló usando el promotor CMV. Se usó una línea de células HEK-293 para producción de reservas virales. Cuando el efecto citopático fue evidente en las células HEK-293 debido a la producción viral, las células se recogieron, se lisaron y los sobrenadantes se recogieron. Estos sobrenadantes son ricos en adenovirus y se usaron para infectar células de mamífero para demostrar efectos contrastantes de IRM. Se incubaron células 9L en DMEM complementado con FBS al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina. Se sembraron células (\sim 20 x 10^{6}) en placas de 24 pocillos 1 día antes de la infección para conseguir confluencia del 60-80%. Después las células se enjuagaron con DMEM sin suero y después se cubrieron con la misma solución. Se añadieron volúmenes iguales del adenovirus tanto LF como HF de cada uno de los sobrenadantes respectivos a las células 9L. Los virus y las células se incubaron en medio sin suero durante 0,5 horas y después se añadió FBS al DMEM para producir FBS al 10%. Después de 48 horas de incubación las células se recogieron, se enjuagaron y se ensayaron los efectos de los genes de contraste. La Figura 5 muestra datos de IRM típicos de dos gránulos, infectado y no infectado (control), de células 9L. Estos datos se adquirieron usando una secuencia espín-eco 2DFT potenciada con T_{2} de una manera similar a los experimentos de transfección anteriores. El gránulo de la izquierda es el control y el gránulo de la derecha contiene células infectadas con transgenes LF y HF. El contraste de imagen es claramente evidente entre las dos muestras.

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Ejemplo 5 Introducción de un Ácido Nucleico que Codifica una Proteína de Contraste In Vivo

Este experimento está diseñado para demostrar la administración de agente de contraste de la invención in vivo.

En este ejemplo, dos muestras de tumor se trasplantan en un ratón desnudo. Una administración de HSV se modifica por ingeniería genética para que contenga una construcción de ácido nucleico que comprenda las secuencias codificantes de las ferritinas humanas representadas en las SEC ID Nº: 2 y 4. A una muestra de tumor se inyecta el vector de HSV + ferritina, mientras que a la otra muestra de tumor se inyecta un vector de HSV "vacío". Después el ratón se somete a IRM y se compara el contraste entre la muestra de HSV + ferritina y la muestra de HSV "vacía".

Las referencias citadas adicionales son las siguientes: Trinder et al., Int. J. Biochem. & Cell Biol., 35: 292-296 (2003); Fleming et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 10653-10658 (2002) y Fleming et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 2214-2219 (2000).

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4683195 A, Mullis [0015]

\bullet WO 9428152 A [0091]

\bullet US 5223409 A [0066]

\bullet FR 9400851 W, Imler [0091]

\bullet US 5198346 A [0066]

\bullet WO 9502697 A [0091]

\bullet US 5096815 A [0066]

\bullet US 9514793 W, Perrocaudet [0091]

\bullet US 5399346 A [0076]

\bullet WO 9614061 A, Wang [0091]

\bullet US 6207451 A [0076]

\bullet WO 9708298 A, O'Riordan [0096]

\bullet US 5538722 A [0076]

\bullet US 5688676 A, Thou [0096]

\bullet US 6146889 A [0076]

\bullet WO 9613598 A [0097]

\bullet US 6001647 A [0076]

\bullet WO 9428938 A, Wilson [0099]

\bullet US 5888705 A [0076]

\bullet WO 9613597 A [0099]

\bullet US 5851832 A [0076]

\bullet WO 9626285 A [0099]

\bullet WO 0036091 A [0076]

\bullet US 9609948 W, Clackson [0101]

\bullet WO 0153461 A [0076]

\bullet US 4868116 A [0102)

\bullet WO 0121767 A [0076)

\bullet US 4980286 A [0102]

\bullet US 5679647 A, Carson [0079]

\bullet WO 8907136 A [0102]

\bullet US 5631236 A [0085]

\bullet WO 8902468 A [0102]

\bullet WO 0008191 A [0085)

\bullet WO 8906345 A [0102]

\bullet US 5698443 A, Henderson and Schuur [0089]

\bullet WO 9207573 A [0102]

\bullet US 9515947 W[0091]

\bullet WO 9325234 A [0103]

\bullet WO 9618418 A [0091)

\bullet WO 9406920 A [0103]

\bullet US 9507341 W, Kadan [0091]

\bullet WO 9411524 A [0103]

\bullet WO 95346671 A [0091]

\bullet US 6316692 B [0118]

\bullet FR 9400624 W, Kovesdi [0091]

Literatura no patente citada en la descripción

\bullet Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0015]

\bulletDNA Cloning. 1985, vol I, II [0015]

\bulletOligonucleotide Synthesis. 1984 [0015]

\bulletNucleic Acid Hybridization. 1984 [0015]

\bulletTranscription And Translation. 1984 [0015]

\bullet R. I. Freshney. Culture Of Animal Cells. Alan R. Liss, Inc, 1987 [0015]

\bullet Immobilized Cells And Enzymes. IRL Press, 1986 [0015]

\bullet B. Perbal. A Practical Guide To Molecular Cloning. 1984 [0015]

\bullet Methods in Enzymology. Academic Press. Inc. [0015]

\bullet Gene Transfer vectors For Mammalian Cells. Cold Spring Harbor Laboratory, 1987 [0015]

\bulletMethods In Enzymology. vol. 154, 155 [0015]

\bullet Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology. Academic Press, 1987 [0015]

\bullet Handbook Of Experimental Immunology 1986. vol. I-IV [0015]

\bullet Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo, 1986 [0015]

\bulletAltschul et al. J Mol. Biol., 1990, vol 215, 403-10 [0027]

\bulletAltschul et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25 (17), 3389-3402 [0027]

\bullet Computational Molecular Biology. Oxford University Press, 1988 [0028]

\bullet Biocomputing: Informatics and Genome Projects. Academic Press, 1993 [0028]

\bullet Computer Analysis of Sequence Data. Humana Press, 1994, vol. I [0028]

\bulletHeinje, G. Sequence Analysis in Molecular Biology. Academic Press, 1987 [0028]

\bullet Sequence Analysis Primer. M Stockton Press, 1991 [0028]

\bulletCarillo, H.; Lipman, D. SIAM J. Applied Math. 1998, vol 48, 1073 [0028]

\bulletDevereux, J. et al. Nucleic Acids Research. 1984. vol. 12 (1), 387 [0028]

\bulletAltschul, S. F. et al. J. Molec. Biol., 1990, vol 215, 403-410 [0028]

\bulletAltschul et al. Nuc. Acids Res., 1997, vol. 25, 3389-3402[0028]

\bulletAltschul, S. et al. BLAST Manual. NCBI NLM NIH Bethesda [0028]

\bulletAltschul, S. et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0028]

\bulletLaVaute et al. Nat Genet, 2001, vol. 27 (2), 209-14 [0062]

\bulletBiochemistry. W.H. Freeman and Co, 1981 [0064]

\bulletScott et al. Science, 1990, vol. 249, 386-390 [0066]

\bulletRoberts et al. PNAS USA, 1992, vol. 89, 2429-2433 [0066]

\bulletDevlin et al. Science, 1990, vol. 249, 404-406 [0066]

\bulletCwirla et al. PNAS USA, 1990, vol. 87, 6378-6382 [0066]

\bulletRuf et al. Biochemistry, 1994, vol. 33, 1565-1572 [0067]

\bulletWang et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 3095-3099 [0067]

\bulletBalint et al. linker scanning mutagenesis, 1993 [0067]

\bulletGustin et al. Virology, 1993, vol. 193, 653-660 [0067]

\bulletBrown et al. Mol. Cell Biol., 1992, vol. 12, 2644-2652 [0067]

\bulletMcKnight et al. Science, 1982, vol. 232, 316 [0067]

\bulletMeyers et al. Science, 1986, vol. 232, 613 [0067]

\bulletLeung et al. Method Cell Mol Biol, 1989, vol. 1,11-19 [0067]

\bulletMiller et al. A Short Course in Bacterial Genetics. CSHL Press, 1992 [0067]

\bulletGreener et al. Strategies in Mol Biol, 1994, vol. 7, 32-34 [0067]

\bulletCavauana-Calvo et al. Science, 2000, vol. 288 (5466), 669-72 [0076]

\bulletDubensky et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol 81, 7529-7533 [0077]

\bulletKaneda et al. Science, 1989, vol. 243, 375-378 [0077]

\bulletHiebert et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 3594-3598(0077]

\bulletHatzoglu et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 17285-17293 [0077]

\bulletFerry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 8377-8381 (0077]

\bulletFeigner et al. Ann NY Acad Sci, 1995, 126-139 [0079]

\bulletCanonico et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, vol. 10, 24-29 [0079]

\bulletTsan et al. Am J Physiol, 268 [0079]

\bulletAlton et al. Nat Genet, 1993, vol. 5, 135-142 [0079]

\bulletHaj-Ahmand; Graham. J. Virol., 1986, vol. 57, 267 [0087]

\bulletJones et al. Cell, 1979, vol. 16, 683 [0087]

\bulletGraham et al. Methods in Molecular Biology. Humana, Clifton, 1991, vol. 7, 109-127 [0087]

\bulletBerkner et al. BioTechniques, 1988, vol. 6, 616 [0088]

\bulletRosenfeld et al. Science, 1991, vol. 252, 431-434 [0088]

\bulletRosenfeld et al. Cell, 1992, vol. 68, 143-155 [0088]

\bulletMuzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol, 1992, vol. 158, 97-129 [0092]

\bulletFlotte et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1992, vol. 7, 349-356 [0094]

\bulletSamuiski et al. J. Virol. 1989, vol. 63, 3822-3828 [0094]

\bulletMcLaughlin et al. J. Virol, 1989, vol. 62, 1963-1973 [0094]

\bulletTratschin et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5, 3251-3260 [0094]

\bulletHermonat et al. PNAS USA, 1984, vol. 81, 6466-6470 [0094]

\bulletTratschin et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 4, 2072-2081 [0094]

\bulletWondisford et al. Mol Endocrinol, 1988, vol 2, 32-39 [0094]

\bulletTratschin et al. J. Virol., 1984, vol. 51, 611-619 [0094]

\bulletFlotte et al. J. Biol. Chem., 1993, vol 268, 3781-3790 [0094]

\bulletKotin, R.M. Human Gene Therapy, 1994, vol 5, 793-801 [0095]

\bulletFlotte et al. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, 3781-3790 [0095]

\bulletHermonat; Muzyczka. PNAS, 1984, vol. 81, 6466 [0096]

\bulletSamutski et al. J. Virol., 1989, vol. 63, 3822 [0096]

\bulletFlotte et al. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, 3781-3790 [0096]

\bulletMann et al. Cell, 1983, vol. 33, 153 [0100)

\bullet Retroviral Vectors. Nicolas; Rubenstein. Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses. Stoneham:Butterworth, 1988 [0100]

\bullet Retrovirus Vectors for Gene Transfer Efficient Integration into and Expression of Exogenous DNA in Vertebrate Cell Genome. Temin. Gene Transfer. Plenum Press, 1986 [0100]

\bulletPaskind et al. Virology, 1975, vol. 67, 242 [0100]

\bulletMiller, A.D. Blood, 1990, vol. 76, 271 [0101]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates. 1989, 9.10-9.14 [0101)

\bulletMuller et al. Mol. Cell Biol., 1991, vol 11, 1785 [0101]

\bulletSawyers et al. J. Exp. Med., 1995, vol. 181, 307 [0101]

\bulletFederico. Curr. Opin. Biotechnol., 1999, vol. 10, 448 [0102]

\bulletEglitis et al. Science, 1985, vol. 230, 1395-1398 [0102]

\bulletDanos; Mulligan. PNAS USA, 1988, vol. 85, 6460-6464[0102]

\bulletWilson et al. PNAS USA, 1988, vol. 85, 3014-3018 [0102]

\bulletArmentano et al. PNAS USA, 1990, vol. 87, 6141-6145[0102]

\bulletHuber et al. PNAS USA, 1991, vol. 88, 8039-8043 [0102]

\bulletFerry et al. PNAS USA, 1991, vol. 88, 8377-8381 [0102]

\bulletChowdhury et al. Science, 1991, vol. 254, 1802-1805 [0102]

\bulletBeusechem et al. PNAS USA, 1992, vol. 89, 7640-7644 [0102]

\bulletKay et al. Human Gene Therapy, 1992, vol. 3, 641-647[0102]

\bulletDai et al. PNAS USA, 1992, vol. 89, 10892-10895 [0102]

\bulletHwu et al. J. Immunol., 1993, vol. 150, 4104-4115 [0102]

\bulletRoux et al. PNAS USA, 1989, vol. 86, 9079-9083 [0103]

\bulletJulan et al. J. Gen Virol, 1992, vol. 73, 3251-3255 [0103]

\bulletGoud et al. Virology, 1993, vol. 163, 251-254 [0103]

\bulletNeda et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 14143-14146 [0103]

\bulletRidgeway. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth, 1988 [0104]

\bulletBaichwal; Sugden. Gene transfer Plenum Press, 1986 [0104]

\bulletCoupar et al. Gene, 1988, vol. 68, 1-10 [0104]

\bulletWalther; Stein. Drugs, 2000, vol. 60, 249-71 [0104]

\bulletTimiryasova et al. J Gene Med, 2001, vol. 3, 468-77 [0104]

\bulletSchlesinger. Expert Opin Biol Ther, 2001, vol. 1, 177-91 [0104]

\bulletKhromykh. Curt Opin Mol Ther, 2000, vol. 2, 555-69 [0104]

\bulletFriedmann. Science, 1989, vol. 244, 1275-1281 [0104]

\bulletHorwich et al. J. Virol., 1990, vol. 64, 642-650 [0104]

\bulletBrinster et al. PNAS, 1985, vol. 82, 4438-4442 [0107]

\bulletLois et al. Science, 2002, vol. 295, 868-872 [0119]

\bulletJaenich, R. PNAS, 1976, vol 73, 1260-1264 [0120]

\bullet Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986 [0120]

\bulletJahner et al. PNAS, 1985, vol. 82, 6927-6931 [0120]

\bullet Van der Putten et al. PNAS, 1985, vol. 82, 6148-6152 [0120]

\bulletStewart et al. EMBO J, 1987, vol. 6, 383-388 [0120]

\bulletJahner et al. Nature, 1982, vol 298, 623-628 [0120]

\bulletEvans et al. Nature, 1981, vol. 292, 154-156 [0121]

\bulletBradley et al. Nature, 1984, vol. 309, 255-258 [0121]

\bulletGossler et al. PNAS, 1986, vol. 83, 9065-9069 [0121]

\bulletRobertson et al. Nature, 1986, vol. 322, 445-448 [0121]

\bulletJaenisch, R. Science, 1988, vol. 240, 1468-1474 [0121]

\bulletBlood, 2001, vol 97 (9), 2863 [0134]

\bulletTrinder et al. Int. J. Biochem. & Cell Biol., 2003, vol. 35, 292-296 [0140]

\bulletFleming et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99, 10653-10658 [0140]

\bulletFleming et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, 2214-2219 [0140]

Claims (9)

1. Un método para generar una imagen de un material objeto que comprende:

\quad

proporcionar un material objeto que comprende una pluralidad de células, en el que un subconjunto de las células sobre-expresa o expresa ectópicamente una cantidad detectable por IRM de una proteína ferritina recombinante, donde dicha ferritina está en complejo con hierro endógeno y

\quad

formar imágenes de las células mediante formación de imágenes de resonancia magnética.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las células que comprenden la cantidad medible de una proteína ferritina se distinguen de las células u otros componentes del material que no comprende la cantidad medible de una proteína ferritina.

3. Un método para detectar expresión génica que comprende:

\quad

proporcionar una célula que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína ferritina, mediante lo cual dicha célula sobre-expresa o expresa ectópicamente ferritina y donde dicha ferritina está en complejo con hierro endógeno y

\quad

formar imágenes de las células mediante formación de imágenes de resonancia magnética,

en el que la detección de proteína ferritina mediante formación de imágenes de resonancia magnética indica que el ácido nucleico que codifica la proteína ferritina está y/o se ha expresado.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína ferritina tiene una identidad de al menos el 60% con una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4.

5. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es parte de un cultivo celular.

6. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es parte de un tejido in vitro.

7. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es parte de un organismo multicelular.

8. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es parte de un mamífero.

9. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es parte de una planta.