ES2327309A1 - Proteinas de fusion con un domino lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
Proteinas de fusion con un domino lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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-
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-
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Abstract
Proteínas de fusión con un dominio lectina de
tipo \beta-trébol, procedimiento de obtención y
sus aplicaciones.
La presente invención describe un nuevo método
general de expresión y purificación de proteínas de fusión
conteniendo un dominio peptídico lectina beta-trébol
como etiqueta de afinidad y solubilidad. Esta etiqueta permite
producir diferentes proteínas de fusión solubles con elevados
rendimientos y purificarlas mediante un protocolo de purificación
eficaz, sencillo y de bajo coste. Dicho protocolo está basado en la
capacidad del péptido para unir azúcares derivados de galactosa y
consta de una sola etapa de cromatografía de afinidad que emplea
matrices derivadas de agarosa y lactosa como eluyente.
Description
Proteínas de fusión con un dominio lectina de
tipo \beta-trébol, procedimiento de obtención y
sus aplicaciones.
La invención se puede encuadrar de un modo
genérico en el sector de la biotecnología, con evidentes
aplicaciones en el campo farmacéutico y, actualmente, en el
desarrollo de proyectos de genómica estructural de alto
rendimiento. De un modo más concreto, la invención se encuadraría en
los procesos de producción y purificación de proteínas de
fusión.
El exitoso desarrollo de proyectos de genómica
ocurrido en los últimos años ha permitido obtener una vasta
cantidad de información genética, especialmente de organismos
procariotas, en donde el número de genomas secuenciados se contará
por miles en pocos años (Abby, S. & Daubin, V. (2007).
Trends Microbiol. 15, 135-141). Un
factor decisivo de este éxito ha sido, sin duda alguna, la
homogeneidad química y estructural de los ácidos nucleicos, lo cual
ha permitido desarrollar protocolos de secuenciación de alto
rendimiento ("high throughput") de carácter universal.
Actualmente, en la era post-genómica, el interés se
dirige principalmente al análisis funcional y estructural de las
proteínas codificadas por dichos genomas. En este sentido, y a
diferencia de los ácidos nucleicos, las proteínas son química y
estructuralmente mucho más heterogéneas, lo cual supone de
facto la imposibilidad de desarrollar protocolos de alto
rendimiento universales para la purificación y caracterización
estructural de estas moléculas (Waugh, D.S. (2005). Trends
Biotechnol. 23, 316-320). Otros problemas
relevantes asociados al diseño de este tipo de procesos de alto
rendimiento es el bajo rendimiento en la producción y la escasa
solubilidad de muchas de las proteínas
sobre-expresadas (Esposito, D. & Chatterjee,
D.K. (2006). Curr. Opin. Biotechnol. 17,
353-358). Esto último ha conducido a la búsqueda de
sistemas de sobre-expresión de proteínas
recombinantes alternativos al que puede considerarse el sistema de
expresión por excelencia: la bacteria Escherichia coli.
Algunos sistemas considerados están basados en células eucariotas
de mamífero, levaduras o de insectos (Greene, J.J. (2004).
Methods Mol. Biol. 267, 3-14; Daly,
R. & Hearn, M.T. (2005). J. Mol. Recognit. 18,
119-138; Kost, T.A., Condreay, J.P. & Jarvis,
D.L. (2005). Nat. Biotechnol. 23,
567-575) o bien sistemas libres de células (Murthy,
T.V., Wu, W., Qiu, Q.Q., Shi, Z. Labaer, J. & Brizuela, L.
(2004). Prot. Expr. Purif. 36,
217-225). No obstante, el bajo coste, la facilidad
de manejo y de escalado de cultivos siguen haciendo de E.
coli el sistema de sobre-expresión
prácticamente universal (Esposito, D. & Chatterjee, D.K.
(2006). Curr. Opin. Biotechnol. 17,
353-358).
Una aproximación empleada actualmente en el
desarrollo de protocolos de alto rendimiento universales de
producción/purificación de proteínas en E. coli es el uso de
etiquetas de afinidad ("affinity tag") (Waugh, D.S.
(2005). Trends Biotechnol. 23,
316-320; Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G.E.
& Petersen, J. (2006). Prot. Express. Purif. 48,
1-13). Estas etiquetas son proteínas o péptidos
que, fusionados a la proteína recombinante de interés, idealmente
permitirían aumentar el rendimiento de su expresión, incrementar su
solubilidad y desarrollar un protocolo simple y eficaz de
purificación. Se puede afirmar que actualmente no existe una
etiqueta de afinidad que reúna estas características de un modo
general o universal; de hecho, se considera que el uso combinado de
varias etiquetas podría ser una posible solución al diseño de
estrategias generales (Waugh, D.S. (2005). Trends Biotechnol.
23, 316-320). Obviamente, el empleo
sistemático de esta aproximación combinatorial requiere de un
conocimiento preciso de las ventajas e inconvenientes de las
correspondientes etiquetas individuales.
En la Tabla I y Tabla III se muestran las
principales etiquetas de afinidad ("affinity tag") pues
permiten desarrollar protocolos de purificación genéricos basados
en cromatografías de afinidad, mientras que en la Tabla II, aparecen
etiquetas que en algunos casos se ha comprobado actúan como
"agentes solubilizantes" ("solubility
enhancers").
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Gaberc-Porekar, V. & Menart, V. (2001). J. Biochem. Biophys. Methods 49, 335-360.
- 2.
- Smith, D. B. & Johnson, K. S. (1988). Gene 67, 31-40.
- 3.
- Di Guan, C., Li, P., Riggs, P. D. & Inoue, H. (1998). Gene 67, 21-30.
- 4.
- Einhauer, A. & Jungbauer, A. (2001). J. Biochem. Biophys. Methods 49, 455-465.
- 5.
- Schatz, P. J. (1993). Biotechnology (NY) 11, 1138-1143.
- 6.
- Voss, S. & Skerra, A. (1997). Protein Eng. 10, 975-982.
- 7.
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q. & Breister, L. (2000) Methods Enzymol. 326, 340-362.
\vskip1.000000\baselineskip
- 8.
- Nallamsetty, S. & Waugh, D. S. (2006). Prot. Expr. Purif. 45, 175-182.
- 9.
- Nygren, P. A., Stahl, S. & Uhlen, M. (1993). Trends Biotechnol. 12, 184-188.
- 10.
- LaVallie, E. R., DiBlasio, E. A., Kovacic, S., Grant, K. L., Schendel, P. F. & McCoy, J. M. (1993). Biotechnology (NY). 11, 187-193.
- 11.
- Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M. & Harrison, R. G. (1999). Biotechnol. Bioeng. 65, 382-388.
- 12.
- Marblestone, J. G., Edavettal., S. C., Lim, Y., Lim, P., Zuo, X. & Butt, T. R. (2006). Prot. Sci. 15, 182-189.
- 13.
- Zhang, Y. B., Howitt, J., McCorkle, S., Lawrence, P., Springer, K. & Freimuth, P. (2004). Prot. Expr. Purif. 36, 207-216.
\vskip1.000000\baselineskip
Hoy día el interés se centra principalmente en
MBP, GST, NusA y Trx. No obstante y teniendo en cuenta, por un
lado, que estudios recientes demuestran una baja eficacia de GST
(Dyson, M.R., Shadbolt, S.P., Vincent, K.J., Perera, R.L. &
McCafferty, J. (2004). BMC Biotechnol. 4, 32) y Trx
(Marblestone, J.G., Edavettal., S.C., Lim, Y., Lim, P., Zuo, X.
& Butt, T.R. (2006). Prot. Sci. 15,
182-189) como agentes solubilizantes en E.
coli y, por otro, que NusA, aun con una eficacia similar a MBP
como agente solubilizante, no permite desarrollar un protocolo de
purificación inmediato (Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. &
Harrison, R.G. (1999). Biotechnol. Bioeng. 65,
382-388; Dummler, A., Lawrence, A.M. & de Marco,
A. (2005). Microb. Cell Fact. 4, 34), MBP ha devenido
una de las etiquetas de afinidad sobre la que más interés se tiene
y una de las más ampliamente estudiadas (Dyson, M.R., Shadbolt,
S.P., Vincent, K.J., Perera, R.L. & McCafferty, J. (2004).
BMC Biotechnol. 4, 32; Braud, S., Moutiez, M., Belin,
P., Abello, N., Drevet, P., Zinn-Justin, S.,
Courcon, M., Masson, C., Dassa, J. & Charbonnier, J.B. (2005).
J. Proteome Res. 4, 2137-2147).
Asimismo, puede afirmarse que la eficacia de estas etiquetas es
función de la proteína "acompañante" (Dyson, M.R., Shadbolt,
S.P., Vincent, K.J., Perera, R.L. & McCafferty, J. (2004).
BMC Biotechnol. 4, 32), lo cual no es sino reflejo de
la diversidad química y estructural de las proteínas.
Indudablemente, una validación cualitativa de las etiquetas de
afinidad requerirá de una aproximación a gran escala o
"proteómica" (Esposito, D. & Chatterjee, D.K. (2006).
Curr. Opin. Biotechnol. 17,
353-358).
14. Gaberc-Porekar, V.
& Menart, V. (2001). J. Biochem. Biophys.
Methods 49, 335-360.
15. Smith, D. B. & Johnson, K.
S. (1988). Gene 67, 31-40.
16. Di Guan, C., Li, P.,
Riggs, P. D. & Inoue, H. (1998).
Gene 67, 21-30.
17. Einhauer, A. & Jungbauer,
A. (2001). J. Biochem. Biophys. Methods 49,
455-465.
18. Schatz, P. J. (1993).
Biotechnology (NY) 11,
1138-1143.
19. Voss, S. & Skerra, A.
(1997). Protein Eng. 10,
975-982.
20. Vaillancourt, P., Zheng, C.
F., Hoang, D. Q. & Breister, L. (2000)
Methods Enzymol. 326, 340-362.
Una etiqueta de afinidad ideal aumenta el
rendimiento en la producción de proteínas (Waugh, D.S. (2005).
Trends Biotechnol. 23, 316-320). Este
efecto está asociado normalmente con etiquetas proteicas (no
péptidos pequeños) situadas en el extremo
N-terminal de la fusión, en donde la etiqueta
proporcionaría un entorno eficaz para iniciar el proceso de
traducción, evitando que el ARNm adoptara estructuras secundarias
que pudiesen interferir en la unión a los ribosomas (Hartz, D.,
McPheeters, D.S., Green, L. & Gold, L. (1991). J. Mol.
Biol. 218, 99-105). Por otro lado,
también deben permitir desarrollar un protocolo de purificación
eficaz, potencialmente escalable a procesos de alto rendimiento con
costes mínimos (Waugh, D.S. (2005). Trends Biotechnol.
23, 316-320). En este sentido, la matriz
cromatográfica de afinidad cobra especial relevancia (ver Tabla
III), distinguiéndose dos grandes grupos: matrices con proteínas
inmovilizadas, que suelen ser caras, con baja capacidad de unión y
vidas medias cortas (FLAG, BAP, StrepII, CBP), y matrices con
ligandos de pequeño tamaño (MBP, GST), más baratas y estables. Por
otro lado, la disociación de la proteína inmovilizada en la matriz
debe producirse en condiciones no "agresivas" para el estado
nativo de la proteína.
Claramente, cualquier estrategia basada en el
uso de etiquetas de afinidad debería proporcionar la posibilidad de
eliminarla de un modo eficaz (Waugh, D.S. (2005). Trends
Biotechnol. 23, 316-320), aspecto éste
especialmente relevante cuando se trata de proteínas con potenciales
aplicaciones en terapia humana (Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen,
G.E. & Petersen, J. (2006). Prot. Express. Purif.
48, 1-13). La disponibilidad de
endoproteasas con una especificidad exquisita como AcTEV® (tobacco
etch virus; Invitrogen) o PreScission® (Amersham Biotech) han
mitigado notablemente este problema. Puesto que los determinantes
de la especificidad de estas endoproteasas se localizan en el lado
C-terminal del enlace peptídico diana (TEV:
ENLYFQ/G; PreScission: LEVLFQ/GP), tras la hidrólisis, estos
permanecerán en las etiquetas si están situadas en el extremo
N-terminal de la proteína de fusión.
Finalmente, de acuerdo a las expectativas de
aumento de inversiones en el mercado farmacéutico en fármacos de
naturaleza proteica para el periodo 2004-2010 (de
34000 a 52000 millones de dólares; Pavlou, A.K. & Reichert,
J.M. (2004). Nat. Biotechnol. 22,
1513-1519), se espera la aparición de nuevas
proteínas de interés terapéutico, de ahí que la búsqueda de nuevas
etiquetas de afinidad sea actualmente un campo de intensa
investigación (Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G.E. &
Petersen, J. (2006). Prot. Express. Purif. 48,
1-13).
En resumen, la puesta a punto de un
procedimiento de alto rendimiento de carácter general de producción
y/o purificación de proteínas se enfrenta al problema de la
heterogeneidad química y estructural de estas moléculas.
Concretamente, los tres principales desafíos a los que se intenta
aportar soluciones mediante el uso de las etiquetas de afinidad y
solubilidad son:
- \bullet
- Aumento del rendimiento de la producción de las proteínas heterólogas,
- \bullet
- Aumento de la solubilidad de la proteína de interés, y
- \bullet
- Aportar un protocolo de purificación eficaz y fácilmente escalable a procesos de alto rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto de la invención lo constituye una
proteína de fusión recombinante, en adelante proteína de fusión de
la invención, que comprende, al menos, una secuencia del siguiente
grupo:
- a)
- la secuencia de aminoácidos del péptido LSL_{150} del hongo Laetiporus sulphureus (SEQ ID NO2), y
- b)
- una secuencia análoga a la SEQ ID NO2 de a).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID NO2, por ejemplo,
mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
aminoácidos en cualquier extremo o en el interior de la
secuencia.
En general, una secuencia de aminoácidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos
identificada como la SEQ ID NO2. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de
identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
procedimiento de obtención de la proteína de fusión, en adelante
procedimiento de la invención, que comprende las siguientes
etapas:
- i)
- Obtención de una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos de LSL_{150} (SEQ ID NO1) y la secuencia que codifica para la proteína o péptido de interés, y del vector de expresión que lo comprende,
- ii)
- Transformación de una célula huésped, preferentemente procariota, más preferentemente de Escherichia coli, en la que la construcción génica o el vector de expresión de i) bajo control de los promotores adecuados, permite la expresión de la proteína o péptido de fusión de interés, y purificación del extracto crudo de las células,
- iii)
- Inmovilización de la proteína o péptido de fusión en matrices derivadas de agarosa mediante el paso de extracto crudo de ii) a través de la matriz,
- iv)
- Disociación de la proteína o péptido de fusión de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio conteniendo uno o varios azúcares competidores,
y,
opcionalmente
- v)
- Separación del péptido SEQ ID NO2 de la proteína de fusión mediante tratamiento proteolítico adecua- do.
Para llevar a cabo el paso i) del procedimiento
de la invención es necesario elaborar una construcción genética que
comprenda la secuencia de ADN codificante del peptido SEQ ID NO2,
la proteína o péptido de interés y opcionalmente, una secuencia de
reconocimiento de endoproteasas, por ejemplo, TEV (tobacco etch
virus endoprotease) con objeto de separar la etiqueta de afinidad
de la proteína de interés. Así, otro aspecto de la invención lo
constituye una construcción genética codificante de la secuencia de
ADN codificante de la proteína de fusión de la invención, en
adelante construcción genética de la invención, que comprende,
al menos, una secuencia del siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de ADN SEQ ID NO1, y
- b)
- una secuencia homóloga a la SEQ ID NO1.
La construcción genética de la invención permite
la expresión de una proteína de interés unida al péptido de SEQ ID
NO2. Esta construcción genética de la invención, también puede
comprender, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento,
detección o secreción al exterior de la célula del péptido de
interés expresado, una secuencia de nucleótidos que codifica para
un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento,
detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, un objeto
particular de la presente invención lo constituye una construcción
genética de la invención que comprende cualquier otra secuencia de
nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que
permita el aislamiento, la detección o la secreción al exterior de
la célula del péptido expresado, por ejemplo, a título ilustrativo y
sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de
polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica reconocible por un
anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su identificación, o
cualquier otra que sirva para purificar la proteína de fusión
resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta
tales como c-myc, HA, E-tag) (Using
antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David Lane (1999).
Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Capítulo: Tagging
proteins. Pp. 347-377).
La construcción genética de la invención
descrita previamente puede aislarse y obtenerse por un experto
mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado
de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning", a
Laboratory Manual 2nd ed., Cold Sping Harbor Laboratory Press,
N.Y., 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de
nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión
génica que permite la regulación de la expresión de la misma en
condiciones adecuadas en el interior de las células.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
lo constituye un vector de expresión, en adelante vector de
expresión de la invención, que comprende una construcción
genética de la invención y que permite la expresión de una proteína
o péptido. Ejemplos de una realización particular se pueden
encontrar en los ejemplos de la presente invención.
En general, un vector de expresión comprende,
además de la construcción genética descrita en la invención, un
promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc,
ptac, pBAD, ret, etc.), al que está operativamente enlazado, y
otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan
dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de
interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de
transcripción (tlt2, etc.), señal de poliadenilación, origen de
replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias
codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc.
Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de
acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto
entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o RNA),
cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener,
además, marcadores utilizables para seleccionar las células
transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La
elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso
que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización
particular de la presente invención dicho vector es un plásmido o
un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por
métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al
igual que para la transformación de microorganismos y células
eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente
conocidas - transformación química, electroporación,
microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.].
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una célula huésped, en adelante célula de la
invención, que comprende la construcción genética o el vector
de expresión de la invención, preferentemente una célula
proca-
riota.
riota.
Una realización particular de la invención lo
constituye una célula huésped de la invención constituida por una
célula E. coli., preferentemente células E. coli BL21
DE3.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un nuevo
método general o universal de expresión y purificación de proteínas
de fusión conteniendo un dominio lectina
\beta-trébol como etiqueta de afinidad.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que el módulo lectina de la proteína
hemolítica del hongo Laetiporus sulphureus (los primeros 150
aminoácidos: LSL_{150}) (SEQ ID NO2) es funcional en tanto que
parte constituyente de numerosas proteínas recombinantes de fusión
diseñadas ad hoc. Es decir, que por un lado, la SEQ ID NO2 es
versátil desde una perspectiva de plegamiento de proteínas pues se
pliega adecuadamente estando acompañada de diferentes proteínas en
su extremo C-terminal y, por otro, conserva su
capacidad de unión de azúcares. Sorprendentemente, las proteínas
recombinantes de interés fusionadas al extremo
C-terminal de SEQ ID NO2 también se pliegan
adecuadamente, según se deduce de los resultados de actividad
llevados a cabo con las proteínas puras. Además, estas proteínas de
interés mantienen su estado nativo incluso una vez separadas de SEQ
ID NO2 mediante tratamiento proteolítico (TEV proteasa; ver más
abajo). Todo ello ha permitido purificar diversas proteínas de
fusión conteniendo la SEQ ID NO2 en su extremo
N-terminal empleando un único protocolo de
purificación.
purificación.
En este sentido, los inventores han observado
que la SEQ ID NO2 (de origen eucariota) se produce en E.
coli (procariota) con un elevado rendimiento (aprox. 80 mg por
litro de cultivo), plegándose adecuadamente. De hecho, la
estructura tridimensional de SEQ ID NO2 producida en E. coli
que han determinado es esencialmente igual a la del correspondiente
módulo lectina de LSL aislada directamente del hongo L.
sulphureus (Figura 3). Esta estructura es garantía del
plegamiento adecuado de SEQ ID NO2 expresada heterólogamente en un
organismo procariota, lo cual no es siempre obvio.
Sorprendentemente, en todos los ejemplos indicados más abajo, el
rendimiento con el que se obtienen las proteínas de fusión
construidas (ver ejemplos más abajo) es tal que permite afrontar
proyectos de cristalización de las proteínas puras, una vez
separadas de SEQ ID NO2, con un coste bajo. En el caso concreto de
la proteína PLD de A. haemolyticum (ver ejemplo 3), su
expresión con una etiqueta de histidinas (His6 tag) en las mismas
condiciones que LSL_{150}-PLD, no permitía
obtener la proteína de fusión soluble. Es decir, la secuencia SEQ
ID NO2 reúne propiedades de etiqueta de afinidad y de solubilidad.
En este sentido, es de destacar que actualmente se desconocen las
bases moleculares por las cuales una proteína actúa como etiqueta de
solubilidad y que, por ello, no disponemos de criterios objetivos
con los cuales realizar una búsqueda sistemática de proteínas que
pudiesen actuar como tales. En nuestro caso particular, podemos
afirmar que del análisis estructural y biofísico de la secuencia
SEQ ID NO2 no se pueden deducir sus propiedades como etiqueta de
solubilidad. La idea inicial de que cualquier proteína muy
soluble puede actuar como tal se ha comprobado incorrecta (Waugh,
D.S. (2005). Trends Biotechnol. 23,
316-320). Aunque la solubilidad es una propiedad
necesaria para una potencial etiqueta de solubilidad, es obvio que
no es un requisito suficiente.
En tanto que etiqueta de afinidad y de
solubilidad, la SEQ ID NO2 permite producir diferentes proteínas de
fusión con elevados rendimientos y establecer un protocolo de
purificación de las mismas de carácter general, eficaz, sencillo y
de bajo coste. Estas características se deben a factores de
distinta naturaleza. En primer lugar, se debe a que el método de
purificación de la proteína de fusión implica una única etapa
cromatográfica de afinidad. En segundo lugar, a que el costo de los
principales componentes empleados en dicho protocolo, esto es, las
matrices cromatográficas derivadas de agarosa (Sepharose^{TM} 4B,
6B, CL-4B, CL-6B) y eluyentes
(D(+)-lactosa), es sorprendentemente bajo. Así, y a
modo de comparación, mientras que el precio medio de estas resinas
está en torno a unos 420-580
\euro/litro (en el caso de Sepharose^{TM} 6B se emplea una columna con unos 25 ml de resina) y el de D(+)-lactosa como eluyente unos 28
\euro/kilo, el precio de los componentes empleados en el sistema descrito en (Tielker, D., Rosenau, F., Bartels, K.M., Rosenbaum, T. & Jaeger, K.E. (2006). Bio-Techniques 41, 327-332), esto es, manosa-agarosa es de 33120
\euro/litro y el de D-manosa de unos 900
\euro/kilo. Y, finalmente, en tercer lugar, las matrices cromatográficas empleadas, por una parte, no requieren de ningún tratamiento químico adicional para actuar como matrices de afinidad frente a la secuencia SEQ ID NO2 y, por otra, al ser esencialmente inertes a los homogeneizados celulares y no requerir regeneraciones más allá de su lavado con buffer, pueden reutilizarse de un modo esencialmente continuo.
Una vez comprobada la capacidad de la secuencia
SEQ ID NO2 para actuar como etiqueta de afinidad y solubilidad, se
puede afirmar a posteriori que ésta reúne características
ventajosas adicionales para ser empleada biotecnológicamente en
procesos de producción y purificación de proteínas. En primer
lugar, al ser un dominio monomérico no impone restricciones
estéricas sobre la proteína C-terminal
"acompañante"; en segundo lugar, al carecer de residuos de
cisteína la secuencia SEQ ID NO2 no demanda el uso de agentes
moduladores del estado redox del medio y, finalmente, en tercer
lugar, esta secuencia es LSL_{150} es desde una perspectiva
evolutiva un módulo proteico, por lo que está adaptada estructural
y funcionalmente a ser parte constituyente de proteínas modulares,
como son de facto las proteínas recombinantes de fusión. En
este sentido es destacable el hecho de que ninguna de las etiquetas
de afinidad (proteínas) actualmente relevantes, como MBP, GST o Trx,
proceden de proteínas
modulares.
modulares.
Por tanto, un aspecto de la invención lo
constituye una proteína de fusión recombinante, en adelante
proteína de fusión de la invención, que comprende, al menos, una
secuencia del siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de aminoácidos del péptido LSL_{150} del hongo Laetiporus sulphureus (SEQ ID NO2), y
- b)
- una secuencia análoga a la SEQ ID NO2 de a).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID NO2, por ejemplo,
mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
aminoácidos en cualquier extremo o en el interior de la
secuencia.
En general, una secuencia de aminoácidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos
identificada como la SEQ ID NO2. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de
identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
procedimiento de obtención de la proteína de fusión, en adelante
procedimiento de la invención, que comprende las siguientes
etapas:
- i)
- Obtención de una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos de LSL_{150} (SEQ ID NO1) y la secuencia que codifica para la proteína o péptido de interés, y del vector de expresión que lo comprende,
- ii)
- Transformación de una célula huésped, preferentemente procariota, más preferentemente de Escherichia coli, en la que la construcción génica o el vector de expresión de i) bajo control de los promotores adecuados, permite la expresión de la proteína o péptido de fusión de interés, y purificación del extracto crudo de las células,
- iii)
- Inmovilización de la proteína o péptido de fusión en matrices derivadas de agarosa mediante el paso de extracto crudo de ii) a través de la matriz,
- iv)
- Disociación de la proteína o péptido de fusión de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio conteniendo uno o varios azúcares competidores,
y,
opcionalmente
- v)
- Separación del péptido SEQ ID NO2 de la proteína de fusión mediante tratamiento proteolítico adecuado.
Para llevar a cabo el paso i) del procedimiento
de la invención es necesario elaborar una construcción genética que
comprenda la secuencia de ADN codificante del peptido SEQ ID NO2,
la proteína o péptido de interés y opcionalmente, una secuencia de
reconocimiento de endoproteasas, por ejemplo, TEV (tobacco etch
virus endoprotease) con objeto de separar la etiqueta de
afinidad de la proteína de interés. Así, otro aspecto de la
invención lo constituye una construcción genética codificante de la
secuencia de ADN codificante de la proteína de fusión de la
invención, en adelante construcción genética de la
invención, que comprende, al menos, una secuencia del siguiente
grupo:
- a)
- la secuencia de ADN SEQ ID NO1, y
- b)
- una secuencia homóloga a la SEQ ID NO1.
La construcción genética de la invención permite
la expresión de una proteína de interés unida al péptido de SEQ ID
NO2. Esta construcción genética de la invención, también puede
comprender, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento,
detección o secreción al exterior de la célula del péptido de
interés expresado, una secuencia de nucleótidos que codifica para
un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento,
detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, un objeto
particular de la presente invención lo constituye una construcción
genética de la invención que comprende cualquier otra secuencia de
nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que
permita el aislamiento, la detección o la secreción al exterior de
la célula del péptido expresado, por ejemplo, a título ilustrativo y
sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de
polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica reconocible por un
anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su identificación, o
cualquier otra que sirva para purificar la proteína de fusión
resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta
tales como c-myc, HA, E-tag) (Using
antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David Lane (1999).
Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Capítulo: Tagging
proteins. Pp. 347-377).
La construcción genética de la invención
descrita previamente puede aislarse y obtenerse por un experto
mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado
de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning", a
Laboratory Manual 2nd ed., Cold Sping Harbor Laboratory Press,
N.Y., 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de
nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión
génica que permite la regulación de la expresión de la misma en
condiciones adecuadas en el interior de las células.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
lo constituye un vector de expresión, en adelante vector de
expresión de la invención, que comprende una construcción
genética de la invención y que permite la expresión de una proteína
o péptido. Ejemplos de una realización particular se pueden
encontrar en los ejemplos de la presente invención.
En general, un vector de expresión comprende,
además de la construcción genética descrita en la invención, un
promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc,
ptac, pBAD, ret, etc.), al que está operativamente enlazado, y
otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan
dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de
interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de
transcripción (tlt2, etc.), señal de poliadenilación, origen de
replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias
codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc.
Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de
acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto
entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o RNA),
cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener,
además, marcadores utilizables para seleccionar las células
transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La
elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso
que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización
particular de la presente invención dicho vector es un plásmido o
un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por
métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al
igual que para la transformación de microorganismos y células
eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente
conocidas - transformación química, electroporación,
microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.].
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una célula huésped, en adelante célula de la
invención, que comprende la construcción genética o el vector
de expresión de la invención, preferentemente una célula
procariota.
Una realización particular de la invención lo
constituye una célula huésped de la invención constituida por una
célula E. coli., preferentemente células E. coli BL21
DE3.
Figura 1.- Plásmido pKLSL150 y secuencia de
la proteína LSL_{150}. Parte izquierda: esquema del vector de
expresión pKLSL150 que contiene la secuencia de 450 nt que codifica
para la proteína LSL_{150} bajo el control del promotor de T7 y
un regulador inducible por IPTG. Este plásmido contiene el gen de
resistencia a la Kanamicina (Kan), el gen del represor
lacI, y un sitio múltiple de clonaje
(NcoI/XhoI). Parte derecha: secuencia de nucleótidos y
aminoácidos de la proteína LSL_{150} flanqueada por los sitios de
restricción NcoI y EcoRI utilizados en el
clonaje.
Figura 2.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la purificación de la proteína de
fusión LSL_{150}. En el gel aparecen muestras de diferentes
fracciones del perfil de elución de LSL_{150} al lavar la columna
con buffer conteniendo 0.2 M lactosa. A la izquierda se muestran
patrones de masa molecular con sus correspondientes masas en
kDa.
Figura 3.- Estructura tridimensional de la
proteína LSL_{150}. Parte izquierda: representación del
esqueleto peptídico de LSL_{150} (negro: hebras \beta; gris:
bucles). Parte derecha: esqueleto peptídico del módulo lectina de la
proteína completa aislada directamente del hongo Laetiporus
sulphureus (negro: hebras \beta gris: bucles). N: extremo
amino terminal; C: extremo carboxilo terminal. La estructura de
ambas proteínas se ha determinado mediante cristalografía de
proteínas. La superposición revela una rmsd para 148 carbonos
\alpha de 1.1 \ring{A}, esto es, son casi perfectamente
superponibles.
Figura 4.- Plásmido pKLSLt y secuencia de
reconocimiento de la TEV proteasa. Parte superior: esquema del
vector de expresión pKLSLt derivado del pKLSL150 (Figura 1). En él
se han insertado, en el extremo 3' de la secuencia que codifica
para la proteína LSL_{150}, las secuencias que codifican para el
linker y para el sitio de reconocimiento por la TEV proteasa.
Se indica asimismo, la situación de un sitio múltiple de clonaje
(EcoRI/XhoI). Parte inferior: secuencia de nucleótidos y
aminoácidos del extremo C-terminal de LSL_{150}
así como del linker, de la secuencia de corte TEV y de los sitios de
restricción.
Figura 5.- Plásmido
pKLSLt-EGFP. Parte superior: esquema del vector
de expresión pKLSLt-EGFP derivado del pKLSLt
(Figura 4) en el cual se ha insertado la secuencia que codifica
para la Enhancer Green Fluorescence Protein (EGFP) de
Aequorea victoria (Clontech) de 720 pb entre los sitios de
restricción EcoRI y Not I. Parte inferior: secuencia
de nucleótidos y aminoácidos del sitio de corte TEV y parte de la
proteína clonada.
Figura 6.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la expresión y purificación de la
proteína de fusión LSL_{150}-EGFP y del
tratamiento de ésta con la TEV proteasa. Calles: 1. marcadores de
masa molecular (kDa); 2. fracción soluble del homogeneizado
celular; 3. proteína LSL_{150}-EGFP tras
Sepharose^{TM} 4B; 4. tratamiento de
LSL_{150}-EGFP con TEV proteasa; 5. EGFP tras
filtración en gel con Superdex 75; 6. LSL_{150} tras filtración
en gel con Superdex 75. A la izquierda se muestra la masa molecular
en kDa.
Figura 7.- Plásmido
pKLSLt-PLD. Parte superior: esquema del vector
de expresión pKLSLt-PLD derivado del pKLSLt (Figura
4) en el cual se ha insertado la secuencia que codifica para la
proteína PLD (fosfolipasa dependiente de esfingomielina del
microorganismo Arcanobacterium haemolyticum) de 846 pb entre
los sitios de restricción EcoRI y Hind III. Parte
inferior: secuencia de nucleótidos y aminoácidos del sitio de corte
TEV y parte de la proteína clonada.
Figura 8.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la expresión y purificación de la
proteína de fusión LSL_{150}-PLD y del tratamiento
de ésta con la TEV proteasa. Calles: 1. marcadores de masa
molecular (kDa); 2. fracción soluble del homogeneizado celular; 3.
proteína LSL_{150}-PLD tras Sepharose^{TM} 4B;
4. tratamiento de LSL_{150}-PLD con TEV proteasa;
5. PLD tras filtración en gel con Superdex 75; 6. LSL_{150} tras
filtración en gel con Superdex 75. A la izquierda se muestra la
masa molecular en kDa.
Figura 9.- Plásmido
pKLSLt-SMD. Parte superior: esquema del vector
de expresión pKLSLt-SMD derivado del pKLSLt (figura
4) en el cual se ha insertado la secuencia que codifica para la
proteína SMD (fosfolipasa dependiente de esfingomielina del
microorganismo Corynebacterium pseudotuberculosis) de 802 pb
entre los sitios de restricción EcoRI y Hind III.
Parte inferior: secuencia de nucleótidos y aminoácidos del sitio de
corte TEV y parte de la proteína clonada.
Figura 10.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la expresión y purificación de la
proteína de fusión LSL_{150}-SMD y del tratamiento
de ésta con la TEV proteasa. Calles: 1. marcadores de masa
molecular (kDa); 2. fracción soluble del homogeneizado celular; 3.
proteína LSL_{150}-SMD tras Sepharose^{TM} 4B;
4. tratamiento de LSL_{150}-SMD con TEV proteasa;
5. SMD tras filtración en gel con Superdex 75; 6. LSL_{150} tras
filtración en gel con Superdex 75. A la izquierda se muestra la
masa molecular en kDa.
Figura 11.- Plásmido
pKLSLt-CPL7. Parte superior: esquema del vector
de expresión pKLSLt-CPL7 derivado del pKLSLt
(figura 4) en el cual se ha insertado la secuencia que codifica
para la proteína CPL7 (mureín hidrolasa del fago
Cp-7 del microorganismo Streptoccocus
pneumoniae) de 1003 pb entre los sitios de restricción
EcoRI y Hind III. Parte inferior: secuencia de
nucleótidos y aminoácidos del sitio de corte TEV y parte de la
proteína clonada.
Figura 12.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la expresión y purificación de la
proteína de fusión LSL_{150}-CPL7 y del
tratamiento de ésta con la TEV proteasa. Calles: 1. marcadores de
masa molecular (kDa); 2. fracción soluble del homogeneizado
celular; 3. proteína LSL_{150}-CPL7 tras
Sepharose^{TM} 4B; 4. tratamiento de
LSL_{150}-CPL7 con TEV proteasa; 5. CPL7 tras
filtración en gel con Superdex 75; 6. LSL_{150} tras filtración
en gel con Superdex 75. A la izquierda se muestra la masa molecular
en kDa.
Figura 13.- Plásmido
pKLSLt-IP5_2K. Parte superior: esquema del
vector de expresión pKLSLt-IP5_2K derivado del
pKLSLt (figura 4) en el cual se ha insertado la secuencia que
codifica para la proteína IP5_2K (Inositol
(1,3,4,5,6)-pentakisfosfato quinasa de
Arabidopsis thaliana) de 1353 pb entre los sitios de
restricción EcoRI y Hind III. Parte inferior:
secuencia de nucleótidos y aminoácidos del sitio de corte TEV y
parte de la proteína clonada.
Figura 14.- Análisis mediante
SDS-PAGE de la expresión y purificación de la
proteína de fusión LSL_{150}-IP5_2K y del
tratamiento de ésta con la TEV proteasa. Calles: 1. fracción
soluble del homogeneizado celular; 2 marcadores de masa molecular
(kDa).; 3. proteína LSL_{150}-IP5_2K tras
Sepharose^{TM} 4B; 4. tratamiento de
LSL_{150}-IP5_2K con TEV proteasa; 5. IP5_2K tras
filtración en gel con Superdex 75. A la izquierda se muestra la
masa molecular en kDa.
Ejemplo
1
Con objeto de caracterizar estructuralmente el
dominio lectina \beta-trébol base de la
invención, el gen que codifica para este péptido LSL_{150} fue
expresado heterólogamente en E. coli. Concretamente, el
péptido LSL_{150} de la invención (SEQ ID NO2) es el módulo
lectina de la proteína modular LSL (Mr 35 kDa) producida por el
hongo Laetiporus sulphureus (Tateno, H. & Goldstein, I.J.
(2003). J. Biol. Chem. 278,
40455-40463). LSL_{150} está constituido por los
150 primeros aminoácidos de LSL (17 kDa), que adoptan una
estructura denominada de \beta-trébol (Mancheño.
J.M., Tateno, H., Goldstein, I.J., Martínez-Ripoll,
M. & Hermoso, J.A. (2005). J. Biol. Chem. 280,
17251-17259). Este se puede describir como un
pequeño barril \beta formado por 6 hebras \beta, en uno de
cuyos extremos se encuentra el denominado triplete de bucles. La
estructura en su conjunto resulta de la triplicación de una unidad
estructural básica de unos 50 residuos, cada una de las cuales
poseería capacidad de unión de azúcares derivados de galactosa. Por
ello, LSL_{150} tiene tres potenciales sitios de unión de
azúcares, dos de los cuales son competentes para unir disacáridos
conteniendo galactosa según se ha demostrado (Mancheño. J.M.,
Tateno, H., Goldstein, I.J., Martínez-Ripoll, M.
& Hermoso, J.A. (2005). J. Biol. Chem. 280,
17251-17259).
Previamente, el vector plasmídico pKLSL150
(Figura 1) fue construido insertando la fase de lectura abierta de
los primeros 450 nt del gen de la proteína LSL (LSL_{450})
en el vector pET28a+ (Novagen). El inserto se obtuvo mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como molde el
pET43-LSLa (Tateno, H. & Goldstein, I.J. (2003).
J. Biol. Chem. 278, 40455-40463), así como
oligonucleótidos específicos que hibridan en la región inicial y
final del gen LSL_{450} y presentan en sus extremos las
secuencias diana de las enzimas de restricción NcoI y
EcoRI respectivamente. Tras la reacción, el fragmento
obtenido y el vector pET28a+, fueron digeridos con las
correspondientes enzimas de restricción, purificados y ligados en
presencia de la enzima T4 ligasa (Roche). Posteriormente, se
transformaron bacterias competentes con el producto de la ligación
y se seleccionó el plásmido recombinante pKLSL150 siguiendo
procedimientos estándares de clonaje (Sambrook, J. & Russell,
D.W. (2001). Cold Spring Harbour Lab. Press. 3rd Ed).
Para la producción de la proteína LSL_{150}
recombinante, se transformaron bacterias E. coli (BL21 DE3)
con el vector de expresión pKLSL150, en donde la expresión del gen
que codifica para ella se encuentra bajo el control transcripcional
del promotor de T7. Las células de E. coli fueron crecidas en
1 L de medio Luria Bertani LB conteniendo kanamicina (50 \mug/mL)
durante 3-4 horas a 37ºC, hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 0.6, momento en donde se induce la expresión de
la proteína mediante la adición de 0.3 mM IPTG y posterior
incubación a 16ºC durante 20 horas. Los cultivos celulares se
separaron del medio de cultivo mediante centrifugación a 4000 x g
durante 15 min. El sedimento así obtenido se resuspende en 25 ml de
buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1 M NaCl y 0.04% azida
sódica. Con objeto de romper las células y obtener un homogeneizado
celular, el sedimento resuspendido se pasó por una French press. La
fracción soluble del homogeneizado celular se obtiene mediante
centrifugación a 20000 rpms en un rotor SS34 durante 30 minutos.
Esta fracción soluble se aplicó en una columna de Sepharose^{TM}
4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1 M NaCl y 0.04% azida
sódica y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con
el mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280 nm),
se lleva a cabo la elución de la proteína LSL_{150} mediante
lavado con el mismo buffer anterior conteniendo lactosa 0.2 M. La
columna puede ser empleada de nuevo sin necesidad de etapas de
regeneración adicionales, simplemente tras equilibrarla de nuevo en
el buffer de lavado sin azúcar. Debido a que la matriz
cromatográfica resulta ser inerte a los homogeneizados celulares su
uso continuado está garantizado. La proteína así purificada se ha
conseguido con un rendimiento de aproximadamente 50 mg/litro de
cultivo. El protocolo de purificación proporciona proteína
LSL_{150} electroforéticamente pura (Figura 2). Todas las etapas
del proceso de purificación se realizan a 4ºC. Se ha determinado la
estructura tridimensional de LSL_{150} recombinante mediante
cristalografía de proteínas, encontrándose que es perfectamente
superponible (rmsd 1.1 \ring{A} para 148 carbonos) al dominio
lectina de LSL aislada directamente del hongo Laetiporus
sulphureus (Figura 3), lo cual es garantía del plegamiento
adecuado de esta proteína expresada heterólogamente. El
extraordinario rendimiento de la producción de LSL_{150}, que
apunta a unas muy eficaces etapas de transcripción y traducción,
así como la eficacia, sencillez y costes perfectamente asumibles
del protocolo de purificación condujeron al planteamiento de la
hipótesis de trabajo de que LSL_{150} pudiese actuar como
etiqueta de afinidad y de solubilidad en la producción de proteínas
de fusión. Además, esta molécula posee características muy
atractivas como etiqueta de fusión: en primer lugar, es
extraordinariamente soluble (se han preparado soluciones de hasta
60-80 mg/ml). Aunque esta característica no es un
requisito suficiente para considerarse un agente
solubilizante, sí que es un requisito necesario para serlo;
en segundo lugar, es monomérica, por lo que no va a contribuir al
establecimiento de interacciones intermoleculares entre las
proteínas de fusión de las que forme parte, y en tercer lugar,
carece de residuos de cisteína, lo que implica la ausencia de
problemas de oxidaciones.
Con objeto de validar esta hipótesis se han
construido una serie de fusiones génicas entre la secuencia que
codifica para LSL_{150} y las secuencias que codifican para
distintas proteínas, entre las cuales se ha incorporado la
secuencia de reconocimiento de la proteasa TEV. Para ello se
construyó el vector plasmídico pKLSLt insertando en el vector
pET28a+ (Novagen) la fase de lectura abierta de los primeros 450 nt
del gen de la proteína LSL (LSL_{450}) seguida de la
secuencias de nucleótidos que codifican para un linker de unión y
el sitio de reconocimiento de la TEV proteasa (LTEV). Dicho
inserto se obtuvo mediante reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) utilizando como molde el pET43-LSLa (Tateno,
H. & Goldstein, I.J. (2003). J. Biol. Chem. 278,
40455-40463) y oligonucleótidos que hibridan en la
región inicial y final del gen LSL_{450} y presentan en sus
extremos las secuencias diana de las enzimas de restricción
NcoI y la secuencia (LTEV) seguida de la secuencia
diana para la enzima de restricción EcoRI, respectivamente
(Figura 4). Tras la reacción, el fragmento obtenido y el vector
pET28a+, fueron digeridos con las correspondientes enzimas de
restricción, purificados y ligados en presencia de la enzima T4
ligasa (Roche). Posteriormente, se transformaron bacterias
competentes con el producto de la ligación y se seleccionó el
plásmido recombinante pKLSLt siguiendo procedimientos estándares de
clonaje (Sambrook, J. & Russell, D.W. (2001). Cold Spring
Harbour Lab. Press. 3rd Ed).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con objeto de validar las aplicaciones del
dominio SEQ ID NO2 se han construido una serie de fusiones génicas
entre la secuencia de ADN que codifica para el dominio LSL_{150}
(SEQ ID NO1) y las secuencias que codifican para distintas
proteínas, entre las cuales se ha incorporado la secuencia de
reconocimiento de la proteasa TEV. Para ello se construyó el vector
plasmídico pKLSLt insertando en el vector pET28a+ (Novagen) la fase
de lectura abierta de los primeros 450 nt del gen de la proteína
LSL (LSL_{450}) seguida de la secuencias de nucleótidos
que codifican para un linker de unión y el sitio de reconocimiento
de la TEV proteasa (LTEV). Dicho inserto se obtuvo mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como molde el
pET43-LSLa (Tateno & Goldstein, 2003) y
oligonucleótidos que hibridan en la región inicial y final del gen
LSL_{450} y presentan en sus extremos las secuencias diana de las
enzimas de restricción NcoI y la secuencia (LTEV)
seguida de la secuencia diana para la enzima de restricción
EcoRI, respectivamente (Figura 4). Tras la reacción, el
fragmento obtenido y el vector pET28a+, fueron digeridos con las
correspondientes enzimas de restricción, purificados y ligados en
presencia de la enzima T4 ligasa (Roche). Posteriormente, se
transformaron bacterias competentes con el producto de la ligación
y se seleccionó el plásmido recombinante pKLSLt siguiendo
procedimientos estándares de clonaje (Sambrook y Russell;
2001).
\vskip1.000000\baselineskip
El vector plasmídico pKLSLt-EGFP
(Figura 5) fue construido insertando una fase de lectura abierta de
720 nt del gen de la proteína EGFP (Enhancer Green Fluorescence
Protein) en el vector pKLSLt (Figura 4). El inserto se obtuvo
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como
molde el plásmido pCMV-EGFP (Clontech), así como
oligonucleótidos específicos que hibridan en la región inicial y
final del gen EGFP y presentan en sus extremos las secuencias diana
de las enzimas de restricción EcoRI y NotI,
respectivamente. Tras la reacción, el fragmento obtenido y el vector
pKLSLt, fueron digeridos con las correspondientes enzimas de
restricción, purificados y ligados en presencia de la enzima T4
ligasa (Roche). Posteriormente, se transformaron bacterias
competentes con el producto de la ligación y se seleccionó el
plásmido recombinante pKLSLt-EGFP siguiendo
procedimientos estándares de clonaje (Sambrook y Russell;
2001).
Se incubaron células de E. coli (BL21
DE3) conteniendo el plásmido pKLSLt-EGFP (Figura 5)
durante 3-4 horas a 37ºC en 1 L de medio LB
conteniendo kanamicina (50 \mug/mL), hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 0.6. En ese momento se induce la expresión de la
proteína LSL_{150}-EGFP mediante la adición de
0.3 mM IPTG, tras lo cual se mantiene el cultivo a 16ºC durante 20
horas. Tras centrifugación a 4000 x g durante 15 min, las células se
separaron del medio de cultivo. El sedimento así obtenido se
resuspende en 25 ml de buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1M
NaCl y 0.04% azida sódica. Con objeto de romper las células y
obtener un homogeneizado celular, el sedimento resuspendido se pasó
por una French press. La fracción soluble del homogeneizado celular
se obtiene mediante centrifugación a 20000 rpms en un rotor SS34
durante 30 minutos. Esta fracción soluble se aplicó en una columna
de Sepharose^{TM} 4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1M NaCl y 0.04% azida sódica
y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con el
mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280 nm),
se lleva a cabo la elución de LSL_{150}-EGFP
mediante lavado de la matriz cromatográfica con el mismo buffer
anterior conteniendo lactosa 0.2 M (Figura 6). Las fracciones
conteniendo LSL_{150}-EGFP se juntaron (Figura 6,
calle 3), concentrándose la proteína mediante ultrafiltración con
membranas Centriprep YM-10 (Amicon). El tratamiento
de esta proteína con TEV proteasa en buffer 50 mM Tris, pH 8.0, con
200 mM NaCl, 0.04% azida sódica (80:1; w/w), rinde EGFP y
LSL_{150} (Figura 6, calle 4) las cuales se resolvieron
posteriormente mediante cromatografía de penetrabilidad en Superdex
75 (Figura 6, calles 5 y 6, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El vector plasmídico pKLSLt-PLD
(Figura 7) fue construido insertando la fase de lectura abierta de
los primeros 846 nt del gen de la fosfolipasa dependiente de
esfingomielina (PLD) de la bacteria patógena Arcanobacterium
haemolyticum en el vector pKLSLt (Figura 4). El inserto se
obtuvo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando como molde el plásmido pJB31 (proporcionado por el Dr.
Stephen Billington del Department of Veterinary Science and
Microbiology, University of Arizona), así como oligonucleótidos
específicos que hibridan en la región inicial y final del gen PLD y
presentan en sus extremos las secuencias diana de las enzimas de
restricción EcoRI y HindIII respectivamente. Tras la
reacción, el fragmento obtenido y el vector pKLSLt, fueron
digeridos con las correspondientes enzimas de restricción,
purificados y ligados en presencia de la enzima T4 ligasa (Roche).
Posteriormente, se transformaron bacterias competentes con el
producto de la ligación y se seleccionó el plásmido recombinante
pKLSLt-PLD siguiendo procedimientos estándares de
clonaje (Sambrook y Russell;
2001).
2001).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células de E. coli (BL21
DE3) conteniendo el plásmido pKLSLt-PLD (Figura 7)
durante 3-4 horas a 37ºC en 1 L de medio LB
conteniendo kanamicina (50 \mug/mL), hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 0.6. En ese momento se induce la expresión de la
proteína LSL_{150}-PLD mediante la adición de 0.3
mM IPTG, tras lo cual se mantiene el cultivo a 16ºC durante 20
horas. Tras centrifugación a 4000 x g durante 15 min, las células se
separaron del medio de cultivo. El sedimento así obtenido se
resuspende en 25 ml de buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1 M
NaCl y 0.04% azida sódica. Con objeto de romper las células y
obtener un homogeneizado celular, el sedimento resuspendido se pasó
por una French press. La fracción soluble del homogeneizado celular
se obtiene mediante centrifugación a 20000 rpms en un rotor SS34
durante 30 minutos. Esta fracción soluble se aplicó en una columna
de Sepharose^{TM} 4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1 M NaCl y 0.04% azida
sódica y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con
el mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280
nm), se lleva a cabo la elución de LSL_{150}-PLD
mediante lavado de la matriz cromatográfica con el mismo buffer
anterior conteniendo lactosa 0.2 M (Figura 8). Las fracciones
conteniendo LSL_{150}-PLD se juntaron (Figura 8,
calle 3), concentrándose la proteína mediante ultrafiltración con
membranas YM-10 (Amicon). El tratamiento de esta
proteína con TEV proteasa en buffer 50 mM Tris, pH 8.0, con 200 mM
NaCl, 0.04% azida sódica (80:1; w/w), rinde PLD y LSL_{150}
(Figura 8, calle 4) las cuales se resolvieron posteriormente
mediante cromatografía de penetrabilidad en Superdex 75 (Figura 8,
calles 5 y 6, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El vector plasmídico pKLSLt-SMD
(Figura 9) fue construido insertando la fase de lectura abierta de
802 nt del gen de la fosfolipasa dependiente de esfingomielina del
microorganismo patógeno Corynebacterium pseudotuberculosis
(SMD) en el vector pKLSLt (Figura 4). El inserto se obtuvo mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como molde el
plásmido pJG90 (Tambourgi et al., 2002), así como
oligonucleótidos específicos que hibridan en la región inicial y
final del gen EGFP y presentan en sus extremos las secuencias diana
de las enzimas de restricción EcoRI y HindIII
respectivamente. Tras la reacción, el fragmento obtenido y el vector
pKLSLt, fueron digeridos con las correspondientes enzimas de
restricción, purificados y ligados en presencia de la enzima T4
ligasa (Roche). Posteriormente, se transformaron bacterias
competentes con el producto de la ligación y se seleccionó el
plásmido recombinante pKLSLt-SMD siguiendo
procedimientos estándares de clonaje (Sambrook y Russell;
2001).
2001).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células de E. coli (BL21
DE3) conteniendo el plásmido pKLSLt-SMD (Figura 9)
durante 3-4 horas a 37ºC en 1 L de medio LB
conteniendo kanamicina (50 \mug/mL), hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 0.6. En ese momento se induce la expresión de la
proteína LSL_{150}-SMD mediante la adición de 0.3
mM IPTG, tras lo cual se mantiene el cultivo a 16ºC durante 20
horas. Tras centrifugación a 4000 x g durante 15 min, las células se
separaron del medio de cultivo. El sedimento así obtenido se
resuspende en 25 ml de buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1 M
NaCl y 0.04% azida sódica. Con objeto de romper las células y
obtener un homogeneizado celular, el sedimento resuspendido se pasó
por una French press. La fracción soluble del homogeneizado celular
se obtiene mediante centrifugación a 20000 rpms en un rotor SS34
durante 30 minutos. Esta fracción soluble se aplicó en una columna
de Sepharose^{TM} 4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1 M NaCl y 0.04% azida sódica
y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con el
mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280 nm),
se lleva a cabo la elución de LSL_{150}-SMD
mediante lavado de la matriz cromatográfica con el mismo buffer
anterior conteniendo lactosa 0.2 M (Figura 10). Las fracciones
conteniendo LSL_{150}-SMD se juntaron (Figura 10,
calle 3), concentrándose la proteína mediante ultrafiltración con
membranas YM-10 (Amicon). El tratamiento de esta
proteína con TEV proteasa en buffer 50 mM Tris, pH 8.0, con 200 mM
NaCl, 0.04% azida sódica (80:1; w/w), rinde SMD y LSL_{150}
(Figura 10, calle 4) las cuales se resolvieron posteriormente
mediante cromatografía de penetrabilidad en Superdex 75 (Figura 10,
calles 5 y 6, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El vector plasmídico pKLSLt-CPL7
(Figura 11) fue construido insertando la fase de lectura abierta de
los primeros 1003 nt del gen de la proteína mureín hidrolasa CPL7
del bacteriófago Cp-7 de Streptococcus
pneumoniae en el vector pKLSLt (Figura 4). El inserto se obtuvo
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como
molde el plásmido pCP700 (García, P., García, JL., García, E.,
Sánchez-Puelles, J.M., López, R. (1990) Gene
86, 81-88), así como oligonucleótidos específicos
que hibridan en la región inicial y final del gen CPL7 y presentan
en sus extremos las secuencias diana de las enzimas de restricción
EcoRI y HindIII respectivamente. Tras la reacción, el
fragmento obtenido y el vector pKLSLt, fueron digeridos con las
correspondientes enzimas de restricción, purificados y ligados en
presencia de la enzima T4 ligasa (Roche). Posteriormente, se
transformaron bacterias competentes con el producto de la ligación
y se seleccionándose el plásmido recombinante
pKLSLt-CPL7 siguiendo procedimientos estándares de
clonaje (Sambrook y Russell; 2001).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células de E. coli (BL21
DE3) conteniendo el plásmido pKLSLt-CPL7 (Figura
11) durante 3-4 horas a 37ºC en 1 L de medio LB
conteniendo kanamicina (50 \mug/mL), hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 0.6. En ese momento se induce la expresión de la
proteína LSL_{150}-CPL7 mediante la adición de
0.3 mM IPTG, tras lo cual se mantiene el cultivo a 16ºC durante 20
horas. Tras centrifugación a 4000 x g durante 15 min, las células se
separaron del medio de cultivo. El sedimento así obtenido se
resuspende en 25 ml de buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1 M
NaCl y 0.04% azida sódica. Con objeto de romper las células y
obtener un homogeneizado celular, el sedimento resuspendido se pasó
por una French press. La fracción soluble del homogeneizado celular
se obtiene mediante centrifugación a 20000 rpms en un rotor SS34
durante 30 minutos. Esta fracción soluble se aplicó en una columna
de Sepharose^{TM} 4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1 M NaCl y 0.04% azida
sódica y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con
el mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280
nm), se lleva a cabo la elución de LSL_{150}-CPL7
mediante lavado de la matriz cromatográfica con el mismo buffer
anterior conteniendo lactosa 0.2 M (Figura 12). Las fracciones
conteniendo LSL_{150}-CPL7 se juntaron (Figura 12,
calle 3), concentrándose la proteína mediante ultrafiltración con
membranas YM-10 (Amicon). El tratamiento de esta
proteína con TEV proteasa en buffer 50 mM Tris, pH 8.0, con 200 mM
NaCl, 0.04% azida sódica (80:1; w/w), rinde CPL7 y LSL_{150}
(Figura 12, calle 4) las cuales se resolvieron posteriormente
mediante cromatografía de penetrabilidad en Superdex 75 (Figura 12,
calles 5 y 6, respectivamente).
\newpage
Ejemplo
6
El vector plasmídico
pKLSLt-IP5_2K (Figura 13) fue construido insertando
la fase de lectura abierta de los primeros 1353 nt del gen de la
proteína Inositol (1,3,4,5,6)-pentakisfosfato
quinasa de Arabidopsis thaliana en el vector pKLSLt (Figura
4). El inserto se obtuvo mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando como molde el plásmido pET28c
conteniendo el cDNA de IP5_2K (proporcionado por la Dr. Beatriz
González, Grupo de Cristalografía, Insto. Rocasolano, CSIC), así
como oligonucleótidos específicos que hibridan en la región inicial
y final del gen IP5_2K y presentan en sus extremos las secuencias
diana de las enzimas de restricción SacI y XhoI
respectivamente. Tras la reacción, el fragmento obtenido y el vector
pKLSLt, fueron digeridos con las correspondientes enzimas de
restricción, purificados y ligados en presencia de la enzima T4
ligasa (Roche). Posteriormente, se transformaron bacterias
competentes con el producto de la ligación, seleccionándose el
plásmido recombinante pKLSLt-IP5_2K siguiendo
procedimientos estándares de clonaje (Sambrook y Russell; 2001).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células de E. coli (BL21
DE3) conteniendo el plásmido pKLSLt-IP5_2K (Figura
13) durante 3-4 horas a 37ºC en 1 L de medio LB
conteniendo kanamicina (50 \mug/mL), hasta alcanzarse una
OD_{600\ nm} de 1. En ese momento se induce la expresión de la
proteína LSL_{150}-IP5_2K mediante la adición de
0.3 mM IPTG, tras lo cual se mantiene el cultivo a 16ºC durante 16
horas. Tras centrifugación a 4000 x g durante 15 min, las células se
separaron del medio de cultivo. El sedimento así obtenido se
resuspende en 25 ml de buffer 20 mM Tris, pH 8.0 conteniendo 0.1 M
NaCl y 0.04% azida sódica. Con objeto de romper las células y
obtener un homogeneizado celular, el sedimento resuspendido se pasó
por una French press. La fracción soluble del homogeneizado celular
se obtiene mediante centrifugación a 20000 rpm en un rotor SS34
durante 30 minutos. Esta fracción soluble se aplicó en una columna
de Sepharose^{TM} 4B, equilibrada previamente en buffer 20 mM
Tris-HCI, pH 8.0 con 0.1 M NaCl y 0.04% azida
sódica y mantenida a 4ºC. Tras lavado exhaustivo de la columna con
el mismo buffer (se alcanza línea base en mediciones de Abs 280
nm), se lleva a cabo la elución de
LSL_{150}-IP5_2K mediante lavado de la matriz
cromatográfica con el mismo buffer anterior conteniendo lactosa 0.2
M (Figura 14). Las fracciones conteniendo
LSL_{150}-IP5_2K se juntaron (Figura 14, calle 3),
concentrándose la proteína mediante ultrafiltración con membranas
YM-10 (Amicon). El tratamiento de esta proteína con
TEV proteasa en buffer 50 mM Tris, pH 8.0, con 200 mM NaCl, 0.04%
azida sódica (80:1; w/w), rinde IP5_2K y LSL_{150} (Figura 14,
calle 4) las cuales se resolvieron posteriormente mediante
cromatografía de penetrabilidad en Superdex 75 (Figura 14, calles
5).
A modo de comparación, IP5_2K se ha producido
como proteína de fusión con GST (GST-IP5_2K) y
purificado siguiendo protocolos estándar para esta etiqueta
afinidad/solubilidad (resultados no mostrados). Al igual que
LSL-IP5_2K, GST-IP5_2K fue tratada
con TEV proteasa, y posteriormente IP5_2K purificada mediante
cromatografía de penetrabilidad en Superdex 75. Los rendimientos
finales de ambas purificaciones llevadas a cabo en paralelo, en
condiciones experimentales esencialmente idénticas, fueron: 23
mg de IP5_2K partiendo de 4 litros de cultivo con el sistema basado
en LSL y de 3.2 mg con el basado en GST.
Claims (8)
1. Proteína de fusión recombinante
caracterizada porque comprende, al menos, una secuencia del
siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de aminoácidos del péptido LSL_{150} del hongo Laetiporus sulphureus (SEQ ID NO2), y
- b)
- una secuencia análoga a la SEQ ID NO2 de a).
2. Procedimiento de obtención de la proteína de
fusión según reivindicación 1 caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- i)
- Obtención de una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos de LSL_{150} (SEQ ID NO1) y la secuencia que codifica para la proteína o péptido de interés, y del vector de expresión que lo comprende,
- ii)
- Transformación de una célula huésped, preferentemente procariota, más preferentemente de Escherichia coli, en la que la construcción génica o el vector de expresión de i) bajo control de los promotores adecuados, permite la expresión de la proteína o péptido de fusión de interés, y purificación del extracto crudo de las células,
- iii)
- Inmovilización de la proteína o péptido de fusión en matrices derivadas de agarosa mediante el paso de extracto crudo de ii) a través de la matriz,
- iv)
- Disociación de la proteína o péptido de fusión de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio conteniendo uno o varios azúcares competidores,
y,
opcionalmente
- v)
- Separación del péptido SEQ ID NO2 de la proteína de fusión mediante tratamiento proteolítico adecuado.
3. Construcción genética codificante de la
secuencia de ADN codificante de la proteína de fusión según
reivindicación 1 caracterizada porque comprende, al menos,
una secuencia del siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de ADN SEQ ID NO1, y
- b)
- una secuencia homóloga a la SEQ ID NO1.
4. Construcción genética según reivindicación 3
caracterizada porque comprende cualquier otra secuencia de
nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que
permita el aislamiento, la detección o la secreción al exterior de
la célula del péptido expresado, por ejemplo, a título ilustrativo y
sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de
polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica reconocible por un
anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su identificación, o
cualquier otra que sirva para purificar la proteína de fusión
resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta
tales como c-myc, HA, E-tag).
5. Vector de expresión caracterizado
porque comprende una construcción genética según reivindicaciones 3
y 4 que permite la expresión de una proteína o péptido.
6. Vector de expresión según reivindicación 5
caracterizado porque el vector es un plásmido o un vector
viral.
7. Célula huésped caracterizada porque
comprende la construcción genética según reivindicaciones 3 y 4 o
el vector de expresión según reivindicaciones 5 y 6,
preferentemente una célula procariota.
8. Célula huésped según reivindicación 7
caracterizada porque está constituida por una célula E.
coli., preferentemente células E. coli BL21 DE3.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200800909A ES2327309B1 (es) | 2008-04-02 | 2008-04-02 | Proteinas de fusion con un dominio lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
| PCT/ES2009/070079 WO2009121994A1 (es) | 2008-04-02 | 2009-03-30 | Proteínas de fusión con un dominio lectina de tipo beta-trébol, procedimiento de obtención y sus aplicaciones |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200800909A ES2327309B1 (es) | 2008-04-02 | 2008-04-02 | Proteinas de fusion con un dominio lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
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|---|---|---|---|
| ES200800909A Expired - Fee Related ES2327309B1 (es) | 2008-04-02 | 2008-04-02 | Proteinas de fusion con un dominio lectina de tipo beta-trebol, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
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| WO1999066053A1 (en) * | 1998-06-16 | 1999-12-23 | Rmf Dictagene S.A. | Expression vector for use in a one-step purification protocol |
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- 2008-04-02 ES ES200800909A patent/ES2327309B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-30 WO PCT/ES2009/070079 patent/WO2009121994A1/es active Application Filing
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO1999066053A1 (en) * | 1998-06-16 | 1999-12-23 | Rmf Dictagene S.A. | Expression vector for use in a one-step purification protocol |
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