ES2327378B1 - Composicion farmaceutica util para la administracion oral de farmacos y vacunas a jabalies y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica útil para la
administración oral de fármacos y vacunas a jabalíes y sus
aplicaciones.
En la presente invención se describe una
composición farmacéutica sólida específica para la administración
oral de fármacos y vacunas a jabalíes (Sus scrofa) como
mecanismo de prevención y control de enfermedades de la fauna
silvestre y de los animales relacionados con éstos.
Description
Composición farmacéutica útil para la
administración oral de fármacos y vacunas a jabalíes y sus
aplicaciones.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica terapéutica en forma de cebo, útil para la
administración oral de fármacos, vacunas y sustancias beneficiosas
para la salud, a animales silvestres por ejemplo jabalíes (Sus
scrofa), y por tanto, es un mecanismo de prevención y control de
enfermedades en las que estos animales están afectados, así como
para la demás fauna silvestre, no silvestre, animales domésticos y
seres humanos relacionados con ellos, por lo que sus principales
aplicaciones están en los sectores cinegético, agropecuario y
veterinario.
Se ha demostrado que la fauna silvestre y en
particular los mamíferos terrestres son importantes hospedadores de
patógenos que afectan a los seres humanos y a los animales
domésticos (Ballesteros et al., 2007). En concreto, el
jabalí europeo (Sus scrofa) es un reservorio importante de
patógenos tales como aquellos pertenecientes al complejo
Mycobacterium tuberculosis que afectan tanto a las personas
como a los animales domésticos. El virus de la peste porcina
clásica y el herpesvirus porcino (pseudorabia) se mantienen en la
naturaleza debido a la transmisión entre jabalíes y cerdos. La
erradicación de estas enfermedades requiere el desarrollo de
estrategias de control que reduzcan la transmisión patogénica entre
los animales.
El control y la erradicación de estas
enfermedades en el jabalí requieren del tratamiento de crías de
jabalí entre 2 y 4 meses de edad.
El control de enfermedades mediante vacunación
de la fauna silvestre tiene numerosas ventajas sobre otras técnicas
como, por ejemplo, el control poblacional y está más aceptado
socialmente (Kaden et al., 2005; Cross et al.,
2006).
El concepto de inmunización de fauna silvestre
con vacunas orales fue propuesto por primera vez por los Centros
para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, Atlanta, GA,
USA) y ensayado con zorros en cautividad para controlar la rabia en
la década de los 60 (Rupprecht et al., 2004). Cada vez son
más innovadoras las técnicas y sistemas de administración utilizados
en las vacunas orales contra la rabia en Europa, Canadá y Estados
Unidos diseñados para el control de la enfermedad en la fauna
silvestre (Rupprecht et al., 2004; Cross et al.,
2006). Sin embargo, la vacunación efectiva de algunas especies de la
fauna silvestre como el jabalí requiere el desarrollo de cebos
específicos y efectivos para la administración oral de vacunas,
estables y, preferiblemente, para la especie a tratar. Se ha
comprobado (Brauer et al., 2006) que esta tarea es
particularmente difícil cuando se trata de jabalíes jóvenes debido a
que la inmunización oral de rayones a los 2-4 meses
de vida es difícil debido a problemas fisiológicos asociados con el
vacío inmunológico y el limitado consumo de alimento sólido de los
animales a estas edades.
Existen sistemas de cebos orales para la
vacunación de animales contra la rabia ya patentados. En la patente
americana 4,014,991 (Baer et al., 1977) se describe un cebo
compuesto por una salchicha con un tubo alargado de polietileno en
su interior donde se introduce la vacuna. La especie a la que va
dirigido este tipo de cebo son los zorros. Otro tipo de cebo
destinado a vacunar zorros contra la rabia es el descrito por
Johnston et al. (1987) en el que el cebo se compone de una
esponja recubierta de un material compuesto por grasa de ternera y
cera. Maki et al. (2005) describe un cebo fabricado con
comida de pescado en cuyo interior se introduce un sobre de
plástico donde va la vacuna. Este cebo está destinado a vacunar
mofetas y mangostas frente a la rabia. Otro tipo de cebo es el
descrito en la patente alemana 3611122 (Apr 3, 1986) y americana
4,861,586 de los inventores Lother and Irma Schneider titulada
"Animal Bait" donde describen un cebo consistente en una
matriz de grasa de pescado y una sustancia farmacéuticamente activa
para vacunar conejos. Además de cebos con vacunas contra la rabia
en su interior, también se han descrito patentes de cebos para
vacunar zarigüeyas frente la tuberculosis bovina US2004234533
(Aldwell et al., 2004) y mamíferos frente a la enfermedad de
Lyme US20067094391 (Barbour et al., 2006).
La vacunación efectiva de algunas especies de la
fauna silvestre como el jabalí requiere el desarrollo de un sistema
de cebos efectivo para la administración oral de vacunas, estables
y, preferiblemente, específicos para la especie a tratar (Brauer
et al., 2006; Ballesteros et al., 2007).
Actualmente, se ha desarrollado un tipo de cebo
oral destinado a administrar tóxicos, anticonceptivos o vacunas a
los cerdos no domésticos en Australia. El cebo diseñado se llama
PIGOUT® y forma parte de un proyecto entre las Tecnologías de
Control Animal de Australia (ACTA) y el Centro de Investigación de
Control de Plagas de especies invasoras (PAC CRC). Dicho cebo ha
demostrado ser específico para la especie a tratar. Se ha probado
con éxito en Australia, América y Nueva Zelanda (Campbell et
al., 2007). Sin embargo, este cebo no está destinado a vacunar
crías de jabalí de 2-4 meses de edad (también
denominados rayones).
El control y la erradicación de enfermedades
como la tuberculosis bovina y el virus de la peste porcina clásica
requerirá de la inmunización de crías de jabalí en algunas regiones
(Kaden et al., 2000; 2005; Kaden and Lange, 2001; Ballesteros
et al., 2007; Martín-Hernando et al.,
2007; Naranjo et al., 2007). La inmunización oral de crías
de jabalí (rayones) a los 2-4 meses de vida es
difícil debido a problemas fisiológicos asociados con el vacío
inmunológico (Kaden et al., 2002; 2003; 2005) y el limitado
consumo de alimentos sólidos de los animales a estas edades (Brauer
et al., 2006). Este problema se asociaba con la imposibilidad
de suministrar alimento sólido a los jabalís jóvenes de esta edad
ya que son amamantados por sus madres durante sus tres primeros
meses de vida, tiempo en el que entran en contacto con alimento
sólido (Brauer et al., 2006).
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Un aspecto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica terapéutica, en adelante
composición farmacéutica de la invención, útil para la
administración oral de fármacos, vacunas u otros principios activos
a animales silvestres, preferentemente jabalíes o, más
preferentemente, rayones, que comprende al menos, los siguientes
elementos:
a) una matriz alimenticia que comprende
distintos elementos nutritivos, azúcar entre un 8 y un 45%,
parafina entre un 8 y un 45%, y entre un 0.5 y un 10%, de
aromatizante constituido por esencia de trufa y canela,
b) una cápsula de polímero biocompatible que
incluye el compuesto farmacéutico terapéutico activo.
Un aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
el aromatizante está constituido por, al menos, un 1% de esencia de
trufa y canela, o por, al menos, un 2% de esencia de trufa y
canela.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso de aroma de trufa y canela en la elaboración de un medicamento
o composición farmacéutica útil para el tratamiento o prevención de
enfermedades de animales silvestres, preferentemente, jabalíes y,
más preferentemente, rayones.
Otro aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
el principio activo contenido en la misma pertenece, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: fármaco veterinario, vitaminas, nutrientes,
vacuna, uno o varios microorganismos, o combinaciones de los
mismos.
Otro aspecto de la presente invención es el
procedimiento de elaboración de la composición de la invención que
comprende las siguientes etapas:
i.- una vez fundida la parafina se añaden el
azúcar y el resto de elementos nutritivos lentamente y con
agitación constante,
ii.- una vez que la matriz de i) alcance la
temperatura de, aproximadamente, 45ºC, se añade el aromatizante de
trufa y canela, y
iii.- se embebe la cápsula de polímero
biocompatible con el fármaco o vacuna terapéuticamente activo en la
matriz de ii), la cual es introducida en moldes donde se deja
enfriar hasta, aproximadamente, los 25ºC.
Finalmente, otro aspecto de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
procedimientos de aporte nutritivo o en procedimientos terapéuticos
o preventivos de animales silvestres, preferentemente, jabalíes, y
más preferentemente, rayones.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que es posible inducir la ingesta por
parte de rayones silvestres de un cebo útil para el tratamiento y
la prevención (vacunación) de distintas enfermedades infecciosas,
así como la administración de principios activos que pueden ser
beneficiosos para la alimentación y salud del animal. Dicho cebo
está constituido por una composición farmacéutica terapéutica
sólida (en adelante composición o cebo de la invención) que incluye
parafina y que debido a su nuevo contenido en aromatizantes, es
ingerido por los jabalíes y más concretamente por los rayones
silvestres de forma espontánea. Dicho cebo puede considerarse como
pienso de estos animales o mezclarse con el pienso utilizado
normalmente para la alimentación de jabalíes o rayones.
Además, se ha observado que el cebo objeto de la
presente invención, y más propiamente los microorganismos/vacuna
que contiene, son asimilados por el organismo del rayón,
demostrándose que penetra en las zonas del intestino donde debe
inducir la correspondiente respuesta inmune (Ejemplo 3, Figura
2).
El cebo descrito en esta patente es óptimo para
su utilización en campo durante los meses de verano, cuando la
población de jabalíes jóvenes aumenta y además, son adecuados (pero
no de forma exclusiva) para regiones donde la media de las
temperaturas máximas mensuales alcanza los 34.5ºC, y la lluvia es
escasa, con menos de 30 mm.
La viabilidad de la composición de la presente
invención después de la preparación de los cebos y la incubación de
los mismos a 37ºC y 45ºC era mayor en las cápsulas de polietileno
debido probablemente al mayor intercambio de calor producido en las
finas paredes de las cápsulas de polipropileno, por lo que las
cápsulas de polietileno pueden ser consideradas más adecuadas para
la preparación del cebo en condiciones de campo más extremas.
El cebo de la invención es bien aceptado por
jabalíes de 2-4 meses de edad, la edad idónea para
la vacunación de estos animales, por lo que es idóneo para la
administración oral de fármacos y vacunas a jabalíes de
2-4 meses de edad, que es coincidente con el
momento en que es más importante el tratamiento de algunas
enfermedades como la tuberculosis bovina causada por el complejo
Mycobacterium tuberculosis, el herpes virus porcino
(Pseudorabia), el virus de la peste porcina y la colibacilosis
porcina causada por Escherichia coli. Los rayones empiezan a
ingerir alimento sólido alrededor de los dos meses de edad con la
composición de la invención. La adaptación al alimento sólido
estimula el consumo de los cebos de los jabalíes de
2-3 meses de edad. Los datos de la presente
invención confirman que se obtuvo un mayor consumo de cebos por
parte de jabalíes y cerdos no domésticos que habían sido
alimentados con placebos antes de empezar el ensayo (Hohne and
Stone, 1989; Mcllroy et al., 1989; Saunders et al.,
1990; Kaden et al., 2000). Adicionalmente, el uso del cebo de
la invención puede inducir períodos de lactancia más cortos,
disminuyendo así el vacío inmunológico descrito por Kaden et
al. (2002; 2003; 2005) en jabalíes hasta la edad de 3 a 4
meses, haciendo posible la inmunización activa en animales más
jóvenes como se describe en la presente invención.
Por lo tanto, un aspecto de la presente
invención lo constituye una composición farmacéutica terapéutica,
en adelante composición farmacéutica de la invención, útil para la
administración oral de fármacos, vacunas u otros principios activos
a animales silvestres, preferentemente jabalíes o, más
preferentemente, rayones que comprende, al menos, los siguientes
elementos:
a) una matriz alimenticia que comprende
distintos elementos nutritivos, azúcar entre un 8 y un 45%),
parafina entre un 8 y un 45%, y entre un 0.5 y un 10% de un
aromatizante constituido por esencia de trufa y canela, y,
b) una cápsula de polímero biocompatible que
incluye el compuesto farmacéutico terapéutico activo.
Un aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
el aromatizante está constituido por, al menos, un 1% de esencia de
trufa y canela, o al menos, un 2% de esencia de trufa y canela.
Otro aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
la matriz alimenticia, comprende elementos nutritivos
preferentemente, entre un 7.4 y un 22.2% de cebada, entre un 6.4 y
un 19.2% de trigo, entre un 2.1 y un 6.3% de harina de soja, entre
un 1.2 y un 3.6% de guisantes, entre un 1 y un 3% de salvado de
trigo, entre un 0.8 y un 2.4% de gluten de maíz, entre un 0.5 y un
1.4% de ácidos grasos, entre un 0.2 y un 0.7% de fosfato dicálcico,
entre un 0.2 y un 0.7% de carbonato de calcio, entre un 0.1 y un
0.3% de minerales, vitaminas y aditivos
(6,000-12,000 u vitamina A,
800-4,000 u vitamina D3, 7.5-25 mg
cobre, 0.3-1% lisina), entre un 0.1 y 0.2% de
cloruro de sodio, entre un 10 y un 30% de harina de trigo.
Otro aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
el polímero biocompatible se selecciona, a título ilustrativo y sin
que limite el alcance de la invención, del siguiente grupo:
polipropileno y polietileno, preferentemente, polietileno.
Otro aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
la parafina escogida para la composición de la matriz tiene un
punto de fusión de 51-53ºC.
Una realización particular lo constituye la
composición farmacéutica de la invención que comprende un 44% de
pienso de jabalí (37% cebada, 32% trigo, 10.5% harina de soja, 6%
guisantes, 5% salvado de trigo, 4% gluten de maíz, 2.3% ácidos
grasos, 1.2% fosfato dicálcico, 1.1% carbonato de calcio, 0.5%
minerales, vitaminas y aditivos (9,000 u vitamina A, 1,800 u
vitamina D3, 15 mg cobre, 0.7% lisina), 0.4% cloruro de sodio;
Piensos Inalsa S.A., Ciudad Real, Spain), 22% harina de trigo,
16.5% parafina (punto de fusión 51-53ºC; Dilabo
S.A., Madrid, Spain), 16.5% azúcar, y 1% aromatizante de trufa y
canela (Norel S.A., Madrid, Spain).
Otro aspecto más particular de la presente
invención es la composición farmacéutica de la invención en la que
el principio activo contenido en la misma pertenece, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: fármaco veterinario, vitaminas, nutrientes,
vacuna, uno o varios microorganismos, o combinaciones de los
mismos.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso de aroma de trufa y canela en la elaboración de un medicamento
o composición farmacéutica útil para el tratamiento o prevención de
enfermedades de animales silvestres, preferentemente, jabalíes y,
más preferentemente, rayones.
Otro aspecto de la presente invención es el
procedimiento de elaboración de la composición de la invención que
comprende las siguientes etapas:
i.- una vez fundida la parafina se añaden el
azúcar y el resto de elementos nutritivos lentamente y con
agitación constante,
ii.- una vez que la matriz de i) alcance la
temperatura de, aproximadamente, 45ºC, se añade el aromatizante de
trufa y canela, y
iii.- se embebe la cápsula de polímero
biocompatible con el fármaco o vacuna terapéuticamente activo en la
matriz de ii), la cual es introducida en moldes donde se deja
enfriar hasta, aproximadamente, los 25ºC.
La parafina utilizada debe tener una temperatura
de fusión que pueda ser utilizada por un experto medio en la
materia con el objeto que la matriz sea manejable durante el
procedimiento de elaboración de la composición farmacéutica y al
mismo tiempo respete al máximo la viabilidad funcional del
aromatizante y del principio activo incluido en la cápsula. Por otro
lado, la selección de una u otra parafina puede llevarse a cabo
igualmente seleccionando uno u otro tipo de polímero biocompatible
de la cápsula de tal forma que se puedan obtener distintas
alternativas del procedimiento descrito en función del principio
activo utilizado y de las condiciones externas que pueden esperarse
encontrar en el campo.
Finalmente, otro aspecto de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
procedimientos de aporte nutritivo o en procedimientos terapéuticos
o preventivos de animales silvestres, preferentemente, jabalíes, y
más preferentemente, rayones.
Figura 1. Estudios de estabilidad física de
los cebos y de viabilidad bacteriana. (A) Estudio de
estabilidad física: cuatro grupos de 21 cebos cada uno fueron
incubados a diferentes temperaturas. Un quinto grupo fue incubado en
agua a 25ºC. Muestras de tres cebos cada una fueron tomadas a
diferentes tiempos para hacerles ensayos de estabilidad física
determinando la altura final de los cebos después de someterles a
una presión de 111 g/cm^{2} durante 10 minutos. Se calculó la
diferencia entre la altura inicial y final de los cebos y se utilizó
para realizar un análisis estadístico. (B) Estudio de viabilidad
bacteriana: se incubaron grupos de 12 cebos cada uno a diferentes
temperaturas. Se tomaron muestras de tres cebos cada una a
distintos tiempos y se recuperaron las cápsulas de polietileno para
realizar el ensayo de viabilidad. Se diluyeron las células de E.
coli recombinante en PBS y se cultivaron en placas con agar de
LB/Ampicilina. Se determinó y se comparó el número de unidades
formadoras de colonias (UFC) entre los distintos tratamientos. Para
el análisis estadístico, se utilizó un ANOVA factorial que incluyó
el tiempo y el tratamiento como factores explicativos y la
interacción entre ambos. También se realizó un test
post-hoc de Tukey para estudiar las
diferencias existentes entre los tratamientos (*P<0.05).
Figura 2. Respuesta inmune de los rayones
vacunados con E. coli recombinante que expresa la proteína
de fusión BM95-MSP1a. (A) Se inducía E.
coli recombinante (pMBXAF3) con IPTG durante 3.5 horas para la
expresión de la proteína de fusión recombinante
BM95-MSP1a (flecha). Se cargaban diez \mug de
proteína total por pocillo en un gel 10%
SDS-poliacrilamida. Después se tiñó el gel con
Coomassie Brilliant Blue. Se utilizó E. coli (pMBXAF3) no
inducida como control. (B) Para el análisis de
Western-blot, se transfirieron las proteínas de
E. coli (pMBXAF3) inducida a una membrana de nitrocelulosa,
se trataron con el antisuero de los jabalíes (026 y 035,
inmunizados; 036, 095 y 001, controles) y la señal se reveló con un
anticuerpo de conejo anti-cerdo conjugado con HRP.
La posición de la proteína de fusión recombinante
BM95-MSP1a se indica con flechas. Se utilizaron
marcadores de electroforesis ColorBurst (Sigma) como marcadores de
peso molecular (MW) en la electroforesis.
Ejemplo
1
Para la preparación de la composición objeto de
esta invención, se utilizó un 44% de pienso de jabalí (37% cebada,
32% trigo, 10.5% harina de soja, 6% guisantes, 5% salvado de trigo,
4% gluten de maíz, 2.3% ácidos grasos, 1.2% fosfato dicálcico, 1.1%
carbonato de calcio, 0.5% minerales, vitaminas y aditivos (9,000 u
vitamina A, 1,800 u vitamina D3, 15 mg cobre, 0.7% lisina), 0.4%
cloruro de sodio; Piensos Inalsa S.A., Ciudad Real, Spain), 22%
harina de trigo, 16.5% parafina (punto de fusión
51-53ºC; Dilabo S.A., Madrid, Spain), 16.5% azúcar,
y 1% aromatizante de trufa y canela (Norel S.A., Madrid,
Spain).
Para preparar la matriz de la composición
farmacéutica de la invención, primero se fundió la parafina a 52ºC,
se añadió el azúcar y después el resto de los ingredientes
lentamente y con agitación constante. El aromatizante se añadió al
final cuando la temperatura de la masa era de, aproximadamente,
45ºC. Después se introdujo la matriz la composición farmacéutica en
moldes de silicona y se pusieron cápsulas de polipropileno o
polietileno de 0.2 ml de volumen en el interior de cada cebo para
contener la vacuna utilizada como principio activo. Se dejó enfriar
los cebos a 25ºC, se sacaron de los moldes utilizándose
inmediatamente para el análisis.
A continuación, se realizaron estudios de
estabilidad física para comprobar la resistencia de dichas
composiciones o cebos para su aplicación en el campo. Cuatro grupos
de 21 cebos fueron incubados a diferentes temperaturas (4ºC, 25ºC,
37ºC y 42ºC). Un quinto grupo fue incubado en agua a 25ºC. Muestras
de tres cebos de cada tratamiento fueron tomadas a diferentes
tiempos (0, 10, 24, 34, 48, 58 y 72 horas) para realizarles el
ensayo de estabilidad, el cual consistía en someter a los cebos a
una presión de 111 g/cm^{2} durante unos diez minutos y
determinar la altura final de los cebos. Después se calculó la
diferencia entre la altura inicial y final de los cebos para hacer
un análisis estadístico.
Además, se realizó un análisis de viabilidad
bacteriana en el interior de los cebos, para ello se usó la
bacteria E. coli JM109 transformada con el vector de
expresión pMBXAF3. La bacteria recombinante E. coli fue
inoculada en medio Luria-Bertani (LB) que contenía
50 \mug/ml de Ampicilina y 0.4% de glucosa. Los cultivos se
hicieron a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica medida a 600 nm
(DO_{600\ nm}) de 2.7\pm0.3. Las células se centrifugaron a
3,800 x g durante 10 min a 4ºC y se lavaron con PBS. Después se
resuspendieron en PBS hasta una concentración de 5 x 10^{7}
células/ml, de este cultivo se cogían 100 \mul para rellenar las
cápsulas que se introducían dentro de los cebos. Cuando los cebos
solidificaron, se dividieron en tres grupos de 12 cebos cada uno y
se incubaron durante 96 horas a 25ºC, 37ºC y 45ºC. Se cogieron
muestras de tres cebos de cada tratamiento a las 24, 48, 72 y 96
horas y se recuperaron las cápsulas del interior de los cebos para
determinar la viabilidad de las bacterias. Las células de E.
coli se diluyeron en PBS (1:10 - 1:10^{5}) y se cultivaron en
placas de agar con LB/Ampicilina. El experimento se realizó con
cápsulas de polietileno y con cápsulas de polipropileno de 0.2 ml
de capacidad. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se
determinó después de cada tratamiento y los resultados se
analizaron estadísticamente.
Para el análisis de los resultados obtenidos del
ensayo de estabilidad física, la diferencia entre la altura inicial
y final de los cebos se usó como variable de respuesta para
analizar el efecto del tiempo y el tipo de tratamiento sobre el
período estudiado. Se utilizó un modelo general lineal (MGL, SPSS
14.0, Chicago. IL, EEUU) con un ANOVA factorial que incluyó el
tiempo (0, 10, 24, 34, 48, 58 y 72 horas) y el tratamiento (4ºC,
25ºC, 37ºC, 42ºC, y agua) como factores explicativos y la
interacción entre ambos. Se construyó un modelo similar para la
viabilidad de E. coli después del tratamiento, la variable
UFC transformada Iogarítmicamente en base 10 se utilizó como
variable dependiente, y el tiempo (0, 10, 24, 34, 48, 58, y 72
horas) y la temperatura (25ºC, 37ºC y 45ºC) como factores
explicativos y la interacción entre ambos. Se utilizaron tests
post-hoc de Tukey para estudiar las
diferencias existentes entre las categorías. La incertidumbre
estadística de los estadísticos descriptivos se expresó con un
intervalo de confianza del 95% de la desviación típica.
La composición del cebo debía garantizar que
éste fuera estable en las condiciones que se dan en el campo de
manera que la vacuna pudiese inmunizar a los animales a los que iba
destinada. Los ensayos de estabilidad física demostraron que los
cebos eran estables durante al menos tres días a 42ºC (Fig. 1A).
Sin embargo, el agua afectaba a la estabilidad física de los cebos
después de dos días (Fig. 1A).
Por otro lado, la composición y su procedimiento
de preparación debían proteger también a la vacuna o principio
activo para que mantuviese su eficacia. La parafina escogida para
la composición de la matriz de los cebos tiene un punto de fusión
de 51-53ºC, una temperatura que no afectaba a la
viabilidad de la bacteria E. coli en las cápsulas de
polietileno después de la preparación de los cebos (98.7\pm10.6%
viabilidad expresada como el número de UFC recuperadas después de
aproximadamente 30 minutos, cuando el cebo alcanzaba la temperatura
ambiente). La viabilidad de E. coli no se vio afectada
después de la incubación de los cebos a 25ºC y 37ºC durante 96
horas (Fig. 1B), pero si le afectó la incubación a 45ºC a las 72
horas (Fig. 1B). Las cápsulas de polipropileno eran menos efectivas
en la protección de la viabilidad de la bacteria (datos no
mostrados). Las cápsulas de polietileno mostraron una disminución
del 12.0\pm2.7% de la viabilidad de E. coli después de la
incubación de los cebos a 37ºC durante 96 horas y a 45ºC durante 48
horas.
Los resultados de los ensayos de estabilidad
física y viabilidad bacteriana demuestran que la composición sólida
descrita en esta patente es adecuada para la aplicación en campo
durante los meses de verano, cuando la población de jabalíes
jóvenes aumenta. Estos cebos se pueden usar en regiones donde la
media de las temperaturas máximas mensuales alcanza los 34.5ºC en
agosto, y la lluvia es escasa con menos de 30 mm. La viabilidad de
las bacterias después de la preparación de los cebos y la
incubación de los mismos a 37ºC y 45ºC era mayor en las cápsulas de
polietileno debido probablemente al mayor intercambio de calor
producido en las finas paredes de las cápsulas de polipropileno.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para comprobar la aceptación de las
composiciones farmacéuticas de la invención por parte de jabalíes
de 2-4 meses de edad se realizaron estudios en una
finca de caza situada en la provincia de Ciudad Real, Castilla - La
Mancha, centro de España (38º55'N; 0º36'E; 600 - 850 m sobre el
nivel del mar). En esta finca, se utilizan comederos artificiales
con maíz y pienso para completar el alimento de los rayones en
libertad y los cebos fueron añadidos a éstos de forma que se
mezclaron con el alimento.
En el primer estudio, se utilizaron diferentes
proporciones de aromatizante de trufa y canela en los cebos. Se
prepararon dos grupos de 12 composiciones o cebos cada uno, los
cebos del grupo A contenían un 1% de aromatizante mientras que los
del grupo B contenían el doble (2%). Los cebos elaborados se
mezclaron con el alimento en los comederos y se dejaron a las 10
horas de la mañana en dos comederos distintos donde los rayones
comían normalmente y se revisaron a las 24 horas para comprobar si
fueron consumidos. Para asegurarse de la consumición de los cebos
se utilizaron cámaras digitales con iluminación infrarroja (Leaf
River Outdoor, Taylorsville, MS, EEUU) que se colocaron en las
proximidades de los comederos. Se realizaron dos réplicas de este
experimento con resultados similares, los cebos de ambos grupos A y
B (1% y 2% de aromatizante, respectivamente) fueron totalmente
consumidos al cabo de 24 horas por los rayones, y como era de
esperar la mayoría era consumida durante la
noche.
noche.
En el segundo estudio, se utilizaron seis
comederos (A-F) distribuidos a lo largo de toda la
finca. Se pusieron veinticinco cebos en cada uno (150 cebos en
total) mezclados con el resto de la comida. Cada cebo contenía una
cápsula de 0.2 ml de polietileno rellena de agua. El consumo de los
cebos se evaluó durante cuatro días. Los comederos se revisaron
todas las mañanas para anotar el número de cebos que habían sido
consumidos y el número de cápsulas que se encontraban intactas o
masticadas. En los comederos A-C todos los cebos que
habían sido colocados en cada una fueron consumidos durante la
primera noche. En el comedero D se encontraron 4 cebos en la
primera revisión pero fueron consumidos durante la segunda noche.
En el comedero E, los rayones consumieron 19 cebos durante la
primera noche y los seis cebos restantes durante la segunda. En el
comedero F, los animales necesitaron cuatro noches para consumir
todos los cebos, probablemente debido a que los rayones visitaban
este comedero con menos frecuencia que el resto. De las 150 cápsulas
de polietileno introducidas en los cebos, sólo se recuperaron 52.
En todos los casos, excepto en dos, las cápsulas recuperadas estaban
masticadas y vacías. De manera que es muy probable que la mayoría
de las cápsulas (65%) fuesen masticadas y tragadas por los rayones
y sólo un 1% permanecieron intactas después de la ingestión de los
cebos.
Los estudios de aceptación de campo demostraron
que las composiciones o cebos de la invención eran bien aceptados
por jabalíes de 2-4 meses de edad, la edad idónea
para la vacunación. Estos resultados indican que los cebos descritos
pueden utilizarse para la administración oral de fármacos y vacunas
a jabalíes de 2-4 meses de edad, durante los meses
de verano con temperaturas relativamente altas. El uso de comederos
selectivos para la administración de los cebos a los rayones podría
evitar o reducir enormemente el consumo de cebos por otras
especies.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se realizó un ensayo de vacunación oral con
jabalíes de 2-4 meses de edad, se utilizaron cuatro
jabalíes mantenidos en el parque Senda Viva (Arguedas, Navarra,
España) con la aprobación y supervisión de las autoridades del
parque. El pienso y el agua eran suministrados ad libitum.
Los animales fueron distribuidos al azar en dos grupos utilizando
el programa Random Number Generator Pro v1.45 (Segobit Software,
http://www.segobit.com/rnq.htm). Dos jabalíes inmunizados
(Nos. 026 y 035) recibieron cada uno seis cebos con E. coli
recombinante en su interior mientras que dos jabalíes control (036 y
095) recibieron cada uno seis cebos con PBS en su interior. Se
observo que los jabalíes comieron los cebos masticando las cápsulas
de polietileno que contenían la bacteria recombinante o el PBS y
las escupían vacías después de la ingestión del cebo.
Para los experimentos se utilizó E. coli
K-12 (cepa JM109) transformada con el plásmido de
expresión pMBXAF3. La bacteria fue cultivada en medio
Luria-Bertani (LB) que contenía 50 \mug/ml de
Ampicilina y 0.4% de glucosa a 37ºC hasta alcanzar una DO_{600\
nm}, = 0.4. Después se añadió
Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) hasta una concentración final de 0.5 mM, la incubación
continuó durante 3.5 horas para inducir la expresión de la proteína
recombinante. Esta bacteria recombinante produce con la inducción
una proteína de fusión (BM95-MSP1a) que comprende
los péptidos inmunogénicos de garrapata BM95 fusionados con la
región N-terminal MSP1a de Anaplasma
marginate que es expresada en la superficie de E. coli
(Fig. 2A). La expresión de la proteína recombinante fue corroborada
por SDS-PAGE y alcanzó el 2.8% del total de
proteínas. Las células fueron centrifugadas como se describió
anteriormente y resuspendidas en PBS hasta una concentración de 5 x
10^{9} células/ml, después se cogieron 200 \mul para rellenar
las cápsulas de polietileno que se introducían dentro de los
cebos.
Las composiciones o cebos de la invención fueron
administrados oralmente los días 1, 21 y 42 del experimento. Se
recogió sangre para preparación de suero los días uno (antes de la
administración de los cebos orales) y 56 (dos semanas después de la
última administración de cebos) y se determinaron mediante
Western-blot y ELISA anticuerpos contra la proteína
de fusión BM95-MSP1a.
Para hacer el análisis de
Western-blot se cargaron diez \mug de proteína
total de E. coli recombinante inducida (pMBXAF3) en un gel
12% PAGEgel^{TM} SDS (PAGE-gel, San Diego, CA,
EEUU). Las muestras se sometieron a electroforesis durante dos
horas con una corriente constante de 90 mA. Después los geles SDS
podían teñirse con Coomasie Brilliant Blue o transferirse a una
membrana de nitrocelulosa para hacer un análisis de Western blot.
Para el análisis de Western blot, se transfirieron las proteínas
del gel a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell,
PROTRAN BA85, Dassel, Alemania) durante una hora a 12 V en una
unidad de transferencia Minie-Genie Electroblotter
(Idea Scientific, Corvallis, OR, EEUU). Después se bloqueó la
membrana con 5% de leche desnatada disuelta en tampón salino (TBS)
durante una hora a temperatura ambiente, se lavó tres veces con TBS
y se cubrió con el suero de los jabalíes. También se incluyó en el
experimento el suero de un jabalí adulto (más de dos años de edad)
que había vivido en libertad (No. 001) para examinar la reactividad
cruzada de los anticuerpos adquiridos de manera natural frente a
E. coli. Los sueros fueron diluidos 1:10 en 3% BSA en TBS y
la membrana fue incubada con el suero diluido durante una hora a
temperatura ambiente. Después se lavó tres veces con TBS.
Posteriormente, se incubó la membrana con un anticuerpo secundario
desarrollado en conejo: anti-cerdo conjugado con
peroxidasa (HRP) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO,
EEUU) diluido 1:10,000 en TBS. La membrana se lavó diez veces con
TBS y finalmente se reveló con sustrato estabilizado TMB para HRP
(Promega, Madison, WI, EEUU) durante 5 minutos.
Se estudió la respuesta de anticuerpos frente a
la proteína de fusión BM95-MSP1a mediante un
análisis ELISA realizado a los sueros de los jabalíes, tanto a los
inmunizados como a los controles. Se utilizó la proteína
recombinante parcialmente purificada (0.1 \mug por pocillo) para
antigenar la placa de ELISA durante toda la noche a 4ºC. Los sueros
fueron diluidos de manera seriada desde 1:10 hasta 1:320 en
TBS/0.05% Tween 20 (TBST) y 5% de leche desnatada. La placa fue
incubada con los sueros diluidos durante 1 hora a 25ºC y luego
incubada con un anticuerpo de conejo anti-cerdo
conjugado con peroxidasa (Sigma) diluido 1:500 durante 1 hora a
25ºC. Después se reveló con SIGMAFAST OPD (o-Fenilenodiamina
dihidrocloruro) (Sigma) y se determinó la DO_{450\ nm}. Después de
cada incubación se lavaba la placa con PBST. Los títulos de
anticuerpo se consideraban positivos cuando se obtenía un valor de
DO, medido al menos dos veces, tan alto como el del suero utilizado
como control negativo y se expresaron como la media geométrica
(media \pm S.D.) en la dilución 1:10.
Se compararon los títulos de anticuerpo
obtenidos mediante ELISA frente a la proteína de fusión
BM95-MSP1a entre los jabalíes inmunizados y los
jabalíes control con un test t de Student (P<0.05).
Los animales inmunizados tenían títulos de
anticuerpos IgG (P=0.04) frente a la proteína recombinante de
fusión (valores de DO correspondientes a la dilución 1:10 del suero
de 14\pm7 y 0\pm6 para los animales inmunizados y control,
respectivamente) también se detectó una banda correspondiente a la
proteína de fusión BM95-MSP1a en el análisis por
Western blot en los jabalíes que habían sido inmunizados oralmente
mientras que no se detectó ninguna banda en los jabalíes control
(Fig. 2B). Tampoco se detectó ninguna señal positiva en el suero
preinmune ni en el suero perteneciente al jabalí adulto (No 001),
esto indicaba la ausencia de reactividad cruzada entre los
anticuerpos anti-E. coli adquiridos naturalmente y los
anticuerpos anti-proteína recombinante (Fig.
2B).
Se recogieron muestras de heces de los jabalíes
inmunizados el día 70 (cuatro semanas después de la última
administración de los cebos), se hicieron cultivos en placas con
agar de MacConkey y en placas con agar de LB que contenían además
50 \mug/ml de Ampicilina (placas LBA). El número de colonias de
E. coli resistente a Ampicilina recuperadas era similar al
número de colonias cultivadas en placas con agar de MacConkey.
Se cultivaron cuarenta y ocho colonias crecidas
en las placas LBA de cada jabalí inmunizado como se describió
anteriormente y se utilizaron para verificar la presencia del
plásmido pMBXAF3 mediante PCR utilizando cebadores oligonucleótidos
específicos del vector (N26: 5'-CAT CAT MC GGT TCT
GGC AAA TAT TC-3' y C24: 5'-CTG TAT
CAG GCT GM MT CTT CTC-3'). El 36% de las colonias
cultivadas en placas LBA demostraron ser E. coli recombinante
que contenía el plásmido pMBXAF3.
Así, los estudios de inmunización oral con el
cebo objeto de esta invención confirmaron que la composición
vacunal había sido liberada y había alcanzado el tracto
gastrointestinal de los jabalíes, desarrollando en ellos una
respuesta inmunológica. Por lo tanto, se puede concluir que esta
composición farmacéutica terapéutica, a modo de cebo, es adecuada
para inmunización por vía oral de jabalíes de entre 2 y 4 meses de
edad.
Claims (11)
1. Composición farmacéutica terapéutica útil
para la administración oral de fármacos, vacunas u otros principios
activos a animales silvestres, preferentemente jabalíes y cerdos
silvestres o, más preferentemente, rayones caracterizada
porque comprende, al menos, los siguientes elementos:
a) una matriz alimenticia que comprende
distintos elementos nutritivos, azúcar entre un 8 y un 45%,
parafina entre un 8 y un 45%, y entre un 0.5 y un 10% de un
aromatizante constituido por esencia de trufa y canela y,
b) una cápsula de polímero biocompatible que
incluye el compuesto farmacéutico terapéutico activo.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque el aromatizante está
constituido por, al menos, un 1% de esencia de trufa y canela.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque el aromatizante está
constituido por, al menos, un 2% de esencia de trufa y canela.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque la matriz alimenticia
comprende elementos nutritivos preferentemente, entre un 7.4 y un
22.2% de cebada, entre un 6.4 y un 19.2% de trigo, entre un 2.1 y un
6.3% de harina de soja, entre un 1.2 y un 3.6% de guisantes, entre
un 1 y un 3% de salvado de trigo, entre un 0.8 y un 2.4% de gluten
de maíz, entre un 0.5 y un 1.4% de ácidos grasos, entre un 0.2 y un
0.7% de fosfato dicálcico, entre un 0.2 y un 0.7% de carbonato de
calcio, entre un 0.1 y un 0.3% de minerales, vitaminas y aditivos
(6,000-12,000 u vitamina A,
800-4,000 u vitamina D3, 7.5-25 mg
cobre, 0.3-1% lisina), entre un 0.1 y 0.2% de
cloruro de sodio, entre un 10 y un 30% de harina de trigo.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque el polímero
biocompatible se selecciona del siguiente grupo: polipropileno y
polietileno, preferentemente, polietileno.
6. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque la parafina escogida
para la composición de la matriz tiene un punto de fusión de
51-53ºC.
7. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque comprende un 44% de
pienso de jabalí (37% cebada, 32% trigo, 10.5% harina de soja, 6%
guisantes, 5% salvado de trigo, 4% gluten de maíz, 2.3% ácidos
grasos, 1.2% fosfato dicálcico, 1.1% carbonato de calcio, 0.5%
minerales, vitaminas y aditivos (9,000 u vitamina A, 1,800 u
vitamina D3, 15 mg cobre, 0.7% lisina), 0.4% cloruro de sodio), 22%
harina de trigo, 16.5% parafina (punto de fusión
51-53ºC), 16.5% azúcar, y 1% aromatizante de trufa
y canela.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 caracterizada porque el principio activo
contenido en la misma pertenece a: un fármaco veterinario, una
vitamina, un nutriente, una vacuna, uno o varios microorganismos, o
combinaciones de los mismos.
9. Uso de aroma de trufa y canela en la
elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para
el tratamiento o prevención de enfermedades de animales silvestres,
preferentemente, jabalíes y, más preferentemente, rayones.
10. Procedimiento de elaboración de la
composición según las reivindicaciones 1 a la 8
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
i.- una vez fundida la parafina se añaden el
azúcar y el resto de elementos nutritivos lentamente y con
agitación constante,
ii.- una vez que la matriz de i) alcance la
temperatura de, aproximadamente, 45ºC, se añade el aromatizante de
trufa y canela, y
iii.- se embebe la cápsula de polímero
biocompatible con el fármaco o vacuna terapéuticamente activa en la
matriz de ii), la cual es introducida en moldes donde se deja
enfriar hasta, aproximadamente, los 25ºC.
11. Uso de la composición farmacéutica según las
reivindicaciones 1 a la 8 en un procedimiento de aporte nutritivo o
en un procedimiento terapéutico o preventivo de animales
silvestres, preferentemente, jabalíes, y más preferentemente,
rayones.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
ES200800798A ES2327378B1 (es) | 2008-03-18 | 2008-03-18 | Composicion farmaceutica util para la administracion oral de farmacos y vacunas a jabalies y sus aplicaciones. |
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ES2327378A1 ES2327378A1 (es) | 2009-10-28 |
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DE4233625C2 (de) * | 1992-10-06 | 1995-08-03 | Altrogge Holding S A | Tierköder und Verfahren zu dessen Herstellung |
FR2702960B1 (fr) * | 1993-03-26 | 1995-06-16 | Kerouedan Bruno | Leurre pour l'administration orale de médicaments vétérinaires. |
FR2710500B1 (fr) * | 1993-09-27 | 1995-12-01 | Virbac Laboratoires | Composition et système à administration orale pour animaux, leur procédé de préparation et leurs applications. |
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US20090117172A1 (en) * | 2005-03-28 | 2009-05-07 | Ed Rogers | Oral delivery vehicle and material |
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