ES2326414T3 - Mss4 como una diana antifungica. - Google Patents

Abstract

Un método para cribar o someter a ensayo compuestos candidatos contra la especie Candida, que alteran la función de la enzima 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato MSS4 de C. albicans (MSS4), que comprende: a) proporcionar MSS4 de C. albicans; b) proporcionar uno o varios compuestos candidatos; c) poner en contacto dicha MSS4 con dicho o dichos compuestos candidatos; y d) determinar la interacción del compuesto candidato con dicha MSS4.

Description

MSS4 como una diana antifúngica.

La presente invención se refiere a una nueva diana antifúngica, 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato (MSS4), para el uso en métodos de cribado de inhibidores de MSS4. También se describe el uso de la misma como compuesto antifúngico, las composiciones farmacéuticas que la contienen y su uso en medicina, específicamente en el tratamiento de un individuo que es susceptible o padece una infección antifúngica. En particular, los compuestos se pueden emplear en el tratamiento de infecciones fúngicas tópicas o de la mucosa (p. ej., la candidosis bucal y vaginal), p. ej., causadas por hongos de la especie Candida, y de infecciones sistémicas, p. ej., las causadas por hongos de la especie Candida, tales como C. albicans.

Introducción Agentes patógenos fúngicos

Los agentes patógenos fúngicos principales incluyen los de la especie Candida, tales como C. albicans.

Las infecciones fúngicas pueden afectar a seres humanos y a animales. Generalmente, las infecciones fúngicas pueden aparecer como el resultado de una infección oportunista de un individuo debilitado o inmunosuprimido, y pueden incluir infecciones de las articulaciones y de la piel. La levadura Candida albicans (C. albicans) es uno de los agentes patógenos fúngicos más generalizados en los seres humanos. Es la causa de una carga económica y logística creciente sobre el sistema de asistencia sanitaria y sus centros. Aunque C. albicans es un miembro de la flora normal de las membranas mucosas en el tracto respiratorio, gastrointestinal y genital femenino, puede ir ganando preponderancia en tales lugares (p. ej., después del tratamiento con antibióticos antibacterianos, en pacientes con diabetes o en pacientes que emplean corticoesteroides) y estar asociada con estados patológicos. Además, casi todos los individuos que son positivos para VIH, padecen una infección con Candida antes del inicio del desarrollo del SIDA verdadero. La incidencia de las infecciones fúngicas peligrosas ha aumentado enormemente, ya que la población de individuos inmunodeprimidos (que incluye pacientes con cáncer, trasplante de órganos y con SIDA) ha crecido. Las opciones terapéuticas actuales para el tratamiento de estas infecciones son limitadas y por tanto existe una necesidad de nuevos compuestos antifúngicos con mecanismos de acción nuevos, para uso en el tratamiento o la prevención de tales infecciones fúngicas.

El desarrollo de fármacos antifúngicos depende frecuentemente del cribado de un gran número de compuestos, antes de que se encuentren uno o varios compuestos guías que sean eficaces contra los hongos diana. Por lo tanto, para el desarrollo de estos cribados, es decisivo definir proteínas esenciales para la supervivencia o el crecimiento de los hongos diana y descubrir medios de purificación o de producción de tales proteínas. Por ello, existe una necesidad en la técnica de identificar productos génicos fúngicos, estructurales o funcionales que sean esenciales y puedan servir como dianas para la mediación del fármaco, y para los métodos de identificación de agentes antifúngicos útiles, que alteren la función de estos productos génicos fúngicos esenciales, y composiciones que se pueden utilizar para tratar infecciones fúngicas para evitar o inhibir el crecimiento de los hongos y preferentemente destruirlos.

Identificación de genes esenciales

En la técnica se emplean diferentes definiciones de lo que constituye un gen esencial, pero la expresión se aplica con mayor frecuencia a los genes necesarios para el crecimiento sobre un medio rico. Esta variación en la técnica puede desorientar y ser restrictiva en lo que respecta a la identificación de productos génicos que constituyen dianas antifúngicas adecuadas. Una cantidad significativa de la información de la secuencia genómica de C. albicans está disponible en la base de datos pública (http://www.sequence.stanford.edu/group/candida) y en la base de datos privada (Incyte Genomics Inc.). Esto se puede combinar con datos de secuencias genómicas procedentes de otros organismos ("The yeast genome directory", 1997, Nature, 387(supl. 6632):5; Wood V. y col., 2002, Nature, 415(6874):871-80) y con datos de soporte tales como el perfil funcional del genoma de Saccharomyces cerevisiae (Giaever G. y col., 2002, Nature, 418(6896):387-91). Este enfoque impulsado por la bioinformática ha permitido la predicción de genes que pueden ser esenciales en C. albicans (Spaltmann F. y col., 1999, Drug Discovery Today, 4:17-26). Sin embargo, incluso en organismos que están relacionados de forma relativamente próxima, tales como Saccharomyces cerevisiae y C. albicans, existen unas diferencias significativas que hacen que estas predicciones in silico sean poco fidedignas. Por ejemplo, CET1 y CDC25 no son esenciales en C. albicans, a pesar de ser esenciales en Saccharomyces cerevisiae (Enloe B. y col., 2000, J. Bacteriol., Oct, 182:20, 5730-6; Dunyak DS y col., 2002, 6ª Conferencia ASM sobre Candida y Candidosis).

Existen diversas estrategias para identificar genes esenciales en C. albicans mediante metodología práctica. Enfoques negativos dependen de la incapacidad de generar una cepa que contenga un gen diana funcional destruido. La mayoría de los genes caracterizados de este modo, dependen de variaciones del método de chorro de URA (del inglés, "URA-blaster") (Fonzi, W.A. & Irwin, MY, 1993, Genetics, 134:717-728). Estas técnicas pueden ser muy eficaces para el análisis de genes individuales, pero no son completamente fiables. CET1 se presentó incorrectamente como que era esencial en C. albicans, ya que unos mutantes homocigotos viables no se podían recuperar empleando el método de chorro de URA (Pei, y col., 2001). Sin embargo, se ha mostrado posteriormente que no es esencial (Dunyak, y col., 2002). Los enfoques positivos controlan la expresión del gen diana indirectamente, por ejemplo, empleando ARN no codificante (De Backer MD, y col., 2001, Nat. Biotechnol., Mar, 19:3, 235-41), o directamente, por ejemplo, con una sustitución del promotor por promotores inducibles tales como MRP1 y Tet (Munro CA, y col., 2001, Mol. Microbiol., Mar 39:5 1414-26; Nakayama H. y col., 2000, Infect Immun, dec 68:12 6712-9).

La amplia identificación del genoma de genes esenciales no se ha aplicado con éxito a C. albicans por diversas razones. Estas incluyen que C. albicans es un organismo diploide y no es capaz de aparearse bajo circunstancias normales, y que existen algunos elementos transponibles funcionales. Los intentos para superar estas cuestiones empleando ARN no codificante y la interferencia del promotor, tuvieron un éxito limitado (De Backer y col., 2001). Por tanto, existe una necesidad en la técnica de validar los genes esenciales de especies de hongos, en particular la especie Candida, que se pueden emplear como dianas para el desarrollo de nuevos compuestos antifúngicos.

5-Quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato

La 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato (MSS4) E.C. 2.7.1.68 está implicada en el metabolismo del fosfato de inositol y actúa convirtiendo ATP + 4-fosfato de 1-fosfatidil-1D-mio-inositol \rightarrow ADP + 4,5-bisfosfato de 1-fosfatidil-1D-mio-inositol (PIP2) (Yoshida y col., 1994, Mol. Gen. Genet. 242, 631-640; Hairfield y col., 2002, Microbiology, 148(6), 1737-1746). La enzima MSS4 está codificada por el gen de MSS4 (YDR208W/YD8142A.05) y los detalles de la enzima fúngica se proporcionan con los números de entrada: P38994 en la base de datos Swiss Prot (http://ca.expasy.org) para S. cerevisiae; CA0623 en la base de datos de Candida del Instituto Pasteur (http://genolist.
pasteur.fr/CandidaDB/) que es una referencia cruzada con el marco de lectura abierta (ORF) de Stanford orf6.1660 (http://www.sequence.stanford.edu/group/candida/). Los sinónimos de MSS4 incluyen difosfoinositida-quinasa, quinasa PIP (PIP5K), PtdIns(4)P-5-quinasa y CaMSS4.3.

Homma K. y col., 1998, J. Biol. Chem., 273:25, 15779-15786 y Desrivieres S. Y col., 1988, J. Biol. Chem. 273:25, 15787-15793 describen el papel de MSS4 en la organización de la actina en S. cerevisiae.

CA-A-2309327 se refiere al descubrimiento de que la proteína PKA-R es esencial para la supervivencia de C. albicans y por tanto, que PKA-R constituye una diana celular para el desarrollo de sustancias anti-Candida.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que MSS4 es una proteína esencial para la especie de hongo Candida. Este descubrimiento muestra el potencial para desarrollar inhibidores fúngicos selectivos de MSS4, que pueden destruir organismos fúngicos invasores, a la vez que limitan en el hospedador cualquier efecto negativo. Antes de esta invención, MSS4 no se había considerado una diana diferencial para compuestos antifúngicos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de la 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato (de aquí en adelante, se denominará "MSS4") como diana para la terapia antifúngica, en particular, para la terapia antifúngica contra la especie Candida, en un método para cribar o someter a ensayo compuestos que sean potencialmente antifúngicos, p. ej., moléculas pequeñas, determinando si un agente candidato es capaz de inhibir específicamente la actividad fúngica de fosforilación mediante una interacción selectiva con MSS4. En esta memoria se describe la naturaleza esencial de MSS4 en C. albicans. Además, en esta memoria se describe el uso de ensayos basados en mecanismos con o sin el uso de un organismo eucarionte transformado con el gen de MSS4, bajo el control de un promotor heterólogo, para facilitar el descubrimiento de fármacos.

Adicionalmente, en esta memoria se describen composiciones inhibidoras de MSS4 y métodos para tratar infecciones fúngicas, p. ej., infecciones fúngicas con Candida, administrando a un hospedador que padece una infección fúngica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MSS4.

Definiciones

En el contexto de esta invención:

"Gen esencial" se define como un gen fúngico necesario para el crecimiento sobre un medio rico.

"Inhibidor de MSS4" se define como cualquier compuesto que altere la función de MSS4 en el hongo. Un compuesto que altera la función de MSS4 puede ser uno que module, p. ej., inhiba, la expresión o la actividad de MSS4, interaccione con MSS4 o que se una a MSS4. Además, un compuesto que modula la expresión de MSS4 puede interferir en la transcripción del gen que codifica MSS4 o en la traducción del ARNm que codifica MSS4 en los organismos diana. Se desearía que el compuesto muestre una especificidad hacia MSS4 del hongo frente a MSS4 del hospedador. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MSS4, es una que es suficiente para inhibir parcial o totalmente la actividad de fosforilación mediante MSS4, de los hongos patógenos.

"Fragmento" se define como una fragmento de un polipéptido de MSS4, p. ej., tal y como los que se proporcionan con los números de entrada P38994, CA0623, o Stanford orf6.1660, que tiene al menos 70%, más preferentemente tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de identidad con el polipéptido natural a lo largo de la longitud del fragmento y que tiene al menos diez aminoácidos de longitud. Un fragmento activo es uno que conserva la capacidad de permitir la función de la enzima MSS4.

"Fragmento que conserva la función" se define como una secuencia que codifica MSS4, en la que un residuo de aminoácido dado en el polipéptido, se ha cambiado sin alterar la conformación general y la función del polipéptido natural, incluyendo, pero sin estar limitado, la sustitución de un aminoácido con uno que tenga propiedades físicas y/o químicas similares (tal como, por ejemplo, la acidez, basicidad, hidrofobicidad, y similares) o polimorfismos.

"Proteína de fusión", a no ser que se especifique de otro modo, se define como un polipéptido de MSS4, un fragmento o un fragmento que conserva la función del mismo, fusionado a través de un enlace covalente (p. ej., un enlace peptídico), opcionalmente, en el extremo N-terminal o C-terminal, con una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o una porción de la misma; preferentemente, una porción con al menos una porción con 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). Preferentemente, el polipéptido o el fragmento del mismo está ligado con la otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante del polipéptido.

"Crecimiento" se define como el patrón de crecimiento normal de los hongos, es decir, el tiempo de duplicación de la célula durante la fase log de crecimiento. Por ejemplo, en medios ricos, C. albicans de tipo silvestre tiene un tiempo de duplicación de aproximadamente 60 minutos. El crecimiento de las células se puede medir con un seguimiento de la densidad óptica de las células en medio líquido, en donde una densidad óptica en aumento indica crecimiento. Alternativamente, el crecimiento también se puede medir mediante la formación de colonias a partir de células aisladas sobre placas con medio sólido.

"Viabilidad" se define como la capacidad de las células fúngicas para reanudar el crecimiento después de un tratamiento de las células que produce como resultado el cese del crecimiento. Una manera típica con la que se mide la viabilidad, es sometiendo a ensayo la capacidad de las células para formar colonias sobre placas con medio sólido.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona MSS4 de C. albicans como una diana específica para compuestos antifúngicos.

Los métodos de la invención proporcionan un ensayo sencillo y específico para cribar compuestos que sean compuestos potencialmente antifúngicos contra a la especie Candida.

Por tanto, la invención proporciona un método para cribar o someter a ensayo compuestos candidatos contra la especie Candida que alteren la función de la enzima MSS4 de C. albicans, 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato (MSS4), que comprende:

a) proporcionar MSS4 de C. albicans;

b) proporcionar uno o varios compuestos candidatos;

c) poner en contacto dicha MSS4 con dicho o dichos compuestos candidatos; y

d) determinar la interacción del compuesto candidato con dicha MSS4.

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El método de cribado de la invención se puede realizar empleando técnicas conocidas en la materia, p. ej., el ensayo puede comprender un ensayo de inhibición del crecimiento, un ensayo de ligación o un ensayo de inhibición de la traducción. Los ensayos de ligación incluyen los ensayos de ligación competitiva, en donde la afinidad de la unión del compuesto candidato se compara con la de un sustrato enzimático conocido para MSS4, un sustrato enzimático preferido de la enzima es la adenosina-trifosfato (ATP).

En los métodos de cribado de la invención, el compuesto candidato o el sustrato enzimático se puede marcar para permitir una cuantificación sencilla de la interacción entre el compuesto candidato y la enzima. Preferentemente, el sustrato se marca, p. ej., empleando un radiomarcador, tal como ^{32}P, pero sin estar limitado al mismo, y el sustrato preferido es adenosina-trifosfato (ATP), tal y como se describe en el Ejemplo 3.

MSS4 se puede clonar o purificar a partir de los hongos para el uso en ensayos de ligación in vitro, de ligación de ligando o de inhibición de la traducción. La MSS4 procede de C. albicans, un agente patógeno de humanos y de animales. En una realización particular, MSS4 puede comprender un fragmento, una variante conservadora de la función, un fragmento activo o una proteína de fusión de MSS4.

La MSS4 se puede purificar por técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos para la purificación de polipéptidos incluyen, sin limitación, la electroforesis preparativa de disco en gel, el enfoque isoeléctrico, la HPLC, la HPLC de fase inversa, la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de partición, y la distribución a contracorriente. Para algunos fines, es preferible producir el polipéptido en un sistema recombinante, en el que la proteína contenga una secuencia de marcador adicional que facilite la purificación, tal como una secuencia de polihistidina, pero sin estar limitada a la misma. El polipéptido se puede purificar a continuación a partir de un material lisado bruto de la célula hospedadora, mediante cromatografía sobre una matriz en fase sólida adecuada. Alternativamente, los anticuerpos producidos contra la proteína de la diana fúngica o contra péptidos obtenidos a partir de la misma, se pueden utilizar como reactivos de purificación.

La MSS4 también se puede proporcionar en un organismo eucarionte transformado, bajo el control de un promotor heterólogo. Tales células se pueden utilizar en ensayos de inhibición del crecimiento. El organismo eucarionte es C. albicans. Resumiendo, se genera una cepa de C. albicans en la que la expresión del gen de MSS4 se puede regular de forma estricta. Para ello, el alelo de tipo silvestre del gen de interés se sustituye por un alelo que se puede regular con un agente exógeno. En general, las manipulaciones del ácido nucleico y otras técnicas relacionadas empleadas en la puesta en práctica de la presente invención, emplean métodos que son bien conocidos en la técnica, tal y como se describe, p. ej., en "Molecular Cloning. A Laboratory Manua" (2ª ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor) y "Current Protocols in Molecular Biology" (compiladores Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith y Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY, NY, 1997).

Por tanto, la invención también proporciona una(s) célula(s) eucariótica(s) modificada(s) de C. albicans, en donde la(s) célula(s) expresa MSS4 de C. albicans bajo el control de un promotor heterólogo. En una realización, la MSS4 puede ser heteróloga u homóloga. Preferentemente, la MSS4 es homóloga.

La célula eucariótica es C. albicans.

En una realización preferida, MSS4 se puede expresar en un sistema de expresión regulable con tetraciclina (tal y como se describe en el Ejemplo 4). El sistema de expresión regulable con tetraciclina es una herramienta establecida para la expresión condicional de genes eucarióticos (Gossen, MA, & H Bujard, 1922, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Nagahashi S. y col., 1997, Mol. Gen. Genet, 255: 372-375; Nakayama H., y col., 1998, Microbiology, 144:2407-2415; Nakayama H y col., 2000, Infect Immun, dec. 68:12 6712-9). Un sistema tal consta de dos componentes obtenidos a partir del transposón Tn10 de Escherichia coli (Hillen W, & A Wissman, 1989, en "Protein-nucleic acid interaction", vol. 10, Macmillan Press, Londres, Reino Unido, págs. 143-162). El primer componente comprende un elemento mínimo de promotor, aguas abajo de una secuencia de operador de tetraciclina (tetO), que sustituye al promotor natural del gen diana. El segundo componente es un transactivador, que es una proteína de fusión que comprende un dominio de activación transcripcional y la proteína represora de tetraciclina (TetR).

En ausencia de tetraciclina, TetR se une específicamente a tetO como un dímero, dando como resultado la activación de la transcripción mediante la incorporación del transactivador para el promotor. Cuando está presente la tetraciclina, se une al represor TetR con alta afinidad e inhibe la dimerización, evitando de este modo la unión a tetO. De este modo, la expresión del gen de MSS4 se activa en ausencia de tetraciclina y se inhibe en presencia de tetraciclina. Un derivado sintético de la tetraciclina, tal como doxiciclina, pero sin estar limitado al mismo, se puede utilizar para controlar la expresión del gen de MSS4 tal y como se ha descrito anteriormente.

El sistema de expresión regulable con tetraciclina tiene diversas ventajas sobre sistemas alternativos. Se obtuvo a partir de un sistema procarionte, de modo que no se mostraran efectos pleyotrópicos (Gossen y Bujard, 1992), se puede utilizar en un hospedador animal (Nakayama H. y col., 1998, Microbiology, 144:2407-2415; Nakayama H. y col., 2000, Infect. Immun., dec. 68:12 6712-9), es altamente específico y no es tóxico.

Tales células modificadas se pueden utilizar en métodos de cribado. Por tanto, la invención también proporciona un método para cribar o someter a ensayo compuestos candidatos contra la especie Candida, que alteran la función de la enzima 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato MSS4 de C. albicans, que comprende:

a) proporcionar MSS4 de C. albicans en una(s) célula(s) eucariótica de C. albicans que expresa MSS4 de C. albicans, bajo el control de un promotor heterólogo;

b) proporcionar uno o varios compuestos candidatos;

c) poner en contacto dicha(s) célula(s) eucariótica(s) dicho o dichos compuestos candidatos; y

d) determinar la interacción del compuesto candidato con dicha MSS4, determinando el efecto sobre el crecimiento o la viabilidad de dichas células.

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Los métodos de cribado de la invención incluyen métodos in vitro y métodos in vivo. Los compuestos candidatos que se pueden cribar según los métodos de la invención, incluyen moléculas y péptidos pequeños. Los compuestos candidatos pueden ser compuestos sintéticos, una mezcla de compuestos sintéticos, una preparación en bruto, una preparación purificada o un extracto inicial de un producto natural obtenido a partir de fuentes vegetales, animales, o de un microorganismo.

Un compuesto identificado mediante los métodos de cribado descritos anteriormente, que altera la función de MSS4 de C. albicans, se denomina en esta memoria, un "inhibidor de MSS4".

Los inhibidores de MSS4 identificados con los métodos de cribado de la invención, son útiles como compuestos antifúngicos. Por tanto, se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de diversas infecciones fúngicas, tales como infecciones fúngicas tópicas o de las mucosas (p. ej., la candidosis bucal y vaginal), causadas por hongos de la especie Candida, e infecciones fúngicas sistémicas, causadas por la especie Candida, tal como C. albicans.

El medicamento identificado mediante los métodos de cribado de esta invención se puede utilizar en el tratamiento profiláctico o curativo de infecciones fúngicas en humanos y en animales, especialmente animales domésticos tales como perros, gatos, caballos, etc.

Además, los inhibidores de MSS4 identificados con los métodos de cribado de esta invención también se pueden utilizar en el tratamiento curativo o profiláctico de infecciones fúngicas en personas que están inmunosuprimidas, a causa, p. ej., de una terapia (p. ej., quimioterapia o radioterapia), un trasplante de órganos o una infección (p. ej., VIH).

Para emplear los inhibidores de MSS4 en la terapia (humana o veterinaria), se formularán generalmente en una composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, p. ej., incorporando por mezcla el inhibidor de MSS4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas son particularmente útiles en la prevención o en el tratamiento de infecciones fúngicas con Candida.

Los inhibidores de MSS4 se pueden administrar a un hospedador mediante cualquiera de las vías que se emplean convencionalmente para la administración de fármacos, por ejemplo, se pueden administrar por vía parenteral, oral, tópica (que incluye bucal, sublingual o transdérmica) o por inhalación. La vía más adecuada para la administración dependerá en cualquier caso del inhibidor de MSS4 en particular, del organismo infeccioso implicado, del hospedador y de la naturaleza o la gravedad de la enfermedad y del estado físico del hospedador.

Los inhibidores de MSS4 se pueden administrar en combinación, p. ej., de forma simultánea, secuencial o separada, con uno o varios de los compuestos terapéuticamente activos, p. ej., compuestos antifúngicos.

La dosificación que se va a administrar de un inhibidor de MSS4 variará según el inhibidor de MSS4 en particular, el organismo infeccioso implicado, el hospedador, la gravedad de la enfermedad, el estado físico del hospedador y la vía seleccionada de administración, la dosificación adecuada la puede determinar fácilmente una persona experta en la técnica. Para el tratamiento de enfermedades fúngicas en humanos y en animales, la dosificación puede estar en el intervalo desde 0,01 mg/kg hasta 750 mg/kg. Para el uso profiláctico en seres humanos y animales, la dosificación puede estar en el intervalo desde 0,01 mg/kg hasta 100 mg/kg.

Las composiciones pueden contener desde 0,1% en peso, preferentemente desde 10-60% en peso del inhibidor de MSS4, dependiendo del método de administración.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar de forma conveniente en forma de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de inhibidor de MSS4 por dosis. Una unidad tal puede contener a modo de ejemplo, pero sin limitación, de 100 mg/kg hasta 0,1 mg/kg, dependiendo del estado que se está tratando, la vía de administración y la edad, el peso y el estado del hospedador. Las composiciones para dosificación unitaria preferidas, son las que contienen una dosis o subdosis diaria, tal y como se ha indicado anteriormente, o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente activo.

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciado de las dosificaciones individuales se determinarán según la naturaleza y el grado del estado que se está tratando, la forma, la vía y el sitio de administración, y el hospedador particular que se está tratando, y que tales valores óptimos se pueden determinar por técnicas convencionales. También apreciará un experto en la técnica que el curso óptimo del tratamiento, es decir, el número de dosis dadas por día, durante una cantidad de días definida, lo puede establecer un experto en la técnica, empleando un curso convencional de ensayos para determinar el tratamiento.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar una inyección intravenosa rápida, se pueden administrar varias dosis divididas durante un tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente, según sea lo indicado para las exigencias de la situación terapéutica.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden tener una amplia variedad de formas, dependiendo, p. ej., de la vía de administración.

Las composiciones para la administración oral pueden ser líquidas o sólidas. Las preparaciones líquidas orales pueden ser en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado, antes del uso. Las preparaciones orales líquidas pueden contener agentes de suspensión, por ejemplo, sorbitol, metil celulosa, jarabe de glucosa, gelatina, hidroxietil celulosa, carboximetil celulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo, lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga; agua; se pueden utilizar vehículos no acuosos (que pueden incluir grasas comestibles), por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos tales como glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo, o ácido sórbico; agentes saboreantes, agentes conservantes, agentes colorantes y similares.

En el caso de preparaciones orales sólidas, tales como polvos, cápsulas y comprimidos, se pueden incluir vehículos tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes y similares. Gracias a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan la unidad de dosificación oral más ventajosa, en la que se emplean generalmente vehículos sólidos farmacéuticos. Además de las formas de dosificación comunes descritas anteriormente, los inhibidores de MSS4 también se pueden administrar mediante medios de liberación controlada y/o dispositivos de entrega. Los comprimidos y las cápsulas pueden comprender vehículos convencionales o excipientes tales como agentes aglutinantes, por ejemplo, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo, lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina; agentes lubricantes de comprimidos, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o sílice; agentes disgregantes, por ejemplo, almidón de patata; o agentes humectantes aceptables, tales como lauril-sulfato sódico. Los comprimidos se pueden revestir mediante técnicas convencionales acuosas o no acuosas según métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos, conteniendo cada una, una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como polvo o gránulos, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite-en-agua o una emulsión de agua-en-aceite. Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos farmacéuticos, pero todos los métodos incluyen la etapa de producir la asociación del ingrediente activo con el vehículo, lo que constituye uno o varios ingredientes más necesarios. En general, las composiciones se preparan incorporando por mezcla de forma uniforme e íntima, el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si es necesario, dando forma al producto para tener la presentación deseada. Por ejemplo, se puede preparar un comprimido por compresión o moldeando, opcionalmente con uno o varios ingredientes accesorios.

Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo, en una máquina adecuada, el ingrediente activo en una forma de flujo libre, tal como polvo o gránulos, mezclados opcionalmente con un agente aglutinante, lubricante, diluyente inerte, tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo, humedecido con un diluyente líquido inerte. De forma deseable, cada comprimido contiene desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo y cada oblea o cápsula contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo.

Las composiciones que comprenden un inhibidor de MSS4 se pueden preparar también en forma concentrada en polvo o líquida. Los excipientes solubles en agua convencionales, tales como lactosa o sacarosa, se pueden incorporar en los polvos para mejorar sus propiedades físicas. Por tanto, los polvos particularmente adecuados comprenden de 50 a 100% en p/p, y preferentemente de 60 a 80% en p/p de la combinación y de 0 a 50% en p/p y preferentemente de 20 a 40% en p/p de excipientes convencionales. Cuando se emplean en un ámbito veterinario, tales polvos se pueden añadir a los alimentos animales, por ejemplo, en forma de una mezcla previa intermedia, o diluidos en el agua para beber del animal.

Los concentrados líquidos para la administración oral, contienen de forma adecuada una combinación de un compuesto hidrosoluble y puede incluir opcionalmente un disolvente miscible en agua farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol, glicerol formal o un disolvente tal mezclado con hasta 30% de v/v de etanol.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración por vía parenteral se pueden preparar como soluciones o suspensiones de inhibidores de MSS4 en agua, mezcladas de forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones se pueden preparar también en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable, incluyen soluciones para inyectar, estériles, acuosas o no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que vuelven la composición isotónica con la sangre del receptor deseado, y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las soluciones, las dispersiones y las suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Las composiciones se pueden presentar en recipientes para una dosis unitaria o para dosis múltiples, por ejemplo, en ampollas y frascos sellados y para mejorar la estabilidad, se pueden almacenar en un estado liofilizado que sólo requiera la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para las inyecciones, inmediatamente antes del uso. El vehículo líquido estéril se puede suministrar en un frasco o en una ampolla separada y puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. De forma ventajosa, agentes tales como un anestésico local, un agente conservante y tamponador, pueden estar incluidos en el vehículo líquido estéril.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica, se pueden formular como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, vendajes impregnados, pulverizaciones, aerosoles o aceites, dispositivos transdérmicos, polvos en seco, y similares. Estas composiciones se pueden preparar mediante métodos convencionales que contienen el ingrediente activo. Por tanto, también pueden comprender vehículos y aditivos convencionales compatibles, tales como agentes conservantes, diluyentes para facilitar la penetración del fármaco, emolientes en cremas o ungüentos y etanol o oleil-alcohol para lociones. Tales vehículos pueden estar presentes desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 98% de la composición. Generalmente, formarán hasta aproximadamente 80% de la composición. A modo de ilustración, una crema o un ungüento se prepara mezclando cantidades suficientes de material hidrófilo y agua, que contiene desde aproximadamente 5-10% en peso del compuesto, en cantidad suficiente para producir una crema o un ungüento que tenga la consistencia deseada.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración por vía transdérmica se pueden presentar como parches discretos, para que permanezcan en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede suministrar desde el parche mediante iontoforesis.

Para las aplicaciones a tejidos externos, por ejemplo, la boca y la piel, las composiciones se aplican preferentemente como un ungüento o una crema tópica. Cuando se formulan como un ungüento, el ingrediente activo se puede emplear con una base de ungüento parafínico o miscible en agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular en forma de crema con una base de crema de aceite-en-agua o una base de agua-en-aceite.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por vía tópica en la boca, incluyen pastillas para chupar, pastillas y lavados bucales.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración tópica en el ojo, incluyen gotas oculares en donde el ingrediente activo se disuelve o se suspende en un vehículo aceptable, especialmente un disolvente acuoso. También incluyen cremas o ungüentos tópicos como los anteriores.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal en las que el vehículo es un sólido, se presentan más preferentemente como supositorios para dosis unitaria. Los vehículos adecuados incluyen manteca de coco u otro glicérido o materiales empleados normalmente en la técnica, y los supositorios se pueden formar convenientemente mediante adición por mezcla de la combinación con el(los) vehículo(s) ablandado(s) o fundido(s), seguido de enfriamiento rápido y moldeado. También se pueden administrar como enemas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por vía vaginal, se pueden presentar como supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o composiciones pulverizadas. Estas pueden comprender emolientes o bases, tal y como se emplean generalmente en la técnica.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y de ningún modo una limitación del alcance de la invención. La memoria descriptiva se refiere a la figura en la que:

Figura 1: Esta muestra el crecimiento en fase sólida de una cepa recombinante de C. albicans, en la que el gen de MSS4 está bajo la regulación de un promotor que se puede inhibir con tetraciclina. Las imágenes representan el crecimiento de dos días a 30ºC sobre placas SC-U sin suplemento (-DOX), o suplementadas con un análogo de tetraciclina, doxiciclina 20 \mug/ml (+DOX). Se observa el efecto de la fuerte inducción o la represión ajustada de la expresión del gen de MSS4 sobre la formación de colonias, en ausencia y en presencia de doxiciclina, respectivamente.

Figura 2: Esta muestra el crecimiento en la fase líquida de una cepa recombinante de C. albicans, en la que el gen de MSS4 está bajo la regulación de un promotor que se puede inhibir con tetraciclina. El crecimiento en un medio YEPD a 25ºC, sin suplemento (-DOX, \blacklozenge \pm S.D.), o con suplemento de un análogo de tetraciclina, doxiciclina 20 \mug/ml (+DOX, \Box \pm S.D.). Se observa el efecto de la fuerte inducción o la represión ajustada de la expresión del gen de MSS4 sobre el crecimiento, en ausencia y en presencia de doxiciclina, respectivamente.

Figura 3: Esta muestra la tasa de supervivencia de ratones infectados con la cepa recombinante de C. albicans, en la que el gen de MSS4 está bajo la regulación de un promotor que se puede inhibir con tetraciclina. Tal y como se indica, se administró a los ratones agua (testigo \blacklozenge) o 2 mg/ml de un análogo de tetraciclina, doxiciclina, disuelto en una solución de sacarosa al 5% (+DOX, \Box) como agua para beber. En las condiciones en las que se expresaba el gen de MSS4 (testigo), C. albicans era capaz de afectar a la tasa de supervivencia de los ratones, mientras que bajo las condiciones en las que la expresión de MSS4 estaba inhibida (es decir, en presencia de doxiciclina), C. albicans era incapaz de impactar sobre la tasa de supervivencia de los ratones.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión de MSS4

El ORF de MSS4 de clonó en pGex-6P-1 (Pharmacia Biotech) para permitir la expresión como una proteína de fusión 5' GST. Los hospedadores E. coli empleados eran Tuner(DE3)pLysS (Novagen). E. coli en la que se recogió el plásmido de expresión, se hizo crecer a 37ºC hasta la fase semilogarítmica (DO600= 0,6), a continuación se enfrió a 17ºC y se indujo con IPTG (0,3 mM) durante aproximadamente 4 h.

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Ejemplo 2 Purificación de MSS4

Las células de E. coli procedentes de 5 L de cultivo se recogieron por centrifugación a 6000 x g durante 10 min. Los sedimentos celulares se congelaron a -80ºC, se descongelaron y se resuspendieron en 150 ml de tampón A (Hepes 20 mM (pH 7,4), DTT 5 mM, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 10% (v/v) de glicerol, 0,02% (p/v) de azuro sódico y una mezcla de inhibidor de proteasa que consistía en benzamidina 1 mM, 1 mg/ml de pepstatina, de antipaína y de leupeptina, PMSF 0,2 mM, Complete (Roche) y una mezcla de inhibidor de proteasa general (Sigma).

El extracto se sometió a ultrasonidos en ráfagas de 3x10 s para reducir la viscosidad. Se añadió Triton X-100 hasta tener 1%, seguido de centrifugación a 75.000 x g durante 10 min. El material sobrenadante se cargó por tandas sobre 5 ml de Sefarosa glutatión (Amershan Biosciences) a 4ºC. La resina se lavó a fondo por tandas con tampón fosfato que contenía NaCl 0,5 M, a continuación con tampón B (Hepes 20 mM (pH 7,4) DTT 1 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, 10% de glicerol, 0,02% de azuro sódico). La resina se empaquetó a continuación en una columna PD-10 desechable. MSS4 se separó de GST incubando lechos de de Sefarosa glutatión con 1 volumen de columna de tampón B que contenía 300 U de proteasa Precision (Amersham Biosciences), durante una noche a 4ºC con rotación constante. MSS4 se recuperó por centrifugación de la columna PD-10 (500 x g) seguido de lavado de la columna con tampón B.

Las fracciones que contenían MSS4 se reunieron y se concentraron hasta obtener 2 ml, empleando un filtro Vivaspin 6 con un punto de corte de membrana de 10 K (Vivascience). La proteína se aplicó sobre una columna 26/10 de Superdex 200, ligada a un sistema FPLC de AKTA (Amersham Biosciences) y se recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones eluidas que contenían MSS4 se recogieron, se concentraron y se diluyeron 10 veces con tampón sin NaCl y se aplicaron a una columna Mono Q (HR5/5) ligada a un sistema de FPLC de AKTA (Amersham Biosciences). La MSS4 se eluyó empleando un gradiente lineal de 0-500 mM de NaCl y se eluyó en aproximadamente 25-350 mM de NaCl.

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Ejemplo 3 Ensayo de MSS4

El ensayo de la 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato se basa en el método de Desrivieres S. y col., (1998, J. Biol. Chem., 273(25) 15787-93). Los lípidos secos se someten a ultrasonidos en 174 \mul de tampón de ensayo (HEPES 25 mM, pH 7,4, a 25ºC, MgCl 2 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 1 mM, \beta-glicerofosfato 5 mM, ditiotreitol 1 mM y NaCl 120 mM) para proporcionar una concentración final en el ensayo de fosfatidilinositol-4-fosfato 100 mM y fosfatidilserina 300 mM. La MSS4 purificada se añade al ensayo (4 \mul) y las reacciones comienzan con la adición de 20 \mul de tampón del ensayo que contiene [\gamma^{33}P]-ATP 0,04 MBq y ATP 100 \muM. Las actividades quinasa se someten a ensayo a 30ºC durante 30 min. Las reacciones se detienen añadiendo 750 \mul de cloroformo:metanol (1:2). Los lípidos se extraen a continuación añadiendo 200 \mul de HCl 2,4 M y 900 \mul de cloroformo. La fase inferior se lava dos veces con 1 ml de fase superior (HCl:cloroformo:metanol (47:3:48)). El \gamma^{33}P incorporado se mide a continuación transfiriendo 750 \mul de la fase inferior a un frasco para centelleo, secando bajo nitrógeno, añadiendo 2 ml de mezcla para centelleo y haciendo el recuento en un contador de centelleo de Beckman.

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Ejemplo 4 MSS4 como un producto génico esencial 4.1 Construcción del sistema de expresión regulable con tetraciclina

C. albicans CAl8 se empleó como la cepa parental para todas las manipulaciones. La cepa parental se construyó para expresar constitutivamente un transactivador de tetraciclina mejorado con codón, que constaba de TetR fusionado con el dominio vírico de activación de la transcripción de VP16 (Gari E. y col., 1997, Yeast, 13:837-848), procedente del promotor cromosómico de la enolasa (Mason y col., 1993, J. Bacteriol., 175:2632-2639). Una copia del gen diana, MSS4, se destruyó en la cepa que expresaba el transactivador, empleando el método convencional de chorro de URA (Fonzi WA & Irwin MY, 1993, Genetics, 134:717-728). La región del promotor del otro alelo de MSS4, se sustituyó a continuación con el elemento mínimo del promotor que contenía la secuencia del operador de tetraciclina tetO. Tanto in vivo como in vitro, este sistema permite una fuerte inducción y una represión estrecha de la expresión del gen MSS4, en ausencia y en presencia, respectivamente, del análogo de tetraciclina, doxiciclina.

4.2 Experimentos de validación in vitro

La naturaleza esencial de MSS4 se determinó determinando el crecimiento y la viabilidad de la cepa de C. albicans modificada para incluir un sistema de expresión de MSS4 regulable con tetraciclina, tal y como se ha descrito anteriormente (sección 4.1). Una colonia nueva, aislada (que crecía a 30ºC en medio rico en ausencia de tetraciclina) se empleó para hacer surcos en placas nuevas que contenían un medio completo sintético, sin uracilo (SC-U) (Qbiogene), más 2% de agar, con o sin 20 \mug/ml de doxiciclina, tal y como se ha indicado. El crecimiento se puntuó después de 2 días a 30ºC (Figura 1). Se observaron muy pocas colonias con las condiciones en las que la expresión de MSS4 estaba inhibida (es decir, en presencia de doxiciclina).

El crecimiento tetraciclina de la cepa de C. albicans con el sistema de expresión de MSS4 regulable con en medio YEPD líquido, también se determinó. El inóculo era una dilución 1:100 de un cultivo durante una noche ajustado con PBS hasta una densidad óptica de 600 nm = 1 y se almacenó a 4ºC. El crecimiento a 25ºC, con o sin 20 \mug/ml de doxiciclina, se midió a intervalos de 30 minutos, durante un periodo de tiempo de 43 h o hasta que el crecimiento había alcanzado claramente un nivel estable. Las curvas de crecimiento se registraron en placas de 96 pocillos en un lector de placas Wallac (600 nm, fase calentada a 25ºC, patrón de agitación orbital de 2 mm) (Figura 2). De nuevo, se observó un crecimiento reducido significativamente, bajo las condiciones en las que se inhibía la expresión de MSS4 (es decir, en presencia de doxiciclina).

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Ejemplo 5 MSS4 como producto génico esencial: experimento de validación in vivo - modelo en múrido de la infección sistémica con mutantes condicionales de C. albicans

Se han descrito diversos modelos animales reproducibles, incluyendo los de candidosis vaginal y oral de rata (Calderone RA & Braun PC, 1991, Microbiol. Rev., 55:1-20). Sin embargo, el modelo usado más generalmente es el modelo de múrido de candidosis diseminada, inoculada hematógena (Ghannoum MA y col., 1995, Infect. Immun., 63:4528-4530). En el modelo diseminado de múrido, se inocula una sola dosis de organismo a través de la vena de la cola. Los criterios de valoración para este modelo son la supervivencia de los animales y el recuento en tejido de C. albicans (generalmente los riñones).

Para validar adicionalmente la naturaleza esencial del gen de MSS4, los mutantes condicionales de las cepas de C. albicans (tal y como se han descrito en el ejemplo 4, sección 4.1), en donde el gen de MSS4 está bajo el control de un promotor que se puede inhibir con tetraciclina, se sometieron a ensayo para determinar si estaban atenuados en un modelo de infección de múrido inmunocompetente (Ghannoum y col., 1985) del modo siguiente:

Inicialmente, se dejaron crecer los organismos en ausencia de DOX, puesto que bajo esas condiciones se podía expresar el gen de MSS4. Estos organismos se emplearon a continuación para inocular dos grupos de 12 ratones. Un grupo se trató con DOX, en donde se había inhibido la expresión del gen de MSS4, y el segundo grupo de ratones se trató con agua (testigo), en donde el gen seguía expresándose. Los ratones empleados eran ratones BALB/c de un solo sexo, Harlan, con cuatro semanas de edad y un peso entre 19-22 g.

Las dosis infecciosas de C. albicans se inyectaron en la vena de la cola. Los inóculos eran de cultivos nuevos en fase estacionaria, lavados con solución salina, en medio NGY [0,1% de neopeptona, 0,4% de glucosa, 0,1% de extracto de levadura] durante 18-24 h a 30ºC. Las levaduras que crecían de este modo tenían un recuento viable de 2 x 10^{7} UFC/ml \pm 0,3 x 10^{7} UFC/ml y se podían ajustar fácilmente a la concentración deseada con solución salina. La concentración se comprobó por espectrofotometría y se verificó mediante recuento de células viables. El volumen inyectado era el mismo frente a las dosis. Se empleó una dosis infectiva de 1 x 10^{6} UFC/ratón. Esta dosis infectiva se había observado anteriormente que proporcionaba un tiempo medio de supervivencia de 5-7 días en los ratones BALB/c.

Los animales comieron y bebieron ad libitum durante el curso del experimento. En el grupo tratado con DOX (+DOX), a los ratones se les administró DOX (2 mg/ml) disuelta en solución de sacarosa al 5% en el agua de beber, desde dos días antes de la inoculación con células de C. albicans. Se sabe que los ratones beben aproximadamente 5 ml de solución de sacarosa cada día. Bajo este régimen, las concentraciones de DOX en suero, hígado y riñones se mantienen en más de 2 mg/ml en el suero, 8 mg/ml en el hígado y 10 mg/g en el riñón, respectivamente (Nakayama, H. y col., 1998, Microbiology 144:2407-2415). El porcentaje de supervivencia se vigiló durante 28 días, pesando diariamente los ratones. Las diferencias entre los efectos de C. albicans con el gen de MSS4 activo (-DOX) o inhibido (+DOX), in vivo, se vigilaron a través de la cantidad de ratones supervivientes (véase la Figura 3), de las cargas renales de hongos viables, y de los cambios en el peso corporal en relación con la línea basal.

El recuento renal (recuento de unidades formadoras de colonia por gramo de tejido renal) para el grupo (+DOX), estaba significativamente reducido, comparado con el grupo testigo (-DOX) y estos ratones también mantenían su peso durante el curso del estudio.

Claims (6)

1. Un método para cribar o someter a ensayo compuestos candidatos contra la especie Candida, que alteran la función de la enzima 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato MSS4 de C. albicans (MSS4), que comprende:

a) proporcionar MSS4 de C. albicans;

b) proporcionar uno o varios compuestos candidatos;

c) poner en contacto dicha MSS4 con dicho o dichos compuestos candidatos; y

d) determinar la interacción del compuesto candidato con dicha MSS4.

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2. Un método según la reivindicación 1, en el que la MSS4 de C. albicans comprende un fragmento, una variante conservadora de la función, un fragmento activo o una proteína de fusión de MSS4.

3. Una(s) célula(s) de C. albicans eucariótica(s) modificada(s) y, en donde la(s) célula(s) expresa MSS4 de C. albicans bajo el control de un promotor heterólogo.

4. La célula según la reivindicación 3, en la que la MSS4 es homóloga.

5. La célula según la reivindicación 3, en la que MSS4 comprende un fragmento, una variante conservadora de la función, un fragmento activo o una proteína de fusión de MSS4.

6. Un método para cribar o someter a ensayo compuestos candidatos contra la especie Candida, que alteran la función de la enzima 5-quinasa de 1-fosfatidilinositol-4-fosfato MSS4 de C. albicans (MSS4), que comprende:

a) proporcionar MSS4 de C. albicans en una(s) célula(s) eucariótica, tal y como se ha definido en la reivindicación 3 ó 4;

b) proporcionar uno o varios compuestos candidatos;

c) poner en contacto dicha(s) célula(s) eucariótica(s) con dicho o dichos compuestos candidatos; y

d) determinar la interacción del compuesto candidato con dicha MSS4, determinando el efecto sobre el crecimiento o la viabilidad de dichas células.