ES2327839T3 - Monodosis de fgf-2 eficaz angiogenicamente y metodo de uso. - Google Patents

Abstract

Una composición en monodosis para inducir angiogénesis en un ser humano, que comprende un agente que es FGF-2 o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo en una cantidad de aproximadamente 0,008 mg a aproximadamente 7,2 mg en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor.

Description

Monodosis de FGF-2 eficaz angiogénicamente y método de uso.

Compendio de la invención A. Campo de la invención

La presente invención está dirigida a una composición en monodosis para inducir angiogénesis en un ser humano, que comprende un agente que es FGF-2 o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo en una cantidad de aproximadamente 0,008 mg a aproximadamente 7,2 mg en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor. La presente invención también está dirigida al uso de un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente humano de una enfermedad de las arterias coronarias o de un infarto de miocardio, o para inducir angiogénesis en un corazón de un paciente humano, donde dicho medicamento es una composición en monodosis según la invención, que ha de ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de la vena periférica en un paciente humano con necesidad de tratamiento para dicha enfermedad de las arterias coronarias. La presente invención también está dirigida al uso de un agente que es un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente humano de enfermedad de las arterias coronarias, donde dicho agente ha de ser administrado en una cantidad terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,2 \mug/kg a 48 \mug/kg del peso del paciente dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica en un paciente humano con necesidad de tratamiento de dicha enfermedad de las arterias coronarias. La presente invención es útil porque la composición en monodosis descrita, y el método para su administración, proporcionan una alternativa a la angioplastia o intervención quirúrgica para el tratamiento de la enfermedad de las arterias coronarias (EAC) y además proporciona un adjunto para reducir el daño posterior del infarto de miocardio (IM) en seres humanos.

B. Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento fibroblástico (FGF) son una familia de al menos dieciocho polipéptidos estructuralmente relacionados (llamados FGF-1 a FGF-18) que están caracterizados por un alto grado de afinidad a proteoglicanos, tales como heparina. Las distintas moléculas de FGF tienen un intervalo de tamaño de 15-23 kD, y exhiben un amplio intervalo de actividades biológicas en condiciones normales y malignas, que incluyen adhesión a la célula nerviosa y diferenciación [Schubert et al., J. Cell. Biol., 104:635-643 (1987)]; curación de heridas [Patente de EE.UU. 5.439.818 (FIDES)]; como mitógenos hacia muchos tipos celulares mesodérmicas y ectodérmicas, como factores tróficos, como diferenciación que induce o inhibe factores [Clements et al., Oncogene 8:1311-1316 (1993)]; y como un factor angiogénico [Harada, J. Clin. Invest., 94:623-630 (1994)]. Por ello, la familia FGF es una familia de factores de crecimiento pluripotentes que estimulan a una extensa variedad de fibroblastos, células del músculo liso, células epiteliales y células neuronales.

Cuando FGF es liberado por tejidos normales, tales como en el desarrollo fetal o en la curación de heridas, es sometido a controles temporales y espaciales. Sin embargo, muchos de los miembros de la familia de FGF también son oncogenes. Por ello, en ausencia de controles temporales y espaciales, tienen el potencial de estimular el crecimiento tumoral proporcionando angiogénesis.

La enfermedad de las arterias coronarias es una condición progresiva en seres humanos donde una o más arterias coronarias se ocluyen gradualmente por la acumulación de la placa arterial (aterosclerosis). Las arterias coronarias de pacientes que tienen esta enfermedad se tratan normalmente con angioplastia con globo o con la inserción de sondas para abrir de forma apropiada las arterias ocluidas. En última instancia, se necesita que muchos de estos pacientes sufran cirugía de circunvalación de la arteria coronaria con gran coste y riesgo. Sería deseable proporcionar a estos pacientes un medicamento que pueda potenciar el flujo de sangre coronaria con el fin de reducir la necesidad de sufrir la cirugía de circunvalación.

Se llega a una situación incluso más crítica en humanos cuando un paciente padece un infarto de miocardio, donde una o más arterias o arteriolas coronarias se ocluyen totalmente, tal como por un coágulo. Hay una necesidad inmediata de recuperar la circulación en la porción del miocardio servida por la arteria o arteriola ocluida. Si se restaura la circulación coronaria perdida dentro de las horas de la aparición del infarto, se puede prevenir mucho el daño del miocardio que se da por debajo de la oclusión. Los fármacos que disuelven los coágulos, tales como el activador de tejido plasminógeno (tPA), la estreptoquinasa, y la uroquinasa, se han probado para ser útiles en este caso. Sin embargo, como adjunto a los fármacos que disuelven coágulos, también sería deseable obtener la circulación colateral por angiogénesis en el miocardio dañado u ocluido.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un medicamento y un modo de administración que proporcione a los pacientes humanos una angiogénesis cardiaca durante la enfermedad arterial y/o infarto de miocardio agudo. Más particularmente, es un objeto adicional de la presente invención proporcionar una dosis terapéutica de un FGF y un modo de administración a seres humanos que proporcione la propiedad deseada de angiogénesis cardiaca, mientras se minimizan los efectos adversos.

Muchas de las varias moléculas de FGF han sido aisladas y administradas a varios modelos animales de isquemia miocárdica con resultados variables y, algunas veces, opuestos. Según Battler et al., "el modelo canino de isquemia miocárdica ha sido criticado debido a la abundante circulación colateral que se da de forma natural, que es opuesto al modelo porcino, que ``destaca'' por su relativa escasez de circulación colateral natural y su semejanza con la circulación coronaria en humanos". Battler et al., "Intracoronary Injection of Basic Fibroblast Growth Factor Enhances Angiogenesis in Infacted Swine Myocardium", JACC, 22(7): 2001-6 (Dic. 1993) en la página 2002, col. 1. Sin embargo, Battler et al., que administraron bFGF bovino (es decir, FGF-2) a cerdos en un modelo de infarto de miocardio, consideraron los resultados variables que se obtienen de una especie animal a otra, y describieron expresamente que los resultados divergentes "de este modo enfatizan el cuidado que debe ser ejercido al extrapolar los resultados de diferentes modelos animales". Battler et al., en la página 2005, col. 1. Además, Battler puntualiza que la "posología y modo de administración de bFGF [es decir, FGF-2 bovino] puede tener profundas implicaciones para el efecto biológico conseguido". Battler et al., en la página 2005, col. 1. Así, es un objeto adicional de esta invención descubrir una posología y un modo de administración de un factor de crecimiento fibroblástico que pueda proporcionar un tratamiento seguro y eficaz de EAC y/o daño posterior en IM en un paciente humano. Más generalmente, es un objeto de la presente invención proporcionar
una composición farmacéutica y el uso de dicha composición para inducir angiogénesis en un corazón humano.

Sellke et al. (1998), Annals of Thoracic Surgery, vol. 65, 1540-1544, describen el uso de perlas de heparina-alginato que contienen FGF-2 para inducir angiogénesis.

Schumaher et al. (1998), Circulation, 97/7, 645-650, describen el uso del factor de crecimiento fibroblástico acídico para el tratamiento de la EAC.

Uchida et al. (1996), Ann. Herat J., vol. 130, 1182-1188, describen una terapia de infarto de miocardio agudo con factor de crecimiento fibroblástico básico y heparina.

Compendio de la invención

Los solicitantes han descubierto que administrando una sola dosis única de aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína angiogénicamente activos del mismo dentro de uno o más vasos coronarios (IC) o de una vena periférica (IV) de un paciente humano con necesidad de angiogénesis coronaria, se proporcionó de forma inesperada al paciente humano una angiogénesis rápida y terapéutica que dio como resultado un gran e inesperado aumento (es decir, 96 y 100 segundos de aumento en el cambio medio desde el recuento basal para todos los grupos a 2 y 6 meses) en el tiempo de tolerancia del ejercicio (TTE) del paciente tratado, que persistió durante una inesperada y larga duración (es decir, 6 meses desde este escrito). Estos cambios podrían dar como resultado una menor necesidad de procedimientos clásicos de revascularización. El término "angiogénesis coronaria", tal como se usa en la presente memoria, significa la formación de nuevos vasos sanguíneos, con intervalos de tamaño desde capilares a arteriolas que actúan como colaterales en la circulación coronaria. Como modo de comparación, la angioplastia es considerada un éxito terapéutico si proporciona un aumento en un TTE de un paciente de más de 30 segundos en comparación con el placebo.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención está dirigida a una sola dosis de rFGF-2 que comprende una cantidad segura y terapéuticamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde el vehículo comprende un tampón y un agente reductor. Típicamente, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg de r-FGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, basado en un peso ideal. En otras realizaciones, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz de la dosis única comprende 0,2 \mug/kg a 2,0 \mug/kg, superior a 2,0 \mug/kg a menos de 24 \mug/kg, o 24 \mug/kg a 48 \mug/kg IC de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. En otra realización, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz de la dosis única comprende 18 \mug/kg a 36 \mug/kg IV de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Expresado en términos absolutos, la dosis única de la presente invención comprende 0,008 mg a 7,2 mg, más típicamente 0,3 mg a 3,5 mg, de FGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Un FGF-2 adecuado es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida al uso de un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente humano con enfermedad de las arterias coronarias o para inducir angiogénesis en un corazón de un paciente humano. El medicamento es para administrar dentro de uno o más vasos coronarios o una vena periférica de un paciente humano con necesidad de tratamiento para la enfermedad de las arterias coronarias (o con necesidad de angiogénesis). El medicamento comprende una cantidad segura y terapéuticamente eficaz de un FGF-2 recombinante (rFGF-2) o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Típicamente, una porción de la cantidad segura y terapéuticamente eficaz es a ser administrada a cada uno de las dos vasos coronarios. La cantidad segura y terapéuticamente eficaz comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg, de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz comprende 0,2 \mug/kg a 2 \mug/kg, >2 \mug/kg a > 24 \mug/kg, o 24 \mug/kg a 48 \mug/kg de rFGF-2, un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En términos absolutos, la cantidad de rFGF-2 o fragmento o muteína angiogénicamente activos del mismo que es usado en el método descrito más arriba comprende 0,008 mg a 7,2 mg, más típicamente 0,3 mg a 3,5 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

Debido a que FGF-2 es una proteína de unión a proteoglicano (por ejemplo, heparina) y la presencia de un proteoglicano optimiza la actividad y AUC (véanse Figs. 3 y 4), las posologías IC de rFGF-2 de la presente invención típicamente están para ser administradas de 0-30 minutos previamente a la administración de un proteoglicano, tal como heparina. La heparina es administrada IC o IV, típicamente IV. Opcionalmente, la heparina está combinada con la composición en monodosis.

Debido a que rFGF-2 libera óxido nítrico, que es un potente vasodilatador, el agresivo manejo de fluidos previo a (proactivamente) y durante la infusión es crítico para la seguridad del paciente. La administración de fluidos IV (por ejemplo, 500-1000 ml de suero salino normal) para establecer una cuña de presión de 12 mm Hg antes de la infusión y la administración de bolos de fluidos IV (por ejemplo, 200 ml de suero salino normal) para disminuir la presión sanguínea sistólica (por ejemplo, < 90 mm Hg) asociado con la infusión optimizó la seguridad de la administración de rFGF-2 por infusión IC o IV a pacientes humanos.

Debido a que el EDTA es un potente quelante de calcio, que es necesario para la contracción normal del miocardio y la conducción cardiaca, minimizar la concentración de EDTA es crítico para la seguridad del paciente. Una concentración de EDTA menor de 100 \mug/ml en la composición en monodosis optimizó la seguridad de la administración de rFGF-2 por infusión IC o IV en pacientes humanos.

Debido a que un bolo de rFGF-2 repentino está asociado a profunda hipotensión en animales, el ritmo de infusión es crítico para la seguridad del paciente. La administración de 0,5 a 2 ml por minuto, típicamente 1 ml por minuto, optimizó la seguridad de la administración de rFGF-2 por infusión IC o IV en pacientes humanos.

La inesperada magnitud y duración del beneficio terapéutico que se proporcionó a los pacientes humanos con necesidad de angiogénesis coronaria por la composición en monodosis y el método de administración se vieron, como pronto, a las dos semanas tras administrarse una sola dosis, y persistió durante 6 meses tras administrarse una sola dosis IC o IV, tal como se determinó al medir los puntos clínicos finales reconocidos en el estado de la técnica, tales como TTE, el "Cuestionarios de Angina de Seattle" (SAQ) y MRI de las áreas diana del corazón. En particular, cuando el TTE de 58 pacientes EAC humanos se calculó por rutina en el recuento basal, y al mes, a los 2 meses y los 6 meses tras la administración en monodosis de rFGF-2 por rutas IC o IV, se observó beneficio clínico en algunos pacientes en todos los grupos de posología. Véase Tabla 1. El aumento en la capacidad de ejercicio apareció entre 1 y 2 meses. El TTE medio aumentó a más de 60 segundos a los 2 y 6 meses viéndose el mayor beneficio en el grupo de dosis superior (24-48 \mug/kg) en comparación con los grupos de dosis media (6-12 \mug/kg) o menor (0,33-2,0 \mug/kg). (Véase Tabla 1). Particularmente inesperados e impredecibles en modelos animales fueron los aumentos medios de TTE, en pacientes humanos, de 93,4 y 87,5 segundos que se observaron a los 2 y 6 meses, respectivamente, posología posterior para aquellos pacientes a los que se les administró una sola dosis de rFGF-2 IV. Incluso suponiendo un efecto placebo, el cambio medio desde el recuento basal para los segundos del TTE todavía permitieron una comparación inesperadamente favorable de los resultados con la angioplastia.

Cuando la calidad de vida de 48 pacientes humanos con EAC se valoró con un cuestionario validado específico de la enfermedad, El Cuestionario de Angina de Seattle (SAQ), en el recuento basal (es decir, antes de la posología) y a 2 y 6 meses tras recibir una sola dosis de rFGF-2 de la presente invención por rutas IC o IV, el cambio medio desde el recuento basal paras las 5 escalas medidas por SAQ aumentó de una manera clínicamente significativa para todos los intervalos de podología tanto administrados IC como IV. (Tablas 2-6). En particular, las cinco escalas valoradas por SAQ son de capacidad de esfuerzo, estabilidad de angina, frecuencia de angina, satisfacción del tratamiento, y percepción de la enfermedad. En relación al recuento basal, el valor medio para la capacidad de esfuerzo aumentó de 10.9 a 20,2 a los 2 meses; y de 16,5 a 24,1 a los 6 meses. Para la estabilidad de angina, el valor medio aumentó de 32,1 a 46,2 a los 2 meses; y de 16,7 a 23,2 a los 6 meses. Para la frecuencia de angina, el valor medio aumentó de 20,0 a 32,9 a los 2 meses; y de 11,4 a 36,7 a los 6 meses. Para la satisfacción del tratamiento, el valor medio aumentó de 8,5 a 19,8 a los 2 meses; y de 6,3 a 19,8 a los 6 meses. Para la percepción de la enfermedad, el valor medio aumentó de 20,2 a 27,8 a los 2 meses; y de 23,8 a 34,0 a los 6 meses. Generalmente, un cambio de 8 puntos en cualquier escala es considerado clínicamente significativo. Así, los cambios observados de 8,5-46,2 son clínicamente significativos para cada una de las cinco escalas que se evaluaron. Incluso asumiendo un efecto placebo a través del que un cambio medio de 14 puntos es considerado clínicamente significativo, los resultados todavía proporcionan un efecto superior inesperado en casi todas las escalas que se evaluaron.

Como parte de este estudio, también se realizó MRI en 33 pacientes humanos diagnosticados de EAC para evaluar el efecto de administrar una sola dosis de rFGF-2 en su fracción de expulsión cardiaca, función miocárdica regional y perfusión (zona de llegada retrasada). Específicamente, a los pacientes se les administró una sola dosis de 0,33 \mug/kg a 48 \mug/kg IC o 18 \mug/kg a 36 \mug/kg IV de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2. Cuando los 33 pacientes EAC humanos se evaluaron por formación de imágenes por resonancia magnética cardiaca en reposo (MRI) en el recuento basal (es decir, antes del tratamiento), y 1, 2 y 6 meses después del tratamiento con una sola dosis de rFGF-2 de la invención por rutas IC o IV, los pacientes exhibieron una respuesta significativa estadísticamente alta al método de tratamiento tal como se midió objetivamente por engrosamiento de la pared diana, el movimiento de la pared diana, y la extensión del área colateral diana, y por disminución de la extensión de llegada retardada del área diana. (Tabla 7). Como modo de resumen, a 1, 2 y 6 meses, el grosor de la pared diana aumentó en relación al recuento basal a 4,4%, 6,3% y 7,7%, respectivamente; el movimiento de la pared diana aumentó en relación al recuento basal en 2,7%, 4,4% y 6,4%, respectivamente; la extensión del área colateral diana aumentó en relación al recuento basal en 8,3%, 10,9% y 11,2%, respectivamente; y la disminución de la extensión de llegada retardada del área diana en relación al recuento basal en -10,0%, -8,3% y -10,0%, respectivamente.

Los datos de más arriba demuestran la eficacia clínica, en seres humanos, de la presente composición en monodosis de rFGF-2 o un fragmento angiogénicamente activo del mismo cuando se administra IC o IV según la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de la concentración media de rFGF-2 frente a los perfiles de tiempo para ocho dosis diferentes de rFGF-2 (SEQ ID NO: 2) administradas por infusión IC en seres humanos durante un periodo de 20 minutos. Las ocho dosis de rFGF-2 presentadas en la Figura 1A son 0,33, 0,65, 2, 6, 12, 24, 36 y 48 \mug/kg de masa corporal magra (MCM).

La Figura 1B es un diagrama de la concentración media de FGF-2 de plasma frente a perfiles de tiempo para 2 dosis diferentes de rFGF-2 (SEQ ID NO: 2) administradas por infusión IV en seres humanos durante un periodo de 20 minutos. Las dos dosis IV de rFGF-2 en la Figura 1B son 18 y 36 \mug/kg. El perfil medio de concentración-tiempo tras la administración IC de 36 \mug/kg de rFGF-2 se incluye para comparar.

La Figura 2 es un diagrama del área media de FGF-2 bajo la curva (AUC) en pg*min/ml que corresponde a las Figuras 1A y 1B. Este diagrama muestra la linealidad de dosis de exposición sistémica a rFGF-2 tras infusión IC o IV. La exposición sistémica para la ruta IC es similar a la observada tras administración IV.

La Figura 3 es un diagrama de los valores de evacuación individual de FGF-2 en plasma de un paciente humano (CL) como una función del tiempo de la administración de heparina en "minutos antes de la infusión de rFGF-2" y muestra la influencia del tiempo de la administración de heparina sobre la evacuación de rFGF-2 en plasma.

La Figura 4 es un diagrama de área normalizada de dosis individual de FGF-2 en un paciente humano bajo curvas (AUCs) como una función del tiempo de la administración de heparina en "minutos antes de la infusión de rFGF-2" y muestra la influencia del tiempo de la administración de heparina sobre AUC de FGF-2.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes han descubierto que una sola dosis de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, cuando se administra en una cantidad segura y terapéuticamente eficaz dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica de un paciente humano diagnosticado con EAC, proporciona al paciente un tratamiento seguro y terapéuticamente eficaz de la enfermedad de las arterias coronarias del paciente que dura al menos de 4 a 6 meses, más típicamente al menos 6 meses, antes de que se necesite un tratamiento adicional. Esta duración del efecto y la magnitud de las mejoras en los TTE, SAQ y MRI fueron inesperados en un medicamento en monodosis.

Por la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad segura y terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente memoria en relación a rFGF-2 significa una cantidad de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos que , cuando se administra según esta invención, está libre de complicaciones principales que no pueden ser manejadas médicamente, y que mantiene mejora cardiaca objetiva en pacientes que tienen síntomas de EAC a pesar de la administración médica óptima. Así, la hipotensión aguda que puede ser manejada por administración de fluidos, es considerada "segura" para el propósito de esta invención. Típicamente, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz de rFGF-2 comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Un FGF-2 adecuado para uso en la presente invención es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

Por consiguiente, la presente invención tiene múltiples aspectos. En su primer aspecto, la presente invención está dirigida a una composición en monodosis para inducir angiogénesis en un paciente humano, la dosis única comprende una cantidad terapéuticamente eficaz (es decir, angiogénicamente eficaz) de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, la cantidad comprendiendo aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. La composición de dosis única además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor.

Por el término "composición de dosis única" tal como se usa en la presente memoria significa una composición que, cuando se administra a un paciente humano según el método de la presente invención, proporciona un efecto típico de angiogénesis de eficacia significativa a un paciente humano con necesidad de angiogénesis, de forma que no se necesita un nuevo tratamiento durante al menos 4-6 meses, típicamente 6 meses. La composición en monodosis de la presente invención típicamente está proporcionada en combinación con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En otras realizaciones de la composición en monodosis, una cantidad segura y terapéuticamente eficaz comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 2 \mug/kg, aproximadamente 2 \mug/kg a aproximadamente 24 \mug/kg, o aproximadamente 24 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

Es conveniente definir la composición en monodosis de la presente invención en términos más absolutos que no son dependientes del peso del paciente a ser tratado. Cuando se defina, la composición en monodosis comprende de 0,008 mg a 7,2 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. En esta realización, la composición en monodosis contiene una cantidad suficiente de FGF-2 para alojar la dosis de cualquiera de los pacientes EAC humanos mayoritarios, con intervalos desde el paciente más pequeño (por ejemplo, 40 kg) en la posología más baja (aproximadamente 0,2 \mug/kg) hasta los pacientes más grandes (por ejemplo, 150 kg) en la posología más alta (aproximadamente 48 \mug/kg). Más típicamente, la dosis única comprende 0,3 mg a 3,5 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína angiogénicamente activos del mismo. La composición en monodosis típicamente está proporcionada en forma de solución o liofilizada, que contiene la cantidad de rFGF-2 arriba mencionada y una cantidad eficaz de uno o más tampones, estabilizantes, y/u otros excipientes farmacéuticamente aceptables tal como se describen más adelante.

El agente activo en la composición en monodosis de los solicitantes arriba descrita es un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Los métodos para hacer FGF-2 recombinante son bien conocidos en el estado de la técnica. El FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 está hecho tal como se describe en la Patente de EE. UU. 5.155.214, titulada "Factor de Crecimiento Fibroblástico Básico", que se emitió el 13 de Octubre de 1992, y que está expresamente incorporada por referencia en su totalidad en la presente memoria. Además, todas las referencias citadas en la presente memoria, tanto si se dan antes o después de esta frase, están expresamente incorporadas por referencia en su totalidad. Tal como se describe en el paciente '214, un ADN de SEQ ID NO: 1, que codifica un bFGF (más adelante "FGF-2") de SEQ ID NO: 2, se inserta dentro de un vector de clonación, tal como pBR322, pMB9, Col E1, pCRI, RP4 o fago \lambda, y el vector de clonación es usado para transformar tanto una célula eucariota como procariota, donde la célula transformada expresa el FGF-2. En una realización, la célula hospedadora en una célula de levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae. El FGF-2 de longitud completa resultante que se expresa tiene 146 aminoácidos según la SEQ ID NO: 2. Aunque el FGF-2 de SEQ ID NO: 2 tiene cuatro cisteínas, es decir, en las posiciones de los restos 25, 69, 87 y 92, no hay enlaces de disulfuro internos ['214 en la col. 6, líneas 59-61]. Sin embargo, en el caso de que se de la reticulación bajo condiciones oxidativas, esta se daría entre los restos en posiciones 25 y 69.

El FGF-2 de SEQ ID NO: 2, que tiene 146 restos de aminoácidos, difiere del FGF-2 humano natural sólo en dos restos aminoacídicos. En particular, los aminoácidos en posición 112 y 128 del FGF-2 de SEQ ID NO: 2 son Ser y Pro, respectivamente, mientras que en el FGF-2 humano, son Thr y Ser, respectivamente. En la naturaleza, el FGF-2 bovino, como el FGF-2 humano correspondiente, es inicialmente sintetizado in vivo como un polipéptido que tiene 155 restos animoacídicos. Abraham et al. "Human Basic Fibroblast Growth Factor: Nucleotide Sequence and Genomic Organization", EMBO J., 5(10):2523-2528 (1986). Cuando el FGF-2 de SEQ ID NO: 2 se compara con el FGF- bovino de longitud total de 155 restos aminoacídicos de Abraham, el FGF-2 de SEQ ID NO: 2 carece de los primeros nueve restos aminoacídicos, Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr thr Leu (SEQ ID NO: 3) en el extremo N-terminal de la correspondiente molécula de longitud completa. El FGF-2 recombinante empleado en las presentes composiciones y método se purificó hasta una calidad farmacéutica (98% o superior de pureza) usando las técnicas descritas en detalle en la Patente de EE. UU. 4.956.455, titulada "Factor de Crecimiento Fibroblástico Bovino" que se emitió el 09/11/90 y que se incorpora en su totalidad por referencia en la presente memoria. En particular, las dos primeras etapas empleadas en la purificación del FGF-2 recombinante de la composición en monodosis de los solicitantes son "etapas de purificación de intercambio iónico convencional y HPLC en fase reversa tal como se describen anteriormente". [Patente de EE. UU. 4.956.455, que cita a Bolen et al., PNAS USA 81:5364-5368]. La tercera etapa, que la patente '455 se refiere a la "etapa clave de purificación" ['455 en la col. 7, líneas 5-6], es una cromatografía de afinidad heparina-SEPHAROSE®, donde la fuerte afinidad de unió a heparina del FGF-2 se utiliza para evaluar la purificación de varios cientos de veces cuando se eluye en NaCl de aproximadamente 1,4M y 1,95M ['455 en la col. 9, líneas 20-25]. La homogeneidad del polipéptido se confirmó por cromatografía líquida de alta presión en fase reversa (RP-HPLC). El cambio de tampón se realizó por cromatografía de filtración en gel SEPHADEX® G-25(M).

Además del rFGF-2 de 146 restos de SEQ ID NO: 2, el agente activo en la dosis única de la presente invención también comprende un "fragmento angiogénicamente activo" de FGF-2- Por el término "fragmento angiogénicamente activo" de FGF-2 se quiere decir un fragmento de FGF-2 que tiene aproximadamente el 80% de los 146 restos de SEQ ID NO: 2 y que conserva al menos el 50%, preferiblemente el 80%, de la actividad angiogénica del FGF-2 de SEQ ID NO: 2.

Para ser angiogénicamente activo, el fragmento de FGF-2 debe tener dos sitios de unión celular y al menos uno de los dos sitios de unión a heparina. Los dos sitios de unión celular putativos del análogo de FGF-2 humano se dan en las posiciones de los restos 36-39 y 77-81 del mismo. Véase Yoshida et al., "Genomic Sequensce of hst, a Transforming Gene Encoding a Protein Homologous to Fibroblast Growth Factor and the int-2-Encoded Protein" PNAS USA, 84:7305-7309 (Oct. 1987) en la Fig. 3. Los dos sitios de unión a heparina putativos de hFGF-2 se dan en las posiciones de los restos 18-22 y 107-111 de los mismos. Véase Yoshida (1987) en la Fig. 3. Dada la superior similitud del 98% entre las secuencias aminoacídicas para el FGF-2 humano natural (hFGF-2) y el rFGF-2 (SEQ ID NO: 2), se espera que los dos sitios de unión celular para rFGF-2 (SEQ ID NO: 2) también estén en las posiciones de los restos 36-39 y 77-81 del mismo, y que los dos sitios de unión de la heparina estén en las posiciones de los restos 18-22 y 107-111 del mismo. En concordancia con lo de más arriba, es bien conocido en el estado de la técnica que los truncamientos en el extremo N-terminal del FGF-2 de SEQ ID NO: 2 no eliminan su actividad en vacas. En particular, el estado de la técnica describe varios fragmentos naturales y biológicamente activos del FGF-2 que tienen truncamientos en el extremo N-terminal en relación al FGF-2 de SEQ ID NO: 2. Un bFGF-2 activo y truncado que tiene los restos 12-146 de SEQ ID NO: 2 se encontró en hígado bovino y otro bFGF-2 activo y truncado , que tiene restos 16-146 de SEQ ID NO: 2, se encontró en riñón, glándulas adrenales y testículos de bóvido. [Véase la Patente de EE. UU. 5.155.214 en la col. 6, líneas 41-46, que cita a Ueno et al., Biochem and Biophys Res. Comm., 138:580-588 (1986)]. Asimismo, otros fragmentos del bFGF-2 de SEQ ID NO: 2 que se conoce tienen actividad FGF son FGF-2 (24-120)-OH y FGF-2 (30-110)-NH2. [Patente de EE. UU. 5.155.214 en la col. 6, líneas 48-52]. Estos últimos fragmentos conservan tanto las porciones de unión celular de FGF-2 (SEQ ID NO: 2) como uno de los segmentos de unión a heparina (restos 107-111). Por consiguiente, los fragmentos angiogénicamente activos de FGF-2 típicamente abarcan aquellos fragmentos truncados en el extremo terminal de FGF-2 que tienen al menos restos que corresponden a los restos 30-110 de FGF-2 de SEQ ID NO: 2; más típicamente, al menos restos que corresponden a los restos 18-146 de FGF-2 de SEQ ID NO: 2.

La dosis única de la presente invención también comprende una "muteína... angiogénicamente activa" del rFGF-2 de SEQ ID NO: 2. Por el término "muteína... angiogénicamente activa", tal como se usa en la presente memoria, se quiere decir una proteína o polipéptido recombinante aislada y purificada que tiene 65% de identidad de secuencia (homología) con cualquier FGF-2 natural, tal como se determina por el algoritmo de búsqueda de secuencia Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol.. 70:173-187 (1997)) como se lleva a cabo en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de hueco afín con los siguientes parámetros de búsqueda: penalización de hueco abierto de 12, y penalización de extensión de hueco de 1, y que mantiene al menos el 50%, preferiblemente al menos el 80%, de la actividad angiogénica del FGF-2 natural con el cual se ha dado al menos el 65% de identidad de secuencia. Preferiblemente, la muteína angiogénicamente activa tiene al menos el 75%, más preferiblemente al menos 85%, y lo más preferiblemente, al menos 90% de identidad de secuencia con el FGF-2 natural. Otros algoritmos de escrutinio de homología /identidad bien conocidos y usados de forma rutinaria incluyen Pearson y Lipman, PNAS USA, 85:2444-2448 (1988); Lipman y Pearson, Science, 222:1435 (1985); Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984); o los algoritmos BLASTP, BLASTN o BLASTX de Altschul, et al., Mol. Biol.., 215:403-410 (1990). También están disponibles programas computerizados que usan estos algoritmos e incluyen, pero no se limitan a: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA, que están disponibles comercialmente en el paquete del Grupo de Genética Computerizada (GGC), Versión 8, Madison WI, USA; y CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intellegenetics, Mountain View CA. Preferiblemente, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando los parámetros de omisión determinados por el programa.

La frase "identidad de secuencia", tal como se usa en la presente memoria, pretende referirse al porcentaje de los mismos aminoácidos que se encuentran posicionados de forma similar dentro de la secuencia de la muteína cuando un segmento continuo y específico de la secuencia aminoacídica de la muteína es alineado y comparado con la secuencia aminoacídica del FGF-2 natural.

Cuando se considera el porcentaje de similitud de la secuencia aminoacídica en la muteína, algunas posiciones de los restos aminoacídicos pueden diferir de la proteína referencia como resultado de sustituciones conservadoras de aminoácidos, que no afectan a las propiedades de la proteína o a la función de la proteína. En estos casos, el porcentaje de identidad de secuencia puede ser ajustado hacia arriba para explicar la similitud en los aminoácidos sustituidos de forma conservadora. Dichos ajustes son bien conocidos en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Meyers y Miller, "Computer Applic. Bio. Sci"., 4:11-17 (1988).

Para preparar una "muteína angiogénicamente activa" de un agente angiogénico de la presente invención, se usan técnicas clásicas para la mutagénesis dirigida al sitio, tal como se conoce en el estado de la técnica y/o se enseña en Gilman et al., Gene, 8:81 (1979) o Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987). Usando una de estas técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, se introducen una o más mutaciones puntuales dentro de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 1 para introducir una o más sustituciones aminoacídicas o una deleción interna. Las sustituciones aminoacídicas conservadoras son aquellas que conservan la carga general, la hidrofobicida/hidrofilicidad, y/o el conjunto estérico del aminoácido a ser sustituido. Como modo de ejemplo, las sustituciones entre los siguiente grupos son conservadoras: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr, y Phe/Trp/Tyr. Está permitida una variación significativa (hasta el 35%) de la secuencia del FGF-2 angiogénico natural siempre que la proteína o el polipéptido resultante mantenga la actividad angiogénica dentro de los límites especificados más arriba.

Las muteínas con la cisteína depletada son muteínas dentro del alcance de la presente invención. Estas muteínas se construyen usando la mutagénesis dirigida al sitio tal como se describe más arriba, o según el método descrito en la Patente de EE.UU. 4.959.314 ("la patente '314"), titulada "Muteínas Depletadas en Cisteína de Proteínas Biológicamente Activas". La patente '314 describe cómo determinar la actividad biológica y el efecto de la sustitución. La sustitución de cisteínas es particularmente útil en proteínas que tienen una o más cisteínas que no están implicadas en la formación del disulfuro. Sustituciones adecuadas incluyen la sustitución de una o ambas de las cisteínas en las posiciones de los restos 87 y 92 por serina, que no están implicadas en la formación del disulfuro. Preferiblemente, las sustituciones se introducen en el extremo N-terminal de FGF-2, que no está asociado con actividad angiogénica. Sin embargo, tal como se discute más arriba, las sustituciones conservadoras son adecuadas para la introducción a lo largo de la molécula.

La composición en monodosis de la presente invención comprende una dosis segura y angiogénicamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor. Típicamente, la dosis segura y angiogénicamente eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención está en una forma y un tamaño adecuado para la administración a un paciente humano y comprende (i) 0,2 \mug/kg a 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, (ii) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la dosis segura y angiogénicamente eficaz comprende 0,2 \mug/kg a 2 \mug/kg, > 2 v a > 24 \mug/kg o 24 \mug/kg a 48 \mug/kg de FGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Expresado en términos absolutos para la mayoría de los pacientes EAC humanos, la dosis única de la presente invención comprende 0,008 mg a 7,2 mg, más típicamente 0,3 mg a 3,5 mg, del FGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

El segundo componentes enumerado de la composición en monodosis de la presente invención es un "vehículo farmacéuticamente aceptable". Por el término "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en la presente memoria, se quiere decir cualquiera de los vehículos o diluyentes bien conocidos en el estado de la técnica para la estabilización y/o administración de un medicamento de proteína que, por sí mismo, no induce la producción de anticuerpos dañinos en el paciente que recibe la composición, y que puede ser administrado sin demasiada toxicidad. La elección del vehículo farmacéuticamente aceptable y su procesamiento posterior permite a la composición en monodosis de la presente invención ser proporcionada tanto en forma líquida como en forma sólida.

Cuando la composición en monodosis está en forma líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende un vehículo estable o un diluyente adecuado para infusión o inyección intravenosa ("IV") o intracoronaria ("IC"). Los vehículos o diluyentes adecuados para soluciones inyectables o de infusión no son tóxicos en el receptor humano a las posologías y concentraciones empleadas, e incluyen agua estéril, soluciones azucaradas, soluciones salinas, soluciones proteicas o combinaciones de las mismas.

Típicamente, el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un tampón y uno o más estabilizantes, agentes reductores, antioxidantes y/o agentes quelantes antioxidantes. El uso de tampones, estabilizantes, agentes reductores, antioxidantes y agentes quelantes en la preparación de composiciones basadas en proteínas, particularmente composiciones farmacéuticas, es bien conocido en el estado de la técnica. Véase, Wang et al., "Review of Excipients and pHs for Parenteral Products Used in the United States", J. Parent. Drug Assn., 34(6):452-462 (1980).; Wang et al., "Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", J. Parent. Sci. and Tech., 42:S4-S26 (Supplement 1988); Lachman et al., "Antioxidants and Chelating Agents as Stabilizers in Liquid Dosage Forms-Part 1", Drug and Cosmetic Industry, 102(1): 36-38, 40 y 146-148 (1968); Akers, M.J., "Antioxidants in Pharmaceutical Products", J. Parent. Sci and Tech., 36(5):222-228 (1988): y Methods in Enzimology, Vol. XXV, Colowick y Kaplan Eds., "Reduction of Disulfide Bonds in Proteins with Dithiothreitol", por Konigsberg, páginas 185-188. Tampones adecuados incluyen acetato, adipato, benzoato, citrato, lactato, maleato, fosfato, tartrato y las sales de varios aminoácidos. Véase Wang (1980) en la página 455. Estabilizantes adecuados incluyen carbohidratos tales como trelosa o glicerol. Agentes reductores adecuados, que contienen la reducción de cisteínas reducidas, incluyen ditiotreitol (DTT también conocido como agente de Cleland) o ditioeritriol del 0,01% al 0,1% p/p; acetilcisteína o cisteína del 0,1% al 0,5% (pH 2-3); y tioglicerol del 0,1% al 0,5% (pH 3,5 al 7,0) y glutation. Véase Akers (1988) en las páginas 225 a 226. Antioxidantes adecuados incluyen bisulfito sódico, silfito sódico, metabisulfito sódico, tiosulfato sódico, sulfoxilato de formaldehído sódico, y ácido ascórbico. Véase Akers (1988) en las páginas 225. Agentes quelantes adecuados, que quelan metales traza para prevenir la oxidación de cisteínas reducidas catalizada por metales traza, incluyen citrato, tartrato, ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en sus sales disódicas, tetrasódicas y calcio disódicas, y ácido de dietilentriamina pentaacético (DTPA). Véase por ejemplo, Wang (1980) en las páginas 457-458 y 460-461, y Akers (1988) en las páginas 224-227. Azúcares adecuados incluyen glicerol, trealosa, glucosa, galactosa y manitol, sorbitol. Una proteína adecuada es albúmina de suero humano.

En forma líquida, una composición en monodosis típica de la presente invención comprende de aproximadamente 0,001 mg a 8 mg, más típicamente 0,03 a 5 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, disueltos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor. Un vehículo farmacéuticamente aceptable comprende tioglicerol 10 mM, Ancla 135 mM, citrato sódico 10 mM, y EDTA 1 mM pH 5. Un agente diluyente o nivelante para la composición en monodosis arriba descrita es cualquier vehículo arriba descrito. Típicamente, el diluyente es la solución portadora. El rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos son inestables durante largos periodos de tiempo en forma líquida. Para maximizar la estabilidad y la vida de la forma líquida, la composición en monodosis debería almacenarse a -60º C. Cuando se descongela, la solución es estable durante 6 meses en condiciones de refrigeración. Una dosis única típica podría comprender aproximadamente 1-40 ml, más típicamente 10-40 ml, de la composición arriba descrita que tiene 0,008-7,2 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína angiogénicamente activos disueltos en la misma. Un rFGF-2 adecuado para uso en la dosis única es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

En otra realización, la composición en monodosis está proporcionada en forma liofilizada (congelado en seco). En esta forma, la dosis única de rFGF-2 es capaz de almacenarse a temperaturas de refrigeración adecuadamente durante más de 6 meses sin perder eficacia terapéutica. La liofilización se logra por la rápida congelación en seco (es decir, separando el agua) bajo presión reducida de una pluralidad de viales, que contienen la forma líquida arriba descrita de la dosis única de rFGF-2 de la presente invención de este respecto. Los liofilizantes, que llevan a cabo la liofilización arriba descrita, están disponibles comercialmente y se utilizan fácilmente por aquellos expertos en la materia. La composición en monodosis liofilizada, en forma de torta liofilizada, está formulada para contener dentro de la torta liofilizada resultante uno o más de los tampones, estabilizantes, antioxidantes, agentes reductores, sales y/o azúcares descritos más arriba para la formulación líquida correspondiente. Una composición en monodosis liofilizada que contiene otros componentes sólo necesita ser reconstituida hasta un volumen o concentración con un diluyente acuoso estéril tal como agua estéril, una solución azucarada estéril, o una solución salina estéril. Alternativamente, puede ser reconstituida con una solución tampón estéril tal como se describe más arriba, pero sin un agente quelante, tal como EDTA. Como torta liofilizada, la composición en monodosis es estable de 6 meses a dos años a temperaturas de refrigeración. Así, el almacenamiento de la composición en monodosis en forma liofilizada se acomoda fácilmente usando equipos de refrigeración convencionales.

Debido a que la composición en monodosis dela presente invención es administrada vía un catéter cardiaco u otro instrumento de inyección, que tiene un espacio muerto, es conveniente formular el vial que contiene la composición de dosis única de forma que contenga aproximadamente 10-50% más del rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos que el que se administra al paciente. Por ejemplo, cuando la dosis única del rFGF-2 a administrarse es 7,2 mg, el vial se formula opcionalmente para contener hasta un 50% extra (por ejemplo, un total de aproximadamente 10,8 mg) de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. La solución extra es adecuada para rellenar el espacio muerto en el equipo de administración. En una realización alternativa, que no permite el espacio muerto, la composición farmacéutica se carga en el catéter cardiaco frente a un tampón, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, que luego se usa para administrar la cantidad apropiada de una o más posologías a uno o más sitios en el miocardio que necesita angiogénesis.

Como se discute más arriba, el vehículo farmacéuticamente aceptable para la composición en monodosis arriba descrita comprende un tampón y uno o más estabilizantes, agentes reductores, antioxidantes y/o agentes quelantes antioxidantes. Dentro del alcance de la invención también está que la composición en monodosis contiene una cantidad de glucosaminiglicano (también conocido como "proteoglicano" o un "mucopolisacárido"), tal como heparina, que es eficaz para unirse al FGF-2 y a los receptores de célula endotelial con el fin de potenciar la eficacia angiogénica del FGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. La cantidad de heparina que es administrada es aproximadamente 10-80 U por kg del peso del paciente (U/kg), típicamente aproximadamente 40 U/kg. Expresado en términos absolutos, la cantidad total de heparina administrada a un paciente cualquiera no excede 5.000 U. Así, en la reconstitución, la composición en monodosis de la presente invención no sólo contiene una cantidad angiogénicamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, también puede contener de aproximadamente 10-80 U/kg de heparina, típicamente 40 U/kg. El volumen típico de diluyente es de aproximadamente 1 a 40 ml. Mientras se pueden usar volúmenes mayores de diluyente, dichos volúmenes mayores típicamente pueden dar como resultado mayores tiempos de administración. Dependiendo del peso del paciente en kg, una sola dosis que comprende de 0,2 \mug/kg a 48 \mug/kg del rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos se descongela del vial como producto reconstituido para administrar al paciente. Así, un hombre de 70 kg de peso medio al que se le administra una dosis de 24 \mug/kg puede tener un volumen suficiente de producto reconstituido descongelado del vial para recibir una infusión IC de (70 \mug/kg x 30 \mug/kg) el uso de una cantidad segura y terapéuticamente eficaz de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos para fabricar un medicamento para tratar a un paciente humano de enfermedad de las arterias coronarias, donde tal cantidad segura y terapéuticamente eficaz de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es a ser administrada 2100 \mug (es decir, 2,1 mg). En un segundo aspecto, la presente invención está dirigida al uso de la composición en monodosis arriba mencionada para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente humano de EAC o IM. En particular, en una realización, la presente invención está dirigida al uso de una cantidad segura y terapéuticamente eficaz de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos para fabricar un medicamento para tratar a un paciente humano de enfermedad de las arterias coronarias, donde dicha cantidad segura y terapéuticamente eficaz de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es administrada a uno o más, típicamente 2, vasos coronarios patentes o una vena periférica de un paciente humano con necesidad de tratamiento para la enfermedad de las arterias coronarias. El paciente humano con necesidad de tratamiento para la enfermedad de las arterias coronarias es típicamente un paciente humano con enfermedad de las arterias coronarias que permanece sintomático con angina a pesar de administración médica opcional. Un vaso coronario preferido es una arteria coronaria, aunque también son adecuadas venas safenas injertadas y arterias mamarias internas injertadas, proporcionadas por angioplastia coronaria. Venas periféricas adecuadas para administrar la composición en monodosis incluyen aquellas venas periféricas que se encuentran en todo el cuerpo humano que se usan de forma rutinaria por médicos y enfermeras para la administración de fluidos y medicamentos. Ejemplos de dichas venas incluyen la cefálica, la cubital media, y la basílica del brazo.

Cuando se administra como infusión intracoronaria (IC), la dosis única de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es administrado típicamente en una hora, más típicamente en un periodo de aproximadamente 20 minutos dentro de uno o más (típicamente dos) vasos coronarios patentes. Cuando se administra en un periodo de veinte minutos, la composición en monodosis es típicamente administrada a un ritmo de 0,5 a 2,0 ml/minuto, más típicamente a aproximadamente 1 ml/minuto. Los vasos coronarios peden ser vasos naturales o injertos, con tal de que no estén ocluidos. El volumen de la dosis única de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es típicamente 10-40 ml; más típicamente 20 ml. La longitud de tiempo para la infusión de la dosis única no es crítica y puede ser acortada o alargada dependiendo del ritmo y volumen de infusión.

Cuando se administra como infusión intravenosa (IV), la dosis única de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es administrado típicamente en una hora, más típicamente en un periodo de 20 minutos, dentro de una vena periférica usando sistema IV convencional. Cuando se administra en un periodo de veinte minutos, la composición en monodosis es típicamente administrada a un ritmo de 1 ml/minuto.

\newpage

En el ensayo clínico en Fase I del método arriba descrito para tratar EAC, una composición en monodosis se administró IC o IV a pacientes humanos que tienen EAC que mantenían síntomas con angina a pesar de administración médica opcional. Debido a que el método de la presente invención induce angiogénesis, el método de la presente invención proporciona tratamiento de la condición subyacente en EAC o IM y simplemente no alivia de forma transitoria los síntomas, tal como se proporcionan por nitratos. Típicamente, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz del método de la presente invención comprende 0,2 \mug/kg a 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz del método de la presente invención comprende 0,2 \mug/kg a 2 \mug/kg, >2 \mug/kg a >24 \mug/kg, o 24 \mug/kg a 48 \mug/kg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En términos absolutos, la cantidad segura y terapéuticamente eficaz es aproximadamente 0,008 mg a aproximadamente 7,2 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, más típicamente, 0,3 mg a 3,5 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Un rFGF-2 adecuado es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

En otro aspecto, la presente invención también está dirigida al uso de una composición en monodosis de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos para fabricar un medicamento para inducir angiogénesis en el corazón de un paciente humano, donde dicha dosis única es a ser administrada a uno o más vasos coronarios o a una vena periférica en un paciente humano con necesidad de angiogénesis coronaria, dicha composición en monodosis comprende de aproximadamente 0,008 mg a 7,2 mg de rFGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más típicamente, la composición en monodosis comprende aproximadamente 0,3-3,5 mg de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. . Como se describe más arriba, una composición en monodosis que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos es administrado a al menos un vaso coronario de un paciente humano con necesidad de angiogénesis, usando técnicas de cateterización cardiaca clásicas, por ejemplo, trombolíticos, estreptoquinasa, o tintes radio-opacos o partículas magnéticas usadas para visualizar las arterias coronarias. . Como modo de ejemplo, un catéter coronario es insertado dentro de una arteria (por ejemplo, femoral o subclavia) del paciente con necesidad de tratamiento y el catéter se empuja hacia adelante , con visualización, hasta que está posicionado en el vaso coronario apropiado del paciente a ser tratado. Usando precauciones clásicas para mantener una línea clara, la composición farmacéutica en forma líquida es administrada por infusión de la dosis única de forma sustancialmente continua durante un periodo de 10 a 30 minutos. Aunque la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada durante un periodo de tiempo más largo, los solicitantes no perciben beneficio y hay un riesgo potencialmente aumentado de trombosis si lo hacen. Típicamente, una porción (por ejemplo, una mitad) de la dosis única es administrada en un primer vaso coronario. Luego, el catéter es recolocado dentro de un segundo vaso coronario secundario y el resto de la dosis única es administrado con nivelación del catéter. Usando el procedimiento de recolocación arriba descrito, las porciones de las dosis única pueden ser administradas a una pluralidad de vasos coronarios hasta que se haya administrado la dosis única entera. Tras la administración, el catéter se retira usando protocolos conocidos en el estado de la técnica. En los ensayos clínicos de Fase I descritos en la presente memoria, se mostró beneficio terapéutico en pacientes tan pronto como dos semanas tras la administración IC de rFGF-2 en monodosis. La mejora clínicamente significativa se demostró por criterios objetivos (TTE y/o SAQ) tan pronto como 30 días tras la administración IC o IV en monodosis de la presente invención, y se mantuvo durante seis meses tras la dosis. En algunos pacientes con enfermedad EAC progresiva, puede ser necesario o apropiado administrar dosis únicas adicionales de rFGF-2 a intervalos de seis o 12 meses tras la dosis única inicial, para superar la progresión de la EAC durante ese periodo intermedio. En algunos pacientes con EAC muy progresiva, las dosis únicas de la presente invención pueden ser readministradas a intervalos de 4 meses. En cualquier caso, el médico que trata debe ser capaz de determinar el tiempo, si hay, para la readministración basada en la evaluación rutinaria de los síntomas clínicos del paciente.

Uno de los beneficios del método de la presente invención es la angiogénesis cardiaca. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención está dirigida al uso de una composición en monodosis que comprende una cantidad angiogénicamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento para inducir angiogénesis en el corazón de un paciente humano, donde dicha dosis única es para administrar dentro de uno o más vasos coronarios (IC) o dentro de una vena periférica (IV) de un paciente humano con necesidad de angiogénesis coronaria. La cantidad angiogénicamente eficaz comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg (o en términos absolutos aproximadamente 0,008 mg a 7,2 mg) de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Más típicamente, la cantidad angiogénicamente eficaz comprende aproximadamente 0,3 mg a 3,5 mg de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. Un rFGF-2 adecuado para uso es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos. En una realización, la composición en monodosis es a ser administrada IC a vasos coronarios patentes o IV a una vena periférica. En otra realización, la composición en monodosis es a ser administrada con heparina tal como se describe en la presente memoria.

El método arriba descrito para proporcionar angiogénesis coronaria también es beneficioso en pacientes humanos que hay sufrido un infarto de miocardio (IM) en una o más arterias coronarias. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención también está dirigida al uso de una composición en monodosis que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos para la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente humano de un IM, donde dicha composición en monodosis es para administrar dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica de dicho paciente. La composición en monodosis típicamente comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg (o en términos absolutos aproximadamente 0,008 mg a 7,2 mg) de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un rFGF-2 adecuado para uso es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

En el caso de angina inestable o infarto de miocardio agudo, que necesita angioplastia, las mismas dosis de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos, que se describen en la presente memoria, también pueden ser útiles como una terapia de ayuda para tratar estas condiciones. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención está dirigida al uso de una composición en monodosis que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de rFGF-2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos para la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente humano de angina inestable o infarte de miocardio agudo, donde el tratamiento comprende angioplastia y donde el medicamento es para administrar dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica de dicho paciente humano. La composición en monodosis típicamente comprende aproximadamente 0,2 \mug/kg a aproximadamente 48 \mug/kg (o en términos absolutos aproximadamente 0,008 mg a 7,2 mg) de un FGF-2 recombinante o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un rFGF-2 adecuado para uso es el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos.

En cualquiera de los métodos arriba descritos de la presente invención, el rFGF-2 o el fragmento o muteína del mismo angiogénicamente activos está asociado con la liberación de óxido nítrico, un conocido dilatador de músculo liso, que en la administración al paciente causa una caída repentina de la presión sanguínea del paciente. Por consiguiente, en los métodos de la presente invención, es preferible hidratar al paciente con fluidos IV antes de administrar la dosis única de la presente invención. Además, para la seguridad y tolerabilidad de la dosis única, también se prefiere la administración agresiva del fluido durante y tras la administración de rFGF-2. Finalmente, también está dentro del alcance de la invención de los métodos arriba descritos incluir la etapa de administrar una cantidad eficaz de un glicosaminoglicano (también conocido como "proteoglicano" o un "mucopolisacárido"), tal como heparina de 0-30 minutos antes de administrar la composición en monodosis de la presente invención. Típicamente, la cantidad eficaz de glucosaminoglicanos (tal como heparina) que se administra es aproximadamente 10-80 U/kg, más típicamente, aproximadamente 40 U/kg. Sin embargo, la cantidad total de heparina administrada a un paciente cualquiera inmediatamente antes de la dosis, generalmente no excede de aproximadamente 5.000 U.

Debido a que el EDTA es un potente quelante de calcio que se necesita para la contracción normal del miocardio y la conducción cardiaca, minimizar la concentración de EDTA es crítica para la seguridad del paciente. Una concentración de EDTA menor de 100 \mug/ml optimizó la seguridad de la administración de rFGF-2 por infusión IC o IV en pacientes humanos.

Debido a que el bolo repentino de rFGF-2 está asociado con profunda hipotensión en animales, el ritmo de infusión es crítico para la seguridad del paciente. La administración de 0,5 a 2 ml por minuto, típicamente 1 ml por minuto, optimizó la seguridad de administración de rFGF-2 por infusión IC o IV al paciente humano.

Se llevó a cabo un ensayo clínico en Fase I dirigido para tratar pacientes humanos con EAC por administración de una composición en monodosis de la presente invención y se describe en los Ejemplos 1-3 en la presente memoria. En ese ensayo, sesenta y seis (66) pacientes humanos diagnosticados con EAC, que satisfacen el criterio del Ejemplo 2 de la presente memoria, recibieron una sola dosis de rFGF-2 según el método de la presente invención. Específicamente, a cincuenta y dos pacientes humanos se les administró una dosis única de 0,33 \mug/kg a 48 \mug/kg de rFGF-2 por infusión IC durante un periodo de aproximadamente 20 minutos. A cuarenta pacientes humanos se les administró una dosis única de 28 \mug/kg o 36 \mug/kg de rFGF-2 por infusión IC durante un periodo de 20 minutos. Los 66 pacientes tratados luego se evaluaron en relación al recuento basal (es decir, antes del tratamiento con la dosis única), y de nuevo al mes, 2 meses y 6 meses tras el tratamiento con la dosis única, usando tres conjuntos de criterios de evaluación reconocidos en el estado de la técnica: 1) cambios en su tiempo de tolerancia al ejercicio (TTE); 2) el Cuestionarios de Angina de Seattle (SAQ), que proporciona una evaluación basada en una combinación mezclada de criterios objetivos y subjetivos; y 3) la medida de cambios físicos en el corazón por evaluación con MRI.

Para el TTE de los 66 pacientes del ensayo clínico en Fase I de los Ejemplos 1-3 se midió en el recuento basal y al mes, 2 meses y 6 meses tras la dosis (con una composición en monodosis de la invención) usando un protocolo de rutina Bruce. Los sujetos se excluyeron del análisis si el protocolo de rutina no era el mismo al usado como recuento basal. Por ello, el número de individuos variaba durante el tiempo. Además, alguno de los pacientes que tipo revascularización de emergencia se excluyó del análisis. Una dosis se consideró eficaz si el cambio medio en TTE a partir del recuento basal aumentaba en más de 60 segundos. Los resultados de la evaluación de TTE se proporcionan en la Tabla 1.

TABLA 1 Tiempo de Tolerancia al ejercicio (TTE)-Cambios a partir del recuento basal

1

En referencia a la Tabla 1, el cambio medio a partir del recuento basal en el mes uno fue menor de 60 segundos para todos los grupos de dosis. Sin embargo, el porcentaje de pacientes que pararon su ensayo de rutina debido a angina disminuyó en todos los grupos a lo largo del tiempo. A los 2 meses y 6 meses tras la dosis, los cambios medios a partir del recuento basal fueron mayores en los grupos de pacientes de dosis IC e IV alta que los grupos de dosis IC baja y media. La persistencia de TTE aumentado a los 6 meses (133,1 seg. Y 87,5 seg.) en los grupos de dosis IC alta (24-48 \mug/kg) e IV alta (18 & 38 \mug/kg), respectivamente, fue inesperada. Los aumentos medios más grandes en TTE de 107,9 y 133,1 segundos a los 2 y 6 meses, respectivamente, ocurrieron en el grupo de dosis IC alta (24-48 \mug/kg). El grupo IV mostró aumentos medios significativos en TTE de 93,4 segundos y 87,5 segundos a los 2 meses y 6 meses respectivamente, que no se predijeron en los modelos animales de rata y cerdo de la presente memoria. En total, la persisten-
cia del efecto (aumento en TTE) a los seis meses y su magnitud para los grupos IC e IV fue totalmente inesperado.

Los 66 pacientes humanos del ensayo clínico en Fase I descritos en los Ejemplos 1-3 de la presente memoria también se evaluaron usando el Cuestionario de Angina de Seattle (SAQ). SAQ es un instrumento válido, específico de enfermedad y de calidad de vida que evalúa las cinco escalas siguientes: 1) "capacidad de ejercitación"=limitación de actividad física; 2) "percepción de la enfermedad"=preocupación por IM; 3) "satisfacción del tratamiento"; 4) "frecuencia de angina"=número de episodios y uso de nitroglicerina sublingual; y 5) "estabilidad de la angina"=número de episodios de actividad física más agotadora. El intervalo posible de valores para cada una de las cinco escalas es 0 a 100 con los valores más altos indicando una mejor calidad de vida. Típicamente, un cambio medio de 9 puntos o más entre los valores de recuento basal medio (es decir, antes del tratamiento) t y los valores tras el tratamiento se reconoce como "clínicamente significativo". Sin embargo, en el presente análisis, una dosis se considera "eficaz" si el cambio medio en el valor a partir del recuento basal aumenta en más de 14 puntos. La razón de que 14 fuera elegido (en lugar de 8) fue para permitir la mejora que se vio en el grupo placebo a los 2 meses en el ensayo clínico de otro factor de crecimiento-VEGF.

Para realizar la evaluación SAQ, los pacientes se clasificaron según los mismos grupos de posología que se evaluaron para TTE, es decir, 0,33-2,9 \mug/kg IC (baja); 6,0-12,0 \mug/kg IC (media); 24-48 \mug/kg IC (alta); y 18 y 36 \mug/kg IV. El cuestionario se administró a individuos en cada grupo de posología en el recuento basal (antes de las dosis), y a los 2 meses y 6 meses tras haber administrado una composición en monodosis de rFGF-2 según el método de la presente invención.

La primera escala de SAQ es "capacidad de ejercitación". Los datos de la capacidad de ejercitación están enumerados en la Tabla 2 de la presente memoria. Tal como se refleja en la Tabla 2,

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Capacidad de ejercitación (CE)-Cambio a partir del Recuento Basal

2

el cambio a partir del recuento basal en el valor medio aumentado a los 2 y 6 meses para cada uno de los tres grupos de posología IC y a los 6 meses para todos los grupos de posología (IC e IV). Todos los valores a todos los niveles de posología aumentaron con el tiempo desde los 2 meses a los 6 meses con los mejores aumentos (23,2, 24,1, 22,9 y 16,5) en relación al recuento basal viéndose a los 6 meses tras la Según.

La segunda escala de SAQ que se evaluó fue la "estabilidad de la angina". Los datos enumerando la estabilidad de la angina están presentados en la Tabla 3 de la presente memoria.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Estabilidad de la Angina (EA)-Cambio a partir del Recuento Basal

4

Según la Tabla 3, el cambio en el valor de la estabilidad de angina aumentó en relación al recuento basal tanto a los 2 como a los 6 meses para cada grupo. Las mejoras en la estabilidad de angina vistas a los 2 meses tras la dosis (46,2, 32,1, 24,3 y 39,6) fueron significativamente mayores que aquellas vistas a los 6 meses (21,4, 16,7, 17,7 y 23,2). Sin embargo, los valores encontrados tanto a los 2 meses como a los 6 meses tras la dosis mostraron que todas las posologías fueron eficaces (<14) en el aumento de la estabilidad de la angina. Además, la magnitud de los aumentos y su duración para los 6 meses fueron inesperados.

La tercera escala de SAQ a ser evaluada era la "frecuencia de angina". Los datos enumerando la frecuencia de angina están presentados en la Tabla 4 de la presente memoria.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Frecuencia de Angina (FA)- Cambio a partir del Recuento Basal

5

\vskip1.000000\baselineskip

Según la Tabla 4, los valores medios de los pacientes (27,9, 32,9, 28,9 y 20,0) para la frecuencia de angina aumentaron a los 2 meses (en relación al recuento basal) por una cantidad eficaz (<14) para todos los grupos de posología y para todos los modelos de administración (IC e IV). Los valores medios de los pacientes continuaron aumentando a los 6 meses sólo para el grupo de la dosis media (6,0-12,0 \mug/kg), lo que sugiere un efecto de pico a los 2 meses tras la dosis. Sin embargo, para los grupos de la dosis media (6,0-12 \mug/kg) y dosis alta (24,0-48,0 \mug/kg), los cambios a los 2 meses y a los 6 meses fueron similares, lo que sugiere un efecto persistente a los 6 meses en la frecuencia de angina. La tercera escala SAQ a ser evaluada fue la "frecuencia de Angina". Los datos enumerando la frecuencia de angina están presentados en la Tabla 4 en la presente memoria.

La cuarta escala SAQ a ser evaluada fue la "frecuencia de angina". Los datos enumerando la frecuencia de angina están presentados en la 5 en la presente memoria.

TABLA 5 Satisfacción del Tratamiento (ST)- Cambio a partir del Recuento Basal

6

Según la Tabla 5, el valor para la satisfacción del tratamiento aumentó por una cantidad eficaz a los 2 meses para los grupos de dosis IC medias y altas. Así como para el grupo IV. A los seis meses tras la dosis, sólo el valor para el grupo IC de dosis media tuvo un valor que fue mayor de 14, lo que sugiere un efecto pico para la satisfacción del tratamiento a los 2 meses.

La quinta escala de SAQ a ser evaluada fue la "percepción de la enfermedad". Los datos enumerando la frecuencia de angina están presentados en la 6 en la presente memoria. Según la Tabla 6, los valores de percepción de la enfermedad aumentaron a partir del recuento basal a valores de 20,2-29,2 a los 2 meses y 23,8-34,0 a los 6 meses. Estos valores mostraron que administrar una composición en monodosis según el método de la presente invención se consideró como eficaz (o más eficaz) a los 6 meses que a los dos meses. Estos valores sugieren una persistencia de la eficacia del método de la presente invención sobre la percepción de la enfermedad fuera de los seis meses tras la administración de una composición en monodosis.

TABLA 6 Percepción de la Enfermedad (PE)- Cambio a partir del Recuento Basal

7

Hasta 60 de los pacientes humanos del ensayo clínico en Fase I descritos en los Ejemplo 1-3 de la presente memoria también se evaluaron usando un escáner de formación de imágenes por resonancia magnética en reposo (MRI) en sus corazones. Los escáneres de MRI en reposo se llevaron a cabo en pacientes en el recuento basal, al mes, 2 meses y 6 meses tras la dosis con una composición en monodosis de la presente invención. Las dosis se consideraron "eficaces" en base a la importancia estadística (p< 0,05). Los criterios objetivos evaluados por los escáneres MRI en reposo son los siguientes: (1) fracción de expulsión; (2) extensión del infarto de miocardio (%); (3) engrosamiento de la pared normal (%); (4) movimiento de la pared normal (%); (5) engrosamiento de la pared diana (%); (6) movimiento de la pared diana (%); (7) extensión colateral del área de la pared diana (%); y (8) extensión de la llegada retardada del área diana (%).

Basado en MRI en reposo, no se observó cambio en la fracción de expulsión al mes para ninguno de los grupos. El cambio medio a partir del recuento basal para todos los grupos (n=33) a 1 mes fue de un aumento de 2,0% (p=0,042). A los dos meses, el cambio medio a partir del recuento basal para el grupo de dosis IC baja (n=13) fue de un aumento de 8,1% (p=0,007); y para todos los grupos (n=54), el cambio medio a partir del recuento basal fue un aumento de 3,8% (p=0,001). A los seis meses, el cambio medio a partir del recuento basal para el grupo de dosis IC alta (n=19) fue 5,3% (p=0,023); para el grupo IV (n=3) fue 11,1% (p=0,087); y para todos los grupos (n=33) fue 5,7% (p=0,001).

Basado en MRI en reposo, no hubo cambio estadísticamente significativo en la "extensión del infarto de miocardio" (%) para ningún grupo, o para todos los grupos en combinación a 1 mes, 2 meses o 6 meses tras la dosis. Cuando se evaluaron el movimiento de la pared normal (%) y el engrosamiento de la pared normal, no hubo cambio estadísticamente significativo a partir del recuento basal a 1 mes, 2 meses o 6 meses para ninguno de los grupos. Sin embargo, hubo un cambio estadísticamente significativo a partir del recuento basal en el movimiento de la pared diana para todos los grupos a uno (n=60), dos (n=54) y seis (n=33) meses, que se reflejó como aumento medio a partir del recuento basal de 2,7% (p=0,015), 4,4% (p=<0,001) y 6,4% (p<0,001), respectivamente. Sin embargo, también hubo cambio estadísticamente significativo a partir del recuento basal en el engrosamiento de la pared diana como una aumento medio a partir del recuento basal de 4,4% (p=0,015), 6,3% (p=<0,001) y 7,7% (p<0,001), respectivamente.

El siguiente criterio evaluado por MRI fue la "extensión colateral del área diana" (%). El aumento medio a partir del recuento basal en la extensión colateral del área diana para todos los grupos fue estadísticamente altamente significativo a un mes (n=31), dos meses (n=27) y seis meses (n=16), donde los aumentos fueron 8,3% (p<0,001), 10,9% (p<0,001) y 11,2% (p<0,001), respectivamente. Los aumentos de extensión colateral mayores se observaron para las dosis IC bajas y medias, es decir, a un mes (10,4% y 18,3%, respectivamente), dos meses (14,7% y 18,0%, respectivamente) y seis meses (16,0% y no valor para la dosis media, respectivamente), que fue totalmente inesperado. A un mes, dos meses y seis meses tras la dosis, los correspondientes % de aumento en la extensión colateral del área diana que se observaron para el grupo de dosis IC alta fueron 6,3%, 8,0% y 9,0%, respectivamente.

El criterio final evaluado por MRI fue la "extensión de llegara retardada del área diana" (%). La disminución media a partir del recuento basal en la extensión de llegara retardada del área diana para todos los grupos fue estadísticamente altamente significativo a 1 mes (n=60), 2 meses (n=54) y 6 meses (n=34), donde las disminuciones fueron -5,8% (p<0,001), -8,3% (p<0,001) y -10,0% (p<0,001), respectivamente. Las disminuciones de extensión retardada del área diana mayores se observaron para el grupo de dosis IC bajas, que también fue altamente inesperado.

Así, proporcionando a los pacientes con EAC una sola infusión IC o IV de rFGF-2 según la presente invención proporcionó a los pacientes una mejora física estadísticamente significativa tal como se midió objetivamente por MRI y otros criterios convencionales.

\vskip1.000000\baselineskip

Farmacocinética y Metabolismo

La estructura molecular de FGF-2 contiene una cola cargada positivamente que se sabe se une a cadenas de proteoglicanos (heparina y estructuras del tipo heparina) sobre las superficies celulares u sobre la pared endotelial vascular. Véase Moscatelli et al., "Interaction of Basic Fibroblast Growth Factor with Extracellular Matrix and Receptors", Ann. NY Acad. Sci., 638:177-181 (1981).

Los riñones y el hígado son los órganos principales para la eliminación de rFGF-2. En particular, los riñones tienen un límite de proteínas de aproximadamente 60 kD y, por ello, retienen la albúmina del suero (PM 60 kD). Sin embargo, FGF-2 (146 restos) tiene un peso molecular de aproximadamente 16,4 kD. Por consiguiente, se espera su excreción renal. En un estudio de biodistribución marcado con radiación de FGF-2 bovino disponible comercialmente (bFGF-2), tanto el hígado como el riñón mostraron que contenían altas cantidades del bFGF-2 marcado con radiactividad a una hora tras la inyección IV o IC. En un estudio publicado, donde se dio a ratas otra forma de bFGF-2 recombinante iodado, el hígado fue identificado como el órgano principal de eliminación. Whalen et al., "The Fate of Intravenously Administered bFGF and the Effect of Heparin", Growth Factors, 1:157-164 (1989). También se conoce que FGF-2 se une en la circulación general a \alpha2-macroglobulinas y que este complejo es internalizado por receptores en las células de Kupffer. Whalen et al. (1989) y LaMarre et al., "Cytokine Binding and Clearance Properties of Proteinase-Activated Alpha-2-Macroglobulins", Lab. Invest., 65:3-14 (1991). No se encontraron fragmentos marcados de FGF-2 en plasma, pero se encontraron en la orina y correspondían en tamaño a los productos de descomposición intracelular.

\newpage

En ensayos preclínicos, se determinó la farmacocinética de rFGF-2 (SEQ ID NO: 2) la administración intravenosa (IV) e intracoronaria (IC) en cerdos domésticos Yorkshire, y tras administración IV de dosis en ratas Sprague Dawley (SD). Los modelos de cerdo demostraron farmacocinética lineal (0,65 \mug/kg-20 \mug/kg) IC e IV. La semivida terminal del FGF-2 en el modelo de cerdo fue 3-4 horas. Los modelos de rata demostraron farmacocinética lineal en el intervalo de 30-300 v IV. La semivida terminal del FGF-2 en el modelo de rata fue de 1 hora. Ambas especies mostraron concentración plasmática, lo que sugiere un modelo de dos compartimentos.

Asimismo, en seres humanos, las concentraciones plasmáticas de FGF-2 tras infusión IV y/o IC siguieron una curva biexponencial con una brusca pendiente y disminución considerable en varias escalas de registro (la fase de distribución) durante la primera hora, seguido de un descenso más moderado (la fase de eliminación). La Fig. 1A proporciona una concentración plasmática frente a una curva temporal que muestra estas fases en seres humanos tras administración IC de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 como una función de cada uno de las ocho dosis siguientes: 0,33 \mug/kg, 0,65 \mug/kg, 2 \mug/kg, 6 \mug/kg, 12 \mug/kg, 24 \mug/kg, 36 \mug/kg, y 48 \mug/kg de masa corporal magra (MCM). La Fig. 1A muestra la linealidad de dosis plasmática para las ocho dosis de rFGF-2 que se administraron por infusión IC durante un periodo de veinte minutos. La Figura 1A también muestra un descenso bifásico del nivel plasmático, es decir, una rápida fase de distribución durante la primera hora, seguido de una fase de eliminación con una T1/2 estimada de 5-7 horas. Las concentraciones plasmáticas de FGF-2 de SEQ ID NO: 2 se determinaron por ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, Minneapolis, MN) que se marcaron para el análisis de FGF-2 humana. El ensayo ELISA mostró 100% de reactividad cruzada con el rFGF-2 de SEQ ID NO: 2. No se detectaron por este ensayo otros miembros de la familia FGF, así como muchas otras citoquinas. Además, la heparina no interfiere con el ensayo.

La Figura 1B es un diagrama de la concentración media de FGF-2 plasmático como una función de tiempo para 18 \mug/kg y 36 \mug/kg de rFGF-2 administrado IV, en comparación con 26 \mug/kg de rFGF-2 administrado IC. La concentración plasmática frente a los perfiles de tiempo en la Figura 1B para las dosis de 36 \mug/kg por las rutas IV e IC superpuestas. Sin embargo, no se elimina un efecto de primer paso con la ruta IC. La Figura 2 es un diagrama del área media de FGF-2 bajo la curva (AUC) en pg*min/ml correspondiente a las Figuras 1A y 1B. La Figura 1B muestra la linealidad de dosis de la exposición sistémica de rFGF-2 (AUC) tras infusión IC o IV. En particular, la Figura 2 muestra que la exposición sistémica a rFGF-2 tras la administración por las rutas IC e IV es sustancialmente similar.

La Figura 3 es un diagrama de los valores de evacuación plasmática (EP) en un paciente humano individual (ml/min/kg) como una función del tiempo de administración de heparina en "minutos antes de infusión de rFGF-2". La Figura 3 muestra la influencia del tiempo de la administración de heparina sobre la evacuación de FGF-2 plasmático (EP). Aunque la Figura 3 muestra que administrar heparina hasta 100 minutos antes que rFGF-2 disminuye la evacuación de FGF-2, el tiempo preferido para administrar la heparina es de 0-30 minutos antes de la administración de rFGF-2, donde el efecto de la heparina sobre la disminución de FGF-2 es mayor.

La Figura 4 es un diagrama del área de dosis de rFGF-2 normalizada de un paciente humano individual bajo las curvas (AUCs) como una función del tiempo de administración de heparina en "minutos antes de la infusión de rFGF-2" y muestra la influencia del tiempo de la administración de heparina sobre AUC de rFGF-2. La Figura 4 muestra que la AUC/dosis mayor se logró cuando se preadministró una cantidad eficaz de una glucosaminoglicano, tal como heparina, dentro de los 30 minutos o menos de la infusión de rFGF-2 IC, más preferiblemente dentro de los 20 minutos o menos de la infusión de rFGF-2 IC o IV. Típicamente, una cantidad eficaz de un glucosaminoglicano es 10-80 U/kg de heparina.

Los parámetros medios de farmacocinética para rFGF-2 en seres humanos como una función de posología y modo de administración se enumeran en la Tabla 8 de la presente memoria. En referencia a la Tabla 8, el T1/2 para FGF-2 en seres humanos se determinó con un intervalo de 2,2\pm3,7 horas en la dosis baja (0,33-2,0 \mug/kg) IC a 7,0\pm3,5 horas a una dosis de 18-36 \mug/kg IV; dado a las limitaciones del ensayo, la semivida terminal está estimada a 5-7 horas para todos los grupos. Las evacuaciones de FGF-2 estaban en el intervalo de 13,2 a 18,2 L/hora/70kg en el hombre. Finalmente, el volumen de estado estacionario (VEE) se determinó en un intervalo de 11,3\pm10,4 L/70kg en el hombre a 16,8\pm10,7 L/70 kg en el hombre.

TABLA 8 Parámetros medios de rFGF-2 en Seres Humanos

9

Aunque la unión de FGF-2 a estructuras del tipo heparina es fuerte (constante de disociación \sim 2x10-9 M), la unión de FGF-2 a un receptor tirosina quinasa específico es aproximadamente de dos órdenes de magnitud superior (constante de disociación \sim 2x10-11). Moscatelli et al., (1991). Así, sin unirse a ninguna teoría, la formación del complejo rGF-2 con un glucosaminoglicano, tal como una heparina, puede aumentar la señal de transducción y la mitogénesis, y/o proteger al rFGF-2 de la degradación enzimática.

Los ejemplos, a continuación, proporcionan más detalles sobre los criterios de selección y el ensayo clínico en Fase I que dan como resultado los datos discutidos más arriba.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Dosis única de rFGF-2 Empleada en el Ensayo Clínico en Fase I

El rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 se formuló como una dosis única y como composición farmacéutica y se administró a ratas, cerdos y finalmente a seres humanos en el ensayo clínico en Fase I arriba referido en la presente memoria. Las formulaciones varias se describen más abajo.

La dosis única de rFGF-2 se proporcionó en un líquido en viales de vidrio de tipo I de 3 cc con un tapón gris de goma de butilo laminado y un precinto rojo. La dosis única de rFGF-2 contenía 1,2 ml de 0,3 mg/ml de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 en citrato sódico 10 mM, monotioglicerol 10 mM, dihidrato sódico de EDTA 1 mM (peso molecular 372,2), cloruro sódico 135 mM, pH 5,0. Así, en términos absolutos, cada vial (y dosis única) contenía 0,36 mg de rFGF-2. Los viales que contienen la dosis única en forma líquida se almacenaron a 2º a 8ºC.

El diluyente de rFGF-2 se suministró en viales de vidrio de tipo I de 5 cc con un tapón gris de goma de butilo laminado y un precinto rojo. El diluyente de rFGF-2 contiene citrato sódico 10 mM, monotioglicerol 10 mM, cloruro sódico 135 mM, pH 5,0. Cada vial contenía 5,2 ml de solución diluyente de que se almacenó a 2 a 8 1ºC.

La composición farmacéutica de rFGF-2 que se infundió se preparó diluyendo la dosis única de rFGF-2 con el diluyente de rFGF-2 de forma que el volumen de infusión es 10-40 ml. Con el fin de mantener la concentración de EDTA por debajo de un límite presente de 100 \mug/ml, el volumen total de infusión se aumentó a un máximo de 40 ml cuando se administraron cantidades superiores proporcionalmente absolutas de FGF-2 a los pacientes con peso corporales mayores.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Criterios de Selección para Pacientes con Enfermedad de las arterias coronarias Para Tratar con rFGF-2

Se aplicaron los siguientes criterios de selección a pacientes en la Fase I con enfermedad de las arterias coronarias, cuyas actividades se limitaban a isquemia coronaria a pesar de la administración médica óptima, y que no fueron candidatos para terapias de revascularización aprobadas:

Criterios de inclusión: El sujeto se elige si:

\bullet

Macho o hembra, mayor o igual a 18 años

\bullet

Diagnóstico de enfermedad de las arterias coronarias (EAC)

\bullet

Candidatos subóptimos para procedimientos de revascularización aprobados, por ejemplo, angioplastia, moldes, injerto de desviación de arteria coronaria (IDAC) (o que rechaza aquellas intervenciones)

\bullet

Capaz de hacer ejercicio al menos tres minutos usando un protocolo Bruce modificado y limitado por la isquemia coronaria

\bullet

Defecto inducible y reversible de al menos el 20% del miocardio en un escáner de esfuerzo farmacológico de sestamibi de talio.

\bullet

CBC, plaquetas, análisis del suero dentro del intervalo clínicamente aceptable para la cateterización cardiaca necesaria

\bullet

INR normal, o si se anticoagula con Coumadina, INR<2,0

\bullet

Estar dispuesto y ser capaz de dar un consentimiento informado firmado para participar en este estudio, incluyendo todos los procedimientos del estudio necesitados y visitas de seguimiento

\newpage

Criterios de exclusión: El sujeto no se elige si:

\bullet

Cáncer: cualquier historia de cáncer en los 10 años anteriores, con la excepción de carcinoma de células basales tratada con curas.

\bullet

Condiciones oculares: retinopatía proliferativa, retinopatía no proliferativa severa, oclusión de la vena de la retina, Enfermedad de Eales, o edema macular o funduscopia por el oftalmólogo: historia de cirugía intraocular dentro de los 6 meses

\bullet

Función renal: evacuación de creatina por debajo del intervalo normal ajustado para la edad; proteína>250 mg o microalbúmina>30 mg/24 horas en orina

\bullet

Fallo cardiaco de clase IV (Asociación Cardiaca de Nueva York)

\bullet

Fracción de expulsión < 20% por ecocardiograma, escáner de talio, MRI o escáner selección de conjuntos de sangre (ESCS)

\bullet

Estenosis valvular severa (área aórtica <1,0 cm2, área mitral <1,2 cm2), o insuficiencia valvular severa

\bullet

Aumento marcado en angina o angina inestable dentro de las tres semanas

\bullet

Historia de infarto de miocardio (IM) dentro de los tres meses

\bullet

Historia de ataque isquémico transitorio (AIT) o ictus dentro de los seis meses

\bullet

Historia de IDAC, angioplastia o molde dentro de los seis meses

\bullet

Historia de tratamiento con revascularización intramiocárdica con láser, rFGF-2, o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) dentro de los seis meses

\bullet

Mujeres o madres con niños o en lactancia

\bullet

Cualquier fibrosis patológica, por ejemplo, fibrosis pulmonar, escleroderma

\bullet

Malformaciones vasculares conocidas, por ejemplo, malformación AV, hemangiomas

\bullet

Coexistencia de cualquier enfermedad que pueda interferir en la evaluación de los síntomas de EAC, por ejemplo, pericarditis, costocondritis, esofagitis, vasculitis sistémica, enfermedad de células falciformes

\bullet

Coexistencia de cualquier enfermedad que limite la realización del ensayo del protocolo Bruce modificado de estrés en el ejercicio, por ejemplo, parálisis o amputación de una extremidad inferior, artritis severa o extremidades inferiores, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)

\bullet

Participación en ensayos clínicos de agentes de investigación, aparatos o procedimientos dentro de los treinta días (o programados dentro de los sesenta días del fármaco en estudio)

\bullet

Hipersensibilidad conocida a rFGF-2 o compuestos relacionados

\bullet

Cualquier condición que hace al sujeto no apropiado para la participación en este estudio en opinión del investigador, por ejemplo, psicosis, retraso mental severo, incapacidad para comunicarse con el personal del estudio, abuso de alcohol y drogas.

Ejemplo 3 Estudio Clínico en Fase I en FGF-2 Recombinante (SEQ ID NO: 2) Administrado a Humanos

El ensayo en Fase I de la EAC de este ejemplo es un estudio de dosis escalada y de etiqueta abierta del factor 2 de crecimiento fibroblástico recombinante (rFGF-2) para su seguridad, tolerabilidad y farmacocinética. El estudio se llevó a cabo en dos lugares: el Hospital Beth Israel Deaconess (Harvard) en Boston, MA y en el Hospital de la Universidad de Emory en Atlanta, GA. La inscripción está completa. Los individuos se trataron con una sola infusión de rFGF-2 en el Día 1 y se siguió durante 365 días; el seguimiento todavía no está completado en algunos individuos.

La población de individuos consiste de pacientes con EAC avanzada que tienen limitación para el ejercicio debido a isquemia coronaria y son considerados candidatos subóptimos para (o no quieren sufrir) uno de los procedimientos de revascularización establecidos (por ejemplo, IDAC, angioplastina con o sin molde). Los principales criterios de exclusión fueron historia o sospecha de cáncer, fallo cardiaco descompensado o fracción de expulsión cardiaca del ventrículo izquierdo <20%, insuficiencia renal o proteinuria, y varias condiciones oculares (por ejemplo, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía no proliferativa severa).

Sesenta y seis individuos han recibido rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 es en este ensayo clínico: cincuenta y dos recibieron el rFGF-2 en infusión IC y cuarenta lo recibieron en infusión IV. Cada individuo fue observado en el hospital durante al menos veinticuatro horas, y luego se les siguió como pacientes externos durante 360 días con visitas de seguimiento (Días 15, 29, 57, 180 y 360). Al menos cuatro individuos se estudiaron para cada dosis; si ningún individuo experimentaba toxicidad limitada por la dosis tal como se define en el protocolo durante seis días, la dosis se escala. El fármaco se administró como una sola infusión de 20 minutos dividida entre dos fuentes principales de suministro de sangre coronaria (IC), usando técnicas clásicas para posicionar un catéter dentro de la arteria coronaria del paciente (tal como ya se empleó en angioplastia) o en una vena periférica (IV). Las dosis en \mug/kg de rFGF-2 administradas IC (y el número de pacientes) fueron 0,33 (n=4), 0,65 (n=4), 2,0 (n=8), 6,0 (n=4), 12,0 (n=4), 24 (n=8), 36 (n=10) y 48 (n=10) de rFGF-2 de SEQQ ID NO: 2. Las dosis en \mug/kg de rFGF-2 administradas IV (y el número de pacientes) fueron 18,0 (n=4) y 36,0 (n=10) de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2.

La frecuencia de angina y la calidad de vida se evaluó por el Cuestionario de Angina de Seattle (SAQ) a un recuento basal (antes de la administración de rFGF-2) y a 2 meses y 6 meses tras la administración de rFGF-2. El tiempo de tolerancia al ejercicio (TTE) se evaluó por ensayo de rutina a 1, 2 y 6 meses. La perfusión nuclear en reposo/ejercicio y la fracción de expulsión en reposo determinada por la zona de sestamibi (FE), y la formación de imágenes por resonancia magnética en reposo (MRI) se evaluaron en el recuento basal, a 1 mes, 2 meses y 6 meses tras la administración de rFGF-2. Las medidas de MRI que se pensaron que objetivamente medían cambios en % de la función cardiaca y la perfusión incluían: (1) fracción de expulsión; (2) extensión del infarto de miocardio (%); (3) engrosamiento de la pared normal (%);(4) movimiento de la pared normal (%); (5) engrosamiento de la pared diana (%); (6) movimiento de la pared diana (%); (7) extensión colateral del área de la pared diana (%); y (8) extensión de la llegada retardada del área diana (%).

Si uno de cuatro individuos experimentaba toxicidad de límite de dosis (como se define por el protocolo), se estudian cuatro individuos adicionales para esa dosis; si ninguno experimenta toxicidad, la dosis se escala y se estudia otro grupo. La dosis máxima tolerada (DMT) se definió como la dosis IC que fue tolerada por 9/10 individuos, es decir, 36 \mug/kg IC.

La administración cuidadosa de la infusión previa del fluido se recomendó usando un catéter SwanGanz y se monitorizaron frecuentemente las señales vitales durante la dosis. La heparina se administró IV antes de la infusión de rFGF-2 en todos los grupos. La concentración de EDTA fue menos de 100 \mug/ml en la composición en monodosis. El volumen del fármaco en estudio administrado varió con la dosis y el peso del individuo, y estaba en el intervalo de 10 ml en las dosis menores a 40 ml en las dosis superiores.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados Preliminares

Los resultados aquí presentados no están revisados y están basados en un tercer análisis provisional para sesenta y seis individuos con un seguimiento de seis meses para todos los grupos (1-10) y la descripción de casos adversos serios (CAS) del 29 de Julio de 1999 de Chiron Drug Safety. La colección de datos durante la última visita (Día 360) y el análisis final está en progreso.

La dosis de comienzo de 0,33 \mug/kg IC se escaló en ocho grupos secuenciales hasta 48 \mug/kg IC, en cuya dosis, 2 de diez individuos experimentaron toxicidad limitada por dosis (hipotensión) tal como define el protocolo. La hipotensión de manejó sólo con líquidos en todos los individuos (sin vasopresores o aparatos de asistencia). A 36 \mug/kg IC, solo 1 de 10 individuos tuvo toxicidad limitada por dosis, que definió esta dosis como la dosis máxima tolerable (DMT). Se estudiaron dos grupos adicionales por infusión IV, cuatro individuos para la mitad de la DMT (18 \mug/kg) y diez individuos para la DMT (36 \mug/kg).

En humanos, la hipotensión fue limitante de dosis, al como se predijo en el modelo animal en cerdos Yorkshire. Sin embargo, 36,0 \mug/kg de rFGF-2 IC fueron tolerados en humanos; mientras que en cerdos, 20,0 \mug/kg de rFGF-2 IC causaron hipotensión profunda en uno de dos animales. La mejor tolerancia en humanos se atribuyó a administración agresiva de líquidos y ausencia de anestesia general.

Como el 29 de Julio de 1999, ocurrieron treinta y tres casos adversos severos (CASs) en 24/66 individuos, pero no estaban relacionados con la dosis. Se consideraron 15 CAS, al menos, relacionados al rFGF-2; siempre que hubiera una diferencia entre la conexión asignada por el investigador y el monitor médico, más conservadora se asignó la relación. Los CAS fueron múltiples en cinco individuos: 01103 (0,33 \mug/kg IC), 01106 (0,65 \mug/kg IC), 01113 (2,0 \mug/kg IC), 01137 (36,0 \mug/kg IV), 02101 (0,65 \mug/kg IC).

Los casos adversos más frecuentes que emergen del tratamiento (CAs) en el Día 1 fueron hipotensión sistólica transitoria y bradicardia transitoria. La hipotensión fue dependiente de dosis y ocurrió más frecuentemente a dosis mayores o iguales a () 24 \mug/kg IC; la bradicardia no fue dependiente de dosis. Otros casos adversos (CAs) que al menos se consideraron posiblemente relacionados y parecían relacionados con la dosis ocurrieron dentro de los primeros días o semana tras la infusión, e incluyen dolor de pecho, falta de aire, insomnio, ansiedad, y náusea. Estos casos fueron de suaves a moderados en la severidad, y muchos no necesitaron intervención específica.

\newpage

Cuando se administra IC, el fármaco se administró en aproximadamente 20 minutos como una sola infusión dividida entre dos fuentes principales de administración de sangre coronaria (IC), usando técnicas clásicas para posicionar un catéter dentro de la arteria coronaria del paciente (tal como ya se empleó en angioplastia). Cuando se administra IV, el fármaco se administró como una infusión en 20 minutos dentro de una vena periférica.

Los resultados de seguridad preliminares indican que casos serios no se relacionaron con la dosis. Hasta ahora, de los ocho grupos de posología IC, hubo tres muertes en los grupos de posología más baja, es decir, a 0,65 \mug/kg (Día 23), a 2,0 \mug/kg (Día 57) y a 6,0 \mug/kg (Día 63), y una muerte en el grupo de dosis más alta, es decir, a 48 \mug/kg (aproximadamente 4 meses tras la dosis). Tres de las muertes fueron cardiacas; una muerte se debió a linfoma de células B y se diagnosticó tres semanas después de la dosis en el paciente en el grupo 4 (6,0 \mug/kg) cuyo paciente murió a los dos meses tras la dosis.

El infarto de miocardio agudo (IM) ocurrió en cuatro pacientes, es decir, un paciente de cada grupos 1 (0,33 \mug/kg), 3 (2,0 \mug/kg), 4 (6,0 \mug/kg) y 7 (36,0 \mug/kg). Múltiples IM ocurrieron en dos pacientes, es decir, uno del grupo 1 (0,33 \mug/kg) y uno del grupo 3 (2,0 \mug/kg). Se llevaron a cabo procedimientos de revascularización de emergencia (IDAC o angioplastia con o sin molde) durante el seguimiento en 4 pacientes: uno de cada grupos 1 (0,33 \mug/kg), 3 (2,0 \mug/kg), 4 (6,0 \mug/kg) y 7 (36,0 \mug/kg).

La hipotensión aguda, vista en las dosis más altas durante o justo tras la infusión, se manejaron con administración de líquidos IV sin necesidad de un vasopresor. La dosis máxima tolerada (DMT) en seres humanos se definió como 36 \mug/kg IC. (En contraste, en cerdos, la DMT fue 6,5 \mug/kg IC). Dosis de rFGF-2 de hasta 48 \mug/kg IC se administraron en pacientes humanos con administración agresiva de fluidos, pero se definió por el protocolo como "no tolerada" debido a hipotensión aguda y/u ortostática y dos de los diez pacientes. La semivida terminal del rFGF-2 infundido se estimó en 5-7 horas.

Los pacientes humanos en este estudio que se trataron con una sola infusión IC o IV de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 mostraron un aumento medio en TTE de 1,5 a 2 minutos. Véase Tabla 1. Esto es especialmente significativo debido a que un aumento en TTE de más de (>) 30 segundos se considera significativo y un punto de referencia para evaluar terapias alternativas, tales como angioplastia. La frecuencia de angina y la calidad de vida, como se mide por SAQ, mostró una mejora significativa a los 2 meses en todas las 5 subescalas para los 66 pacientes (n=66) ensayados. Véanse Tablas 2-6. En las Tablas 2-6, un cambio medio de 14 o más se consideró "clínicamente significativo".

Además de los criterios de más arriba (es decir, TTE, SAQ, MRI), un tratamiento se considera de mucho éxito si el efecto angiogénico dura al menos seis meses. En el presente estudio en Fase I, los efectos angiogénicos inesperadamente superiores se observaron que duraron hasta 6 meses en algunos pacientes en todos los grupos de dosis. Basado en los resultados ya obtenidos, se esperaba que los efectos angiogénicos pueden durar doce meses o más pero duran al menos seis meses en los pacientes, en cuyo caso, si es necesario, se puede repetir el procedimiento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Estudio Clínico en Fase II Propuesto sobre rFGF-2 (SEQ ID NO: 2) Administrado a Humanos para Tratar le enfermedad de las arterias coronarias

El ensayo clínico en Fase II de rFGF-2 para tratar pacientes con enfermedad de las arterias coronarias se lleva a cabo como un estudio controlado de doble ciego/placebo que tiene cuatro ramas: placebo, 0,33 \mug/kg, 3,0 \mug/kg, y 30 \mug/kg administrados una vez IC. Este estudio está en curso y los resultados todavía no están disponibles.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Dosis única y Composición Farmacéutica de rFGF-2 para el Ensayo Clínico en Fase II en Seres Humanos

El rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 se formuló como una composición farmacéutica en monodosis para la administración a seres humanos en el ensayo clínico en Fase II arriba mencionado. Varias formulaciones se describen más
abajo.

La Dosis Única de rFGF-2 se preparó como líquido en viales de vidrio de tipo I de 5 cc con un tapón gris de goma de butilo laminado y un precinto rojo. La formulación de rFGF-2 contiene 0,3 mg/ml de rFGF-2 de SEQ ID NO: 2 en citrato sódico 10 mM, monotioglicerol 10 mM, dihidrato disódico de EDTA 0,3 mM (peso molecular 372,2), cloruro sódico 135 mM, pH 5,0. Cada vial contenía 3,7 ml de la solución del producto del fármaco de rFGF-2 (1,11 mg de rFGF-2 por vial). La dosis única resultante en forma líquida se almacenó a, al menos, -60º C. La dosis única arriba descrita está diluida con el "placebo de rFGF-2". Dependiendo del tamaño del paciente, se puede combinar el contenido de varios viales para producir una dosis única de 36 \mug/kg para el estudio en Fase II.

El placebo de rFGF-2 es suministrado como un líquido claro sin color en viales de vidrio de tipo I de 5 cc con un tapón gris de goma de butilo laminado y un precinto rojo. El placebo de rFGF-2 no se distingue en apariencia del producto del fármaco y tiene la siguiente formulación: citrato sódico 10 mM, monotioglicerol 10 mM, dihidrato disódico de EDTA 0,3 mM (peso molecular 372,2), cloruro sódico 135 mM, pH 5,0. Cada vial contiene 5,2 ml de la solución placebo de rFGF-2. A diferencia de la dosis única, el placebo de rFGF-2 se almacena de 2º a 8ºC.

La Composición Farmacéutica de rFGF-2 que se infunde se prepara diluyendo la dosis única de rFGF-2 con el diluyente de rFGF, de forma que el volumen de infusión es 20 ml para la Fase II.

<110> Whitehouse, Martha J.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Dosis única angiogénicamente eficaz de FGF-2 y método de uso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 1296/12169US04

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/145,743

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-09-03

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/104,103

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-10-13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/104,102

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-10-13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bovis bovinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(438)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

10

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bovis bovinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bovis bovinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

12

Claims (20)

1. Una composición en monodosis para inducir angiogénesis en un ser humano, que comprende un agente que es FGF-2 o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo en una cantidad de aproximadamente 0,008 mg a aproximadamente 7,2 mg en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho vehículo comprende un tampón y un agente reductor.

2. La composición en monodosis de la reivindicación 1, donde el agente es FGF-2, o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo en una cantidad de 0,3 mg a 3,5 mg.

3. La composición en monodosis de la reivindicación 1 o 2, donde dicho agente es FGF-2 de la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2, o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo.

4. Uso de un agente que es un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente humano de una enfermedad de las arterias coronarias, donde dicho agente va a ser administrado en una cantidad terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,2 \mug/kg a 48 \mug/kg del peso del paciente dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica en un paciente humano con necesidad de tratamiento de dicha enfermedad de las arterias coronarias.

5. El uso según la reivindicación 4, donde dicho FGF-2 recombinante tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2, o se emplea dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo.

6. El uso según la reivindicación 4 o 5, donde aproximadamente 10 U/kg a 80 U/kg de heparina van a ser administradas a dicho paciente humano en el intervalo de aproximadamente 0 a 30 minutos antes de administrar dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo.

7. El uso según la reivindicación 4, 5 o 6, donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz de dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo va a ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios.

8. El uso según la reivindicación 7, donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz de dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo es aproximadamente 24 \mug/kg a 48 \mug/kg.

9. El uso según la reivindicación 4, 5 o 6, donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz de dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo va a ser administrado dentro de una vena periférica.

10. El uso según la reivindicación 9, donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz de dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o muteína angiogénicamente activa del mismo es aproximadamente 18 \mug/kg a 36 \mug/kg.

11. Uso de un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente humano de enfermedad de las arterias coronarias, donde dicho medicamento va a ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica en un paciente humano con necesidad de tratamiento para dicha enfermedad de las arterias coronarias, y donde dicho medicamento es una composición en monodosis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Uso de un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para inducir angiogénesis en un corazón de un paciente humano, donde dicho medicamento va a ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica en un paciente humano con necesidad de tratamiento para dicha enfermedad de las arterias coronarias, donde dicho medicamento es una composición en monodosis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Uso de un FGF-2 recombinante o un fragmento angiogénicamente activo o una muteína angiogénicamente activa del mismo para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente humano de infarto de miocardio, donde dicho medicamento va a ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios o dentro de una vena periférica en un paciente humano, donde dicho medicamento es una composición en monodosis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, donde dicho medicamento produce un beneficio terapéutico frente a la enfermedad de las arterias coronarias o infarto de miocardio en dicho paciente humano que dura, al menos, cuatro meses.

15. El uso según la reivindicación 14, donde dicho medicamento produce un beneficio terapéutico frente a la enfermedad de las arterias coronarias o infarto de miocardio en dicho paciente humano que dura seis meses.

16. El uso según la reivindicación 15, donde dicho medicamento produce un beneficio terapéutico frente a la enfermedad de las arterias coronarias o infarto de miocardio del tal magnitud y duración en dicho paciente humano que no es necesario administrar una segunda dosis única durante aproximadamente seis meses.

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, donde dicho medicamento va a ser administrado dentro de uno o más vasos coronarios.

18. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, donde dicho medicamento va a ser administrado dentro de una vena periférica.

19. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, donde dicho medicamento comprende 0,3 mg a 3,5 mg de dicho FGF-2 recombinante de SEQ ID NO: 2 o dicho fragmento angiogénicamente activo o dicha muteína angiogénicamente activa del mismo.

20. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, donde aproximadamente 10 U/kg a 80 U/kg de heparina van a ser administradas a dicho paciente 30 minutos desde la administración de dicha dosis única, donde dicha heparina va a ser administrada por administración intravenosa o intracoronaria.