ES2323553T3 - Determinacion de diaminooxidasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar la actividad de la diaminooxidasa (DAO; EC 1.4.3.6) en una muestra que comprende las etapas: - Proporcionar una cantidad prefijada de una diamina, preferiblemente en una solución acuosa o liofilizada, - Mezclar e incubar la diamina con la muestra durante un espacio de tiempo fijado bajo condiciones a las que la diamina puede convertirse mediante una DAO dado el caso presente en la muestra, - Derivatizar la diamina todavía presente, - Determinar la cantidad de diamina derivatizada y - Comparar la cantidad prefijada de diamina con la cantidad de diamina derivatizada y determinar la actividad de la diaminooxidasa dado el caso presente.
Description
Determinación de diaminooxidasa.
La invención se refiere a un procedimiento para
determinar la actividad de diaminooxidasa (DAO; EC 1.4.3.6).
La histamina
(1H-imidazol-4-etilamina)
se forma mediante la descarboxilación enzimática de histidina y, por
tanto, es una amina biógena básica con un peso molecular de 111
Da.
La histamina se presenta de forma prácticamente
ubicua en el organismo. Es producida por los propios seres humanos
y se almacena en los gránulos metacromáticos de los mastocitos y
leucocitos basófilos, donde está disponible para la liberación
inmediata. Las mayores concentraciones de histamina se miden en el
pulmón. Después de la liberación, la histamina es un mediador
extraordinariamente potente de una pluralidad de procesos
fisiológicos y patofisiológicos, frecuentemente también mediante
interacción con citocinas.
Además, la histamina también puede entrar al
cuerpo desde el exterior, por una parte mediante la respiración o
bien por vía oral, por ejemplo mediante la ingesta de alimentos que
contienen histamina como queso, vino, conservas de pescado y col
fermentada.
Las funciones y los efectos más importantes de
la histamina en el cuerpo humano o animal son:
- 1.
- Dilatación de los capilares, aumento de la permeabilidad de los capilares y disminución de la tensión arterial.
- 2.
- Contracciones de la musculatura lisa, entre otros de los músculos bronquiales en el pulmón.
- 3.
- Inducción de una elevada secreción de ácidos gástricos.
- 4.
- Aumento de la frecuencia cardíaca.
- 5.
- La histamina es el mediador de la reacción alérgica de tipo inmediato, es el mediador más importante en las enfermedades alérgicas, como rinitis alérgica (fiebre del heno) y asma bronquial.
- 6.
- Además, la histamina es el desencadenante clásico de una urticaria y tiene una función importante en las alergias a medicamentos o incompatibilidades.
Concentraciones elevadas de histamina libre en,
por una parte, la circulación sanguínea o, por otra parte, en la
luz intestinal, desencadenan efectos no deseados, como dolores de
cabeza, nariz tapada o rinorrea, obstrucciones de las vías
respiratorias, taquicardias, así como extrasístoles, además de
dolencias gástricas e intestinales, que pueden llevar de heces
blandas a diarreas, e hipotonía. Frecuentemente también se describen
hinchazones de los párpados, ocasionalmente también exantemas
urticariales. Además, pueden producirse enrojecimientos de la piel,
disminución de la tensión arterial y broncoespasmos.
En el organismo de los mamíferos, la histamina
es degradada por dos enzimas: la diaminooxidasa (DAO, EC 1.4.3.6) y
la histamina-N-metiltransferasa
(NMT, EC 2.1.1.8) (Mizuguchi y col. 1994). La DAO cataliza la
desaminación oxidativa de la histamina para dar
imidazolacetaldehído; la NMT cataliza la
N-metilación para dar
N-metilhistamina.
Ambas vías de degradación son esenciales para el
organismo: la DAO elimina la histamina, que, por ejemplo, fue
absorbida mediante la alimentación en el tracto gastrointestinal, la
NMT controla la transmisión de señales histaminérgicas en el
sistema nervioso (Kitanaka y col. 2002).
La tarea principal de la DAO es prevenir que la
histamina ingerida por la alimentación llegue a la circulación
sanguínea desde el intestino o se asimile directamente en el sistema
nervioso vegetativo. Si falla este mecanismos de protección, en el
caso extremo también puede producirse un choque anafiláctico (Taylor
1986, Nilsson y col. 1996). La DAO es una proteína secretora y, por
tanto, funciona extracelularmente, mientras que la
N-metiltransferasa es exclusivamente activa en el
citosol (Küfner y col. 2001).
La DAO nativa, que, además de la histamina,
puede degradar otras aminas biógenas, como por ejemplo putrescina,
espermidina y cadaverina, y la que se obtiene, por ejemplo, a partir
de riñón de cerdo, es una glicoproteína homodímera que contiene
cobre en la que las subunidades están unidas mediante puentes
disulfuro. La DAO tiene un peso molecular de aproximadamente 182
kDa (Kluetz y Schmidt 1997, Rinaldi y col. 1982) y una proporción
de hidratos de carbono de aproximadamente el 11% (Shah y Ali 1988).
La enzima pertenece a la clase de las aminooxidasas que contienen
cobre que catalizan la desaminación oxidativa de aminas primarias
para dar aldehídos, amoniaco y peróxido de hidrógeno según el
siguiente esquema de reacción general (Bachrach 1985):
RCH_{2}NH_{2} + H_{2}O + O_{2} => RCHO + NH_{3} +
H_{2}O_{2}, en el que el resto R contiene un grupo amino.
\newpage
Característico de las aminooxidasas que
contienen cobre es una topaquinona en el centro activo, que se
forman mediante la modificación post-traslacional
de un resto de tirosina conservado (James y col. 1990, James y col.
1992, Mu y col. 1992).
La DAO se encuentra principalmente en el
intestino delgado, en el hígado, en los riñones y en la sangre en
los leucocitos. En mujeres embarazadas, la DAO se forma
adicionalmente en la placenta. Las mujeres embarazadas tienen
aproximadamente un nivel de DAO en sangre de 500 a 1000 veces
superior al de las mujeres no embarazadas.
La DAO se produce continuamente y se excreta en
la luz intestinal. Por tanto, en un ser humano sano, la alimentación
rica en histamina ya libera ampliamente histamina en el intestino.
La histamina restante es degradada al pasar por la mucosa
intestinal por la DAO que allí se encuentra. La histamina se
descompone en imidazolacetaldehído y además en ácido
imidazolacético. Los cofactores de la diaminooxidasa son
6-hidroxidopa y probablemente fosfato de piridoxal,
la vitamina B6. La diaminooxidasa es una enzima sensible que puede
ser inhibida por distintas sustancias, como otras aminas biógenas,
alcohol y su producto de degradación acetaldehído y distintos
medicamentos.
Como ya se menciona anteriormente, la histamina
exógena ingerida por la alimentación, pero también la histamina
producida por el cuerpo, puede desencadenar una multitud de
trastornos debidos a reacciones alérgicas. En lo referente a la
importancia clínica son de destacar al menos tres formas de una
intolerancia a la histamina basada en una actividad reducida de la
diaminooxidasa:
- \bullet
- Menos seres humanos tienen una deficiencia de DAO congénita y tampoco pierden ésta.
- \bullet
- Durante una infección de la mucosa intestinal puede producirse una deficiencia transitoria de DAO. Después de curarse la infección también se normaliza la actividad de la DAO.
- \bullet
- En el marco de la administración de distintas sustancias inhibidoras de la actividad puede producirse una actividad de la DAO reducida exógenamente mediada. A éstas pertenecen prioritariamente el alcohol y su producto de degradación acetaldehído, ciertos alimentos ricos en aminas y muchos medicamentos.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos se producen en mayor o menor
medida los síntomas descritos al principio y en la mayoría de los
casos no pueden clasificarse fácilmente. Una rápida aclaración de la
actividad funcional de la enzima permite una terapia rápida y
sencilla y la creación de un plan dietético correspondiente.
El documento US 5 284 749 da a conocer un
procedimiento para determinar diaminooxidasa en una muestra en el
que para determinar la diaminooxidasa se usan anticuerpos. El
procedimiento descrito en el documento de EE.UU. sirve
especialmente para diferenciar entre diaminooxidasa del líquido
amniótico y diaminooxidasa del suero.
En el documento US 5 124 254 se describe un
procedimiento para la detección de putrescina y cadaverina en el
que una muestra se hace reaccionar con diaminooxidasa y el peróxido
de hidrógeno formado en ésta se detecta mediante otra reacción que
lleva a una formación de color.
La metodología de la detección de la actividad
enzimática en plasma se basa en la propiedad de la DAO de catalizar
la oxidación de diaminas, como histamina, putrescina
(1,4-butanodiamina) y cadaverina
(1,5-pentanodiamina).
Otro procedimiento habitual muy extendido para
determinar la actividad de la DAO se basa en la reacción de
putrescina o cadaverina marcada con ^{14}C con DAO. El
monoaldehído formado en ésta se cicla intramolecularmente con el
grupo amino y puede extraerse, por ejemplo con cloroformo
(CHCl_{3}), debido a la peor solubilidad en agua. A continuación
se realiza la determinación de la actividad mediante recuento por
centelleo líquido (Tufvesson G; Tryding N: "Determination of
diamine oxidase activity in normal human blood serum", Scand J
Clin Lab Invest 1969
Sep;24(2):163-8(ISSN:
0036-5513)).
Esta metodología, aunque se aplica
universalmente, presenta puntos débiles esenciales que hasta la
fecha han perjudicado una difusión adicional de la aplicación de
este principio: por ejemplo, los reactivos utilizados deben
clasificarse como tóxicos o perjudiciales para la salud. Para
mejorar el rendimiento de la extracción, en un procedimiento
actualmente aplicado se sustituyó cloroformo (mutagénico,
cancerígeno) por tolueno (perjudicial para la salud, altamente
inflamable, tóxico para la reproducción, teratogénico). Por tanto,
este reactivo tampoco es inocuo. Además, la mezcla de plasma y
tolueno tiene que congelarse para hacer posible una separación útil
de la entonces fase de plasma sólida y la fase de tolueno líquida.
Además, la reactividad de la enzima es relativamente débil, de
manera que deben utilizarse al menos 250 \mul de muestra, lo que
requiere una cantidad correspondientemente grande de agente de
extracción.
Otro procedimiento para determinar la actividad
enzimática de la DAO se da a conocer en el documento AT 411688. El
procedimiento descrito en ese documento requiere inicialmente la
conversión de una solución acuosa de una determinada cantidad de
una diamina (por ejemplo, histamina, putrescina, cadaverina), que se
cicla intramolecularmente después de que uno de los grupos amina de
la DAO se haya convertido en un grupo aldehído, presentando la
molécula ciclada en acetato de etilo una mayor solubilidad que la
diamina sin ciclar, con DAO, oxidándose uno de los grupos amino a
un grupo aldehído y ciclándose este grupo aldehído
intramolecularmente con el segundo grupo amina. A continuación, el
producto ciclado se extrae con acetato de etilo y se detecta. La
diamina se marca preferiblemente de forma radiactiva, especialmente
con ^{13}C o ^{14}C, o con un colorante o un grupo cromógeno,
especialmente con un colorante de fluorescencia o un fluorógeno.
Además, en la bibliografía científica se
describen procedimientos para determinar la actividad de la DAO que
miden el peróxido de oxígeno producido en la reacción catalizada por
DAO de diamina con agua y oxígeno. In Kohoe CA y col. (J Nutr
(2000) 130:30-33) se determina, por ejemplo, la
actividad de la DAO mediante la reacción de diclorhidrato de
cadaverina. El peróxido de hidrógeno formado en la reacción de la
DAO con cadaverina se mezcla a continuación con la sal de sodio de
10-(carboximetilaminocarbonil)-3,7-bis-(dimetilamino)-fenotiazina,
ascorbatoxidasa y peroxidasa de rábano picante, con la que,
dependiendo de la cantidad de peróxido de hidrógeno formado, se
forma azul de metileno. La cantidad de azul de metileno formado se
determina fotométricamente. Alternativamente a este procedimiento,
el peróxido de hidrógeno formado también puede determinarse
amperimétricamente (véase, por ejemplo, Hibi T. y Senda M., Biosci
Biotechnol Biochem. (2000), 64:1963-1966). Como la
estabilidad del peróxido de hidrógeno en una solución está
influida, entre otras cosas, por la temperatura y la presencia de
otros compuestos (por ejemplo, la presencia de iones metálicos
promueve la descomposición catalítica del peróxido de hidrógeno
oxidando el peróxido de hidrógeno los iones metálicos mediante
etapas intermedias radicálicas), la determinación de la actividad
de la DAO por la velocidad de formación del peróxido de hidrógeno
sólo es adecuada con ciertas limitaciones. En ausencia de
sustancias oxidables, el peróxido de hidrógeno se descompone
autocatalíticamente, especialmente a temperaturas más altas y a
alcalinidad, convirtiéndose el oxígeno activo en oxígeno
molecular.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es poner a disposición un procedimiento para determinar la
actividad de la DAO en una muestra que supere las desventajas
descritas al principio del estado de la técnica. En este caso deben
evitarse sobre todo el uso de sustratos radiactivamente marcados
(como, por ejemplo, histamina, putrescina) y la medición del
peróxido de hidrógeno formado, que se realiza en un grado no
satisfactorio. Como la utilización de material radiactivo sólo es
posible en laboratorios con equipos especiales y además la
realización de una extracción líquida de la putrescina o cadaverina
ciclada requiere mucho trabajo, los procedimientos en los que se
necesitan sustancias radiactivas, o los procedimientos que dependen
de la extracción líquida, no son especialmente adecuados para la
operación rutinaria, por ejemplo, en un hospital. Además, la
eliminación de los materiales radiactivos y los disolventes
orgánicos es problemática y en parte de costes extremadamente
altos.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar la actividad de la diaminooxidasa
(DAO; EC 1.4.3.6) en una muestra que comprende las etapas:
- -
- Proporcionar una cantidad prefijada de una diamina, preferiblemente en una solución acuosa o liofilizada,
- -
- Mezclar e incubar la diamina con la muestra durante un espacio de tiempo fijado, bajo condiciones a las que la diamina puede convertirse mediante una DAO dado el caso presente en la muestra,
- -
- Derivatizar la diamina todavía presente,
- -
- Determinar la cantidad de diamina derivatizada y
- -
- Comparar la cantidad prefijada de diamina con la cantidad de diamina derivatizada y determinar la actividad de la diaminooxidasa dado el caso presente.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra, que contiene una cantidad de DAO que
va a determinarse o es sospechosa de contener DAO, puede obtenerse
a partir de sangre (suero o plasma) de seres humanos o animales,
tejidos u homogeneizados de tejido de origen humano o animal, por
ejemplo, células epiteliales intestinales obtenidas mediante
biopsia, líquido cefalorraquídeo, de un fluido corporal, de una
muestra de tejido, de un cultivo de células in vitro (tanto
de un cultivo de células bacterianas, vegetales, animales, humanas
como también de un cultivo de hongos) o de otra fuente. En este
caso, las muestras pueden utilizarse o directamente o después de una
o varias etapas de procesamiento de la muestra. Estas etapas de
procesamiento de la muestra dependen, por ejemplo, de cómo está a
disposición la DAO en las muestras aisladas. Si la DAO se encuentra,
por ejemplo, en células de muestras de tejido o cultivos de
células, éstas deben abrirse (por ejemplo, mediante tratamiento
ultrasónico, prensa francesa, reactivos de lisis, como detergentes
y enzimas, u homogeneización) antes de la determinación de la
actividad, a la vez que se conserva la actividad enzimática. Además,
a la muestra que va a investigarse también puede añadírsele
reactivos, sales y tampones que contribuyan a la estabilidad de la
DAO. Las matrices de la muestra, que interfieren en la
determinación de la actividad de la DAO o influyen de tal manera que
no permiten un juicio significativo sobre la cantidad de DAO
realmente contenida en la muestra, también deben eliminarse de la
muestra. La degradación de la histamina se realiza de manera
conocida preferiblemente mediante la DAO en la luz intestinal y en
las células epiteliales intestinales. Una comparación de la
actividad de la DAO en plasma y en células epiteliales intestinales
muestra la correlación postulada hasta la fecha. Además, se fija
que la actividad de la DAO en las células epiteliales intestinales
sea mucho mayor (aproximadamente un factor de 100) que en la
sangre.
sangre.
La muestra se pone en contacto y se mezcla con
la cantidad prefijada de diamina, que preferiblemente se encuentra
disuelta en una solución acuosa. Evidentemente, es completamente
posible añadir directamente una cantidad dada de diamina a una
cantidad definida de muestra (por ejemplo, como cristales). En este
caso se utiliza una cantidad de diamina que no lleva a una
inhibición significativa de la DAO (por ejemplo, la DAO se inhibe
al menos parcialmente mediante la adición de al menos histamina 100
\muM, a una concentración de histamina de aproximadamente 500
\muM la DAO se inhibe aproximadamente el 60% y, por tanto,
significativamente). Después de la incubación de esta mezcla
durante un espacio de tiempo fijado durante el cual la diamina que
se encuentra en la solución acuosa se degrada en presencia de la
DAO dependiendo de su cantidad, la diamina restante en la mezcla se
derivativa el 95%, preferiblemente el 99%, todavía más
preferiblemente el 99,5%, especialmente el 100%. En este caso, las
condiciones de incubación deben elegirse de tal forma que la DAO
dado el caso presente en la muestra esté en condiciones de
convertir la diamina presente. La DAO es una enzima que convierte
sustratos de diamina, como por ejemplo histamina, con una velocidad
de reacción tal que la duración de la incubación asciende
preferiblemente a al menos 30 minutos.
Para aumentar la especificidad y la
selectividad, en una configuración especial del sistema de prueba la
DAO puede enriquecerse selectivamente a partir de la muestra
mediante un anticuerpo específico que está unido a una fase sólida.
Entonces, la reacción con histamina u otras aminas biógenas se
realiza sin influencias interferentes de la matriz de muestra en un
sistema tampón especial que promueve la actividad de la DAO. Este
tampón es preferiblemente Tris 10 a 200 mM, todavía más
preferiblemente 20 a 100 mM, especialmente 50 mM a pH = 8,5.
Después de la derivatización de la diamina se
determina su cantidad en la mezcla. La cantidad medida de diamina
derivatizada se compara a continuación con la cantidad de diamina
que se encuentra originalmente en la solución acuosa. La diferencia
entre la cantidad de diamina originalmente utilizada y la cantidad
de diamina derivatizada medida después de la derivatización refleja
la cantidad absoluta de diamina degradada. La cantidad de diamina
degradada en el plazo de un espacio de tiempo definido refleja la
actividad enzimática en la muestra, que preferiblemente se expresa
con unidades/ml (U/ml).
Debido a que, como ya se cita al principio, la
DAO desempeña una función importante en mamíferos y seres humanos,
el procedimiento según la invención también puede usarse para
diagnosticar una intolerancia a histamina debido a una deficiencia
de DAO o a una actividad de la DAO reducida. Además, el
procedimiento según la invención también es adecuado para el
control de una terapia en la intolerancia a histamina. Los
individuos sanos presentan normalmente una actividad de la DAO de
>10 U/ml (véase, por ejemplo, Mayer I y col. (2005) Allergologie
28:1-8). Con el procedimiento según la invención es
posible medir actividades hasta inferiores a 3 U/ml. De esta manera
puede diagnosticarse la intolerancia a histamina en pacientes y/o
controlarse el desarrollo de la terapia.
Debido al hecho de que la diamina ya no está
accesible en el transcurso de la derivatización de la DAO o se
elimina de ésta, no es necesario añadir un inhibidor de la DAO a la
solución de reacción como se menciona a continuación. No obstante,
preferiblemente puede añadirse un inhibidor. La derivatización de la
diamina satisface así varias funciones. Por una parte, la
derivatización previene que puede seguir reaccionando más diamina
con la DAO después de un espacio de tiempo definido. Por otra parte,
una derivatización hace posible la detección de diamina presente en
la muestra, luego la diamina libre no está accesible a una
cuantificación mediante reactivos de unión, como anticuerpos.
El potencial de inhibición de una muestra puede
determinarse mediante la adición adicional de una cantidad definida
de DAO de actividad conocida. Con esto es posible fijar si en la
muestra que va a investigarse está presente una deficiencia de DAO
o, sin embargo, están presentes sustancias que previenen un efecto
fisiológicamente relevante de la DAO. Las sustancias de este tipo
pueden ser o altas cantidades de otras aminas biógenas, como por
ejemplo putrescina, cadaverina o espermina, que son preferiblemente
degradadas por la DAO en comparación con histamina, o se
introdujeron mediante fármacos en el cuerpo (inhibidores de la DAO
conocidos son, por ejemplo, acetilcisteína, ambroxol, aminofilina,
amitriptilina, cloroquina, ácido clavulánico, isoniazida,
metamizol, metodopramida y propafenona). Mediante esta preferencia,
la histamina se degrada claramente más despacio o ya no se degrada
y produce los síntomas descritos en la introducción.
Como consecuencia, esta configuración puede
usarse además para probar "antagonistas de inhibidores" y
cuantificar su efecto.
Según la invención, la diamina puede
derivatizarse con una serie de sustancias, pudiendo determinarse
cuantitativa y/o cualitativamente la diamina derivatizada
directamente (por ejemplo, mediante una reacción colorimétrica,
mediante fluorescencia) o indirectamente (por ejemplo, con ayuda de
anticuerpos o fragmentos de los mismos, reactivos de unión
específicos para derivados). En este caso, los grupos fluorescentes
pueden estar preferiblemente sustituidos en la diamina, que también
se usan en sistema de detección cromatográficos. Los grupos de este
tipo pueden ser: O-ftalaldehídos (OPA) (Oguri S y
col. (1999) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 736:
263-71; Previati M y col. (2002) J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 780: 331-9), formiato
de 9-fluorenilmetilcloro (Aygun O y col. (1999) J
Agric Food Chem 47: 1961-4), grupos dansilo (Bolygo
E y col. (2000) J AOAC Int 83: 543-8),
aloficocianinas (XL 665) (Claret EJ y col. (2003) Comb Chem High
Throughput Screen 6: 789-94), pirenos (Yoshida H y
col. (2004) Anal Sci 20: 557-9) (por ejemplo, éster
de N-hidroxisuccinimida de ácido
4-1-pirenobutírico = PSE (Yoshitake
T y col. (2003) Biomed Chromatogr 17: 509-16)),
7-fluoro-4-nitrobenzoxadiazoles
(NBD-F) (Song Y y col. (2004) Rapid Commun Mass
Spectrom 18: 2818-22),
4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazoles
(DBD-F) (Toyooka T y col. (2004) Anal Biochem 333:
236-45),
naftalen-2,3-dicarboxaldehídos (NDA)
(Zhang LY y Sun MX (2004) J Chromatogr A 1040:
133-40). Evidentemente, estos sustituyentes también
pueden determinarse mediante la unión de anticuerpos a la diamina
derivatizada. La succinil-glicinamida se usa para
derivatizar diamina en radioinmunoensayos (Morel A y col. (1990)
Mol Immunol 27 (10): 995-1000).
\newpage
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para identificar inhibidores de la
diaminooxidasa y para determinar la capacidad de inhibición de
estos inhibidores, que comprende las etapas:
- \bullet
- Proporcionar una cantidad prefijada de una diamina, preferiblemente en una solución acuosa o liofilizada, y de diaminooxidasa
- \bullet
- Mezclar e incubar la diamina y la diaminooxidasa con un compuesto, que potencialmente inhibe la actividad de la diaminooxidasa durante, un espacio de tiempo fijado
- \bullet
- Derivatizar la diamina todavía presente,
- \bullet
- Determinar la cantidad de diamina derivatizada
- \bullet
- Comparar la cantidad prefijada de diamina con la cantidad de diamina derivatizada y determinar la actividad de la diaminooxidasa y
- \bullet
- Dado el caso, identificar los inhibidores de la diaminooxidasa mediante comparación de las actividades de la diaminooxidasa con y sin adición de inhibidor, identificándose un inhibidor de la diaminooxidasa como tal si la actividad de la diaminooxidasa se reduce al menos el 20% por el inhibidor.
El procedimiento según la invención también
puede usarse además para identificar inhibidores de la
diaminooxidasa o para determinar su capacidad de inhibición. Según
la invención, como inhibidor se entiende un compuesto o una mezcla
de compuestos que está en condiciones de reducir la actividad de la
diaminooxidasa al menos el 20%, preferiblemente al menos el 40%,
todavía más preferiblemente al menos el 50%. Como referencia para la
actividad de la DAO sirve en este caso una medición que se realiza
bajo las mismas condiciones que la medición en presencia del
inhibidor, siendo la DAO del mismo origen.
Según una forma de realización preferida, la
diamina se selecciona del grupo constituido por histamina,
putrescina, espermidina y cadaverina.
Para el uso en el procedimiento según la
invención se consideran como especialmente adecuados sustratos que
muestran una alta afinidad por la DAO y buenas velocidades de
conversión con la DAO (véase, por ejemplo, Elmore BO y col. (2002)
J Biol Inorg Chem 7:565-579). Por tanto, la
histamina, la putrescina, la espermidina y la cadaverina son
especialmente adecuadas para determinar la actividad de la DAO en
una muestra. Además, estas diaminas pueden derivatizarse de una
manera sencilla con procedimientos conocidos.
La solución acuosa comprende preferiblemente una
solución de tampón Tris
(tris(hidroximetil)-aminometano) con un
valor de pH de 7 a 9,5, preferiblemente de 7,5 a 9, especialmente de
8 a 8,5.
En este caso, la concentración de Tris en la
solución de tampón puede ascender a de 10 mM a 1 M,
especialmente
50 mM a 1 M. La adición de NaCl en una concentración de 10 a 400 mM, preferiblemente de 50 a 300 mM, especialmente de 200 mM, a la solución de tampón actúa de forma especialmente positiva sobre la actividad de la DAO.
50 mM a 1 M. La adición de NaCl en una concentración de 10 a 400 mM, preferiblemente de 50 a 300 mM, especialmente de 200 mM, a la solución de tampón actúa de forma especialmente positiva sobre la actividad de la DAO.
Según otra forma de realización preferida, la
solución acuosa contiene una diamina en una cantidad de 5 a 400,
preferiblemente de 10 a 200 \muM, especialmente de 80 \muM.
En este intervalo de concentración la DAO
presenta la velocidad de reacción necesaria para el procedimiento
según la invención sin inhibir significativamente la DAO.
La incubación de la solución acuosa con la
muestra se realiza preferiblemente a una temperatura de 10 a 50ºC,
de 10 a 40ºC, de 15 a 37ºC, de 25 a 40ºC, de 18 a 26ºC, de 30 a 37ºC
o 38ºC o de 34 a 38ºC.
La DAO mostró en este intervalo de temperatura
una actividad suficiente para utilizarse en el procedimiento según
la invención.
La incubación de la solución acuosa con la
muestra se realiza preferiblemente durante 30 min a 36 h,
preferiblemente durante 1 a 30 h, todavía más preferiblemente
durante 3 a 24 h, especialmente durante 18 h.
El tiempo de incubación necesario depende, entre
otras cosas, de la temperatura de incubación. Cuanto más se ajuste
esta temperatura a la temperatura óptima de la DAO, más eficaz se
realizará la reacción de conversión y más corto será el tiempo de
incubación. A temperatura ambiente (18-26ºC), por
ejemplo, el tiempo de incubación también puede ascender a varias
horas (por ejemplo, 6 ó 12). La DAO humana de plasma tiene, por
ejemplo, un salto de actividad en el intervalo entre 24ºC y 28ºC
(actividad claramente reducida cuanto más frío). Por tanto, el
tiempo de incubación debe alargarse significativamente a
temperaturas < 16ºC.
Según una forma de realización preferida, la
incubación de la solución acuosa con la muestra y, por tanto, la
reacción de la diamina con la DAO contenida en la muestra antes de
la derivatización con aminoguanidina, se detiene preferiblemente en
una concentración de 1 mM a 10 \muM, especialmente de 10 mM.
Para prevenir o reducir esencialmente la
reacción posterior de la DAO con el sustrato después del tiempo de
incubación, según la invención también pueden utilizarse
inhibidores.
Según la invención, además de aminoguanidina
(Novotny WF y col. (1994) J Biol Chem
269:9921-9925), naturalmente pueden utilizarse
todos los inhibidores de la DAO conocidos en el estado de la
técnica: acriflavina, diazepam,
N-metil-N-formilhidrazina,
b-aminopropionitrilo, dimaprit,
O-metilhidroxilamina, agmantina, etanol (10%),
pargilina, aldomet, furosemida, fenamil, amilorida, guanabenz,
fenelzina, aminoguanidina, guanfacina, fenformina, amitriptilina,
guanidina, feniprazina, amodiaquina, haloperidol, prometiazina,
anserina, hiamina 1622, propranolol, aziridinilalquilamina,
hidroxicloroquina, B1 pirimidina, hidroxilamina, quinacrina,
burimamida, impromidina, semicarbazida, derivados de imidazol,
tiamina, carnosina, iproniazida, tioridazina, clorotiazida,
isocarboxazida, tranilcipramina, cloropromazina, isoniazida,
trimetoprim, cimetidina, metiamida, triptamina, clonidina,
metronidazol, tiramina, cianida, nazlinina (alcaloide) y
Nt-metilhistamina.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, la etapa de procedimiento de derivatizar
comprende acilar.
Según la invención, por acilación se entiende la
unión de un grupo acilo (R) de un ácido orgánico con la fórmula
(R-COOH) o su radical (R-CO\cdot)
al grupo amino libre de la histamina. Los procedimientos de este
tipo son conocidos en su totalidad para el experto (Agrawal VK y
col. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2787-2792). Un
tipo especial de acilación es, por ejemplo, la acetilación, en la
que el ácido orgánico es ácido acético.
Según la invención se ha demostrado que son
especialmente adecuados los procedimientos para derivatizar diaminas
que comprenden al menos una etapa de acilación. Además, es
especialmente posible detectar de forma sencilla y reproducible
diaminas aciladas y, dado el caso, determinar su concentración en
una muestra. Así, por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos que
están específicamente dirigidos contra diaminas aciladas y
utilizarse en un procedimiento de detección específico (véase, por
ejemplo, Campbell AM y col. (1993) Allergy
48:125-9).
La diamina se acila preferiblemente con
NHS-biotina.
Pero, según la invención, también es
completamente posible acilar la diamina con una serie de otras
sustancias (véase, por ejemplo, Morel AM y Delaage MA (1989) J
Allergy Clin Immunol. 82:646-654).
Según una forma de realización preferida, la
cantidad de diamina derivatizada se determina mediante
cromatografía, especialmente con cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), electroforesis, especialmente electroforesis
capilar (CE), o inmunoensayo, especialmente inmunoensayo enzimático
(ELISA; "Enzyme-linked Immunosorbent Assay"
("ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas")) o
radioinmunoensayo (RIA).
La diamina derivatizada puede determinarse
cuantitativamente mediante distintos procedimientos, habiendo
demostrado ser especialmente adecuados en particular procedimientos
cromatográficos, electroforéticos e inmunoquímicos. La
determinación cuantitativa de moléculas, especialmente de diamina
acilada, puede realizarse con todos los procedimientos citados en
este documento. Todos estos procedimiento son suficientemente
conocidos para el experto y pueden adaptarse sin más y con poco
gasto y, por tanto, razonable, a la cuantificación de una pluralidad
de diaminas derivatizadas con distintas sustancias (véanse, por
ejemplo, Garcia-Villar N y col. (2005) Analyst
130:1286-1290; Yoshitake T y col. (2003) J Neurosci
Methods 127:11-17).
La diamina derivatizada se cuantifica con
especial preferencia con procedimientos inmunoquímicos, ya que los
procedimientos de este tipo hacen posible una utilización en la
práctica, como por ejemplo, en hospitales, sin un gasto demasiado
grande de aparatos. El ELISA y el RIA son especialmente muy
adecuados para el fin según la invención. Una condición previa para
el uso de procedimientos inmunoquímicos en el procedimiento según
la invención es la proporción de un anticuerpo que está en
condiciones de diferenciar diamina derivatizada de diamina no
derivatizada. Los anticuerpos de este tipo pueden prepararse, por
ejemplo, mediante inyección de diamina derivatizada en animales
(por ejemplo, conejos, ovejas, ratones) u otros procedimientos
conocidos para el experto (por ejemplo, Köhler G. y Milstein C.,
Nature (1975) 256:495-7). Por ejemplo, en el
documento US 4.818.683 se describe la preparación de anticuerpos
dirigidos contra histamina acilada, pudiendo recurrirse a estos
anticuerpos para determinar la histamina en una muestra.
Los procedimientos inmunoquímicos, especialmente
ELISA, pueden realizarse tanto de forma competitiva como de forma
sencilla. Por ejemplo, es posible recubrir un soporte sólido,
preferiblemente los pocillos de placas de microtitulación (con 96,
384 o más pocillos), con diamina derivatizada. Los pocillos así
recubiertos pueden ponerse en contacto a continuación con una
mezcla de diamina derivatizada que se preparó a partir de la
reacción de conversión de la diamina con la muestra, que dado el
caso comprende DAO, y posterior derivatización, y un anticuerpo
específico para el derivado de diamina. El derivado de diamina unido
en el pocillo compite con la diamina derivatizada obtenida a partir
de la reacción de conversión por el anticuerpo específico para el
derivado de diamina en la solución. Durante la incubación en el
pocillo se ajusta un equilibrio, siendo la cantidad de anticuerpos
que está unida al derivado de diamina del pocillo mayor cuanta más
diamina se convierta con DAO. Los anticuerpos unidos al derivado de
diamina en el pocillo pueden cuantificarse después de una etapa de
lavado mediante una reacción colorimétrica o con otro anticuerpo
dirigido contra el anticuerpo específico para el derivado de
diamina, que preferiblemente está marcado con una enzima (por
ejemplo, con peroxidasa de rábano picante). Mediante una
determinación realizada en paralelo de una serie estándar puede
deducirse la cantidad degradada de diamina. Alternativamente, el
propio anticuerpo específico para el derivado de diamina podría
además estar marcado con, por ejemplo, una enzima (como peroxidasa
de rábano picante, fosfatasa alcalina). Alternativamente es posible
inmovilizar en los pocillos un anticuerpo dirigido contra el
derivado de diamina, pudiendo unirse este anticuerpo tanto al
derivado de diamina marcado (por ejemplo, con enzimas) como también
al derivado de diamina sin marcar. En la determinación de la diamina
no reaccionada por la muestra, ésta compite con el derivado de
diamina marcado añadido por los sitios de unión de anticuerpos
libres. Cuanto más derivado de diamina sin marcar esté disponible,
menos derivado de diamina marcado puede unirse al pocillo mediante
el anticuerpo de unión. La determinación del anticuerpo marcado o el
derivado de diamina se realiza con procedimientos conocidos para el
experto. Además, es posible, si por ejemplo se usa
NHS-biotina para derivatizar la diamina, proveer un
soporte sólido con estreptavidina. Las moléculas de estreptavidina
inmovilizadas en el soporte sólido (por ejemplo, los pocillos de
una placa de microtitulación) pueden unirse a continuación
específicamente a la biotina de la diamina derivatizada. Por tanto,
la diamina convertida por la DAO no puede unirse al soporte sólido.
La diamina derivatizada unida al soporte sólido mediante
estreptavidina puede detectarse directamente o indirectamente a
continuación, y dado el caso cuantificarse, con un anticuerpo que
está dirigido específicamente contra la diamina derivatizada.
Evidentemente, en lugar de la estreptavidina puede usarse otro
reactivo de unión, siempre que éste esté en condiciones de unirse a
la diamina derivatizada y, no obstante, haga posible la
accesibilidad de los anticuerpos específicos para la diamina
derivatizada.
En principio, según la invención puede
recurrirse a todos los procedimientos descritos en la bibliografía
para la detección de diaminas derivatizadas, especialmente de
derivado de diamina (véase, por ejemplo, Claret EJ y col. Comb Chem
High Throughput Screen (2003) 6:789-94).
En la derivatización debe tenerse en cuenta que
también pueden acilarse otras sustancias en la muestra que
presentan grupos amino libres. Por tanto, por una parte,
inicialmente deberá determinarse en todo caso un valor blanco y,
por otra parte, el procedimiento para determinar la diamina acilada
deberá ser específico, en el que se utiliza, por ejemplo, un
reactivo de unión, como un anticuerpo que esencialmente sólo puede
reconocer la diamina acilada.
La diaminooxidasa también puede inhibirse
parcialmente por uno de sus productos de reacción, el peróxido de
hidrógeno (Pietrageli y col. (2004) Eur. J. Biochem. 271,
146-152). Para prevenir o para reducir esta
inhibición, según una forma de realización preferida de la presente
invención, a la solución acuosa y/o a la muestra se añade
peroxidasa (EC 1.11.1), preferiblemente catalasa (EC 1.11.1.6).
Según una forma de realización preferida, la
peroxidasa o la catalasa se añade en una cantidad de 0,1 a 10,
preferiblemente de 0,2 a 5, todavía más preferiblemente de 0,5 a 2,
especialmente de 1, unidades por 100 \mul de muestra.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit para determinar la actividad de la diaminooxidasa (DAO; EC
1.4.3.6) en una muestra que comprende:
- -
- Reactivo de derivatización de diamina,
- -
- Medios para determinar la diamina derivatizada,
- -
- Dado el caso peroxidasa, preferiblemente catalasa (preferiblemente en forma liofilizada), preparado de DAO estabilizado con una cantidad definida de DAO
- -
- Dado el caso un tampón de DAO y
- -
- Dado el caso diamina como sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la actividad de la
diaminooxidasa en una muestra, preferiblemente según el
procedimiento según la invención, es especialmente adecuado un kit
como se define en este documento. En este caso, el reactivo de
derivatización comprende esencialmente los productos químicos,
tampones y similares necesarios para la derivatización de una
diamina. Como constituyente más importante, y dado el caso único,
del reactivo de derivatización deben considerarse aquellos
reactivos que son responsables de la derivatización de la diamina
(por ejemplo, donantes de grupos acilo). Además, el kit puede
contener medios para determinar la diamina derivatizada. Estos
medios comprenden preferiblemente anticuerpos dirigidos contra
diamina derivatizada, especialmente anticuerpos policlonales, y
dado el caso anticuerpos secundarios, estando marcado al menos uno
de estos anticuerpos preferiblemente enzimática o químicamente. Los
anticuerpos previstos en este caso pueden proceder dependiendo del
uso de las fuentes más distintas (por ejemplo, de un cultivo de
células, de un animal; como oveja, conejo o ratón) y estar marcados
(por ejemplo, con una enzima, con biotina, con estreptavidina, con
un radionúclido) o sin marcar.
Para la realización de una reacción de control,
en la que puede utilizarse una cantidad definida de DAO, el kit
según la invención también puede contener un preparado de DAO
estabilizado. Este preparado de DAO puede contener, por ejemplo,
DAO liofilizada o estabilizada en frío (adecuada para almacenar a
temperaturas entre -30ºC y -10ºC o entre 1ºC y 6ºC).
\newpage
Además, el kit según la invención también puede
comprender un tampón de DAO que es especialmente adecuado para la
determinación de la actividad de la DAO. El tampón de DAO puede
preverse en el kit en forma concentrada (por ejemplo, como
concentrado de 5, 10, 20 ó 50 veces).
El kit según la invención también puede contener
diamina acilada a la que puede recurrirse como patrón en la
determinación de la actividad enzimática, especialmente en la
determinación de la cantidad de diamina derivatizada.
La presente invención se representa a
continuación mediante las siguientes figuras y ejemplos, pero sin
estar limitada a éstos.
La fig. 1 muestra la correlación de los
resultados de medición de la determinación de la actividad
enzimática en una muestra con una cantidad definida de DAO entre el
procedimiento según la invención y un procedimiento con uso de
diamina radiactivamente marcada (documento AT 411.688).
La fig. 2 muestra una comparación de
sensibilidad entre un procedimiento para determinar la actividad de
DAO en una muestra con uso de diamina radiactivamente marcada y un
procedimiento para la detección del peróxido de hidrógeno formado
en la degradación de la diamina por la DAO.
La fig. 3 muestra la actividad enzimática
relativa de una cantidad definida de DAO en una muestra en función
de la cantidad de histamina utilizada.
La fig. 4 muestra la comparación de una curva
patrón de DAO con y sin adición de catalasa.
La fig. 5 muestra la velocidad de degradación de
la histamina a una actividad de la DAO de 80 U/ml. Según las curvas
características de Michaelis-Menten de la enzima, la
conversión de la histamina depende de la concentración de histamina
utilizada. El desarrollo de la conversión se especifica en esta
figura para una actividad de la DAO de 80 U/ml.
La fig. 6 muestra la dependencia de la
sensibilidad del procedimiento según la invención del volumen de
muestra utilizado.
La fig. 7 muestra la actividad de la DAO
preparada a partir de un liofilizado. Para garantizar una
estabilidad óptima del sistema de prueba, la DAO se prepara en
forma liofilizada para la curva patrón. La actividad total ya está
disponible 15 min después de la solución y también permanece estable
después de tres días a temperatura ambiente.
La fig. 8 muestra la correlación entre la
actividad de la DAO en plasma y en epitelio intestinal.
Ejemplo
1
Muestras recientemente tomadas (plasma o suero)
se conservaron a 4ºC después de la toma. Las muestras pueden
conservarse a 4ºC hasta durante 2 días, para un tiempo más largo a
-20ºC.
Día 1:
- \bullet
- Los patrones se disolvieron en 1,0 ml de agua desionizada durante 15 min a temperatura ambiente y se mezclaron bien (se removieron con vórtex)
- \bullet
- Las posiciones para los patrones y las muestras se marcaron en el protocolo de mezcla suministrado
- \bullet
- Se pipetearon 200 \mul de cada patrón y muestra en los pocillos respectivos de la placa de incubación (preparación: mezcla de 0,6 \mul de histamina (1 mg/ml en Tris 50 mM, pH 8), 0,2 \mul de catalasa, suspensión cristalina en agua, 0,12 g de sacarosa, 120 \mul de Tris 1 M, 2,3 ml de agua RO y pipeteado de 25 \mul en cada pocillo)
- \bullet
- Las tiras se taparon y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente (18-26ºC). Las tiras sin usar se guardaron en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC
Día 2:
- \bullet
- Se diluyó 10 x el concentrado de tampón de lavado con agua desionizada 1 + 9 (por ejemplo, 60 ml de concentrado de tampón de lavado más 540 ml de agua desionizada) (concentración final: Tris-HCl 100 mM, pH = 9,0)
- \bullet
- El reactivo de acilación (biotina-NHS liofilizada; varios viales según se necesiten) se disolvió con diluyente de acilación (DMSO (dimetilsulfóxido) + DMFO (dimetilformamida) 1:1) (1 ml por vial), eventualmente se reunió, se mezcló bien. El reactivo disuelto deberá usarse en el plazo de 30 min.
- \bullet
- Se pipetearon 50 \mul de reactivo de acilación disuelto en cada pocillo de la placa de incubación con muestra (por ejemplo, con multipipeta). Las tiras sin usar se guardaron en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC
- \bullet
- Las tiras se incubaron 30 min en el agitador a 37ºC
- \bullet
- Se dispusieron 150 \mul de tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, 2% de PEG) en los pocillos necesarios de la placa potenciadora (preparación: 24 ml de tampón de anticuerpo (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, 2% de PEG, 5% de sacarosa), se añadieron 19 \mul de suero anti-acilhistamina (por ejemplo, suero de cabra) y se mezclaron y se pipetearon en cada pocillo
- \bullet
- Se transfirieron 50 \mul de muestra de la placa de incubación a los pocillos correspondientes de la placa potenciadora (pipeta multicanal). Las tiras sin usar se guardaron en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC
- \bullet
- Las tiras se taparon y se incubaron 45 min a 37ºC en el agitador
- \bullet
- Se transfirieron 150 \mul de mezcla de reacción de la placa potenciadora a los pocillos correspondientes de la placa de ELISA (pipeta multicanal). Las tiras sin usar se guardaron en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC
- \bullet
- Las tiras se taparon y se incubaron 90 min a 37ºC en el agitador
- \bullet
- El contenido de los pocillos se desechó y los pocillos se lavaron 4 veces con 350 \mul de tampón de lavado diluido
- \bullet
- Se pipetearon 100 \mul de conjugado (por ejemplo, HRPO de conejo anti-cabra - 1:5000 sobre estabilizador de PO; fabricante e-bioscience) en todos los pocillos
- \bullet
- Las tiras se taparon y se incubaron 30 min a 37ºC en el agitador
- \bullet
- El contenido de los pocillos se desechó y los pocillos se lavaron 4 veces con 350 \mul de tampón de lavado diluido
- \bullet
- Se pipetearon 100 \mul de sustrato (TMB (tetrametilbenzidina) lista para uso de Sigma) en todos los pocillos y se incubó 15 min a TA (18-26ºC)
- \bullet
- Se pipetearon 50 \mul de solución de parada (HCl 1 M) en todos los pocillos
- \bullet
- La densidad óptica se determinó en un lector de ELISA a 450 nm (referencia: 620 nm)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para prevenir la inhibición de la DAO por el
peróxido de hidrógeno, a la muestra se añadió catalasa. Esto
produjo una mejora significativa de la pendiente y una linealidad
esencialmente mejorada de la curva patrón (véase la fig. 4).
La catalasa se añadió inmediatamente antes de la
reacción de la DAO con la histamina en la muestra, la actividad
asciende a 2 unidades enzimáticas de catalasa por 200 \mul de
muestra. En particular, la catalasa se dispuso liofilizada en la
placa de incubación conjuntamente con la histamina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La degradación de la histamina se realiza de
forma conocida preferiblemente por la DAO en la luz intestinal y en
las células epiteliales intestinales. Una comparación de la
actividad de la DAO en plasma y células epiteliales intestinales
muestra la correlación postulada hasta la fecha. Además, se fijó que
la actividad de la DAO en las células epiteliales intestinales es
mucho mayor (aproximadamente un factor de 100) que en la sangre.
Se homogeneizaron 10 mg de material de biopsia
en tampón Tris 50 mM (pH= 8,5 + NaCl 100 mM). El homogeneizado se
diluyó 1:300 en tampón para llevarlo al intervalo medible. Esta
dilución se midió en la prueba de forma análoga a la muestra de
plasma.
En la fig. 8 se representan gráficamente los
resultados de la comparación de la actividad de la DAO.
\newpage
Ejemplo
4
En ejemplo 4 se usan las mismas muestras que en
el ejemplo 1. El ejemplo 4 representa otra posibilidad para
realizar el procedimiento según la invención.
Día 1:
- 1.
- Disolver los patrones en 1 ml de reactivo de ensayo (agua con conservante); dejar disolver 15 min a TA, mezclar bien (remover con vórtex). Los patrones no necesarios pueden guardarse hasta 3 días a 4ºC, conservación más larga hasta la fecha de caducidad a -20ºC.
- 2.
- Disolver los controles en 1 ml de reactivo de ensayo; dejar disolver 15 min a TA, mezclar bien (remover con vórtex). Los controles no necesarios pueden guardarse hasta 3 días a 4ºC, conservación más larga hasta la fecha de caducidad a -20ºC.
- 3.
- Marcar en un protocolo de mezcla las posiciones para los patrones, los controles y las muestras. Sacar las tiras necesarias de la placa de incubación de la bolsa (preparación: mezclar 0,6 \mul de histamina (1 mg/ml en Tris 50 mM, pH 8), 0,2 \mul de catalasa, suspensión cristalina en agua, 0,12 g de sacarosa, 120 \mul de Tris 1M, 2,3 ml de agua RO y pipetear 25 \mul en cada pocillo, liofilizar).
- Guardar las tiras sin usar en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC.
- 4.
- Pipetear 50 \mul de cada patrón, control y muestra en los pocillos respectivos de la placa de incubación.
- 5.
- Pipetear 50 \mul de reactivo de ensayo en todos los pocillos, agitar ligeramente.
- 6.
- Tapar las tiras e incubarlas durante la noche a 37ºC (si es posible, agitar).
Día 2:
- 7.
- Diluir 10 x el concentrado de tampón de lavado con agua desionizada 1 + 9 (por ejemplo, 60 ml de concentrado de tampón de lavado más 540 ml de agua desionizada; concentración final: Tris-HCl 100 mM, pH = 9,0 + 0,05% de Bridge 35). El concentrado de tampón de lavado diluido puede conservarse a 4ºC.
- 8.
- Disolver los anticuerpos (por ejemplo, derivado de cabra anti-histamina) en 20 ml de tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH = 8,05 + NaCl 100 mM).
- 9.
- Disolver el reactivo de acilación (biotina-NHS liofilizado; varios viales según se necesiten) con diluyentes de acilación (DMSO (dimetilsulfóxido) + DMFO (dimetilformamida) 1:1) (1 ml por vial), eventualmente reunir, mezclar bien. El reactivo disuelto deberá usarse en el plazo de 30 min.
- 10.
- Pipetear 20 \mul de reactivo de acilación disuelto en cada pocillo de la placa de incubación con muestra.
- 11.
- Incubar las tiras 30 min a 37ºC (eventualmente agitar cuidadosamente), ¡NO tapar!
- 12.
- Pipetear 150 \mul de reactivo de ensayo en cada pocillo.
- 13.
- Incubar las tiras 30 min a 37ºC (eventualmente agitar cuidadosamente), ¡NO tapar!
- 14.
- Sacar las tiras necesarias de la placa de ELISA (recubierta con diamina derivatizada) de la bolsa.
- Guardar las tiras sin usar en una bolsa de aluminio con bolsa desecante a 4ºC.
- 15.
- Transferir 30 \mul de muestra de la placa de incubación a los pocillos correspondientes de la placa de ELISA.
- 16.
- Pipetear 150 \mul de la solución de anticuerpos disueltos (véase el punto 8) en los pocillos correspondientes de la placa de ELISA.
- 17.
- Tapar las tiras e incubarlas 45 min a 37ºC (eventualmente agitar).
- 18.
- Desechar el contenido de los pocillos y lavar 4 veces con 300 \mul de tampón de lavado diluido.
- 19.
- Pipetear 100 \mul de conjugado (por ejemplo, HRPO de conejo anti-cabra) en todos los pocillos.
- 20.
- Tapar las tiras e incubarlas 30 min a 37ºC (eventualmente agitar).
- 21.
- Desechar el contenido de los pocillos y lavar 4 veces con 300 \mul de tampón de lavado diluido.
- 22.
- Pipetear 100 \mul de sustrato (por ejemplo, mezcla de tetrametilbenzidina/peróxido de hidrógeno) en todos los pocillos.
- 23.
- Incubar 15 min a TA (18-26ºC).
- 24.
- Pipetear 50 \mul de solución de parada (por ejemplo, HCl 1M) en todos los pocillos.
- 25.
- Determinar la densidad óptica en un lector de ELISA a 450 nm (referencia: 620 nm).
Claims (16)
1. Procedimiento para determinar la actividad de
la diaminooxidasa (DAO; EC 1.4.3.6) en una muestra que comprende
las etapas:
- -
- Proporcionar una cantidad prefijada de una diamina, preferiblemente en una solución acuosa o liofilizada,
- -
- Mezclar e incubar la diamina con la muestra durante un espacio de tiempo fijado bajo condiciones a las que la diamina puede convertirse mediante una DAO dado el caso presente en la muestra,
- -
- Derivatizar la diamina todavía presente,
- -
- Determinar la cantidad de diamina derivatizada y
- -
- Comparar la cantidad prefijada de diamina con la cantidad de diamina derivatizada y determinar la actividad de la diaminooxidasa dado el caso presente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento para identificar inhibidores de
la diaminooxidasa y para determinar la capacidad de inhibición de
estos inhibidores que comprende las etapas:
- -
- Proporcionar una cantidad prefijada de una diamina, preferiblemente en una solución acuosa o liofilizada, y de diaminooxidasa
- -
- Mezclar e incubar la diamina y la diaminooxidasa con un compuesto, que potencialmente inhibe la actividad de la diaminooxidasa, durante un espacio de tiempo fijado
- -
- Derivatizar la diamina todavía presente,
- -
- Determinar la cantidad de diamina derivatizada
- -
- Comparar la cantidad prefijada de diamina con la cantidad de diamina derivatizada y determinar la actividad de la diaminooxidasa y
- -
- Dado el caso de los inhibidores de la diaminooxidasa mediante comparación de las actividades de la diaminooxidasa con y sin adición de inhibidor, reduciendo un inhibidor de la diaminooxidasa la actividad de la diaminooxidasa al menos el 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la diamina se seleccionada del grupo
constituido por histamina, putrescina, espermidina y cadaverina.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución
acuosa comprende una solución de tampón Tris
(tris(hidroximetil)-aminometano) con un valor
de pH de 7 a 9,5, preferiblemente de 7,5 a 9, especialmente de 8 a
8,5.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la solución
acuosa contiene diamina en una cantidad de 5 a 400, preferiblemente
de 10 a 200 \muM, especialmente de 80 \muM.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la incubación de
la solución acuosa con la muestra se realiza a una temperatura de
10 a 50ºC, preferiblemente de 25 a 40ºC, todavía más
preferiblemente de 30 a 38ºC, especialmente de 34 a 38ºC.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la incubación de
la solución acuosa con la muestra se realiza durante 30 min a 36 h,
preferiblemente durante 1 a 30 h, todavía más preferiblemente
durante 3 a 24 h, especialmente durante 18 h.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la incubación de
la solución acuosa con la muestra se detiene antes de la
derivatización con aminoguanidina.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la etapa de
procedimiento de la derivatización comprende acilar.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la diamina se acila con
NHS-biotina.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la cantidad de
diamina derivatizada se determina mediante cromatografía,
especialmente con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),
electroforesis, especialmente electroforesis capilar (CE), o
inmunoensayo, especialmente inmunoensayo enzimático (ELISA;
"Enzyme-linked Immunosorbent Assay" ("ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas")) o radioinmunoensayo
(RIA).
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque a la solución
acuosa y/o a la muestra se añade peroxidasa, preferiblemente
catalasa.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la peroxidasa se añade en una cantidad
de 0,1 a 10, preferiblemente de 0,2 a 5, todavía más preferiblemente
de 0,5 a 2, especialmente de 1, unidades de peroxidasa por 100
\mul de muestra.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque antes de
mezclar e incubar la diamina con la muestra, la diaminooxidasa de
la muestra se enriquece selectivamente a partir de la muestra
mediante un anticuerpo específico que está unido a una fase
sólida.
15. Uso de un kit que comprende:
- -
- Reactivo de derivatización de diamina,
- -
- Medios para determinar la diamina derivatizada,
- -
- Preparado de DAO estabilizado con una cantidad definida de DAO
- -
- Tampón DAO,
- -
- Dado el caso peroxidasa, preferiblemente catalasa, y
- -
- Dado el caso diamina como sustrato para determinar la actividad de la diaminooxidasa (DAO; EC 1.4.3.6) en una muestra.
16. Uso según la reivindicación 15,
caracterizado porque el medio para determinar la diamina
derivatizada comprende anticuerpos dirigidos contra la diamina
derivatizada, especialmente anticuerpos policlonales, y dado el
caso anticuerpos secundarios, estando marcado al menos uno de estos
anticuerpos preferiblemente enzimática o químicamente.
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