ES2325882T3 - Formulaciones de toxina botulinica para administracion oral. - Google Patents

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Abstract

Una formulación oral de toxina botulínica en forma sólida, que comprende: (a) una toxina botulínica, y; (b) un soporte asociado con la toxina botulínica, formando por tanto una formulación oral en forma sólida de toxina botulínica, en donde (i) el soporte se formula para disolverse en y por lo tanto liberar en el aparato digestivo de un paciente cantidades terapéuticas de la toxina botulínica en el aparato digestivo de un paciente, y; (ii) la formulación en forma sólida de toxina botulínica muestra retención gástrica debido a un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o administración simultánea de un agente farmacológico para retrasar el vaciado gástrico.

Description

Formulaciones de toxina botulínica para administración oral.
Antecedentes
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas. En particular, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de una toxina botulínica para administración oral.
Se puede formular una composición farmacéutica para administración oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, o por inhalación así como por otras vías (es decir, enema, intranasal, intratecal, etc.). Las ventajas de los productos farmacéuticos administrados por vía oral (como una solución, suspensión, comprimido, cápsula, etc.) incluyen efecto terapéutico rápido y conveniencia del paciente.
Se sabe administrar por vía oral un producto farmacéutico para un efecto directo en un sitio diana en el aparato digestivo, en contraposición a un efecto terapéutico por el principio activo de la composición farmacéutica tras la absorción en el sistema circulatorio del paciente (es decir antiácido, laxantes). Se puede alcanzar la retención gástrica controlada para formas farmacéuticas sólidas de un producto farmacéutico mediante los mecanismos de mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o mediante la administración simultánea de agentes farmacológicos que retrasan el vaciado del estómago.
La mucoadhesión es el proceso mediante el cual macromoléculas sintéticas y naturales se adhieren a las superficies mucosas en el cuerpo. Si estos materiales se incorporan en formulaciones farmacéuticas, puede aumentar la absorción de fármacos por las células de la mucosa o liberar el fármaco en el sitio durante un periodo extendido de tiempo. Para polímeros sintéticos, tales como los quitosanos, carbopoles y carbómeros, el mecanismo de bio/mucoadhesión es el resultado de un número de interacciones fisicoquímicas diferentes. Los bio/mucoadhesivos biológicos, tales como lectinas vegetales, muestran interacciones específicas con las superficies celulares y mucina y se ven como la "segunda generación" de bioadhesivos. Woodley, J., Bioadhesion: new possibilities for drug administration?, Clin Pharmacokinet 2001; 40(2):77-84. De esta manera, la mucoadhesión actúa para dar a las formas farmacéuticas administradas por vía oral la capacidad de resistir las fuerzas de propulsión fuertes de la pared del estómago. La producción continua de mucosidad por la mucosa gástrica para remplazar la mucosidad que se pierde a través de las contracciones peristálticas y la dilución del contenido del estómago se puede superar mediante el uso de mucoadhesión como fuerza gastrorretentiva.
Se han evaluado sistemas nanoparticulados mucoadhesivos, incluyendo liposomas y nanopartículas poliméricas. Se puede conferir capacidad mucoadhesiva en sistemas particulados recubriendo sus superficies con polímeros mucoadhesivos tales como quitosano y Carbopol. Se ha confirmado la viabilidad de tal modificación de la superficie midiendo el potencial zeta. Los procedimientos de evaluación incluyen un método de contar partículas usando un contador Coulter para liposomas recubiertos de polímero. Se han usado nanopartículas mucoadhesivas para la administración oral de fármacos peptídicos, y se ha mostrado que son más eficaces con una acción más prolongada comparada con sistemas no recubiertos. Takeuchi H., et al, Mucoadhesive nanoparticulate systems for peptide drug delivery, Adv Drug Deliv Rev 23 Mar 2001; 47(1):39-54.
Los dispositivos mucoadhesivos de distribución de fármacos ofrecen varias ventajas sobre las formas farmacéuticas tradicionales incluyendo la capacidad de optimizar los efectos terapéuticos de un fármaco controlando su liberación en el cuerpo. Se ha mostrado que varios tipos de hidrogeles de poli(ácido acrílico) (PAA) son capaces de inhibir la actividad hidrolítica de enzimas digestivas, tal como tripsina, produciendo un aumento en la biodisponibilidad del fármaco. Se pueden usar polímeros derivados de acrílico para la unión de sistemas de distribución mucoadhesivos a la mucosa. Los hidrogeles poliméricos modificados injertando copolímeros mucofílicos tal como poli(etilenglicol) (PEG) en las cadenas del esqueleto del polímero pueden fomentar el proceso de adhesión. Esto es debido a la capacidad de estas cadenas injertadas de difundir desde la red a la capa mucosa. Se pueden sintetizar películas de P(AA-g-PEG) usando polimerización en solución con radicales libres iniciada por UV. Se pueden sintetizar diferentes tipos de hidrogeles variando la relación de alimentación molar de AA a PEG. Los hidrogeles poliméricos se caracterizan mediante mucoadhesión para cuantificar los efectos de las cadenas de PEG injertadas sobre la mucoadhesión. Se puede determinar la fuerza de unión bioadhesiva usando un aparato de tensión, y calcular por lo tanto el trabajo de adhesión. Los hidrogeles que contienen AA al 40% y PEG al 60% (40:60 AA/PEG) pueden mostrar la mayor mucoadhesión. Estos resultados se pueden atribuir a los efectos sinergísticos de ambos monómeros. Los grupos funcionales AA pueden permitir que el polímero forme múltiples puentes de hidrógeno así como que se hinche en un alto grado. Las uniones de PEG actuaban como promotores de mucoadhesión. Penetraban en la mucosa y unían el hidrogel base y la mucosa. Estos resultados también se pueden interpretar en términos de los modelos recientes de Huang-Peppas (2002) de efectos de recubrimiento de superficie y longitud de la cadena en mucoadhesión.
La flotación como un mecanismo de retención requiere la presencia de líquido en el que la forma farmacéutica puede flotar, y también asume que el paciente permanece en una posición vertical durante el GRI, porque en una posición supina el píloro está localizado por encima del cuerpo del estómago y permite el vaciado acelerado del material que flota. De esta manera, la flotación puede ser un principio base para la retención gástrica de una formulación oral.
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Se ha usado con éxito la sedimentación como mecanismo de retención para pellas que son lo suficientemente pequeñas para ser retenidas en los pliegues o rugosidades del cuerpo del estómago cerca de la región pilórica, que es la parte del órgano con la posición más baja en la postura vertical. Las pellas densas (aproximadamente 3 g/cm^{3}) atrapadas en los pliegues del estómago también tienden a resistir los movimientos peristálticos de la pared del estómago. Se ha mostrado que la expansión es un mecanismo de retención potencialmente fiable. Se han descrito varios dispositivos con características que aumentan, despliegan o que se inflan por dióxido de carbono generado en los dispositivos después de la administración. Estas formas farmacéutica son excluidas del tránsito del esfínter pilórico si superan un diámetro de aproximadamente 12-18 mm en su estado expandido. Varios mecanismos aseguran la reversibilidad completa de la expansión.
Los trastornos digestivos tratables mediante una composición farmacéutica administrada por vía oral pueden incluir la función anormal del intestino, distensión abdominal, estreñimiento, enfermedad de Cohn, diarrea, mala absorción de grasas, alergias alimentarias, fístula gastrointestinal, intolerancia a glucosa, intolerancia al gluten, mala digestión y absorción, intolerancia a lactosa, función intestinal limitada, síndrome de mala absorción, trastornos pancreáticos, síndrome del intestino corto, intolerancia de volumen, vómitos, nausea, ardor de estómago, apendicitis, enfermedad diverticular, cálculos biliares, reflujo gastrointestinal, enfermedad inflamatoria, úlceras pépticas, hemorroides, hernia y obesidad.
Se puede definir la motilidad gastrointestinal mediante los movimientos del aparato digestivo, y el tránsito del contenido dentro de él. Cuando los nervios o músculos en cualquier parte del aparato digestivo no funcionan de una manera muy coordinada, una persona desarrolla síntomas relacionados con problemas de motilidad. Estos síntomas pueden variar desde ardor de estómago a estreñimiento. Otros síntomas también pueden incluir distensión abdominal, nausea, vómitos y diarrea.
Se puede hacer una formulación oral de modo que distribuya un fármaco al aparato digestivo a una velocidad predeterminada a lo largo de un periodo específico de tiempo. En general, la velocidad de liberación de un fármaco de una formulación oral es una función de las propiedades fisicoquímicas del material de la formulación oral y el fármaco incorporado. Típicamente, una formulación oral incluye un soporte hecho de un material inerte que provoca poca o nula respuesta del huésped.
Una formulación oral puede comprender un fármaco con una actividad biológica incorporado en un material soporte. El soporte puede ser un polímero o un material biocerámico. La formulación oral se puede tragar para liberar un fármaco en una manera y cantidad que pueden dar una eficacia terapéutica deseada.
Los materiales soporte poliméricos pueden liberar fármacos debido a difusión, reacción química o activación de solvente, así como por influencia de factores magnéticos, de ultrasonido o de cambio temperatura. La difusión puede ser de un depósito o matriz. El control químico puede ser debido a la degradación del polímero o escisión del fármaco del polímero. La activación por solvente puede implicar el hinchamiento del polímero o un efecto osmótico. Ver, por ejemplo, Science 249; 1527-1533:1990.
Una formulación oral de membrana o depósito depende de la difusión de un agente bioactivo a través de una membrana polimérica. Una formulación oral de matriz comprende una matriz polimérica en la que el agente bioactivo está distribuido uniformemente. Los sistemas de liberación controlados por hinchamiento normalmente se basan en polímeros hidrofílicos, vítreos que sufren hinchamiento en presencia de líquidos biológicos o en presencia de ciertos estímulos medioambientales.
Una formulación oral puede comprender un soporte que es sustancialmente no tóxico, no carcinogénico y no inmunogénico. Los materiales adecuados de formulación oral pueden incluir polímeros tales como poli(2-hidroxietil-metacrilato) (p-HEMA), poli(N-vinilpirrolidona) (p-NVP)+, poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico) (PAA), polidimetilsiloxanos (PDMS), copolímeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), copolímeros polivinilpirrolidona/metacrilato, poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), polianhídridos, poli(orto ésteres), colágeno y derivados celulósicos y biocerámicas, tales como hidroxiapatita (HPA), fosfato tricálcico (TCP), y fosfato de aluminocalcio (ALCAP). Se pueden usar ácido láctico, ácido glicólico, colágeno y copolímeros de los mismos para hacer formulaciones orales biodegradables.
Se pueden usar las formulaciones orales biodegradables para superar las evidentes deficiencias de formulaciones orales no biodegradables. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 3773919 y 4767628. Un polímero biodegradable puede ser un polímero que se erosiona en la superficie, opuesto a un polímero que muestra degradación en masa u homogénea. Un polímero que se erosiona en la superficie se degrada sólo desde su superficie exterior, y la liberación del fármaco es por lo tanto proporcional a la velocidad de erosión del polímero. Tal polímero adecuado puede ser un polianhídrido. Una formulación oral puede estar en forma de formulaciones orales cilíndricas, microcápsulas de pellas, o microesferas. Drug Development and Industrial Pharmacy 24(12); 1129-1138:1998. Una formulación oral biodegradable se puede basar en la liberación de membrana o matriz de la sustancia bioactiva. Se pueden formular microesferas biodegradables para administración oral comprimiéndolas en un disco o pella.
Se puede hacer una formulación oral de materiales biodegradables, tales como polímeros de ácido poliláctico (PLA), copolímeros de ácido poliglicólico (PGA) ácido poliláctico, policaprolactonas y colesterol son conocidos.
Se conocen al menos tres métodos para preparar microesferas poliméricas, incluyendo microesferas compuestas de un polímero biodegradable. Ver, por ejemplo, Journal of Controlled Release 52(3); 227-237:1998. De esta manera, se puede dispersar una preparación sólida de fármaco en una fase continua que consiste en un polímero biodegradable y un solvente orgánico o, se puede emulsionar una solución acuosa de un fármaco en la fase polímero-orgánica. Las microesferas se pueden formar después mediante técnicas de secado por rociado, separación de fase o doble emulsión.
Toxina botulínica
El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas según su morfología y funciones. La bacteria anaeróbica, gram positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, la toxina botulínica, que produce una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales denominada botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en la tierra y pueden crecer en envases de alimentos incorrectamente esterilizados y sellados de fábricas de conservas locales, que son la causa de muchos casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente aparecen de 18 a 36 horas después de ingerir los comestibles infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente sin atenuar a través del recubrimiento del intestino y atacar neuronas motoras periféricas. Los síntomas por intoxicación de la toxina botulínica pueden evolucionar de dificultad al andar, tragar y hablar hasta parálisis de los músculos respiratorios y muerte.
La toxina botulínica de tipo A es el agente biológico natural más letal conocido para el ser humano. Alrededor de 50 picogramos de un toxina botulínica de tipo A comercialmente disponible (un complejo de neurotoxina purificada)^{1} es una DL_{50} en ratones (es decir, 1 unidad). Una unidad de BOTOX® contiene alrededor de 50 picogramos (alrededor de 56 atomoles) de complejo de toxina botulínica de tipo A. De forma interesante, en base molar, la toxina botulínica de tipo A es alrededor de 1.800 millones de veces más letal que la difteria, alrededor de 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, alrededor de 30 millones de veces más letal que la toxina de cobra y alrededor de 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, Nueva York (1996) (donde la DL_{50} indicada para la toxina botulínica de tipo A de 0,3 ng equivale a 1 U se corrige por el hecho de que alrededor de 0,05 ng de BOTOX® equivale a 1 unidad). Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la DL_{50} tras inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan de 18 a 20 gramos cada una.
Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas, siendo estas respectivamente los serotipos de neurotoxina botulínica A, B, C_{1}, D, E, F y G cada uno de los cuales se distingue mediante neutralización con anticuerpos específicos de tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo A es 500 veces más potente, medida por la tasa de parálisis producida en la rata, de lo que es la toxina botulínica de tipo B. Además, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es alrededor de 12 veces la LD_{50} en primates para la toxina botulínica de tipo A. Moyer E et al., Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience, que es el capítulo 6, páginas 71-85 de "Therapy With Botulinum Toxin", editado por Jankovic, J. et al. (1994), Marcel Dekker, Inc. La toxina botulínica aparentemente se une con gran afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se transloca a la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina.
Independientemente del serotipo, el mecanismo molecular de la intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos tres pasos o fases. En el primer paso del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona diana mediante una interacción específica entre la cadena pesada, cadena H, y un receptor de la superficie celular; se piensa que el receptor es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para la toxina del tétanos. Parece que el segmento del extremo carboxilo de la cadena H, H_{C}, es importante para dirigir la toxina a la superficie celular.
En el segundo paso, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. La toxina es primero absorbida por la célula mediante endocitosis mediada por receptor, y se forma un endosoma que contiene la toxina. La toxina escapa después del endosoma al citoplasma de la célula. Se piensa que este paso está mediado por el segmento del extremo amino de la cadena H, H_{N}, que desencadena un cambio conformacional de la toxina en respuesta a un pH de alrededor de 5,5 o menor. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que disminuye el pH intra-endosómico. El cambio conformacional expone residuos hidrofóbicos en la toxina, que permiten que la toxina se empotre en la membrana endosómica. La toxina (o al menos la cadena ligera) se transloca después a través de la membrana endosómica al citoplasma.
El último paso del mecanismo de la actividad de la toxina botulínica parece implicar reducción del puente disulfuro que une la cadena pesada, cadena H, y la cadena ligera, cadena L. La actividad tóxica completa de las toxinas botulínica y tetánica está contenida en las cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que corta selectivamente proteínas esenciales para el reconocimiento y la interacción de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La neurotoxina del tétanos, toxina botulínica de tipos B, D, F y G producen degradación de sinaptobrevina (también denominada proteína de membrana asociada con vesícula (VAMP)), una proteína de membrana sinaptosomal. La mayoría de la VAMP presente en la superficie citoplásmica de la vesícula sináptica se elimina como resultado
de cualquiera de estos sucesos de corte. La toxina botulínica de serotipo A y E corta SNAP-25. Originalmente se pensó que la toxina botulínica de serotipo C_{1} cortaba sintaxina, pero se determinó que cortaba sintaxina y SNAP-25. Cada una de las toxinas botulínicas corta específicamente un enlace diferente, excepto la toxina botulínica de tipo B (y la toxina del tétanos) que cortan el mismo enlace.
Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben aparentemente la liberación del neurotransmisor acetilcolina en las uniones neuromusculares, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o cortando estas proteínas en sitios diferentes. Por ejemplo, los tipos botulínicos A y E cortan la proteína sinaptosomal asociada de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25), pero se dirigen a diferentes secuencias de aminoácidos en esta proteína. La toxina botulínica de tipos B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a vesículas (VAMP, también llamada sinaptobrevina), cortando cada serotipo la proteína en sitios diferentes. Por último, se ha mostrado que la toxina botulínica de tipo C_{1} corta tanto sintaxina como SANP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar la potencia relativa y/o duración de la acción de los diferentes serotipos de toxina botulínica. Aparentemente, se puede encontrar un sustrato para una toxina botulínica en una variedad de diferentes tipos celulares. Ver por ejemplo, Gonelle-Gispert, C., et al., SNAP-25a and -25b isoforms are both expressed in insulin-secreting cells and can function in insulin secretion, Biochem J. 1;339 (pt 1):159-65:1999, y Boyd R.S. et al., The effect of botulinum neurotoxin-B on insulin release from a \exists-cell line, y Boyd R.S. et al., The insulin secreting \exists-cell line, HIT-15, contains SNAP-25 which is a target for botulinum neurotoxin-A, publicados ambos en Mov Disord, 10(3): 376:1995 (las células B de las isletas pancreáticas contienen al menos SANP-25 y sinaptobrevina).
El peso molecular de la molécula proteica de toxina botulínica, para los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es alrededor de 150 kD. De forma interesante, las toxinas botulínicas se liberan por la bacteria clostridial como complejos que comprenden la molécula proteica de toxina botulínica de 150 kD junto con proteínas asociadas no toxina. De esta manera, el complejo de toxina botulínica de tipo A se puede producir por la bacteria clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. La toxina botulínica de tipos B y C_{1} aparentemente se produce sólo como un complejo de 700 kD ó 500 kD. La toxina botulínica de tipo D se produce tanto como complejos de 300 kD como de 500 kD. Por último, la toxina botulínica de tipos E y F se produce sólo como complejos de aproximadamente 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, pesos moleculares mayores de alrededor de 150 kD) contienen una proteína hemaglutinina no toxina y una proteína no hemaglutinina no toxina y no tóxica. Estas dos proteínas no toxina (que junto con la molécula de toxina botulínica comprende el complejo neurotoxina relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización de la molécula de toxina botulínica y protección contra ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Además, es posible que complejos de toxina botulínica mayores (mayores de alrededor de 150 kD de peso molecular) puedan producir una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica del sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica.
Los siete serotipos de toxina botulínica se fabrican por las bacterias Clostridium botulinum como proteínas de cadena sencilla inactiva que se deben cortar o fragmentar por proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que hacen la toxina botulínica de serotipos A y G poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G se pueden por lo tanto recuperar de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipos de toxina botulínica C_{1}, D y E se sintetizan por cepas no proteolíticas y por lo tanto están típicamente inactivadas cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen tanto por cepas proteolíticas como por no proteolíticas y por lo tanto se pueden recuperar bien en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica de tipo B solo cortan una parte de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas a no cortadas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, toxina de toxina botulínica de tipo B es probable que sea inactivo, explicando posiblemente una potencia menor de la toxina botulínica de tipo comparada con la toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactivas en una preparación clínica contribuirá a la carga global de proteína de la preparación, que se ha unido a la antigenicidad aumentada, sin contribuir a su eficacia clínica.
Se pueden obtener toxinas botulínicas y complejos de toxinas de, por ejemplo, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; el Centro para Microbiología Aplicada e Investigación, Porton Down, R.U.; Wako (Osaka, Japón), así como de Sigma Chemicals de St Louis, Missouri. Las composiciones farmacéuticas que contienen toxina botulínica comercialmente disponibles incluyen BOTOX® (complejo neurotoxina de toxina botulínica de tipo A con seroalbúmina humana y cloruro de sodio) disponible de Allergan, Inc. de Irvine, California en viales de 100 unidades como un polvo liofilizado a ser reconstituido con cloruro de sodio al 0,9% antes de su uso), Dysport® (complejo toxina de tipo A hemaglutinina de Clostridium botulinum con seroalbúmina humana y lactosa en la formulación), disponible de Ipsen Limited, Berkshire, R.U. como un polvo a ser reconstituido con cloruro de sodio al 0,9% antes del uso), y MyoBloc^{TM} (una solución inyectable que comprende toxina botulínica de tipo B, seroalbúmina humana, succinato de sodio, y cloruro de sodio a alrededor de pH 5,6, disponible de Elan Corporation, Dublín, Irlanda).
El éxito de la toxina botulínica de tipo A para tratar una variedad de afecciones clínicas ha llevado al interés en otros serotipos de toxina botulínica. Además, se ha usado toxina botulínica pura para tratar seres humanos. Ver, por ejemplo, Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Supl 3):165. Por lo tanto, se puede preparar una composición farmacéutica usando una toxina botulínica pura.
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Se sabe que la toxina botulínica de tipo A es soluble en soluciones acuosas diluidas a pH 4-6,8. A pH por encima de alrededor de 7 las proteínas no tóxicas estabilizantes se disocian de la toxina, produciendo una pérdida gradual de la toxicidad, particularmente al subir el pH y la temperatura. Schantz E.J., et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (en particular páginas 44-45), que es el capítulo 3 de Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc. (1994).
La molécula de toxina botulínica (alrededor de 150 kD), así como los complejos de toxina botulínica (alrededor de 300-900 kD), tal como el complejo de toxina de tipo A también son extremadamente susceptibles a la desnaturalización debido a desnaturalización de superficie, calor, y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunogénicas. Los anticuerpos resultantes pueden hacer un paciente resistente a la inyección con toxina.
Estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por el catión potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina de cultivos de células primarias de tejido de tronco del encéfalo. Además, se ha descrito que la toxina botulínica inhibe la liberación provocada tanto de glicina como de glutamato en cultivos primarios de neuronas de médula espinal y que en preparaciones de sinaptosomas de cerebro la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina (Habermann E., et al., Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51(2); 522-527:1988) CGRP, sustancia P y glutamato (Sanchez-Prieto, J., et al., Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165; 675-681:1987. De esta manera, cuando se usan concentraciones adecuadas, la toxina botulínica bloquea la liberación provocada por estímulo de la mayoría de los neurotransmisores. Ver, por ejemplo, Pearce, L.B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35(9); 1373-1412 en 1393; Bigalke H., et al., Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360; 318-324:1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [^{3}H]Noradrenaline and [^{3}H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226:1988, Bigalke H., et al., Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeber's Arch Pharmacol 316; 244-251:1981, y; Jankovic J. et al., Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994), página 5.
Se puede obtener toxina botulínica de tipo A estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y después recogiendo y purificando la mezcla fermentada según procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas inactivas de cadena sencilla que se deben cortar o fragmentar por proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que hacen la toxina botulínica de serotipos A y G poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G se pueden por lo tanto recuperar de los cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipos de toxina botulínica C_{1}, D y E se sintetizan por cepas no proteolíticas y por lo tanto están típicamente inactivadas cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen tanto por cepas proteolíticas como por no proteolíticas y por lo tanto se pueden recuperar bien en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica de tipo B solo cortan una parte de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas a no cortadas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, toxina de toxina botulínica de tipo B es probable que sea inactivo, explicando posiblemente una potencia menor de la toxina botulínica de tipo B comparada con la toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas inactivas de toxina botulínica en una preparación clínica contribuirá a la carga global de proteína de la preparación, que se ha unido a la antigenicidad aumentada, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, se sabe que la toxina botulínica de tipo B tiene, tras la inyección muscular, una duración más corta de actividad y también es menos potente que la toxina botulínica de tipo A al mismo nivel de dosis.
Se puede producir toxina botulínica de tipo A cristalina de gran calidad a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de \geq3 X 10^{7} U/mg, una A_{260}/A_{278} de menos de 0,60 y un patrón distinto de bandas en electroforesis en gel. Se puede usar el conocido proceso de Schantz para obtener toxina botulínica de tipo A cristalina, como se explica en Schantz, E.J., et al, Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56; 80-99:1992. Generalmente, se puede aislar y purificar el complejo de toxina botulínica de tipo A de una fermentación anaerobia cultivando Clostridium botulinum de tipo A en un medio adecuado. También se puede usar el proceso conocido, tras la separación de las proteínas no toxinas, para obtener toxinas botulínicas puras, tal como por ejemplo: toxina botulínica de tipo A purificada con un peso molecular aproximadamente de 150 kD con una potencia específica de 1-2 X 10^{8} U DL_{50}/mg o mayor; toxina botulínica de tipo B purificada con un peso molecular de aproximadamente 156 kD con una potencia de específica de 1-2 X 10^{8} U DL_{50}/mg o mayor, y; toxina botulínica de tipo F purificada con un peso molecular de aproximadamente 155 kD con una potencia de específica de 1-2 X 10^{7} U DL_{50}/mg o mayor.
Se puede usar la toxina botulínica pura (es decir la molécula de toxina botulínica de 150 kilodalton) o el complejo de toxina para preparar una composición farmacéutica. Tanto molécula como complejo son susceptibles de desnaturalización debido a desnaturalización de superficie, calor, y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunogénicas. Los anticuerpos resultantes pueden hacer un paciente resistente a inyección de toxina.
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Como con las enzimas en general, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (que son peptidasas intracelulares) dependen, al menos en parte, de su conformación tridimensional. De esta manera, la toxina botulínica de tipo A se detoxifica por calor, varios productos químicos, expansión de la superficie y secado de la superficie. Además, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido por el conocido cultivo, fermentación y purificación a las concentraciones de toxina mucho, mucho más bajas usadas para la formulación de composiciones farmacéuticas produce una rápida detoxificación de la toxina a menos que esté presente un agente estabilizante adecuado. La dilución de la toxina de cantidades de miligramos a una solución que contiene nanogramos por mililitro presenta dificultades significativas debido a la rápida pérdida de toxicidad específica en tal gran dilución. Puesto que la toxina se puede usar meses o años después de que la composición farmacéutica que contiene toxina se formule, la toxina se puede estabilizar con un agente estabilizante tales como albúmina y gelatina.
Una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica comercialmente disponible se vende bajo el nombre comercial BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California). BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica de tipo A purificada, albúmina y cloruro de sodio empaquetada en forma estéril, desecada al vacío. La toxina botulínica de tipo A se hace de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum hecho crecer en un medio que contiene amina N-Z y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica de tipo A se purifica de la solución de cultivo mediante una serie de precipitaciones ácidas a un complejo cristalino que consiste en la proteína toxina activa de alto peso molecular y una proteína hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se redisuelve en una solución que contiene solución salina y albúmina y se esteriliza por filtración (0,2 micrómetros) antes del secado al vacío. El producto desecado al vacío se almacena en un congelador a o por debajo de -5ºC. Se puede reconstituir BOTOX® con solución salina estéril, no conservada antes de la inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene alrededor de 100 unidades (U) de complejo de neurotoxina purificado de toxina de tipo A de Clostridium botulinum, 0,5 miligramos de seroalbúmina humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril, desecada al vacío sin un conservante.
Para reconstituir BOTOX® desecado al vacío, se usa solución salina normal estéril sin conservantes (Inyección de cloruro de sodio al 0,9%) sacando la cantidad adecuada de diluyente en la jeringuilla de tamaño apropiado. Puesto que BOTOX® se puede desnaturalizar por burbujeo o agitación violenta similar, el diluyente se inyecta poco a poco en el vial. Por razones de esterilidad BOTOX® se administra preferiblemente en las cuatro horas siguientes a sacar el vial del congelador y reconstituir. Durante estas cuatro horas, se puede almacenar BOTOX® reconstituido en una nevera a alrededor de 2ºC hasta alrededor de 8ºC. Se ha descrito que BOTOX® reconstituido refrigerado mantiene su potencia durante al menos dos semanas. Neurology, 48:249-53:1997.
Se han usado toxinas botulínicas en marcos clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. La toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) fue aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE.UU. en 1989 para el tratamiento de blefaroespasmo esencial, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de más de doce años de edad. En 2000 la FDA aprobó preparaciones comerciales para los serotipos de toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) y tipo B (MyoBloc^{TM}) para el tratamiento de distonía cervical, y en 2002 la FDA aprobó una toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) para el tratamiento cosmético de ciertas arrugas faciales hipercinéticas (glabelares). Los efectos clínicos de la toxina botulínica de tipo A intramuscular periférica normalmente se ven en una semana de inyección y algunas veces en unas cuantas horas. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis flácida del músculo) de una única inyección intramuscular de toxina botulínica de tipo A puede ser de alrededor de tres meses, aunque en algunos casos se ha descrito que los efectos de la denervación de una glándula inducida por toxina botulínica, tal como una glándula salivar, duran varios años. Por ejemplo, se sabe que la toxina botulínica de tipo A puede tener eficacia hasta 12 meses (Naumann M., et al., Botulinum toxin type A in the treatment of focal, axillary and palmar hyperhidrosis and other hyperhidrotic conditions, European J. Neurology 6 (Sup 4): S111-S115:1999), y en algunas circunstancias durante tanto como 27 meses. Ragona, R.M., et al., Management of parotid sialocele with botulinum toxin, The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración normal de una inyección intramuscular de BOTOX® es típicamente alrededor de 3 a 4 meses.
Se ha descrito que se ha usado una toxina botulínica de tipo A en marcos clínicos diversos, incluyendo por ejemplo, como sigue:
(1) alrededor de 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar distonía cervical;
(2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (ceño fruncido) (5 unidades inyectadas por vía intramuscular en el músculo piramidal de la nariz y 10 unidades inyectadas por vía intramuscular en cada músculo corrugador superciliar);
(3) alrededor de 30-80 unidades de BOTOX® para tratar estreñimiento mediante inyección intraesfínter de músculo puborrectal;
(4) alrededor de 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado por vía intramuscular para tratar blefaroespasmo inyectando el músculo orbicular pretarsal lateral del ojo del párpado superior y el orbicular pretarsal lateral del ojo del párpado inferior.
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(5) para tratar estrabismo, se han inyectado los músculo extraoculares por vía intramuscular con entre 1-5 unidades de BOTOX®, variando la cantidad inyectada basado tanto en el tamaño del músculo a ser inyectado como la extensión de la parálisis muscular deseada (es decir, la cantidad de corrección de dioptrías deseada).
(6) para tratar espasticidad de extremidades superiores después de un ictus mediante inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores diferentes de la extremidad superior, como sigue:
(a)
flexor profundo de los dedos: 7,5 U a 30 U
(b)
flexor superficial de los dedos: 7,5 U a 30 U
(c)
flexor cubital del carpo: 10 U a 40 U
(d)
flexor radial del carpo: 15 U a 60 U
(e)
bíceps braquial: 50 U a 200 U.
Se ha inyectado cada uno de los cinco músculos indicados en la misma sesión de tratamiento, de modo que el paciente recibe de 90 U a 360 U de BOTOX® en músculo flexor de extremidad superior mediante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento.
(7) para tratar migraña, la inyección de 25 U de BOTOX® inyectado pericraneal (inyectado simétricamente en los músculos glabelar, frontal y temporal) ha mostrado un beneficio significativo como un tratamiento profiláctico de migraña comparado con vehículo medido por medidas disminuidas de frecuencia de migraña, gravedad máxima, vómitos asociados y uso de medicación aguda a lo largo de un periodo de tres meses tras la inyección de 25 U.
Además, se ha usado la toxina botulínica intramuscular en el tratamiento de temblor en pacientes con enfermedad de Parkinson, aunque se ha descrito que los resultados no han sido impresionantes. Marjama-Lyons, J., et al., Tremor-Predominant Parkinson's Disease, Drugs & Aging 16(4); 273-278:2000.
Se conoce el tratamiento de ciertos trastornos digestivos y de músculo liso con una toxina botulínica. Ver por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5427291 y 5674205 (Pasricha). Además, se conoce la inyección transuretral de una toxina botulínica en un esfínter de la vejiga para tratar trastorno de la micción (ver, por ejemplo, Dykstra, D.D., et al, Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botulinum A toxin: A double-blind study, Arch Phys Med Rehabil Enero 1990; 71:24-6), como lo es la inyección de una toxina botulínica en la próstata para tratar hiperplasia prostática. Ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6365164 (Schmidt).
La patente de EE.UU. 5766605 (Sanders) propone el tratamiento de varios trastornos autónomos, tal como hipersalivación y rinitis, con una toxina botulínica.
Además, en WO 95/17904 (PCT/US94/14717) (Aoki) se discuten varias afecciones, tales como hiperhidrosis y dolor de cabeza, tratables con una toxina botulínica. EP 0 605 501 B1 (Graham) discute el tratamiento de parálisis cerebral infantil con una toxina botulínica y la patente de EE.UU. 6063768 (First) discute el tratamiento de inflamación neurogénica con una toxina botulínica.
Además de tener acciones farmacológicas en localización periférica, las toxinas botulínicas también pueden tener efectos inhibidores en el sistema nervioso central. Los trabajos de Weigand et al, (^{125}I-labelled botulinum A neurotoxin: pharmacokinetics in cats after intramuscular injection, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165), y Habermann, (^{125}I-labelled Neurotoxin from Clostridium botulinum A: preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56) mostraron que la toxina botulínica es capaz de ascender al área espinal mediante transporte retrógrado. Como tal, una toxina botulínica inyectada en una localización periférica, por ejemplo por vía intramuscular, puede ser transportada retrógradamente a la médula espinal.
Estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina de cultivos de células primarias de tejido de tronco encefálico. Además, se ha descrito que la toxina botulínica inhibe la liberación provocada tanto de glicina como de glutamato en cultivos primarios de neuronas de médula espinal y que en preparaciones de sinaptosomas de cerebro la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato.
La patente de EE.UU. 5989545 divulga que se puede usar una neurotoxina clostridial modificada, o un fragmento de la misma, preferiblemente una toxina botulínica, conjugada químicamente o fusionada recombinantemente a un grupo particular de direccionamiento para tratar el dolor mediante administración del agente en la médula espinal.
También se ha propuesto una toxina botulínica para el tratamiento de hiperhidrosis (sudoración excesiva, patente de EE.UU. 5766605), dolor de cabeza (patente de EE.UU. 6458365, dolor de cabeza por migraña (patente de EE.UU. 5714468), dolor posoperatorio y dolor visceral (patente de EE.UU. 6464986), dolor mediante administración intraespinal (patente de EE.UU. 6113915), enfermedad de Parkinson mediante administración intracraneal (patente de EE.UU. 6306403), crecimiento del pelo y retención del pelo (patente de EE.UU. 6299893), psoriasis y dermatitis (patente de EE.UU. 5670484), músculos dañados (patente de EE.UU. 6423319, varios cánceres (patente de EE.UU. 6139845), trastornos pancreáticos (patente de EE.UU. 6143306), trastornos de músculo liso (patente de EE.UU. 5437291, incluyendo inyección de una toxina botulínica en los esfínteres esofágicos superior e inferior, pilórico y anal)), trastornos de la próstata (patente de EE.UU. 6365164), inflamación, artritis y gota (patente de EE.UU. 6063768), parálisis cerebral infantil (patente de EE.UU. 6395277) trastornos del oído interno (patente de EE.UU. 6265379), trastornos tiroideos (patente de EE.UU. 6358513), trastornos paratiroideos (patente de EE.UU. 6328977). Además, se conocen implantes de liberación controlada de toxina (patentes de EE.UU. 6306423 y 6312708).
Se ha descrito que la inyección intravenosa de una toxina botulínica produce un descenso en la secreción de ácido y pepsina estimulada por pentagastrina en ratas. Kondo T., et al., Modification of the action of pentagastrin on acid secretion by botulinum toxin, Experientia 1977; 33:750-1. Además se ha especulado que se puede usar una toxina botulínica para reducir una secreción gastrointestinal, tal como una secreción gástrica. Ver las páginas 16-17 de WO 95/17904. Además, se ha propuesto una toxina botulínica para el tratamiento de trastornos de músculo intestinal en el trastorno del sistema nervioso entérico (patente de EE.UU. 5437291) y también para tratar varios trastornos autónomos (patente de EE.UU. 5766605). Se ha inyectado toxina botulínica en el fondo del estómago de perros. Wang Z., et al., Effects of botulinum toxin on gastric myoelectrical and vagal activities in dogs, Gastroenterology Abr 2001; 120(5 Supl 1):A-718. Además se ha propuesto la inyección intramuscular de una toxina botulínica en el antro pilórico como un tratamiento para la obesidad. Ver, por ejemplo, Gui D., et al., Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions. A possible tool for correction of obesity?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol Jun 2002; 365(Supl 2):R22; Albanese A., et al., The use of botulinum toxin on smooth muscles, Eur J Neurol Nov 1995; 2(Sup 3):29-33, y; Gui D., et al., Botulinum toxin injected in the gastric wall reduces body weight and food intake in rats, Aliment Pharmacol Ther Jun 2000; 14(6):829-834. Además, se ha propuesto una toxina botulínica de tipo A como una aplicación terapéutica para el control de secreción en el estómago. Rossi S., et al., Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in the stomach of rat, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 365(Supl 2):R37.
De forma significativa, se ha descrito que la inyección de una toxina botulínica en el esfínter esofágico inferior para el tratamiento de acalasia produce la formación de úlceras en el esófago. Eaker, E.Y., et al., Untoward effects of esophageal botulinum toxin injection in the treatment of achalasia, Dig Dis Sci Abr 1997; 42(4):724-7. Se sabe inyectar una toxina botulínica en un esfínter pilórico espástico de un paciente con úlcera prepilórica para permitir que se abra el músculo pilórico. Wiesel P.H. et al., Botulinum toxin for refractory postoperative pyloric spasm, Endoscopy 1997; 29(2):132.
También pueden tener utilidad terapéutica la toxina tetánica, así como derivados (es decir, con un grupo de direccionamiento no nativo), fragmentos, híbridos y quimeras de la misma. La toxina tetánica tiene muchas similitudes con las toxinas botulínicas. De esta manera tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas son polipéptidos fabricados por especies muy relacionadas de Clostridium (Clostridium tetani y Clostridium botulinum, respectivamente). Además, tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas son proteínas dicadena compuestas de una cadena ligera (peso molecular de alrededor de 50 kD) unida covalentemente mediante un único puente disulfuro a una cadena pesada (peso molecular de alrededor de 100 kD). Por lo tanto, el peso molecular de la toxina tetánica y cada una de las siete toxinas botulínicas (no en complejos) es alrededor de 150 kD. Además, tanto para la toxina tetánica como para las toxinas botulínicas, la cadena ligera lleva el dominio que muestra actividad biológica intracelular (proteasa), mientras que la cadena pesada comprende los dominios de unión a receptor (inmunogénico) y de translocación de membrana celular.
Además, tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas muestran una alta afinidad específica por receptores de gangliósidos en la superficie de neuronas colinérgicas presinápticas. La endocitosis mediada por receptor de la toxina tetánica por neuronas colinérgicas periféricas produce transporte axonal retrógrado, bloqueando la liberación de neurotransmisores inhibidores de sinapsis centrales y una parálisis espástica. Por el contrario, la endocitosis mediada por receptor de la toxina botulínica por neuronas colinérgicas periféricas produce poco si algún transporte retrógrado, inhibición de la exocitosis de acetilcolina de las neuronas motoras periféricas intoxicadas y una parálisis fláccida.
Por último, la toxina tetánica y las toxinas botulínicas se parecen entre sí tanto en la biosíntesis como en la arquitectura molecular. De esta manera, hay un identidad global del 34% entre las secuencias de proteína de la toxina tetánica y la toxina botulínica de tipo A, y una identidad de secuencia tan alta como del 62% para algunos dominios funcionales. Binz T. et al., The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265(16); 9153-9158:1990.
Acetilcolina
Típicamente cada tipo de neurona sólo libera un único tipo de neurotransmisor de molécula pequeña en el sistema nervioso de mamíferos. El neurotransmisor acetilcolina es secretado por neuronas en muchas áreas del cerebro, pero específicamente por las células piramidales grandes de la corteza motora, por varias neuronas diferentes en los ganglios basales, por las neuronas motoras que inervan los músculos esqueléticos, por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autónomo (tanto simpático como parasimpático), por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático, y por algunas de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático. Esencialmente, sólo las fibras nerviosas simpáticas posganglionares a las glándulas sudoríparas, los músculos piloerectores y unos pocos vasos sanguíneos son colinérgicos ya que la mayoría de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático secretan el neurotransmisor norepinefrina. En la mayoría de los casos la acetilcolina tiene un efector excitador. Sin embargo, se sabe que la acetilcolina tiene efectos inhibidores en algunas de las terminaciones nerviosas parasimpáticas periféricas, tal como la inhibición de la frecuencia cardiaca por el nervio vago.
Las señales eferentes del sistema nervioso autónomo se transmiten al cuerpo a través del sistema nervioso simpático o el sistema nervioso parasimpático. Las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático se extienden desde los cuerpos celulares de neuronas simpáticas preganglionares localizados en el asta intermediolateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas simpáticas preganglionares, que se extienden desde el cuerpo celular, hacen sinapsis con neuronas posganglionares situadas en un ganglio simpático paravertebral o en un ganglio prevertebral. Puesto que las neuronas preganglionares tanto del sistema nervioso simpático como parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará tanto neuronas posganglionares simpáticas como parasimpáticas.
La acetilcolina activa dos tipos de receptores, receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático así como en aquellas estimuladas por las neuronas colinérgicas posganglionares del sistema nervioso simpático. Los receptores nicotínicos se encuentran en la médula suprarrenal, así como en los ganglios autónomos, es decir, una de las superficies celulares de la neurona posganglionar en la sinapsis entre neuronas preganglionares y posganglionares tanto del sistema simpático como parasimpático. Los receptores nicotínicos también se encuentran en muchas terminaciones nerviosas no autónomas, por ejemplo en las membranas de fibras de músculo esquelético en la unión neuromuscular.
La acetilcolina se libera de las neuronas colinérgicas cuando pequeñas vesículas intracelulares transparentes se fusionan con la membrana celular neuronal presináptica. Una amplia variedad de células secretoras no neuronales, tales como células de médula suprarrenal (así como la línea celular PC12) y de isletas pancreáticas liberan catecolaminas u hormona paratiroidea, respectivamente, de grandes vesículas de núcleo denso. La línea celular PC12 es un clon de células de feocromocitoma de rata extensamente usadas como un modelo de cultivo de tejido para estudios de desarrollo simpatoadrenal. La toxina botulínica inhibe la liberación de ambos tipos de compuestos de ambos tipos de células in vitro, permeabilizada (como por electroporación) o mediante inyección directa de la toxina en la célula desnervada. También se sabe que la toxina botulínica bloquea la liberación del neurotransmisor glutamato de cultivos de células de sinaptosomas.
Una unión neuromuscular se forma en músculo esquelético por la proximidad de los axones a las células musculares. Una señal transmitida a través del sistema nervioso produce un potencial de acción en el axón terminal, con la activación de canales iónicos y produciendo la liberación del neurotransmisor acetilcolina de las vesícula sinápticas intraneuronales, por ejemplo en la placa motora de la unión neuromuscular. La acetilcolina cruza el espacio extracelular para unirse a las proteínas del receptor de acetilcolina en la superficie de la placa motora muscular. Una vez que se ha producido suficiente unión, un potencial de acción de la célula muscular produce cambios específicos en canales iónicos de membrana, produciendo la contracción de la célula muscular. La acetil colina se libera después de las células musculares y se metaboliza por colinesterasas en el espacio extracelular. Los metabolitos se vuelven a reciclar en el axón terminal para reprocesamiento en más acetilcolina.
Lo que se necesita por lo tanto es una formulación oral biocompatible de una toxina botulínica.
DE 100 35 156 A1 divulga un complejo proteico que comprende una o más proteínas complejas, al menos una de las cuales es una toxina de Clostridium botulinum de los tipos A, B, C1, C2, D, E, F ó G y un polipéptido seleccionado. El polipéptido seleccionado puede ser en particular hemaglutinina o MHTH.
US 6 051 239 divulga una toxina botulínica modificada capaz de translocarse del intestino a la circulación general. La toxina botulínica está alterada para ser no tóxica mutando o delecionando aminoácidos en la cadena ligera de la toxina botulínica.
US 6 306 423 divulga un implante biocompatible para la liberación continua in vivo de una neurotoxina a lo largo de un periodo de tratamiento que se extiende desde un mes a cinco años. El implante se puede hacer moldeando una solución de un polímero, por ejemplo, un copolímero de acetato de etilvinilo, y la neurotoxina. La neurotoxina puede ser una toxina botulínica.
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Resumen
La presente invención satisface esta necesidad y proporciona una formulación oral biocompatible de una toxina botulínica.
Según la presente invención, la toxina botulínica se mezcla como una formulación oral para la liberación del principio activo de la toxina en el estómago o duodeno de un paciente con un trastorno digestivo. La preparación de una formulación oral de una toxina botulínica se puede lograr fácilmente mezclando polvo de una toxina botulínica liofilizada o desecada por congelación con un soporte adecuado tales como harina, azúcar o gelatina y después comprimiendo la mezcla para hacer un comprimido ingerible. Se eligen el soporte y la cantidad de compresión de modo que el comprimido resultante (o de forma alternativa se puede formular una cápsula que contiene una cantidad terapéutica de la toxina mezclada con o sin un soporte) se pretende que se trague y el soporte y las características del soporte son tales que el soporte se disuelve rápidamente en el estómago, liberando el principio activo de toxina botulínica.
La presente invención proporciona una formulación oral de toxina botulínica que supera los problemas, dificultades y deficiencias conocidos asociados con un bolus repetitivo o inyección subcutánea de una toxina botulínica, para tratar un trastorno digestivo.
Una formulación oral de toxina botulínica dentro del ámbito de la presente invención puede comprender un material soporte y una toxina botulínica asociada con el soporte. La toxina puede estar asociada con el soporte siendo mezclada con y encapsulada por el soporte para formar de esta manera una sistema de distribución de toxina botulínica que es una formulación oral de toxina botulínica. La formulación oral puede liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica del soporte en el aparato digestivo de un paciente tras la administración oral.
El soporte puede comprender una pluralidad de microesferas poliméricas (es decir, una matriz polimérica) y no se han transformado cantidades sustanciales de toxina botulínica a toxoide botulínico antes de la asociación de la toxina botulínica con el soporte. Es decir, cantidades significativas de la toxina botulínica asociada con el soporte tienen una toxicidad que sustancialmente está sin alterar relativa a la toxicidad de la toxina botulínica antes de la asociación de la toxina botulínica con el soporte.
Según la presente invención, la toxina botulínica se puede liberar del soporte en el aparato digestivo y el soporte está compuesto de una sustancia que es sustancialmente biodegradable. La toxina botulínica es uno de los tipos de toxina botulínica A, B, C_{1}, D, E, F y G y es preferiblemente toxina botulínica de tipo A. La toxina botulínica se puede asociar con el soporte en una cantidad de entre 1 unidad y 10.000 unidades de toxina botulínica. Preferiblemente, la cantidad de la toxina botulínica asociada con el soporte está entre 10 unidades y 2.000 unidades de una toxina botulínica de tipo A. Donde la toxina botulínica es toxina botulínica de tipo B, preferiblemente, la cantidad de la toxina botulínica asociada con el soporte está entre 500 unidades y 10.000 unidades de una toxina botulínica de tipo B.
Una forma de realización detallada de la presente invención puede comprender una formulación oral de toxina botulínica que comprende un polímero biodegradable y entre 10 unidades y 10.000 unidades de una toxina botulínica encapsulada por el soporte polimérico, formando de esta manera un sistema de liberación controlada, en donde se pueden liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica del soporte en el aparato digestivo de un paciente.
Un método para hacer una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención puede tener los pasos de: disolver un polímero en un solvente para formar una solución de polímero; mezclar o dispersar una toxina botulínica en la solución de polímero para formar un mezcla polímero-toxina botulínica, y; permitir que la mezcla polímero-toxina botulínica se endurezca o cure, haciendo de esta manera una formulación oral para la liberación de toxina botulínica. Este método puede tener el paso adicional después del paso de mezcla de evaporar el solvente.
Un método para usar la formulación de la toxina botulínica dentro del ámbito de la presente invención puede ser tragando una formulación oral polimérica que incluye una toxina botulínica, tratando de esta manera un trastorno digestivo influenciado por inervación colinérgica.
Una forma de realización alternativa de la presente invención puede ser un soporte que comprende un polímero seleccionado del grupo de polímeros que consiste en polilactidas y poliglicolidas y una toxina botulínica estabilizada asociada con el soporte, formando de esta manera una formulación oral de toxina botulínica, en donde se pueden liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica del soporte en el aparato digestivo tras la ingestión de la formulación oral por un paciente humano. El soporte puede comprender una pluralidad de conjuntos discretos de microesferas poliméricas, que incorporan toxina botulínica, en donde cada conjunto de polímeros tiene una composición polimérica diferente.
La toxina botulínica usada en una formulación oral según la presente invención puede comprender: un primer elemento que comprende un elemento de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de superficie celular neuronal en condiciones fisiológicas, un segundo elemento que comprende un elemento de translocación capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana celular neuronal, y un tercer elemento que comprende un elemento terapéutico capaz, cuando está presente en el citoplasma de una neurona, de inhibir la exocitosis de acetilcolina de la neurona. El elemento terapéutico puede cortar una proteína SNARE, inhibiendo por lo tanto la exocitosis de acetilcolina de la neurona y se puede seleccionar la proteína SNARE del grupo que consiste en sintaxina, SNAP-25 y VAMP. Generalmente, la neurona afectada por la toxina botulínica es una neurona presináptica, colinérgica que inerva por ejemplo, un músculo del aparato digestivo (músculo liso, estriado o liso y estriado mezclado) o un tejido glandular secretor del aparato digestivo. Aunque una neurona colinérgica puede mostrar gran afinidad por una toxina botulínica (es decir, mediante un receptor para la toxina), las células musculares y células glandulares pueden absorber directamente la toxina a través de un mecanismo de baja afinidad (es decir, pinocitosis), De esta manera, tanto neuronas como células no neuronales pueden ser dianas para la toxina botulínica.
La cantidad de una toxina botulínica administrada mediante un sistema de liberación continua dentro del ámbito de la presente invención durante un periodo determinado puede ser entre 10^{-3} U/kg y 35 U/kg para una toxina botulínica de tipo A y hasta 2000 U/kg para otras toxinas botulínicas, tal como una toxina botulínica de tipo B. 35 U/kg ó 2000 U/kg es un límite superior porque se acerca a una dosis letal de ciertas neurotoxinas tal como la toxina botulínica de tipo A o la toxina botulínica de tipo B, respectivamente. De esta manera, se ha descrito que 2000 unidades/kg de una preparación de toxina botulínica de tipo B comercialmente disponible se acerca a una dosis letal en primates de la toxina botulínica de tipo B. Meyer K.E. et al, A Comparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in Adult Juvenile Cynomolgus Monkeys, Mov. Disord 15(Supl 2); 54; 2000.
Preferiblemente, la cantidad de una toxina botulínica de tipo A administrada mediante una formulación oral durante un periodo determinado está entre 10^{-2} U/kg y 25 U/kg. Preferiblemente, la cantidad de una toxina botulínica de tipo B administrada mediante una formulación oral está entre 10^{-2} U/kg y 1000 U/kg, ya que se ha descrito que menos de 1000 U/kg de toxina botulínica de tipo B se puede administrar por vía intramuscular a un primate sin efecto sistémico. Ibíd. Más preferiblemente, la toxina botulínica de tipo A se administra en una cantidad de entre 10^{-1} U/kg y 15 U/kg. Lo más preferiblemente, la toxina botulínica de tipo A se administra en una cantidad de entre 1 U/kg y 10 U/kg. En muchos casos, una administración de desde 1 unidad hasta 500 unidades de una toxina botulínica de tipo A, proporciona un alivio terapéutico eficaz y de larga duración. Más preferiblemente, se pueden usar desde 5 unidades hasta 300 unidades de un toxina botulínica, tal como una toxina botulínica de tipo A y lo más preferiblemente, se pueden administrar localmente desde 10 unidades hasta 200 unidades de una neurotoxina tal como una toxina botulínica de tipo A a un tejido diana del aparto digestivo con resultados eficaces. En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención se pueden administrar localmente desde 1 unidad hasta 100 unidades de una toxina botulínica tal como una toxina botulínica de tipo A a un tejido diana del aparato digestivo mediante administración oral de la formulación oral divulgada con resultados terapéuticamente eficaces.
La toxina botulínica puede ser fabricada por Clostridium botulinum. Además, la toxina botulínica puede ser una toxina botulínica modificada, es decir, una toxina botulínica que tiene al menos uno de sus aminoácidos delecionado, modificado o cambiado, comparada con la toxina botulínica nativa o salvaje. Además, la toxina botulínica puede ser una toxina botulínica recombinante producida o un derivado o fragmento de la misma.
De forma notable, se ha descrito que el tejido glandular tratado con una toxina botulínica puede mostrar una actividad secretora reducida durante tanto como 27 meses tras la inyección de la toxina. Laryngoscope 1999; 109:1344-1346, Laryngoscope 1998; 108:381-384.
La presente invención se refiere a una formulación oral para la liberación GI de una neurotoxina y a métodos para hacer y usar tales formulaciones orales. La formulación oral puede comprender un matriz polimérica que contiene una toxina botulínica. La formulación oral se diseña para administrar niveles eficaces de neurotoxina cuando se administra por vía oral.
Esta invención se refiere además a una composición, y métodos de hacer y usar la composición, para la controlada de neurotoxina biológicamente activa, estabilizada. La composición de liberación controlada de esta invención puede comprender una matriz polimérica de un polímero biocompatible y neurotoxina biológicamente activa, estabilizada dispersada en el polímero biocompatible.
Definiciones
Aquí se aplican las siguientes definiciones.
"Alrededor" significa más o menos el diez por ciento del valor así calificado.
"Biocompatible" significa que hay una respuesta inflamatoria insignificante tras la ingestión de la formulación oral.
"Compuesto biológicamente activo" significa un compuesto que puede efectuar un cambio beneficioso en el sujeto al que se administra. Por ejemplo, "compuestos biológicamente activos" incluye neurotoxinas.
"Cantidad eficaz" como se aplica al compuesto biológicamente activo significa esa cantidad del compuesto que es generalmente suficiente para efectuar un cambio deseado en el sujeto. Por ejemplo, donde el efecto deseado es la parálisis flácida de un músculo, una cantidad eficaz del compuesto es esa cantidad que produce al menos una parálisis sustancial de los músculos deseados sin producir una parálisis sustancial de músculos adyacentes de los que no se desea la parálisis, y sin producir una reacción de toxicidad sistémica significativa.
"Cantidad eficaz" como se aplica a un ingrediente no activo constituyente de una formulación oral (tal como un polímero usado para formar una matriz o una composición de recubrimiento) se refiere a esa cantidad del ingrediente no activo constituyente que es suficiente para influenciar de forma positiva la liberación de un agente biológicamente activo a una velocidad deseada durante un periodo de tiempo deseado. Por ejemplo, donde el efecto deseado es parálisis muscular usando una formulación oral única, la "cantidad eficaz" es la cantidad que puede facilitar extender la liberación durante un periodo de entre alrededor de 60 días y 6 años. Esta "cantidad eficaz" se puede determinar basada en la enseñanza en esta especificación y el conocimiento general en la técnica.
"Cantidad eficaz" como se aplica a la cantidad de área de superficie de una formulación oral es esa cantidad de área de superficie de formulación oral que es suficiente para realizar un flujo del compuesto biológicamente activo de modo que se alcance un efecto deseado, tal como una parálisis muscular o un descenso en la actividad secretora de una glándula. El área necesaria se puede determinar y ajustar directamente midiendo la liberación obtenida para el compuesto activo particular. El área de superficie de la formulación oral o de un recubrimiento de una formulación oral es esa cantidad de membrana necesaria para encapsular completamente el compuesto biológicamente activo. El área de superficie depende de la geometría de la formulación oral. Preferiblemente, el área de superficie se minimiza donde es posible, para reducir el tamaño de la formulación oral.
"Formulación oral" significa un sistema de distribución de fármaco. La formulación oral comprende un polímero biocompatible o material natural que contiene o que puede actuar como soporte para una molécula con una actividad biológica. Se pretende que la formulación oral sea para que la trague un paciente humano.
"Neurotoxina" significa un agente que puede interrumpir la transmisión del impulso nervioso a través de una unión neuromuscular o neuroglandular, bloquear o reducir la exocitosis neuronal de un neurotransmisor o cambiar el potencial de acción de un canal de sodio operado por voltaje de una neurona. Los ejemplos de neurotoxinas incluyen toxinas botulínicas, toxinas tetánicas, saxitoxinas, y tetrodotoxina.
"Tratamiento" significa cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, e incluye: (i) prevenir que se produzca la enfermedad o (ii) inhibir la enfermedad, es decir, parar su desarrollo; (iii) aliviar la enfermedad, es decir, reducir la incidencia de síntomas de o producir la regresión de la enfermedad.
Un método para hacer una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención para la liberación controlada de una neurotoxina, puede incluir disolver un polímero biocompatible en un solvente de polímero para formar una solución de polímero, dispersando partículas de neurotoxina biológicamente activa, estabilizada en la solución de polímero, y después solidificar el polímero para formar una matriz polimérica que contiene una dispersión de partículas de la neurotoxina.
La presente invención abarca una formulación oral de toxina botulínica de forma sólida que comprende una toxina botulínica y un soporte asociado con la toxina botulínica para formar de esta manera la formulación oral de toxina botulínica de forma sólida. Se puede formular el soporte para que se disuelva en y por lo tanto libere en el aparato digestivo de un paciente cantidades terapéuticas de la toxina botulínica en el aparato digestivo de un paciente. Además, la formulación de toxina botulínica de forma sólida puede mostrar retención gástrica debido a un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión o administración simultánea de un agente farmacológico para retrasar el vaciado gástrico. Mediante "retención gástrica" se quiere decir que la formulación oral tiene un tiempo de permanencia que es mayor que el tiempo de permanencia en el aparato digestivo de un comestible o nutriente típicamente ingerido que no está tratado de modo que muestre una característica de mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o que no se administra simultáneamente con un agente farmacológico que actúa para retrasar el vaciado gástrico.
Preferiblemente, la formulación oral no comprende cantidades sustanciales de toxina botulínica que se ha transformado en un toxoide botulínico antes de la asociación de la toxina botulínica con el soporte. De esta manera, la formulación oral preferiblemente comprende toxina botulínica asociada con el soporte, toxina que tiene una toxicidad sustancialmente sin alterar relativa a la toxicidad de la toxina botulínica antes de la asociación de la toxina botulínica con el soporte.
El soporte de la formulación oral puede comprender una sustancia biocompatible, biodegradable seleccionada del grupo que consiste en harina, azúcar y gelatina. La toxina botulínica de la formulación oral se puede seleccionar del grupo que consiste en toxina botulínica de los tipos A, B, C_{1}, D, E, F y G. Preferiblemente, la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A. La cantidad de la toxina botulínica asociada con el soporte está entre alrededor de 1 unidad y alrededor de 10.000 unidades de la toxina botulínica o entre alrededor de 10 unidades y alrededor de 2.000 unidades de una toxina botulínica de tipo A.
La toxina botulínica puede comprender un primer elemento que comprende un elemento de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de superficie celular neuronal en condiciones fisiológicas; un segundo elemento que comprende un elemento de translocación capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana celular neuronal, y un tercer elemento que comprende un elemento terapéutico capaz, cuando está presente en el citoplasma de una neurona, de inhibir la exocitosis de acetilcolina de la neurona. El elemento terapéutico puede cortar una proteína SNARE, inhibiendo por lo tanto la exocitosis de acetilcolina de la neurona: La proteína SNARE se puede seleccionar del grupo que consiste en sintaxina, SNAP-25 y VAMP.
Una formulación oral alternativa de toxina botulínica dentro del ámbito de la presente invención puede comprender una toxina botulínica de tipo A y un soporte asociado con la toxina botulínica de tipo A, formando por lo tanto una formulación oral de toxina botulínica, en donde el soporte se formula para liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica de tipo A en el aparto digestivo de un paciente con úlcera gástrica sin una respuesta significativa del sistema inmune, y en donde el soporte comprende una sustancia biocompatible, biodegradable, y en donde se puede alcanzar una retención gástrica controlada de la forma sólida mediante un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o mediante una administración simultánea de agentes farmacológicos que retrasan el vaciado del estómago.
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Una formulación adicional dentro del ámbito de la presente invención puede comprender una formulación de toxina botulínica para la administración oral a un paciente con un aparato digestivo que comprende toxina botulínica biológicamente activa, y un soporte biocompatible, biodegradable, no tóxico asociado con la toxina botulínica, en donde el soporte tiene una característica de degradarse rápidamente en un aparato digestivo de un paciente y por lo tanto liberar una cantidad terapéutica de la toxina botulínica biológicamente activa en el aparato digestivo del paciente, sin una respuesta significativa del sistema inmune a la toxina botulínica ingerida.
El soporte de la formulación oral puede comprender una pluralidad de microesferas poliméricas o el soporte puede comprender una matriz polimérica. Un método dentro del ámbito de la presente invención puede comprender un método para usar una formulación oral de toxina botulínica comprendiendo el método el paso de ingerir una formulación oral de una toxina botulínica.
Una forma de realización detallada dentro del ámbito de la presente invención puede ser una formulación oral de toxina botulínica que comprende:
(a)
un soporte que comprende un polímero seleccionado del grupo de polímeros que consiste en polilactidas, poliglicolidas y polianhídridos;
(b)
una toxina botulínica estabilizada asociada con el soporte, formando por lo tanto una formulación oral botulínica,
en donde se pueden liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica del soporte en el aparato digestivo de un paciente.
Descripción
La presente invención se basa en el descubrimiento de una formulación oral terapéuticamente eficaz de una toxina botulínica. De esta manera, se ha descubierto que la ingestión de una toxina botulínica, tal como una toxina botulínica de tipo A, mezclada con un soporte adecuado, que se disuelve en el aparato digestivo, permite la distribución de cantidades terapéuticas de una toxina botulínica bioactiva en y en la proximidad de un trastorno digestivo. Típicamente, a los pocos días después el trastorno digestivo muestra signos inequívocos de curación (remisión) y se puede curar completamente en unas pocas semanas después de la administración de la formulación oral de toxina botulínica. Los efectos secundarios pueden incluir una motilidad reducida de los músculos gastrointestinales y pérdida de peso.
La dosis terapéutica de la toxina botulínica administrada por vía oral es tal que hay efectos sistémicos nominales o insignificantes debido a cualquier toxina botulínica que se absorbe a través del recubrimiento del intestino al sistema circulatorio. De esta manera, se pueden inyectar 200 unidades de toxina botulínica en el esfínter pilórico (estómago inferior) de pacientes con gastroparesia diabética sin ninguna toxicidad sistémica subsiguiente. Crowell, M.D., et al., Botulinum toxin reduces pyloric dysfunction in patients with diabetic gastroparesis, Gastroenterology Abr 2002; 122(4 Sup 1):A451-A452. Aunque no hay evidencia de un efecto teratogénico por una toxina botulínica, los métodos dentro del ámbito de la invención divulgada aquí no se pretenden para su aplicación a o por una paciente que está embarazada, en periodo de lactancia o que pretende quedarse embarazada durante el periodo de tratamiento.
Sin querer estar unido por ninguna teoría, se puede proponer un mecanismo fisiológico para la eficacia de la presente invención. De esta manera, es bien sabido que la toxina botulínica actúa sobre nervios colinérgicos, incluyendo aquellos en el aparato digestivo responsables de la motilidad de los músculos GI. Pasricha, P.J., Botulinum toxin for spastic gastrointestinal disorders, Bailliere's Clin Gastroenterol 1999; 13(1):131-143. Además, la secreción de gastrina y la producción de HCl por las células parietales gástricas dependen fuertemente de la actividad colinérgica de las fibras vagas y mientéricas que actúan sobre las uniones neuroglandulares en el aparato digestivo. Rossi S., et al., Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in thestomach of rat, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 365(Supl 2):R37. Además, el sustrato intracelular (SNAP-25) para la toxina botulínica de tipo A BTX-A está presente en células de la pared del estómago. Gui D., et al., Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions. A possible tool for correction of obesity?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol Jun 2002; 365(Supl 2):R22. De esta manera, se puede usar una formulación oral de una toxina botulínica para tratar muchos trastornos digestivos diferentes, por ejemplo reduciendo la motilidad de un músculo gastrointestinal colinérgicamente inervado o reduciendo la secreción excesiva de una glándula gastrointestinal colinérgicamente inervada.
Una toxina botulínica administrada por vía oral puede permanecer bioactiva en el ambiente severo del aparato digestivo. De esta manera, la toxina botulínica se secreta por una bacteria clostridial como un complejo que comprende la molécula de toxina proteica de cadena sencilla de aproximadamente 150 kD rodeada por un número de moléculas proteicas no toxina. De forma significativa, las proteínas no toxina actúan para proteger la toxina de la hidrólisis ácida y degradación enzimática durante el tránsito del complejo a través del aparato digestivo, de modo que el complejo de toxina es capaz de sobrevivir las condiciones severas de extremos de pH y enzimas proteolíticas y funcionar todavía como una neurotoxina potente. Se ha demostrado que las proteínas no toxinas que están en complejo con la molécula de toxina botulínica actúan para proteger la molécula de toxina de 150 kD en el aparato digestivo de los ácidos digestivos. Hanson, M.A. et al., Structural view of botulinum neurotoxin in numerous functional states, que es el capítulo 2, páginas 11-27 de Brin M.F. et al, editores, Scientific and therapeutic aspects of botulinum Toxin, Lippincott, Williams & Wilkins (2002).
Una formulación oral de toxina botulínica dentro del ámbito de la presente invención es capaz de liberar una cantidad terapéutica de una toxina botulínica en el aparato digestivo de un paciente con un trastorno digestivo. La cantidad de toxina botulínica liberada puede comprender (para una toxina botulínica de tipo A) tan poco como alrededor de 10 unidades (es decir, para tratar un trastorno de motilidad GI en un lactante) hasta tanto como 500 unidades (es decir, para tratar glándulas GI con secreción excesiva en un adulto grande). La cantidad de toxina botulínica requerida para la eficacia terapéutica puede variar según la potencia clínica conocida de los diferentes serotipos de toxina botulínica. Por ejemplo, típicamente se requieren varios órdenes de magnitud más unidades de una toxina botulínica de tipo B para alcanzar un efecto fisiológico comparable al alcanzado del uso de una toxina botulínica de tipo A.
La toxina botulínica liberada en cantidades terapéuticamente eficaces por una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención es preferiblemente, toxina botulínica sustancialmente biológicamente activa. En otras palabras, la toxina botulínica liberada de la formulación oral es capaz de unirse con alta afinidad a una neurona colinérgica, ser translocada, al menos en parte, a través de la membrana neuronal, y mediante su actividad en el citosol de la neurona de inhibir la exocitosis de acetilcolina de la neurona. La presente invención excluye de su ámbito de uso el uso deliberado de un toxoide botulínico como un antígeno para conferir inmunidad a la toxina botulínica mediante el desarrollo de anticuerpos (respuesta inmune) debido a la inmunogenicidad del toxoide. El propósito de la presente invención es permitir una liberación de cantidades mínimas de una toxina botulínica de una formulación administrada por vía oral como para inhibir la exocitosis in vivo en el aparato digestivo de un paciente y por lo tanto alcanzar un efecto terapéutico deseado, tales como la reducción del espasmo muscular o tono muscular, prevenir que se contraiga un músculo o reducir una secreción excesiva de una célula o glándula secretora colinérgicamente influenciada en el aparato digestivo.
La formulación oral se prepara de modo que la toxina botulínica se disperse sustancialmente de forma uniforme en un soporte biodegradable. Una formulación oral alternativa dentro del ámbito de la presente invención puede comprender un soporte recubierto por un recubrimiento biodegradable, variando bien el espesor del recubrimiento bien el material de recubrimiento.
Se puede usar el espesor de la formulación oral para controlar la absorción de agua por, y de esta manera la velocidad de liberación de una forma de neurotoxina de, una composición de la invención, liberando las formulaciones orales más gruesas el polipéptido de forma más lenta que las más finas.
La neurotoxina en una composición de liberación controlada de neurotoxina también se puede mezclar con otros excipientes, tales como agentes de carga o agentes estabilizadores adicionales, tales como tampones para estabilizar la neurotoxina durante la liofilización.
El soporte preferiblemente está compuesto de un material biocompatible, no tóxico, no inmunológico. Los materiales adecuados para formulación oral pueden incluir polímeros de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (p-HEMA), poli(N-vinilpirrolidona) (p-NVP)+, poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico) (PAA), polidimetilsiloxanos (PMDS), copolímeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), un polimetilmetacrilato (PMMA), copolímeros de polivinilpirrolidona/metacrilato, poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), polianhídridos, poli(orto ésteres), colágeno y derivados celulósicos y biocerámicas, tales como hidroxiapatita (HPA), fosfato de tricalcio (TCP), y fosfato de aluminocalcio (ALCAP).
Los soportes biodegradables pueden estar hechos de polímeros de poli(lactidas), poli(glicolidas), colágenos, poli(lactida-co-glicolida), poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), poli(ácidos lácticos-co-ácidos glicólicos), policaprolactona, policarbonatos, poliesteramidas, polianhídridos, poli(aminoácidos), poliortoésteres, policianoacrtilatos, poli(p-dioxanona), poli(oxalatos de alquileno), poliuretanos biodegradables, mezclas y copolímeros de los mismos. Los soportes particularmente preferidos están formados como polímeros o copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) ("PLGA"), donde la relación lactida:glicolida puede variar dependiendo de la velocidad de degradación deseada del soporte.
Los polímeros biodegradables de PLGA se han usado para formar suturas y placas óseas resorbibles y en varias formulaciones de micropartículas comerciales. PLGA se degrada a través de erosión masiva para producir ácido láctico y glicólico y está comercialmente disponible en una variedad de pesos moleculares y grupos terminales del polímero (por ejemplo, alcohol laurico o ácido libre).
Los polianhídridos son otro grupo de polímeros que se han aprobado para su uso en seres humanos, y se han usado para distribuir proteínas y antígenos. De forma diferente a PLGA, los polianhídridos se degradan mediante erosión de superficie, liberando la neurotoxina atrapada en la superficie del soporte.
Para preparar una formulación oral adecuada, el polímero soporte se puede disolver en un solvente orgánico tales como cloruro de metileno o acetato de etilo y se puede mezclar después la toxina botulínica en la solución del polímero. Los procesos convencionales para la formación de microesferas son los métodos de evaporación del solvente y (coacervación) de solvente. El método de la doble emulsión de agua en aceite en agua (W/O/W) es un método ampliamente usado de encapsulación de antígeno proteico en microesferas de PLGA.
También se puede usar una solución acuosa de una toxina botulínica para hacer una formulación oral. Se añade una solución acuosa de la neurotoxina a la solución de polímero (polímero previamente disuelto en un solvente orgánico adecuado). El volumen de la solución acuosa (neurotoxina) relativo al volumen de solvente orgánico (polímero) es un parámetro importante en la determinación tanto de las características de liberación de las microesferas como con respecto a la eficacia de encapsulación (relación de carga de proteína teórica a experimental) de la neurotoxina.
La eficacia de encapsulación también se puede aumentar aumentando la viscosidad cinemática de la solución de polímero. La viscosidad cinemática de la solución de polímero se puede aumentar disminuyendo la temperatura de operación y/o aumentando la concentración de polímero en el solvente orgánico.
De esta manera, con un relación de volumen de fase acuosa (neurotoxina) a fase orgánica (polímero) baja (es decir, volumen acuoso: volumen orgánico es \leq 0,1 ml/ml) esencialmente se puede encapsular el 100% de la neurotoxina por las microesferas y las microesferas pueden mostrar una liberación trifásica: un estallido inicial (primer pulso), una fase de latencia con poca o ninguna neurotoxina liberada y una segunda fase de liberación (segundo pulso).
La duración de la fase de latencia depende de la velocidad de degradación del polímero que a su vez depende de la composición del polímero y su peso molecular. De esta manera, la fase de latencia entre el primer pulso (estallido) y el segundo pulso aumenta al aumentar el contenido de lactida, o al aumentar el peso molecular del polímero manteniéndose constante la relación lactida: glicolida. Además de un volumen de fase acuosa (neurotoxina) bajo, la operación a baja temperatura (2-8 grados C), como se ha indicado anteriormente, aumenta la eficacia de encapsulación, así como reduce el estallido inicial y fomenta la estabilidad aumentada de la neurotoxina contra la inactivación térmica.
Las formulaciones orales adecuadas dentro del ámbito de la presente invención para la liberación controlada in vivo de una neurotoxina, tal como una toxina botulínica, se pueden preparar de modo que la formulación oral libere la neurotoxina en el aparato digestivo.
Preferiblemente, una formulación oral libera la toxina botulínica con niveles insignificantes de la toxina en suero. Una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención también se puede formular como una suspensión para ingestión. Tales suspensiones se pueden fabricar mediante técnicas generales bien conocidas en la técnica farmacéutica, por ejemplo moliendo la mezcla polilactida/polipéptido en un molino de ultracentrífuga ajustado con una criba de malla adecuada, por ejemplo una malla de 120, y suspendiendo las partículas molidas, cribadas en un solvente para inyección, por ejemplo propilenglicol, agua opcionalmente con agente de aumento de la viscosidad o de suspensión convencional, aceites u otras vehículos líquidos conocidos, adecuados para la ingestión oral.
Preferiblemente, la liberación de la neurotoxina biológicamente activa in vivo no produce una respuesta significativa del sistema inmune durante el periodo de liberación de la neurotoxina.
Una formulación oral de toxina botulínica preferiblemente permite la liberación botulínica de microesferas de polímero biodegradable en una forma biológicamente activa es decir, con una conformación de la toxina sustancialmente nativa. Para estabilizar una neurotoxina, tanto en un formato que produce la neurotoxina útil para mezclar con un polímero adecuado que puede formar la matriz de la formulación oral (es decir, una neurotoxina en polvo que se ha desecado por congelación o liofilizado) así como mientras la neurotoxina está presente o incorporada en la matriz del polímero seleccionado, se pueden usar varios excipientes farmacéuticos. Los excipientes adecuados pueden incluir almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, albúmina y leche desnatada en polvo. La neurotoxina en una formulación oral de neurotoxina se puede mezclar con excipientes, agentes de carga y agentes estabilizantes, y tampones para estabilizar la neurotoxina durante la liofilización o desecado por congelación.
Se ha descubierto que una neurotoxina estabilizada puede comprender neurotoxina biológicamente activa, no agregada en complejo con al menos un tipo de catión metálico multivalente que tiene una valencia de +2 ó más.
Los cationes metálicos multivalentes incluyen cationes metálicos contenidos en componentes de cationes metálicos biocompatibles. Un componente catiónico metálico es biocompatible si el componente catiónico no es tóxico para el receptor, en las cantidades usadas, y tampoco presenta efectos nocivos o adversos significativos en el cuerpo del receptor, tal como una reacción inmunológica tras la administración oral de la formulación.
Preferiblemente, la relación molar del componente catiónico metálico a neurotoxina, para el catión metálico que estabiliza la neurotoxina, está entre alrededor de 4:1 hasta alrededor de 100:1 y más típicamente de alrededor de 4:1 hasta alrededor de 10:1.
Un catión metálico preferido usado para estabilizar una toxina botulínica es Zn^{++} porque se sabe que las toxinas botulínicas son zinc endopeptidasas. Los cationes divalentes de zinc son preferidos porque se sabe que la toxina botulínica es una endopeptidasa de zinc divalente. En una forma de realización más preferida, la relación molar de componente de catión metálico, que contiene cationes Zn^{++}, a la neurotoxina es alrededor de 6:1.
El experto en la materia puede determinar la idoneidad de un catión metálico para estabilizar una neurotoxina realizando una variedad de técnicas de indican estabilidad tal como electroforesis en gel de poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, cromatografía de fase reversa, HPLC y ensayos de potencia en partículas liofilizadas de neurotoxina que contienen cationes metálicos para determinar la potencia de la neurotoxina después de la liofilización y durante la liberación a partir de las micropartículas. En una neurotoxina estabilizada, la tendencia de la neurotoxina a agregar en una micropartícula durante la hidratación in vivo y/o a perder actividad biológica o potencia debido a la hidratación o debido al proceso de formación de una composición de liberación sostenida, o debido a las características químicas de una composición de liberación sostenida, se reduce formando complejos de al menos un tipo de catión metálico con la neurotoxina antes de poner en contacto la neurotoxina con una solución de polímero.
Mediante la presente invención, la neurotoxina estabilizada se estabiliza contra agregación significativa in vivo a lo largo del periodo de liberación controlada. Se define agregación significativa como una cantidad de agregación que produce la agregación de alrededor del 15% o más de la neurotoxina encapsulada en polímero o incorporada a la matriz polimérica. Preferiblemente, la agregación se mantiene por debajo de alrededor del 5% de la neurotoxina. Más preferiblemente, la agregación se mantiene por debajo de alrededor del 2% de la neurotoxina presente en el polímero.
En otra forma de realización, una composición de liberación controlada de neurotoxina también contiene un segundo componente catiónico metálico, que no está contenido en las partículas de neurotoxina estabilizada, y que se dispersa en el soporte. El segundo componente catiónico metálico preferiblemente contiene la misma especie de catión metálico, que está contenido en la neurotoxina estabilizada. De forma alternativa, el segundo componente catiónico metálico puede contener una o más especies diferentes de catión metálico.
El segundo componente catiónico metálico actúa para modular la liberación de la neurotoxina de la matriz polimérica de la formulación oral, tal como actuando como un depósito de cationes metálicos para alargar adicionalmente el periodo de tiempo a lo largo del cual la neurotoxina se estabiliza por un catión metálico para aumentar la estabilidad de la neurotoxina en la composición.
Un componente catiónico metálico usado en modular la liberación típicamente contiene un tipo de catión metálico multivalente. Ejemplos de segundos componentes catiónicos metálicos adecuados para modular la liberación de neurotoxina, incluyen, o contienen, por ejemplo, Mg(OH)_{2}, MgCO_{3} (tal como 4MgCO_{3}Mg(OH)_{2}5H_{2}O), ZnCO_{3} (tal como 3Zn(OH)_{2}2ZnCO_{3}), CaCO_{3}, Zn_{3}(C_{6}H_{5}O_{7})_{2}, Mg(OAc)_{2}, MgSO_{4}, Zn(OAc)_{2}, ZnSO_{4}, ZnCl_{2}, MgCl_{2} y Mg_{3}(C_{6}H_{5}O_{7})_{2}. Una relación adecuada segundo componente catiónico metálico a polímero está entre alrededor de 1:99 hasta alrededor de 1:2 en peso. La relación óptima depende del polímero y del segundo componente catiónico metálico utilizados.
La formulación oral de neurotoxina de esta invención se puede formar en muchas formas tales como una película, una pella, un cilindro, un disco o una microesfera. Una microesfera, como se define aquí, comprende un componente soporte que tiene un diámetro de menos de alrededor de un milímetro y que tiene una neurotoxina estabilizada dispersada en el mismo. Una microesfera puede tener una forma esférica, no esférica o irregular. Se prefiere que una microesfera sea de forma esférica. Típicamente, la microesfera estará suspendida en un líquido adecuado para la ingestión. Un intervalo de tamaño preferido para microesferas es desde alrededor de 1 hasta alrededor de 180 micrómetros de diámetro.
En el método de esta invención para formar una composición para liberación GI de una neurotoxina biológicamente activa, no agregada, se dispersan una cantidad adecuada de partículas de neurotoxina biológicamente activa, no agregada en un soporte.
Un solvente de soporte polimérico adecuado, como se define aquí, es un solvente en el que el polímero es soluble pero en el que la neurotoxina estabilizada es sustancialmente insoluble y no reactiva. Ejemplos de solventes de polímero adecuados incluyen líquidos orgánicos polares, tales como cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo y acetona.
Para preparar neurotoxina biológicamente activa, estabilizada, se mezcla la neurotoxina en un solvente acuoso adecuado con al menos un componente catiónico metálico adecuado en condiciones de pH adecuadas para formar un complejo de catión metálico y neurotoxina. Típicamente, la neurotoxina en complejo estará en la forma de un precipitado turbio, que se suspende en el solvente. Sin embargo, la neurotoxina en complejo también puede estar en solución. En una forma de realización incluso más preferida, la neurotoxina está en complejo con Zn^{++}.
Las condiciones adecuadas de pH para formar un complejo de neurotoxina típicamente incluyen valores de pH entre alrededor de 5,0 y alrededor de 6,9. Las condiciones de pH adecuadas típicamente se alcanzan mediante el uso de un tampón acuoso, tal como bicarbonato de sodio, como solvente.
Los solventes adecuados son aquellos en los que la neurotoxina y el componente catiónico metálico son cada uno al menos ligeramente solubles, tal como en un tampón acuoso de bicarbonato de sodio. Para solventes acuosos, se prefiere que el agua usada sea agua desionizada o agua para inyección (WFI).
La neurotoxina puede estar en un estado sólido o disuelto, antes de ser puesta en contacto con el componente de catión metálico. Además, el componente catión metálico puede estar en un estado sólido o disuelto, antes de ser puesto en contacto con la neurotoxina. En una forma de realización preferida, se mezcla una solución acuosa tamponada de la neurotoxina con una solución acuosa del componente catión metálico.
Típicamente, la neurotoxina en complejo estará en forma de un precipitado turbio, que se suspende en el solvente. Sin embargo, la neurotoxina en complejo también puede estar en solución. En una forma de realización preferida, la neurotoxina está en complejo con Zn^{++}.
La neurotoxina en complejo con Zn^{++} se puede secar, tal como mediante liofilización, para formar partículas de neurotoxina estabilizada. La neurotoxina en complejo con Zn^{++}, que está suspendida o en solución, se puede liofilizar en masa o se puede dividir en volúmenes más pequeños que después se liofilizan. En una forma de realización preferida, la suspensión de neurotoxina en complejo con Zn^{++} se microniza, tal como mediante el uso de un atomizador ultrasónico, y después se liofiliza para formar partículas de neurotoxina estabilizada. Medios aceptables para liofilizar la mezcla de neurotoxina en complejo con Zn^{++} incluyen aquellos conocidos en la técnica.
En otra forma de realización, también se dispersa en la solución de polímero un segundo componente de catión metálico, que no está contenido en las partículas de neurotoxina estabilizada.
Se entiende que un segundo componente catiónico metálico y la neurotoxina estabilizada se pueden dispersar en una solución de polímero de forma secuencial, en orden inverso, de forma intermitente, por separado o mediante adiciones concurrentes. De forma alternativa, se pueden mezclar un polímero, un segundo componente de catión metálico y la neurotoxina estabilizada en un solvente polimérico de forma secuencial, en orden inverso, de forma intermitente, por separado o mediante adiciones concurrentes. En este método, el solvente de polímero se solidifica después para formar una matriz polimérica que contiene una dispersión de neurotoxinas estabilizadas.
Se describe un método adecuado para formar formulaciones orales de una neurotoxina a partir de una solución de polímero en las patentes de EE.UU. números 3737337; 3523906; 3691090; y 4389330. Se puede usar la evaporación del solvente como un método para formar una formulación oral de neurotoxina.
En el método de evaporación de solvente, una solución de polímero que contiene una dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada se mezcla en o se agita con una fase continua, en la que el solvente del polímero es parcialmente miscible, para formar una emulsión. La fase continua normalmente es un solvente acuoso. Con frecuencia se incluyen emulsionantes en la fase continua para estabilizar la emulsión. El solvente de polímero se evapora después a lo largo de un periodo de varias horas o más, solidificando de esta manera el polímero para formar una matriz polimérica que tiene una dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada contenida allí.
Se describe un método preferido para formar microesferas de liberación controlada de neurotoxina de una solución de polímero en la patente de EE.UU. número 5019400. Este método de formación de microesferas, comparado con otros métodos, tal como la separación de fases, reduce además la cantidad de neurotoxina requerida para producir una formulación oral con un contenido específico de neurotoxina.
En este método, la solución de polímero, que contiene la dispersión de neurotoxina estabilizada, se procesa para crear gotitas, en donde al menos una parte significativa de las gotitas contienen solución de polímero y la neurotoxina estabilizada. Estas gotitas se congelan después por medios adecuados para formar microesferas. Los ejemplos de medios para procesar la dispersión de solución de polímero para formar gotitas incluyen dirigir la dispersión a través de un atomizador ultrasónico, atomizador a presión, propulsor de Rayleigh, o mediante otros medios conocidos para crear gotitas a partir de una solución.
El solvente en las microgotitas congeladas se extrae como un sólido y/o líquido en el no solvente para formar microesferas que contienen neurotoxina estabilizada. Mezclar etanol como otros no solventes, tales como hexano o pentano, puede aumentar la velocidad de extracción del solvente, por encima de la alcanzada con etanol solo, a partir de ciertos polímeros, tal como polímeros de poli(lactida-co-glicolida).
Aún otro método de formar una formulación oral de neurotoxina, a partir de una solución de polímero, incluye moldeado de películas, tales como en un molde, para formar una película o una forma. Por ejemplo, después de poner la solución de polímero que contiene una dispersión de neurotoxina estabilizada en un molde, se elimina después el solvente del polímero por medios conocidos en la técnica, o se reduce la temperatura de la solución de polímero, hasta que se obtiene una película o forma, con un peso seco consistente.
En el caso de una formulación oral de polímero biodegradable, la liberación de la neurotoxina se produce debido a la degradación del polímero. Se puede controlar la velocidad de degradación cambiando las propiedades del polímero que influencian la velocidad de hidratación del polímero. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, la relación de diferentes monómeros, tales como lactida y glicolida, que comprende un polímero; el uso del isómero L de un monómero en lugar de una mezcla racémica; y el peso molecular del polímero. Estas propiedades pueden afectar la hidrofilicidad y cristalinidad, que controlan la velocidad de hidratación del polímero. También se pueden incorporar excipientes hidrofílicos, tales como sales, hidratos de carbono y agentes tensoactivos para aumentar la hidratación y que pueden alterar la velocidad de erosión del polímero.
Cambiando las propiedades de un polímero biodegradable, se pueden controlar las contribuciones de la difusión y/o degradación del polímero a la liberación de la neurotoxina. Por ejemplo, aumentar el contenido de glicolida de un polímero poli(lactida-co-glicolida) y disminuir el peso molecular del polímero puede aumentar la hidrólisis del polímero y de esta manera, proporciona una liberación de neurotoxina aumentada a partir de la erosión del polímero. Además, la velocidad de hidrólisis del polímero aumenta a pH no neutros. Por lo tanto, se puede añadir un excipiente ácido o uno básico a la solución de polímero, usada para la formación de microesferas, para cambiar la velocidad de erosión del polímero.
Se puede administrar una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención a un ser humano para proporcionar la dosis deseada de neurotoxina basada en los parámetros conocidos para el tratamiento con neurotoxina de varias afecciones médicas, como se ha explicado anteriormente.
La dosis específica por la formulación oral apropiada para administración se determina fácilmente por el experto en la materia según los factores discutidos anteriormente. La dosis también puede depender del tamaño de la masa de tejido a ser tratado o desnervado, y de la preparación comercial de la toxina. Además, se pueden extrapolar las estimaciones para dosis apropiadas en seres humanos a partir de determinaciones de las cantidades de botulínica requerida para denervación eficaz de otros tejidos. De esta manera, la cantidad de toxina botulínica A a inyectar es proporcional a la masa y nivel de actividad del tejido a tratar. Generalmente, se pueden liberar entre alrededor de 0,01 unidades por kilogramo hasta alrededor de 35 unidades por kg de peso de paciente de una toxina botulínica, tal como una toxina botulínica de tipo A, por la presente formulación oral por unidad de periodo de tiempo (es decir, a lo largo de un periodo de o una vez cada 2-4 meses) para logar de forma eficaz una parálisis muscular deseada. Menos de alrededor de 0,01 U/kg de una toxina botulínica no tiene un efecto terapéutico significativo en un músculo, mientras que más de alrededor de 35 U/kg de una toxina botulínica se acerca a una dosis tóxica de una neurotoxina, tal como una toxina botulínica de tipo A. La preparación cuidadosa de la formulación oral previene que aparezcan cantidades significativas de forma sistémica de una toxina botulínica. Un intervalo de dosis más preferido es desde alrededor de 0,01 U/kg hasta alrededor de 25 U/kg de una toxina botulínica, tal como la formulada como BOTOX®. La cantidad real de U/kg de una toxina botulínica a ser administrada depende de factores tal como la extensión (masa) y nivel de actividad del tejido a tratar y la vía de administración elegida. La toxina botulínica de tipo A es un serotipo preferido de toxina botulínica para su uso en los métodos de la presente invención.
Preferiblemente, una neurotoxina usada para practicar un método dentro del ámbito de la presente invención es una toxina botulínica, tal como la de las toxinas botulínicas de serotipo A, B, C, D, E, F ó G. Preferiblemente, la toxina botulínica usada es toxina botulínica de tipo A, debido a su alta potencia en seres humanos, fácil disponibilidad, y uso seguro y eficaz conocido para el tratamiento de trastornos de músculo esquelético y músculo liso cuando se administra de forma local mediante inyección intramuscular.
La presente invención incluye dentro de su ámbito el uso de cualquier neurotoxina que tiene un efecto terapéutico de larga duración cuando se usa para tratar un trastorno de movimiento o una afección influenciada por inervación colinérgica. Por ejemplo, se pueden usar o adaptar para su uso en los métodos de la presente invención neurotoxinas fabricadas por cualquiera de las especies de las bacterias Clostridium productoras de toxinas, tales como Clostridium botulinum, Clostridium butyricum y Clostridium beratti. Además, se pueden usar ventajosamente todos los serotipos botulínicos, A, B, C, D, E, F y G en la práctica de la presente invención, aunque el tipo A es el serotipo más preferido, como se ha explicado anteriormente. La práctica de la presente invención puede proporcionar alivio eficaz desde 1 mes hasta alrededor de 5 ó 6 años.
La presente invención incluye en su ámbito: (a) complejo de neurotoxina así como neurotoxina pura obtenida o procesada mediante cultivo bacteriano, extracción de toxina, concentración, conservación, liofilización y/o reconstitución y (b) neurotoxina modificada o recombinante, es decir, neurotoxina que ha tenido uno o más aminoácidos o secuencias de aminoácidos deliberadamente delecionado, modificado o cambiado mediante procedimientos químico/bioquímicos de modificación de aminoácidos o mediante el uso de tecnologías recombinantes conocidas de células huésped/vector recombinante, así como derivados o fragmentos de neurotoxinas hechas así, e incluye neurotoxinas con uno más grupos de direccionamiento unidos para un receptor de superficie celular presente en una célula.
Las toxinas botulínicas para su uso según la presente invención se pueden almacenar en forma liofilizada o desecada al vacío en envases a presión de vacío. Antes de la liofilización la toxina botulínica se puede combinar con excipientes, estabilizantes y/o soportes farmacéuticamente aceptables, tal como albúmina. El material liofilizado o desecado al vacío se puede reconstituir con solución salina o agua.
La presente invención también incluye en su ámbito el uso de una formulación oral para proporcionar alivio terapéutico a un trastorno digestivo. De esta manera, la neurotoxina se puede embeber dentro de, absorber, o transportar por una matriz polimérica adecuada que se puede tragar.
Los métodos para determinar la vía apropiada de administración y dosis generalmente se determinan caso a caso por el médico. Tales determinaciones son rutinarias para el experto en la materia (ver, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14ª edición, publicado por McGraw Hill). De esta manera, una formulación oral dentro del ámbito de la presente invención se puede administrar siendo tragada.
Se sabe que un contenido significativo de agua en el toxoide tetánico liofilizado puede producir agregación de fase sólida e inactivación del toxoide una vez encapsulado dentro de microesferas. De esta manera, con un contenido en agua en el toxoide tetánico del 10% (gramos de agua por 100 gramos de proteína) alrededor de 25% de la toxina sufre agregación, mientras que con un contenido de agua del 5% sólo agrega alrededor del 5% del toxoide. Ver, por ejemplo, página 251, Schwendeman S.P. et al., Peptide, Protein, and Vaccine Delivery From Oral formulationable Polymeric Systems, capítulo 12 (páginas 229-267) de Park K., Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies, American Chemical Society (1997). De forma significativa, el proceso de fabricación para BOTOX® produce un complejo de toxina botulínica de tipo A liofilizado que tiene un contenido de humedad de menos de alrededor del 3%, nivel de humedad al que se puede esperar agregación de fase sólida nominal.
Un procedimiento general para hacer una formulación de toxina botulínica biodegradable es como sigue. La formulación oral puede comprender desde alrededor del 25% hasta alrededor del 100% de una polilactida que es un polímero de ácido láctico solo. Aumentar la cantidad de lactida en la formulación oral puede aumentar el periodo de tiempo antes del cual la formulación oral empieza a biodegradarse, y por lo tanto aumenta el tiempo para la liberación de la toxina botulínica de la formulación oral. La formulación oral también puede ser un copolímero de ácido láctico y ácido glicólico. El ácido láctico puede estar en forma racémica u ópticamente activa, y puede ser soluble en benceno y tener un viscosidad inherente de desde 0,093 (1 g por ml en cloroformo) hasta 0,5 (1 g por 100 ml en benceno), o insoluble en benceno y tener una viscosidad inherente de desde 0,093 (1 g por ml en cloroformo) hasta 4 (1 g por 100 ml en cloroformo o dioxina). La formulación oral también puede comprender desde el 0,001% hasta el 50% de una toxina botulínica uniformemente dispersada en el polímero soporte.
Una vez que una formulación oral empieza a absorber agua puede mostrar dos fases sucesivas y generalmente distintas de liberación de neurotoxina. En la primera fase la neurotoxina se libera mediante difusión inicial a través de regiones acuosas de neurotoxina que comunican con la superficie exterior de la formulación oral. La segunda fase sucede tras la liberación de la neurotoxina consiguiente a la degradación del soporte biodegradable (es decir, una polilactida). La fase de difusión y la fase inducida por degradación pueden ser temporalmente distintas en el tiempo. Cuando la formulación oral se coloca en un medio acuoso fisiológico, el agua difunde en la matriz polimérica y se reparte entre neurotoxina y polilactida para formar regiones acuosas de neurotoxina. Las regiones acuosas de neurotoxina aumentan al aumentar la absorción de agua, hasta que la continuidad de las regiones acuosas de neurotoxina alcanza un nivel suficiente para comunicarse con la superficie exterior de la formulación oral. De esta manera, la neurotoxina empieza a ser liberada de la formulación oral mediante difusión a través de canales polipeptídicos acuosos formados de las regiones acuosas de neurotoxina, mientras que la segunda fase continúa hasta que sustancialmente toda la neurotoxina restante se ha liberado.
También dentro del ámbito de la presente invención está una formulación oral en forma de una suspensión preparada suspendiendo las microesferas con neurotoxina encapsulada en un líquido adecuado, tal como una solución salina fisiológica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos muestran composiciones y métodos específicos abarcados por la presente invención y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención.
Ejemplo 1 Método para hacer un comprimido de toxina botulínica para ingestión oral
Se puede mezclar una toxina botulínica como una formulación oral para la liberación del principio activo de la toxina en el estómago o duodeno. Esto se logra fácilmente mezclando con mortero y mano (a temperatura ambiente sin adición de agua o solución salina) 50 unidades de un polvo de toxina botulínica liofilizada comercialmente disponible, tal como BOTOX® no reconstituido (ó 200 unidades de DYSPORT® en polvo) con un soporte biodegradable tales como harina o azúcar. De forma alternativa, la toxina botulínica se puede mezclar mediante homogenización o sonicación para formar una dispersión fina de la toxina en polvo en el soporte. La mezcla se puede comprimir después con una máquina de hacer comprimidos (tal como la prensa de comprimidos disponible de Scheu & Kniss, 1500 W. Ormsby Ave, Louisville, KY 40210) para hacer un comprimido ingerible. De forma alternativa, la toxina se puede formular con gelatina mediante metodologías bien conocidas para hacer un comprimido de gelatina ("geltab") ingerible.
Ejemplo 2 Método para tratar la obesidad
Se trata un hombre obeso de 42 años mediante administración de la formulación oral de toxina botulínica del ejemplo 1. El paciente se traga un comprimido de 50 unidades de tipo A durante cada uno de cuatro días. En dos semanas el paciente ha perdido diez libras (4,53 kg), y la pérdida de peso aumenta a 20 libras (9,07 kg) al final de la cuarta semana, debido aparentemente a la motilidad gastrointestinal reducida.
Ejemplo 3 Método para hacer una formulación oral de toxina botulínica biodegradable
Se puede preparar una formulación oral biodegradable que comprende una toxina botulínica y un polímero soporte adecuado dispersando una cantidad apropiada de una preparación de toxina botulínica estabilizada (es decir, BOTOX® no reconstituido) en una fase continua que consiste en un polímero biodegradable en un solvente orgánico volátil, tal como diclorometano. Tanto PLGA como los polianhídridos son insolubles en agua y requieren el uso de solventes orgánicos en el proceso de microencapsulación.
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Se disuelve el polímero en un solvente orgánico tal como cloruro de metileno o acetato de etilo para facilitar la fabricación de microesferas. La toxina botulínica se mezcla después mediante homogenización o sonicación para formar una dispersión fina en polímero/solvente orgánico, como una emulsión cuando se usa una solución acuosa de proteína o como una suspensión cuando se mezcla una formulación sólida de proteína con la solución polímero-solvente orgánico. Los procesos convencionales para formación de microesferas son métodos de evaporación de solvente y (coacervación) de solvente. Se pueden formar las microesferas mezclando la solución preformada de fármaco proteico con el polímero-solvente orgánico, con agua que contiene un emulsionante (es decir, alcohol polivinílico). Se añade después agua adicional para facilitar la eliminación del solvente orgánico de las microesferas dejando que se endurezcan. Las microesferas finales se secan para producir un polvo suelto.
El polímero usado puede ser PLA, PGA o un copolímero de los mismos. De forma alternativa, se puede preparar un polímero que incorpora la toxina botulínica emulsionando una solución acuosa de la neurotoxina (es decir BOTOX® reconstituido) en el polímero-fase orgánica (obteniendo por lo tanto una emulsión W/O). Con cualquier proceso se usa un agitador de alta velocidad o ultrasonido para asegurar una mezcla uniforme de la toxina con el polímero. Se pueden formar micropartículas de 1-50 \mum de diámetro atomizando la emulsión en una corriente de aire caliente, induciendo la formación de partículas mediante evaporación del solvente (técnica de secado por rociado). De forma alternativa, la formación de partículas se puede alcanzar mediante coacervación del polímero mediante la adición de no solvente, por ejemplo, aceite de silicona (técnica de la separación de fase) o preparando una emulsión W/O/W (técnica de la doble emulsión).
El pH del moldeado u otra solución en la que se va a mezclar la toxina botulínica se mantiene a pH 4,2-6,8, porque a pH por encima de alrededor de pH 7 la proteínas estabilizantes no toxinas se pueden disociar de la toxina botulínica produciendo una pérdida gradual de toxicidad. Preferiblemente, el pH está entre alrededor de 5-6. Además la temperatura de la mezcla/solución no debe sobrepasar alrededor de 35 grados Celsius, porque la toxina se puede detoxificar fácilmente cuando está en un solución/mezcla calentada por encima de alrededor de 40 grados Celsius.
Los métodos para congelar gotitas para formar micropartículas incluyen dirigir las gotitas a o cerca de un gas licuado, tales como argón líquido y nitrógeno líquido para formar microgotitas congeladas que después se separan del gas líquido. Las microgotas líquidas se pueden exponer a un líquido no solvente, tal como etanol, o etanol mezclado con hexano o pentano.
Se puede hacer un amplio intervalo de tamaños de micropartículas de formulación oral de toxina botulínica variando el tamaño de las gotitas, por ejemplo, cambiando el diámetro del atomizador ultrasónico. Si se desean micropartículas muy grandes, se pueden extruir las micropartículas a través de una jeringuilla directamente en el líquido frío. Aumentar la viscosidad de la solución del polímero también puede aumentar el tamaño de micropartícula. Se puede producir el tamaño de las micropartículas mediante este proceso, por ejemplo micropartículas que varían desde mayor de alrededor de 1000 hasta alrededor de 1 micrómetro de diámetro. Se puede llenar después una cápsula ingerible con las micropartículas que incorporan la toxina botulínica y sellar para hacer una formulación oral de toxina botulínica.
De forma alternativa, la cápsula se puede llenar solo con una cantidad apropiada de polvo de BOTOX no reconstituido (sin procesar adicionalmente en microesferas) mezclado con una cantidad adecuada de un soporte inerte tales como harina o azúcar, de modo que produzca suficiente volumen de material para rellenar la cápsula.
Ejemplo 4 Método para hacer una formulación oral de toxina botulínica y polianhídrido
Se puede hacer un polímero biodegradable de polianhídrido como un copolímero de poli-carboxifenoxipropano y ácido sebácico en una relación de 20:80. Se pueden codisolver polímero y una toxina botulínica (tal como BOTOX® no reconstituido) en cloruro de metileno a temperatura ambiente y secar por rociado en microesferas, usando la técnica del ejemplo 3. Se puede evaporar cualquier cloruro de metileno restante en un desecador de vacío.
Dependiendo del tamaño deseado de formulación oral y por lo tanto la cantidad de toxina botulínica, se puede comprimir una cantidad adecuada de las microesferas a alrededor de 8000 p.s.i. durante 5 segundos o a 3000 p.s.i. durante 17 segundos en un molde para formar discos de formulación oral que encapsulan la neurotoxina. De esta manera, las microesferas se pueden presionar mediante moldeado por compresión en discos de 1,4 cm de diámetro y 1,0 mm de espesor, empaquetar en bolsitas de papel de aluminio en una atmósfera de nitrógeno y esterilizar por irradiación gamma de 2,2 x 10^{4} Gy.
Ejemplo 5 Método de agua en aceite para hacer una formulación oral de toxina botulínica biodegradable
Se puede hacer una formulación oral de toxina botulínica disolviendo copolímero 80:20 de ácido poliglicólico y ácido poliláctico en diclorometano al 10% peso/volumen a temperatura ambiente con agitación suave. Se puede hacer después una emulsión de tipo agua en aceite añadiendo 88 partes de la solución del polímero a 1 parte de una mezcla 1:5 de Tween 80 (monooleato sorbitano polioxietileno 20, disponible de Acros Organics N.V., Fairlawn, NJ) y Span 85 (trioletao sorbitano) y 11 partes de una mezcla acuosa de 75 unidades de BOTOX® (complejo de toxina botulínica de tipo A) y Quil A (adyuvante). La mezcla se agita usando un mezclador de alta velocidad y después se seca inmediatamente por rociado usando un secador Drytec Compact Laboratory Spray equipado con una boquilla 60/100/120 a una presión de atomización de 15 psi y una temperatura de entrada de 65 grados C. Las microesferas resultantes tienen un diámetro de alrededor de 20 \mum de diámetro y se recogen como polvo suelto. Los vestigios del solvente orgánico restante se eliminan mediante evaporación al vacío.
Ejemplo 6 Método de temperatura reducida para una formulación oral de toxina botulínica biodegradable
Se puede hacer una formulación oral de toxina botulínica a una temperatura baja de modo que se inhiba la desnaturalización de la toxina como sigue. Se mezclan 0,3 g de PLGA/ml de cloruro de metileno o acetato de etilo con 0,1 ml de solución de neurotoxina/ml del polímero-solución orgánica a una temperatura reducida (2-8 grados C). Una primera serie de microesferas que incorporan toxina botulínica hechas, como se explica en el ejemplo 1 (la solución de polímero se forma disolviendo el polímero en cloruro de metileno), a partir de un polímero lactida:glicolida 75:25 con una viscosidad inherente (dL/g) de alrededor de 0,62 (disponible de MTI) y se puede degradar en el aparato digestivo de un paciente.
Las composiciones y métodos según la invención divulgada aquí tienen muchas ventajas, incluyendo las siguientes:
1. se puede usar una única formulación oral para proporcionar terapéuticamente eficaz continuo o administración de una neurotoxina a lo largo de un periodo de un año o más.
2. la neurotoxina se distribuye a un área de tejido localizada sin una cantidad significativa de neurotoxina que aparezca sistémicamente.
3. necesidad reducida para cuidado de seguimiento del paciente.
4. necesidad reducida para inyecciones periódicas de neurotoxina para tratar una afección, tal como un trastorno neuromuscular.
5. Aumento en la comodidad del paciente debido a que no se requieren inyecciones.
6. Mejora en la conformidad el paciente.
Una ventaja de las presentes formulaciones orales para neurotoxinas incluye la distribución rápida de niveles terapéuticos consistentes de neurotoxina al tejido digestivo diana. Las ventajas también incluyen aumento en la conformidad y aceptación del paciente.
Todas las referencias, artículos, publicaciones y patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan mediante referencia en su totalidad.
Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con respecto a ciertos métodos preferidos, son posibles otras formas de realización, versiones, y modificaciones dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar de forma eficaz una amplia variedad de neurotoxinas en los métodos de la presente invención. Además, la presente invención incluye formulaciones orales donde dos o más toxinas botulínicas, se administran al mismo tiempo o de forma consecutiva a través de la formulación oral. Por ejemplo, se puede administrar toxina botulínica de tipo A a través de una formulación oral hasta que se desarrollan una pérdida de respuesta clínica o anticuerpos neutralizantes, seguido por administración también mediante formulación oral adecuada de una toxina botulínica de tipo B ó E. De forma alternativa, se puede administrar localmente una combinación de cualesquiera dos o más de los serotipos botulínicos A-G para controlar el inicio y duración del resultado terapéutico deseado. Además, se pueden administrar compuestos no neurotóxicos antes de, al mismo tiempo que o posterior a la administración de la neurotoxina a través de formulación oral de modo que se proporcione un efecto adjunto tal como inicio aumentado o más rápido de la denervación antes de que la neurotoxina, tal como una toxina botulínica, empiece a ejercer su efecto terapéutico.
La presente invención también incluye dentro de su ámbito el uso de una neurotoxina, tal como una toxina botulínica, en la preparación de un medicamento de formulación oral, para el tratamiento de un trastorno digestivo.
Según esto, el espíritu y ámbito de las siguientes reivindicaciones no se deben limitar a las descripciones de las formas de realización preferidas explicadas anteriormente.

Claims (22)

1. Una formulación oral de toxina botulínica en forma sólida, que comprende:
(a) una toxina botulínica, y;
(b) un soporte asociado con la toxina botulínica,
formando por tanto una formulación oral en forma sólida de toxina botulínica, en donde
(i)
el soporte se formula para disolverse en y por lo tanto liberar en el aparato digestivo de un paciente cantidades terapéuticas de la toxina botulínica en el aparato digestivo de un paciente, y;
(ii)
la formulación en forma sólida de toxina botulínica muestra retención gástrica debido a un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o administración simultánea de un agente farmacológico para retrasar el vaciado gástrico.
2. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde no se han transformado cantidades sustanciales de la toxina botulínica en un toxoide botulínico antes de la asociación de la toxina botulínica con el soporte.
3. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde el soporte comprende una sustancia biocompatible, biodegradable seleccionada del grupo que consiste en harina, azúcar o gelatina.
4. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde la toxina botulínica se selecciona del grupo que consiste en toxina botulínica de tipos A, B, C_{1}, D, E, F y G.
5. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A.
6. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde la cantidad de la toxina botulínica asociada con el soporte está entre 1 unidad y 10.000 unidades de toxina botulínica.
7. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde la cantidad de toxina botulínica está entre 10 unidades y 2.000 unidades de una toxina botulínica de tipo A.
8. La formulación oral de la reivindicación 1, en donde la toxina botulínica comprende:
(a) un primer elemento que comprende un elemento de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de la superficie celular neuronal en condiciones fisiológicas,
(b) un segundo elemento que comprende un elemento de translocación capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana celular neuronal, y
(c) un tercer elemento que comprende un elemento terapéutico capaz, cuando está presente en el citoplasma de una neurona, de inhibir la exocitosis de acetilcolina de la neurona.
9. Una formulación oral de toxina botulínica, que comprende:
(a) una toxina botulínica de tipo A, y;
(b) un soporte asociado con la toxina botulínica de tipo A, formando por lo tanto una formulación oral de toxina botulínica, en donde el soporte se formula para liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica de tipo A en un aparato digestivo de un paciente con una úlcera gástrica sin respuesta significativa del sistema inmune, y en donde el soporte comprende una sustancia biocompatible, biodegradable, y en donde se puede lograr una retención gástrica controlada de la forma sólida mediante un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o mediante administración simultánea de agentes farmacológicos que retrasan el vaciado gástrico.
10. Una formulación de toxina botulínica para administración oral a un paciente con un aparato digestivo, comprendiendo la formulación:
(a)
toxina botulínica biológicamente activa, y;
(b)
un soporte biocompatible, biodegradable y no tóxico asociado con la toxina botulínica, en donde el soporte tiene una característica de degradarse rápidamente en el sistema digestivo de un paciente para liberar de esta manera una cantidad terapéutica de la toxina botulínica biológicamente activa en aparato digestivo del paciente, sin una respuesta inmune significativa a la toxina botulínica ingerida,
en donde la formulación de toxina botulínica muestra una retención gástrica debido a un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o mediante administración simultánea de un agente farmacológico que retrasa el vaciado gástrico.
11. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde el soporte comprende una pluralidad de microesferas poliméricas.
12. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde el soporte comprende un matriz polimérica.
13. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde la toxina botulínica se selecciona del grupo que consiste en toxina botulínica de tipos A, B, C_{1}, D, E, F y G.
14. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A.
15. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde la cantidad de la toxina botulínica asociada con el soporte está entre 1 unidad y 10.000 unidades de toxina botulínica.
16. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde la cantidad de toxina botulínica está entre 10 unidades y 2.000 unidades de una toxina botulínica de tipo A.
17. La formulación oral de la reivindicación 10, en donde la cantidad de toxina botulínica está entre 100 unidades y 30.000 unidades de una toxina botulínica de tipo B.
18. Una formulación oral de toxina botulínica como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento.
19. Una formulación oral de toxina botulínica, que comprende:
(a) un soporte que comprende un polímero seleccionado del grupo de polímeros que consiste en polilactidas, poliglicolidas y polianhídridos;
(b) una toxina botulínica estabilizada asociada con el soporte, formando de esta manera una formulación oral de toxina botulínica,
en donde se pueden liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica del soporte en el aparato digestivo de un paciente,
en donde la formulación de la toxina botulínica muestra una retención gástrica debido a un método seleccionado del grupo que consiste en mucoadhesión, flotación, sedimentación, expansión, o mediante administración simultánea de un agente farmacológico que retrasa el vaciado gástrico.
20. La formulación oral de la reivindicación 19, en donde la toxina botulínica comprende:
(a) un primer elemento que comprende un elemento de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de la superficie celular neuronal en condiciones fisiológicas,
(b) un segundo elemento que comprende un elemento de translocación capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana celular neuronal, y
(c) un tercer elemento que comprende un elemento terapéutico capaz, cuando está presente en el citoplasma de una neurona, de inhibir la exocitosis de acetilcolina de la neurona.
21. La formulación oral de la reivindicación 20, en donde el elemento terapéutico puede cortar una proteína SNARE, inhibiendo de esta manera la exocitosis de acetilcolina de la neurona.
22. La formulación oral de la reivindicación 21, en donde la proteína SNARE se selecciona del grupo que consiste en sintaxina, SANP-25 y VAMP.
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