ES2322349T3 - La proteina aca con anclaje gpi como un nuevo marcador tumoral. - Google Patents
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Abstract
Una glicoproteína de superficie ACA que posee las siguientes características: a) Está anclada a la superficie mediante un motivo GPI b) Puede ser retirada de la membrana celular mediante tratamiento con PI-PLC. c) Su anclaje GPI se caracteriza por un anillo inositol no acetilado y un diacilglicerol como cola lipídica del anclaje. d) Posee un punto isoeléctrico de pH 5.5 e) Está presente en células sanguíneas progenitoras, granulocitos, monocitos, células B (y no células T), melanocitos y otras células. f) Se expresa preferentemente durante la división celular y en células tumorales. También aplicable a su forma salina.
Description
La proteína ACA con anclaje GPI como un nuevo
marcador tumoral.
La presente invención se refiere a una
glicoproteína de membrana con un anclaje GPI, el cual se caracteriza
por un anillo inositol no acetilado y una cola lipídica de
diacilglicerol para el anclaje. La proteína ACA se expresa
abundantemente en células de melanoma, en algunas células de
leucemia y en otros tipos de células tumorales, por lo que es útil
como marcador diagnóstico de dichos tumores. La invención también
está referida a sales, derivados funcionales y fracciones activas
de ACA que poseen sustancialmente el mismo espectro de actividad
biológico que ACA. También se refiere al proceso de purificación de
ACA, a su clonaje y a su producción mediante técnicas de ADN
recombinante. Se refiere además a herramientas diagnósticas en las
que se incluyen un anticuerpo anti-ACA, un
oligonucleótido sonda capaz de hibridar con el ARNm de ACA y
compuestos farmacéuticos, conteniendo un compuesto capaz de reducir
la expresión de ACA o su actividad.
La tumorogénesis representa un complejo proceso
multiestado en el cual cambios genéticos y factores ambientales
desregulan los procesos celulares que controlan la proliferación y
diferenciación celular. El melanoma es uno de los cánceres más
comunes a nivel mundial y la mortalidad de pacientes de melanoma se
ha incrementado un 230% en los últimos años. La diagnosis y
monitorización de este tipo de de cáncer es difícil por la
heterogeneidad de esta enfermedad. En base al índice diagnóstico de
Gleason, se distinguen distintos grados de malignidad. Para
realizar estos diagnósticos se toma una muestra del paciente
mediante biopsia y se investiga la morfología del tejido. Sin
embargo, dicha aproximación sólo arroja resultados subjetivos
dependiendo de la experiencia del patólogo. Por tanto,
desafortunadamente, los métodos diagnósticos utilizados hasta el
momento son bastante insensibles, y a menudo generan resultados
falsos positivos debido a la falta de especificidad. Incluso,
utilizando los métodos diagnósticos actuales, no pueden obtenerse
conclusiones acerca del grado de malignidad, la progresión del
tumor y su potencial de metástasis. Así, el uso de marcadores
diagnósticos adecuados servirá de ayuda para la comprensión de las
bases moleculares de tumores como los melanomas, para distinguir
tejido benigno de maligno y para graduar el estado del tumor,
especialmente en pacientes con metástasis de melanoma con mal
pronóstico. Sería muy útil tener un marcador diagnóstico en
particular para micrometástasis de melanoma, que de información
acerca del patrón de metástasis en pacientes con un solo tumor. Esto
podría mejorar la diagnosis y permitir la selección óptima de
quimioterapia. Un marcador así no ha sido descrito todavía. Puede
esperarse que marcadores de este tipo sean también útiles para el
desarrollo de nuevos abanicos terapéuticos para el tratamiento del
cáncer.
Por tanto, el problema técnico subyacente a la
presente invención es proveer medios para el diagnóstico del cáncer
que superen las desventajas de los métodos diagnósticos
actuales.
La solución a este problema técnico se consigue
con la consecución de lo expuesto en las reivindicaciones.
Se ha elaborado un método para aislar y
purificar una glicoproteína nueva de membrana que contiene un
anclaje GPI mediante adición de sulfato amónico
(40-80% saturación), seguido de
SDS-PAGE, cromatografía y precipitación con
acetona. La preparación obtenida fue homogénea durante la
electroforesis en presencia de 0.1% SDS tras la reducción con
2-mercaptoetanol. Se trata de una proteína soluble a
su punto isoeléctrico (pH 5.5) con un peso molecular aproximado de
65.000 Dalton. La proteína aislada está anclada a la membrana
mediante un glicosilfosfatidilinositol susceptible de ser cortado
por fosfolipasa C purificada. Se marcó radiactivamente la porción
hidrofóbica del anclaje a membrana glicolipídico con el agente
fotoactivado
3-(Trifluorometil)-3-(m[^{125}J]iodofenil)diazirina
y se hidrolizó con fosfolipasa C específica para
glicosilfosfatidilinositol (GPI-LC), seguido de
deacetilación enzimática de los lípidos restantes. Mediante
cromatografía en capa fina se muestra que el fragmento radiomarcado
generado migra con la misma movilidad que la glicoproteína variable
de superficie (VSG), obtenida del mismo modo. El anclaje de ACA, al
contrario que otras proteínas de eritrocitos con anclaje GPI, posee
un anillo inositol y diacilglicerol, en lugar de un
alquil-acilglicerol como cola lipídica de anclaje.
Además, se investigó la distribución y el anclaje a la membrana de
ACA. Se generaron anticuerpos policlonales de conejo y anticuerpos
monoclonales de ratón contra la proteína purificada y se utilizaron
para analizar la expresión de ACA en células de sangre periférica
humana mediante citometría de flujo de uno y dos colores. Los
resultados mostraron que esta proteína está presente en
granulocitos, monocitos y linfocitos B, y ausente en linfocitos T.
Mediante análisis de eritrocitos por citometría de flujo no se
encontró expresión de la proteína, sin embargo, si se detectó
reacción de anticuerpos policlonales y monoclonales frente a
membrana de eritrocitos por inmunoblot. ACA se eliminó de la
membrana de granulocitos mediante tratamiento con
PI-PLC, una enzima que hidroliza específicamente el
anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). La forma soluble de
ACA, precipitada del sobrenadante de granulocitos se detectó por
inmunoblot con anticuerpos anti-ACA. Las células B
fueron menos susceptibles a la digestión por
PI-PLC, probablemente debido a una acetilación
parcial del anillo inositol. Se observó que una línea celular de
células B transformada con el virus de Epstein-Barr
(EBV) de un paciente con hemoglobinuria paroximal nocturna (PNH)
(una enfermedad caracterizada por la deficiencia parcial o total de
todas las proteínas ancladas a membrana mediante inositolglicanos),
era negativa para ACA, al contrario que células EBV de donantes
sanos. Finalmente, se encontró que ACA está altamente expresada en
melanoma y en algunas células leucémicas, lo que sugiere importantes
funciones reguladoras de esta proteína. Se generaron dos
anticuerpos monoclonales distintos anti-ACA y ambos
mostraron ser útiles para la detección de metástasis de células de
melanoma por inmunohistoquímica.
Los inventores reconocen que existen dos formas
de la proteína de membrana con anclaje GPI llamada ACA. Una forma
de aproximadamente 68 kD y otra de aproximadamente 65 kD fueron
aisladas de eritrocitos humanos con anclaje intacto de
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Ambas formas proteicas reaccionan
con anticuerpos monoclonales y policlonales generados frente a la
proteína ACA purificada de 65 kD. Frecuentemente en la
caracterización de una proteína es de utilidad determinar si la
proteína posee N-glicanos y, si los posee, realizar
una determinación de cuántos N-glicanos están
unidos al esqueleto peptídico y su contribución en el peso molecular
total de la glicoproteína. Dado que los N-glicanos
son estructuras relativamente grandes y contribuyen en gran medida
al peso molecular aparente de las glicoproteínas al analizarlas por
SDS-PAGE en condiciones reductoras, se realizó
antes y después un tratamiento con una enzima
N-glicosidasa de amplia especificidad. Estas enzimas
hidrolizan específicamente el enlace N-glicosídico
entre los N-glicanos y el péptido. Para clarificar
la heterogeneidad del tamaño de la proteína ACA, se han analizado
las cadenas de carbohidratos unidas por enlaces
O-glicosídicos o Nglicosídicos mediante digestión
con sialidasa,
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa,
péptido-N-glicosidasa F y
Oglicosidasa. La incubación sucesiva de estas proteínas con
glicosidasas que eliminan oligosacáridos unidos mediante enlaces
O-glicosídicos o N-glicosídicos de
glicoproteínas origina una única especie proteica de aproximadamente
59 kD al analizarla por SDS-PAGE. Se obtuvo el
mismo resultado mediante deglicosilación química usando ácido
trifluorometanosulfónico anhidro (TMSF), el cual elimina no
selectivamente las cadenas de O- y N- de carbohidratos. Por tanto,
se puede concluir que la diferencia en el grado de
N-glicosilación es la principal causa de la
heterogeneidad molecular de ACA.
Figura
1
Reacción enzimática de hidrólisis total de la
cola lipídica del glicosilfosfatidilinositol de ACA y reacciones
enzimáticas para la determinación de concentraciones de
glicerol.
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Figura
2
Electroforesis de la fracción proteica de
eritrocitos con sulfato amónico y ACA purificada realizada con
4-15% SDSPAGE. (A) Carriles 1, 2 y 3: Proteína ACA
purificada obtenida de varios lotes de eritrocitos. Carril 4 y 5:
Extractos proteicos precipitados con 40% de sulfato amónico
obtenidos de varios lotes de membranas de eritrocitos. Carril 6:
Marcador de pesos moleculares. (B) Proteína ACA purificada, tiene un
peso molecular de 65 kD aproximadamente.
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Figura
3
Electroforesis de ACA purificado en gel de
gradiente-IEF (A) Carriles 1-6 ACA
purificado de varios lotes de eritrocitos, iniciando en el ánodo
(B) Inicio en el cátodo. Carril 7A: Estándares de calibración del pl
de IEF.
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Figura
4
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Figura
5
Corte de ACA con GPI-PLC,
PI-PLC y GPI-PLD (A) 1, ACA
purificado; 2, ACA tratado con PI-PLC. (B) 1, ACA
purificado; 2, ACA tratado con GPI-PLD; 3, ACA
tratado con GPI-PLC.
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Figura
6
El determinante de reacción cruzada (CRD) es
generado por la acción de G/PI-PLC. (A)
SDS-PAGE 1, Proteína ACA nativa purificada; 2, ACA
purificada cortada por GPI-PLC. (B) Inmunoblot con
anticuerpo anti-CDR; 3, mf ACA (proteína nativa);
4, Digestión de GPI-PLC de la glicoproteína variable
de superficie (sVSG); 5, Digestión de ACA con
GPI-PLC; 6, ACA digerida con
GPI-PLD.
\newpage
Figura
7
Muestras de TID-marcadas con
[^{125}J], las proteínas purificadas se hidrolizaron con
GPI-PLC. Los productos lipídicos de la reacción
fueron posteriormente hidrolizados con lipasas altamente
específicas. Los fragmentos marcados con el isótopo fueron
extraídos y analizados por TLC. El ácido mirístico fue usado como
referencia. Carril 1, Como control se usó mf VSG comercial, el cual
fue marcado y digerido con GPI-PLC e hidrolizado
posteriormente como se ha descrito con ACA; Carril 2, Proteína ACA
digerida con GPI e hidrolizada posteriormente.
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Figura
8
Las proteínas se sometieron a
SDS-PAGE en condiciones reductoras, se transfirieron
a una membrana de nitrocelulosa y se revelaron con anticuerpo de
ratón anti-ACA. Carril 1, extracto de proteína crudo
de membranas de eritrocito; 2, Proteína ACA purificada de
eritrocito; 3, "Ghost" de eritrocitos; 4, "Ghost" de
preparados de células de eritroleucemia.
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Células de sangre periférica de donantes sanos
incubadas con anticuerpos monoclonales de ratón para ACA y
antimouse-IgG-FITC. Después de la
lisis de los eritrocitos, se analizaron por FSC/SSC los
granulocitos, monocitos, linfocitos y reticulocitos. Los
eritrocitos se analizaron por separado. Los resultados muestran
expresión de ACA en granulocitos (b), monocitos (c), parcialmente
en linfocitos (d). No se detectó expresión en eritrocitos (d) y en
reticulocitos (f). Se usó como control negativo un anticuerpo
irrelevante (a).
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Figura
10
Esta figura muestra el resumen de los datos del
análisis de la expresión de ACA en células de sangre periférica de
20 donantes sanos estudiada mediante citometría de flujo con
anticuerpos monoclonales de ratón específicos. La expresión se
muestra como porcentaje de células positivas para cada subpoblación:
granulocitos, monocitos y linfocitos.
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Figura
11
Granulocitos purificados con tampón solo o con
PI-PLC de Bacillus cereus, teñidos con
anticuerpos anti-ACA o anticuerpos IgG irrelevantes
(control negativo) y analizados como se ha descrito. Los
experimentos control se realizaron en las mismas condiciones
utilizando células de eritroleucemia (HEL) teñidas con los
anticuerpos antiACA y anti-CD55. Otro control se
realizó con GPI-fosfolipasa D de suero bovino, la
cual no es capaz de solubilizar proteínas con anclaje GPI. Los
histogramas muestran: la expresión de ACA en granulocitos (a), la
ausencia de la expresión de ACA en granulocitos tras la digestión
con PI-PLC (b), la expresión de ACA tras la
digestión con GPI-PLD (c), la expresión de ACA en
células HEL (d), la rescisión de la expresión de ACA en células HEL
mediante el tratamiento con PI-PLC (e), la
rescisión de la expresión de CD55 en células HEL tras el tratamiento
con PI-PLC (f).
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Figura
12
Linfocitos B periféricos purificados se
incubaron con elevadas concentraciones de PI-PLC
bacteriana como se ha descrito y se tiñeron con anticuerpo
monoclonal anti-ACA para su análisis por citometría
de flujo. Los histogramas muestran: expresión de ACA en linfocitos
B y el control negativo de IgG (a), expresión de ACA tras el
tratamiento con PI-PLC (b). En un segundo
experimento, linfocitos B periféricos purificados se incubaron con
anticuerpos antiACA (marcado con FITC) y con anticuerpos contra
marcadores típicos de células B (CD19, CD20, marcados con PE). Por
análisis de Dot-Blot se muestra: control de isotipo
(c), expresión de ACA en células CD19 negativas (d) y en células
CD20 positivas (e). En un tercer experimento se marcaron PBMCs con
anti-ACA (conjugado a FITC) y con los anticuerpos
anti-CD19, anti-CD20 (conjugados a
PE). El análisis de Dot-Blot muestra el control de
isotipo (f), la expresión de ACA en células periféricas CD19
positivas (g), la expresión de ACA en células periféricas CD20
positivas (h). Un porcentaje del 10-15% de PBMCs
fueron positivos tanto para ACA como para antígenos de células
B.
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Figura
13
Se generaron Linfocitos B transformados con EBV
normales y PNH como se ha descrito, se tiñeron con anticuerpo
anti-ACA (conjugado a FITC) y se analizaron por
citometría de flujo. Se utilizó como control negativo un anticuerpo
irrelevante. Los histogramas muestran: expresión de ACA en
linfocitos B transformados con EBV derivados de un donante sano
(a), expresión de ACA en linfocitos B transformados con EBV
derivados de un paciente con PNH (b). Mientras que células B
normales expresan altos niveles de ACA, células
B-PNH muestran una reducción significativa de este
antígeno.
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Figura
14
Se purificaron linfocitos T como se ha descrito
y se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti ACA (conjugado a FITC)
y anti-CD3 (b), CD4 (c) o CD8 (d) (conjugados a PE).
El control negativo (a) consistió en inmunoglobulinas irrelevantes
conjugadas a PE o FITC. El porcentaje de células para ACA se muestra
en el cuadrante UR. En un segundo experimento, se tiñeron PBMCs con
anticuerpos anti-ACA (conjugados a PE) y con
anticuerpos contra marcadores de células T (conjugados a FITC): CD2
(f), CD5 (g), \gamma\delta-TCR (h). El control
negativo (e) consistió en inmunoglobulinas irrelevantes conjugadas
a PE y FITC. Las células T positivas para ACA se muestran en el
cuadrante UR.
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Figura
15
Clones de células T de pacientes con PNH,
negativos (b) o positivos (c) para CD48 (la cual está unida a GPI)
se tiñeron con anticuerpos anti-CD48 (conjugado a
FITC) y anti-ACA (conjugado a PE). El control
negativo consistió en la tinción con anticuerpos irrelevantes
conjugados a PE y FITC (a). En otro experimento, se analizaron
líneas celulares derivadas de células T malignas por citometría de
flujo de un solo color utilizando anticuerpos
anti-ACA (conjugados a FITC). En el control negativo
las células se tiñeron con inmunoglobulinas no reactivas conjugadas
a FITC. Los histogramas muestran la expresión de ACA en células CEM
(d) MOLT4 (e) y células Jurkat (f).
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Figura
16
Muestras de 2x10^{6} células disueltas como se
ha descrito (a) o el sobrenadante de cultivos de granulocitos (b)
se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron las
proteínas a membranas de nitrocelulosa. Se detectó ACA con
anticuerpos preparados con anterioridad frente a la proteína ACA
purificada de eritrocitos humanos. Las membranas se tiñeron con
anticuerpo secundario conjugado a AP y el sustrato BCIP/NTB. Los
resultados muestran (a) marcador de peso molecular (MWM, carril 1),
células B solubilizadas (carril 2), granulocitos solubilizados
(carril 3), eritrocitos solubilizados (carril 4), fracción ghost de
eritrocitos solubilizados (carril 5), extracto crudo de proteína de
membranas de eritrocitos (carril 6). (b) MWM (carril 1),
sobrenadante de granulocitos antes de la digestión con
PI-PLC (carril 2), sobrenadante precipitado de
granulocitos tras la digestión con PI-PLC (carril
3).
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Figura
17
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
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Figura
18
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
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Figura
19a,b
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
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Figura
19c
Análisis mediante inmunoblot con anticuerpo
anti-ACA de extractos libres de células. Se muestran
melanocitos (carriles 1 y 2), queratinocitos (carriles 3 y 4),
marcador de peso molecular (carril 5). Detalles en los ejemplos 1 y
13.
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Figura
20
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
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Figura
21
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
22
Detalles en los ejemplos 1 y 13.
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Figura
23
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
24
Homegeneizado de piel normal (a), IgG (control
negativo) (b), homogeneizado de tejidos tumorales obtenidos de
distintos pacientes (c-f).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
25
Renal (carril 1), pulmón (carril 2), mama
(carril 3), colon (carril 4), cáncer gástrico (carril 5), melanoma
(carril 6) y mieloma (carril 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
26
IgG control (a), CD34/CD38 (b), CD34/CD90 (c),
CD34/CD117 (d) anti-ACA/CD38 (e),
anti-ACA/CD90 (f), antiACA/CD117 (g),
anti-ACA/HLA-DR (h), IgG control
(i), anti-ACA/CD13 (j),
anti-ACA/CD33 (k) y anti-ACA/CD34
(1).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
Figura
27
(a) HEL, (b) U-937, (c)
HL-60, (d) K-562
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
28
(1) Marcador de peso molecular, (2) leucemia
mieloide crónica humana (K-562), (3) eritroleucemia
promielocítica humana (HL-60), (4) eritroleucemia
humana (HEL), (5) linfoma histiocítico humano
(U-937).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
29
(a,b) Se incubaron células de sangre
periférica de pacientes con PNH con anticuerpos monoclonales de
ratón anti-ACA junto con anti-mouse
IgG FITC y se analizaron por FACS.
Tras la lisis de los eritrocitos, los
granulocitos se identificaron por FSC/SSC.
(c). Análisis mediante inmunoblot con
anticuerpo anti-ACA de la fracción de membrana de
granulocitos obtenida de donantes sanos (carril 1) y de pacientes
con PNH (carril 2).
Marcador de peso molecular (carril 3).
(d). Análisis mediante inmunoblot con
anticuerpo anti-ACA de la fracción de membrana de
granulocitos PNH antes (carril 1) o después (carril 2) del
tratamiento con fosfolipasa C.
Marcador de peso molecular (carril 3).
(e,f). Análisis mediante inmunoblot de la
forma soluble de ACA en sobrenadantes de granulocitos derivados de
donantes sanos (d) y de pacientes con PNH (e) tras el tratamiento
con fosfolipasa C.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
30
Electroforesis de proteínas ACA purificadas en
geles SDS-PAGE del 4-15%. Carril 1:
principal proteína ACA purificada, masa molecular 65 kD. Carril 2:
proteína ACA purificada, masa molecular 68 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
31
Se midió el espectro UV de dos formas
purificadas de proteína ACA de eritrocitos en un espectrofotómetro
Beckman. A: Espectro UV de la proteína ACA purificada de 65 kD. B:
Espectro UV de la proteína ACA purificada de 68 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
32
Las proteínas se sometieron a
SDS-PAGE en condiciones reductoras, se transfirieron
a membrana de nitrocelulosa y se reveló con anticuerpo de ratón
anti-ACA. Carril 1: ACA purificada de eritrocitos,
65 kD. Carril 2: ACA purificada de eritrocitos, 68 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
33
Muestras con proteínas purificadas y marcadas
con [^{125}I]TID, fueron hidrolizadas con
GPI-PLC. Los productos lipídicos de estas
reacciones fueron posteriormente hidrolizados con lipasas altamente
específicas. Los fragmentos radiomarcados se extrajeron y se
analizaron por TLC. Se usó como estándar el ácido mirístico. Carril
1: se utilizó como control mVSG, marcado, digerido con
GPI-PLC e hidrolizado como se ha descrito con ACA.
Carril 2: proteína ACA de 65 kD digerida con
GPI-PLC e hidrolizada posteriormente. Carril 3:
forma de 68 kD de ACA digerida e hidrolizada como descrito
anteriormente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
34
A: Análisis por SDS-PAGE de
la forma de ACA de eritrocitos de 65 kD incubada con
PNGasaF.
Carril 1: ACA de 65 kD purificada tras la
incubación con PNGasa F 0 minutos. Carril 2: ACA de 65 kD purificada
tras la incubación con PNGasa F 10 minutos. Carril 3: 30 minutos.
Carril 4: 90 minutos. Carril 5: 150 minutos. Carril 6: toda la
noche.
B: Análisis por SDS-PAGE de
la forma de ACA de eritrocitos de 68 kD incubada con PNGasa
F.
Carril 1: ACA de 68 kD purificada tras la
incubación con PNGasa F 0 minutos. Carril 2: ACA de 68 kD purificada
tras la incubación con PNGasa F 10 minutos. Carril 3: 30 minutos.
Carril 4: 90 minutos. Carril 5: 150 minutos. Carril 6: toda la
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
35
Electroforesis de la proteína ACA de 65 kD y de
los productos de su desglicosilación química y enzimática en
SDSPAGE 4-15%.
A: Carril 1, ACA purificada de 65 kD
B: Carril 1, ACA purificada de 65 kD tratada con
sialidasa. Carril 2, O-glicosidasa. Carril 3, PNGasa
F. Carril 4, tratamiento sucesivo de ACA de 65 kD de eritrocitos
con sialidasa, O-glicosidasa y PNGasa F.
C: Carril 1, ACA purificada de 65 kD tras la
desglicosilación química con TMSF.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, por un lado, la presente invención se
refiere a una glicoproteína de membrana que tiene las siguientes
características:
- (a)
- Está anclada mediante un GPI a la superficie celular
- (b)
- Puede separarse de la membrana mediante tratamiento con PI-PLC
- (c)
- Su anclaje GPI se caracteriza por un anillo de inositol no acetilado y el diacilglicerol como cola lipídica del anclaje.
Se encuentran preferentemente diacilmiristato u
otros ácidos grasos en su cola lipídica.
Esta glicoproteína de membrana (ACA) se
caracteriza además por:
- (a)
- Tiene un punto isoeléctrico de pH 5.5
- (b)
- Está presente en células sanguíneas progenitoras, granulocitos, monocitos, células B (y no células T), melanocitos y otras células.
- (c)
- Se expresa preferentemente durante la división celular y en células tumorales.
También aplicable a su forma salina.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El término "sal" usado aquí se refiere
tanto a sales del grupo carboxilo como a la adición de sales ácidas
a los grupos amino de la molécula de proteína. El extremo
C-terminal de la proteína está unido mediante un
anclaje GPI con diacilmiristato al final de la molécula, y el
extremo N-terminal de la proteína está bloqueado,
probablemente por acetilación. Entonces, no pueden formarse sales en
los extremos amino y carboxilo terminal de la proteína nativa
completa. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por
procedimientos habituales en el campo e incluyen sales inorgánicas
como por ejemplo sodio, calcio, amonio, sales de zinc o de hierro y
similares. También pueden formarse sales con bases orgánicas como
las constituidas por ejemplo con aminas (trietanolamina, arginina,
lisina, piperidina, procaína y similares). La adición de sales
ácidas incluyen, por ejemplo, sales con minerales ácidos como ácido
clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales de ácidos orgánicos como
ácido acético o ácido oxálico.
El término "derivado funcional" usado aquí
engloba derivados que poseen sustancialmente la misma actividad
biológica que ACA, los cuales pueden ser preparados (por métodos
convencionales) a partir de los grupos funcionales de las cadenas
laterales de los grupos amino o carboxilo terminal. Estos derivados
funcionales se incluyen en la invención dado que no destruyen la
actividad de la proteína ni confieren propiedades tóxicas. Estos
derivados pueden incluir, por ejemplo, ésteres alifáticos de los
grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacción
con amonio o aminas primarias o secundarias, derivados de grupos
amino libres de los residuos de aminoácidos formados por motivos
acilo (por ejemplo los grupos acilo alcanoil o carbocíclico) o
derivados de Oacilo del grupo hidroxilo libre (por ejemplo residuos
seril o treonil) formados con motivos ácidos.
Una "fracción activa" de ACA en la presente
invención engloba cualquier fragmento o precursor de la cadena
polipeptídica de la molécula proteica sola o asociada a moléculas o
residuos unidos a ella (por ejemplo azúcares o fosfato), o
agregados de la molécula proteica o los mismos residuos de azúcar.
Dichas fracciones activas poseen al menos una de las actividades
biológicas de ACA como actividad transductora de señales.
La glicoproteína de superficie ACA de la
presente invención se obtiene preferentemente del cuerpo humano
mediante:
- (a)
- Aislamiento y lisis de células, preferentemente eritrocitos.
- (b)
- Aislamiento disgregación y concentración de membranas libres de hemoglobina de dicha células.
- (c)
- Desalinización continuada de dichas membranas con sulfato amónico (70%-40% de saturación).
- (d)
- SDS-PAGE preparativo en condiciones reductoras de las proteínas precipitadas en el paso (c).
- (e)
- Aislamiento de la proteína de la banda del gel.
Los distintos pasos de este método son llevados
a cabo siguiendo protocolos estándar, como los protocolos descritos
en los siguientes ejemplos.
Como punto importante para la realización de
esta patente, la glicoproteína de superficie ACA de la presente
invención se caracteriza por un peso molecular de 65 kD cuando se
analiza por SDS-PAGE en condiciones reductoras.
Aún más importante, la glicoproteína de
superficie ACA de la presente invención posee al menos una de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
- (a)
- D-L-V-P-L-E-D-K-V-T-I-L-G-M-T-A
- (b)
- K-L-A-L-S-A-D-D-P-G-F-H-N-F-S-H-Q-R-Q-T
- (c)
- D-Q-Q-T-T-S-H-S-S
- (d)
- V-L-E-I-M-L-P
- (e)
- F-Q-D-E-S-E-A-N-K
- (f)
- M-K-Y-V-N-F-K-F-Y-F
- (g)
- N-L-D-F-M-T-W-G-V-T-K-V-T-Y-I-G-Q-P-T-G-G
- (h)
- L-L-M-D-N-N-E-A-V-H
- (i)
- F-D-Q-A-W-A-D-T-A-H-T-W
- (j)
- K-L-D-D-I-Q-K-D-M-Y-S-Q-Q-D-T
- (k)
- G-V-W-I-M-K-N-Q-I-T
Los datos de la secuencia proteica de ACA están
disponibles en las bases datos SWISS-PROT y TrEMBL
con el número de acceso 83408.
La presente invención también se relaciona con
el proceso de aislamiento de la proteína ACA, lo que engloba:
- (a)
- Aislamiento y lisis de células, preferentemente eritrocitos humanos
- (b)
- Aislamiento, disgregación y concentración de membranas libres de hemoglobina de dicha células.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (c)
- Desalinización continuada de dichas membranas con sulfato amónico (70%-40% de saturación).
- (d)
- SDS-PAGE preparativo en condiciones reductoras de las proteínas precipitadas en el paso (c).
- (e)
- Aislamiento de la proteína de la banda del gel.
La presente invención también se refiere a la
glicoproteína de superficie ACA, la cual es preferentemente
producida en células de mamífero. Los métodos para la reproducción
recombinante de ACA usando moléculas de ácido nucleico de la
invención se describen más adelante.
La presente invención también concierne a la
molécula de ácido nucleico, preferentemente a una molécula de ADN,
que engloba la secuencia de nucleótidos codificante de la
glicoproteína de superficie ACA de la invención o un fragmento de
la misma, donde dicha glicoproteína de superficie ACA contiene al
menos las siguientes secuencias de aminoácidos:
- (a)
- D-L-V-P-L-E-D-K-V-T-I-L-G-M-T-A
- (b)
- K-L-A-L-S-A-D-D-P-G-F-H-N-F-S-H-Q-R-Q-T
- (c)
- D-Q-Q-T-T-S-H-S-S
- (d)
- V-L-E-I-M-L-P
- (e)
- F-Q-D-E-S-E-A-N-K
- (f)
- M-K-Y-V-N-F-K-F-Y-F
- (g)
- N-L-D-F-M-T-W-G-V-T-K-V-T-Y-I-G-Q-P-T-G-G
- (h)
- L-L-M-D-N-N-E-A-V-H
- (i)
- F-D-Q-A-W-A-D-T-A-H-T-W
- (j)
- K-L-D-D-I-Q-K-D-M-Y-S-Q-Q-D-T
- (k)
- G-V-W-I-M-K-N-Q-I-T
El término "molécula de ADN" incluye ADN
genómico, ADN copia, ADN sintético y combinaciones de los
mismos.
El clonaje de ACA puede realizarse por distintas
técnicas. Según una de las aproximaciones, se producen anticuerpos
específicos anti-ACA (monoclonales o policlonales) y
se usan para clonar ACA. Esta aproximación se basa en los
siguientes tres pasos:
- (A)
- Preparación de anticuerpos: se pueden producir Anticuerpos Anti-ACA utilizando ACA considerablemente purificado de la presente invención, o utilizando uno o varios péptidos sintéticos idénticos a la secuencia de aminoácidos conocida de la proteína, o por fusión de una de las secuencias de nucleótidos posibles deducidas de la secuencia de aminoácidos de ACA al gen que codifica para la proteína A y expresando la Proteína A-ACA fusionada en E. coli. La generación de los anticuerpos convenientes esta descrita debajo.
- (B)
- Selección de las células productoras de ACA: los anticuerpos frente a ACA se usan para buscar células que producen ACA por inmunofluorescencia o por Western blot. Ejemplos de las células adecuadas se pueden encontrar en los ejemplos de abajo.
- (C)
- Preparación de ADN copia proveniente de las células productoras: el ARN mensajero se extrae a partir de las células productoras de ACA y se obtiene el ADNcopia mediante el empleo de transcriptasa reversa. El ADN copia se clona en un vector de expresión como lambda-gT11, lambda-"ZAP" (e.j., "UNIT- ZAP ^{TM} XR custom cDNA library" Stratagene, La Jolla, CA, USA) y es seleccionado mediante el uso de anticuerpos preparados acorde con el método estándar descrito por Türeci et al. (Cancer Res. 56 (1996), 4766-4772). Los anticuerpos que se unen a proteínas recombinantes expresadas en placas líticas se pueden detectar, por ejemplo: mediante incubación con fosfatasa alcalina conjugada a anticuerpo de cabra anti ratón (goat anti-mouse IgG) (e.j disponible en DAKO, Glostrup, Danmark) y visualizados mediante marcaje con 5-bromo-4-cloro-3 indolil fosfato nitro azul tretrazolio.
Otra aproximación es la producción de un
oligonucleótido sintético o una mezcla de oligonucleótidos
sintéticos cuya secuencia se deriva a partir de la secuencia de un
fragmento de la proteína ACA. Este oligonucleótido o esta mezcla de
oligonucleótidos se utiliza como sondas degeneradas para el clonaje
de ADN copia o de ADN genómico codificante de la proteína ACA. El
ADN genómico puede poseer o no intrones de manera natural. Este se
puede obtener, por ejemplo, mediante su extracción a partir de
células como es bien conocido en el campo. Las preparaciones de ADN
genómico humano son fraccionadas mediante la utilización de enzimas
de restricción o fragmentadas al azar, insertándose los fragmentos
obtenidos de este modo en vectores recombinantes apropiados para
formar una biblioteca genética. Estos vectores pueden ser testados
luego, mediante sondas oligonucleotídicas sintéticas, para
identificar la secuencia que codifica para la proteína ACA de la
presente invención.
Como alternativa, se aísla ARNm a partir de
células que expresan la proteína ACA de la invención y se utiliza
para la producción ADN copia como se conoce bien en el campo; ver,
ej. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, ^{2nd} Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,
USA. Este ADN copia, después de la conversión a la forma de doble
hebra, puede ser clonado y el clon resultante puede ser testado con
una sonda apropiada para ADN copia que codifica para las secuencias
deseadas. Una vez que el clon deseado ha sido aislado, el ADN copia
puede ser manipulado de la misma manera que el ADN genómico. Sin
embargo, en el ADN copia no habrá ningún intrón o secuencias
interventoras. Para el diseño de los oligonucleótidos que van a ser
usados como sondas, se pueden usar las secuencias de aminoácidos
parciales mostradas en la Figura 4. Además es posible realizar el
análisis de la secuencia de la proteína intacta ACA u obtener los
fragmentos peptídicos y caracterizar su secuencia aminoacídica.
Para la obtención de los fragmentos peptídicos, la proteína
purificada es fragmentada, por ejemplo, mediante la digestión con
las proteasas, tripsina, quimo tripsina o papaína mediante métodos
conocidos en el campo (descritos más abajo). Los péptidos producidos
en la digestión son separados mediante cromatografía líquida HPLC
de fase reversa y secuenciados mediante métodos automáticos de
secuenciación de aminoácidos.
Una vez que uno o más fragmentos peptídicos han
sido adecuadamente secuenciados o que una secuencia parcial de la
proteína es determinada, las secuencias de ADN capaces de su
codificación son examinadas. Debido a la degeneración del código
genético, más de un codón puede codificar un aminoácido particular.
Por tanto, se puede obtener uno o varios oligonucleótidos
diferentes, cada uno de los cuales podría estar capacitado para la
codificación de los fragmentos del péptido de la proteína ACA. Sin
embargo, sólo uno de los miembros del conjunto contiene la
secuencia nucleotídica que es idéntica a la secuencia nucleotídica
del gen. Su presencia dentro del conjunto y su capacidad para
hibridar con el ADN aún en presencia de otros miembros del conjunto,
hace que sea posible emplear un conjunto de oligonucleotidos del
mismo modo que se emplearía un solo oligonucleotido para copiar el
gen que codifica el péptido. El empleo de ese oligonucleótido o
conjunto de oligonucleotidos que contienen la secuencia teórica,
"la más probable", capaz de codificar los fragmentos del gen de
la proteína ACA (siguiendo las normas de uso de codones tal y como
se revela en la literatura estándar), permite identificar la
secuencia complementaria de un oligonucleótido o conjunto de
oligonucleótidos que contienen la secuencia teórica "más
probable" capaz de codificar para la proteína ACA o al menos una
parte de esta, o un juego de tales secuencias. Este oligonucleótido
que contiene la secuencia complementaria puede ser entonces
sintetizado y empleado como una sonda para identificar y aislar el
gen de la proteína ACA de la invención. Una vez que el
oligonucleotido o conjunto de oligonucleótidos apropiado capaz de
codificar un fragmento del gen de la proteína ACA (el cuál es
complementario a tal oligonucleotido, o conjunto de
oligonucleotidos) es identificado utilizando el susodicho
procedimiento descrito, es sintetizado e hibridado a un ADN o
preferentemente a una preparación de ADN copia obtenida a partir de
células que son capaces de expresar el gen deseado, preferentemente
después de que la fuente de DNA copia haya sido enriquecida para las
secuencias deseadas; por ejemplo: extrayendo ARN de las células que
producen niveles altos del gen deseado y luego convirtiéndolo en el
correspondiente ADN copia mediante el empleo de la enzima
transcriptasa reversa. Los procedimientos para la hibridación de
ácidos nucleicos son comúnmente conocidos. Mediante la hibridación
con dicho oligonucleótido o conjunto de sondas de oligonucleótidos,
es posible identificar en una genoteca de ADN copia o de ADN
genómico, las secuencias de ADN capaces de dicha hibridación y son
entonces analizadas para determinar en qué medida contienen la
secuencia codificante para la proteína ACA de la invención.
Alternativamente, pueden diseñarse cebadores
específicos para una reacción de PCR basados en una secuencia
parcial de aminoácidos de ACA y usarlos para aislar el gen
codificante de ACA o una parte de este usando como fuente las
células o las genotecas descritas anteriormente. Finalmente,
basándose en la secuencia de ácidos nucleicos derivada de la
secuencia parcial de aminoácidos de ACA, se pueden escrutar los
bancos de genes disponibles (ej. EST gene banks).
La invención, además se refiere a vectores que
contienen las moléculas de ácido nucleico de la misma.
Preferentemente son plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y
otros vectores habituales utilizados en el campo de la ingeniería
genética. Entre los vectores apropiados para esta invención se
incluyen (aunque no se limita solo a estos) el vector de expresión
basado en T7 para expresión en bacteria, el vector de expresión
pMSXND para expresión en células de mamífero y el vector de
expresión derivado de baculovirus para expresión en células de
insecto. La molécula de ácido nucleico de esta invención se une
preferentemente a los elementos reguladores en el vector
recombinante de la invención, lo que garantiza la transcripción y la
síntesis de un ARN en células procariotas y/o eucariotas que puede
ser traducido. La secuencia de nucleótidos a transcribir puede ser
unida a un promotor como el T7, la metalotioneina I o el promotor
Polihedrin.
Otra materialización de la presente invención se
relaciona con células huéspedes recombinantes que albergan, de modo
transitorio ó estable, moléculas de ácido nucleico o vectores de la
invención. Una célula huésped se entiende como un organismo capaz
de tomar in vitro ADN recombinante y, si puede ser el caso,
sintetizar la proteína ACA, fragmentos etc. codificados por las
moléculas de ácido nucleico de la invención. Estas células son,
preferentemente, células procariotas o eucariotas, como por ejemplo
células de mamífero, células bacterianas, células de insecto o
células de levadura. Las células huésped de la invención se
caracterizan por el hecho que la molécula de ácido nucleico
introducida es heteróloga tanto en el sentido de la célula
transformada (no ocurre de forma natural en esas células) como que
dicha molécula se localiza en un lugar del genoma distinto del que
ocupa la secuencia natural.
Otra materialización de la invención se
relaciona con un método de producción recombinante de la proteína
de la invención ACA, donde, por ejemplo, una célula huésped de la
invención es cultivada en condiciones que permiten la síntesis de
la proteína y dicha proteína es subsiguientemente aislada de las
células cultivadas y/o del medio de cultivo. El aislamiento y la
purificación de las proteínas recombinantes producidas se realiza
mediante métodos convencionales, entre los que se incluyen
cromatografía preparativa, de afinidad y separaciones inmunológicas
mediante cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales o
policlonales anti-ACA. Las proteínas ACA están
preferentemente en forma pura. Una versión recombinante de ACA puede
ser purificada abundantemente mediante el método de un solo paso
descrito en Smith and Johnson, Gene 67:31-40
(1988).
La presente invención también se refiere a un
anticuerpo frente a la glicoproteína de superficie ACA de la
presente invención. El término "anticuerpo", preferentemente,
se refiere a anticuerpos, los cuales consisten esencialmente en
conjuntos de anticuerpos monoclonales con distinta especificidad de
epítopos, así como a distintas preparaciones de anticuerpos
monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se realizan a partir de
un antígeno que contiene fragmentos de las proteínas de la invención
mediante métodos bien conocidos y eficientes (Köhler et al.,
Nature 256 (1975), 495). Los términos "anticuerpo" (Ab)
o "anticuerpo monoclonal" (Mab) aquí utilizados incluyen tanto
a moléculas intactas como a fragmentos de anticuerpos (como por
ejemplo los fragmentos Fab y F(ab')2), los cuales se unen
específicamente a la proteína. Los fragmentos Fv, Fab y
F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se
eliminan mejor de la circulación y tienen menos unión inespecífica
a tejidos que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J Nucl.
Med. 24:316-325 (1983)). Por tanto, se prefieren
estos fragmentos, así como los productos de un Fab u otra librería
de expresión de inmunoglobulina. Además, la presente invención
incluye quimeras, cadenas simples y anticuerpos humanizados.
La presente invención también se refiere a un
método para el diagnóstico de un tumor asociado con la
sobreexpresión de ACA o a una predisposición a ese tumor. Esto
incluye poner en contacto una muestra diana con un compuesto que es
capaz de uno, unirse específicamente a la glicoproteína de membrana
ACA de esta invención y otro, un ARNm transcrito de la molécula de
ácido nucleico de ACA. También implica comparar el nivel de la
proteína ACA o del mRNA de ACA de la muestra usando dicho compuesto
con una muestra control obtenida de un individuo sano. Un nivel
elevado de la glicoproteína de superficie ACA o de su
correspondiente ARNm es indicativo de un tumor o de una
predisposición a ese tumor. Dicho compuesto es preferentemente un
anticuerpo anti-ACA o un oligonucleótido capaz de
hibridar con el ARNm transcrito de la secuencia de ADN codificante
de ACA. La longitud de dicho oligonucleótido es preferentemente de
al menos 12, 15 o mejor 20 bases. Los oligonucleótidos usados como
sondas pueden ser marcados para su detección, por ejemplo con un
radioisótopo o un compuesto bioluminiscente, quimioluminiscente o
fluorescente, un quelante de metales o una enzima.
La presencia de la diana celular (la proteína
ACA o su ARNm), puede ser detectada directamente in situ
(por hibridación in situ por ejemplo) en fluidos biológicos
(p. ej. sangre), o tejidos. También puede ser aislada de otros
componentes celulares por métodos conocidos y eficaces antes de
ponerse en contacto con la sonda. Los métodos de detección incluyen
análisis por Northern blot, protección frente a ARNasa, métodos
in situ (hibridación in situ), métodos de
amplificación in vitro (PCR, LCR, QRNA replicasa o
transcripción/amplificación de RNA (TAS, 3SR), dot blot reverso
(EP-B1 0 237 362), inmunoensayos, Western blot y
otros ensayos de detección conocidos y eficaces en el campo.
Los productos obtenidos por amplificación in
vitro pueden detectarse siguiendo métodos establecidos (ej.
separación de productos en geles de agarosa y posterior tinción con
bromuro de etidio). Alternativamente, los productos amplificados
pueden detectarse usando cebadores marcados para la amplificación o
dNTPs marcados.
La expresión de ACA en tejidos puede estudiarse
con métodos clásicos de inmunohistoquímica (Jalkanen et al.,
J. Cell. Biol. 101 (1985), 976-985; Jalkanen et
al., J. Cell. Biol. 105 (1987), 3087-3096; Sobol
et al., Clin. Imunopathol. 24 (1982),
139-144; Sobol et al., Cancer 65 (1985),
2005-2010). Otros métodos basados en anticuerpos
útiles para la detección de la expresión génica de la proteína,
incluyen inmunoensayos como el ensayo de inmunoadsorción enzimático
acoplado (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Ensayos adecuados con
anticuerpos son conocidos en el campo e incluyen marcajes
enzimáticos como glucosa oxidasa y radioisótopos como yodo
(^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C),
azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99}mTc), y marcajes fluorescentes como fluoresceína y rodamina, y biotina. Además de estudiar los niveles de ACA en muestras biológicas, la proteína también puede ser detectada mediante su visualización in vivo. De entre los anticuerpos marcados para la visualización de proteínas in vivo se incluyen los que se detectan mediante radiografía con rayos X, RMN o ESR. Para la radiografía de rayos X, los marcajes adecuados incluyen radioisótopos como el bario o el cesio, los cuales emiten radiación detectable pero no son muy dañinos para el sujeto. Marcadores adecuados para RMN y ESR se incluyen aquellos con un spin característico detectable, como el deuterio, que puede ser incorporado al anticuerpo mediante el marcaje de nutrientes en el hibridoma correspondiente. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de una proteína se introduce en el mamífero (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente). Estos anticuerpos son marcados con un motivo apropiado para su detección visual como un radioisótopo (^{121}I, ^{112}In, ^{99}mTc), una sustancia opaca a la radiación, o un material detectable por resonancia magnética nuclear. Ha de tenerse en cuenta que el tamaño del sujeto y el sistema de visualización utilizado determinará la cantidad del motivo de visualización necesitado para producir imágenes diagnósticas. En el caso de radioisótopos para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada será habitualmente del rango de 5 a 20 milicurios de ^{99}mTc. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, se localizará preferentemente en las células, las cuales contienen la proteína específica. La visualización in vivo de tumores se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (capítulo 13 en ``Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99}mTc), y marcajes fluorescentes como fluoresceína y rodamina, y biotina. Además de estudiar los niveles de ACA en muestras biológicas, la proteína también puede ser detectada mediante su visualización in vivo. De entre los anticuerpos marcados para la visualización de proteínas in vivo se incluyen los que se detectan mediante radiografía con rayos X, RMN o ESR. Para la radiografía de rayos X, los marcajes adecuados incluyen radioisótopos como el bario o el cesio, los cuales emiten radiación detectable pero no son muy dañinos para el sujeto. Marcadores adecuados para RMN y ESR se incluyen aquellos con un spin característico detectable, como el deuterio, que puede ser incorporado al anticuerpo mediante el marcaje de nutrientes en el hibridoma correspondiente. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de una proteína se introduce en el mamífero (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente). Estos anticuerpos son marcados con un motivo apropiado para su detección visual como un radioisótopo (^{121}I, ^{112}In, ^{99}mTc), una sustancia opaca a la radiación, o un material detectable por resonancia magnética nuclear. Ha de tenerse en cuenta que el tamaño del sujeto y el sistema de visualización utilizado determinará la cantidad del motivo de visualización necesitado para producir imágenes diagnósticas. En el caso de radioisótopos para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada será habitualmente del rango de 5 a 20 milicurios de ^{99}mTc. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, se localizará preferentemente en las células, las cuales contienen la proteína específica. La visualización in vivo de tumores se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (capítulo 13 en ``Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
Puede concluirse que al inhibir la expresión y/o
actividad de ACA, se proporciona una terapia efectiva contra
cánceres como el melanoma.
Entonces, la presente invención también se
relaciona con un composición farmacéutica que contiene un compuesto
capaz de reducir o eliminar (a) la expresión de la secuencia de
ácido nucleico codificante para la glicoproteína de superficie ACA
y/o (b) la actividad biológica de ACA. Ejemplos de estos agentes son
ARNs antisentido, ribozimas o inhibidores de la actividad biológica
de la proteína (ej. anticuerpos específicos). Por ejemplo, la
administración de un anticuerpo dirigido contra la proteína, puede
unirse y reducir la sobreproducción de esta proteína.
Una secuencia de un ARN antisentido para la
presente invención se caracteriza porque es complementaria al ARNm
transcrito de la molécula de ácido nucleico de la presente invención
o a una parte de la misma, y puede unirse selectivamente a este
ARNm. Esta secuencia de ARN antisentido es capaz de inhibir la
síntesis de la proteína ACA codificada por dichas moléculas de
ácido nucleico. Una ribozima se caracteriza porque es complementaria
al ARNm transcrito de la molécula de ácido nucleico de la presente
invención o a una parte de la misma, y puede unirse y cortar
selectivamente dicho ARNm, inhibiendo así la síntesis de la proteína
ACA codificada por dichas moléculas de ácido nucleico. Las
ribozimas, las cuales se componen de una sola cadena de ARN, son
ARN enzimáticos (ARN catalíticos) que cortan intramolecularmente un
ARN diana (por ejemplo un ARNm transcrito de uno de los genes Trp).
En la actualidad es posible construir ribozimas que sean capaces de
cortar el ARN diana en un sitio específico siguiendo estrategias
descritas en la literatura (ver Tanner et al., en ``Antisense
Research and Applications, CRC Press Inc. (1993),
415-426). Los dos requisitos principales para estas
ribozimas son su dominio catalítico y las regiones complementarias
al ARN diana que permiten la unión al sustrato, lo que es un
pre-requisito para el corte. Estas secuencias
complementarias (en ARN antisentido o ribozimas) son útiles para la
represión de la expresión de ACA (por ejemplo para el caso de del
tratamiento de un melanoma). Preferentemente, el ARN antisentido y
la ribozima de la invención son complementarias a la región
codificante del ARNm (ej. al extremo 5' de la región codificante).
El especialista que disponga de las secuencias de las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención estará en posición de
producir y utilizar los ARN antisentido y ribozimas descritos
anteriormente. La región del ARN antisentido y ribozima, que muestra
complementariedad con el ARNm transcrito de las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención, poseen preferentemente una
longitud de al menos 10 o 15 nucleótidos, respectivamente, y
preferiblemente al menos 50 nucleótidos.
Los inhibidores de la proteína ACA pueden ser,
por ejemplo, análogos estructurales de la correspondiente proteína
que pueden actuar como antagonistas. Además, estos inhibidores
comprenden moléculas identificadas mediante el empleo de proteínas
producidas recombinantemente. Por ejemplo, la proteína recombinante
producida puede ser usada para escrutar e identificar inhibidores,
por ejemplo, para explotar la capacidad de unión de potenciales
inhibidores a la proteína bajo determinadas condiciones. Los
inhibidores pueden ser identificados, por ejemplo, preparando una
mezcla prueba donde el candidato a inhibidor se incuba con la
proteína ACA en las condiciones apropiadas para permitir una
conformación nativa de ACA. Este sistema de testeo in vitro
puede establecerse según los métodos conocidos en el campo. Se
pueden identificar inhibidores, por ejemplo, realizando un primer
escrutinio de moléculas, sintéticas o naturales, que se unen a la
proteína ACA (producida recombinantemente). En un segundo paso, se
prueban las moléculas seleccionadas en análisis celulares para
inhibir la proteína ACA, como reflejo en la inhibición de al menos
una de sus actividades biológicas. Este escrutinio para moléculas
que interaccionan con la proteína ACA podría realizarse fácilmente a
gran escala, p. ej. escrutando moléculas candidatas desde
bibliotecas de moléculas sintéticas y/o naturales. Tal inhibidor
es, p. ej. un compuesto químico orgánico sintético, un producto de
fermentación natural, una sustancia extraída de un microorganismo,
planta o animal, o un péptido. Una función particular de esas
sustancias inhibidoras es para bloquear la transferencia de ACA
desde célula a célula. Ejemplos adicionales de sustancias
inhibidoras son anticuerpos específicos, preferentemente
anticuerpos monoclonales. Además, las secuencias de ácidos nucleicos
de la invención y las proteínas codificadas pueden emplearse para
identificar factores adicionales, involucrados en el desarrollo y
avance del tumor. Además las proteínas de esta invención puede ser
empleadas, por ejemplo, para identificar proteínas (no
relacionadas) adicionales, las cuales están asociadas por ejemplo
con melanoma, mediante escrutinios o métodos basados en
interacciones proteína/proteína, como el sistema de dos
híbridos.
Para la administración de los compuestos arriba
mencionados, se han de combinar preferentemente con excipientes
farmacéuticos adecuados. Ejemplos de excipientes adecuados son bien
conocidos en el campo e incluyen soluciones de tampón fosfato
salino, agua, emulsiones como aceite/agua, distintos agentes
humectantes, soluciones estériles etc...Dichos excipientes pueden
diseñarse por métodos convencionales y administrarse al sujeto en
una dosis apropiada. La administración de los compuestos adecuados
puede realizarse de maneras distintas, p. ej. vía intravenosa,
intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica.
La vía de administración depende obviamente de la naturaleza del
tumor y del tipo de compuesto incluído en la composición
farmacéutica. El régimen de la dosis se determinará por el medico y
por otros factores clínicos. Como se conoce en el campo médico, la
dosis de cualquier paciente depende de muchos factores, como el
tamaño del paciente, área superficial del cuerpo, edad, sexo, el
compuesto particular para administrar, el tiempo y la ruta de la
administración, el tipo y estado del tumor, salud en general y
otros medicamentos que son administrados al mismo tiempo.
La administración de los ARNs antisentido o
ribozimas de esta invención puede conseguirse mediante la
aplicación directa o preferentemente mediante el uso de un vector de
expresión recombinante como un virus quimérico, que contiene esos
compuestos o un sistema de dispersión coloidal. Mediante la
administración de estos ácidos nucleicos a la diana deseada, se
puede disminuir la expresión intracelular de ACA y por lo tanto el
nivel de expresión de ACA, resultando en la inhibición de los
efectos negativos de ACA, p. ej. en lo referente a la formación de
metástasis de la melanoma.
La aplicación directa al lugar de destino puede
ser realizada, p. ej. mediante suministración balística, como
sistema de dispersión coloidal o mediante un catéter en una arteria.
Los sistemas de dispersión coloidal, los cuales pueden usarse para
suministrar ácidos nucleicos arriba mencionados, incluyen complejos
de macromoléculas, nanocapsulas, microesférulas, bolas y sistemas
basados en lípidos incluyéndose emulsiones de aceite en agua,
micelas, liposomas y lipoplejos. El sistema coloidal preferentemente
es un liposoma. La composición del liposoma es normalmente una
combinación de fosfolípidos y esteroides, especialmente colesterol.
El especialista está en posición de seleccionar los liposomas
adecuados para el suministro de la molécula de ácido nucleico
deseado (targeting). Pueden utilizarse liposomas específicos
de órganos o células para suministrarse solo en el tumor deseado.
Esta administración dirigida de los liposomas puede ser realizada
por un especialista en el campo empleando métodos comúnmente
conocidos e incluye el targeting pasivo (utilizando la
tendencia natural del liposomas para distribuir a las células del
RES en órganos que contienen capilares sinusoidales) o
targeting activo (por ejemplo acoplando el liposoma a un
ligando especifico, como un anticuerpo, un receptor, azúcar,
glicolípido, proteína etc. con métodos muy conocidos). En la
presente invención los anticuerpos son preferentemente empleados
para dirigir liposomas a tumores específicos con ligandos
específicos de la superficie celular.
Los vectores recombinantes útiles preferidos por
la terapia génica son, vectores virales como adenovirus, virus
herpes, virus vaccinia, o preferentemente un virus de ARN como un
retrovirus. El vector más preferido es el vector retroviral
derivado de un retrovirus aviar o retrovirus del ratón. Ejemplos de
dicho vectores retrovirales que pueden ser empleados en la presente
invención son: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV),
virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor de mama
murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Lo mas preferible
es un vector retroviral de primate no humano como el virus de la
leucemia del mono Gibón (GaLV), con un mayor rango de huéspedes que
los vectores murinos. Puesto que los retrovirus recombinantes son
defectuosos, necesitan ayuda para producir partículas infecciosas.
Tal ayuda puede ser empleada por ejemplo mediante el uso de líneas
celulares de ayuda, las cuales contienen plásmidos codificantes de
todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de las
secuencias reguladores dentro el LTR. Son bien conocidas líneas
celulares ayuda en el campo. Esos vectores pueden contener
adicionalmente un gen codificante de un marcador seleccionable para
identificar las células transducidas. Además los vectores
retrovirales pueden modificarse de modo que sean específicos de una
diana. Esto puede conseguirse, por ejemplo, insertando un
polinucleótido codificante de un azúcar, glicolípido o una proteína,
preferentemente un anticuerpo. Los especialistas del campo saben
métodos adicionales para generar vectores
diana-específicos. Más vectores adecuados y métodos
para terapia génica in vitro o in vivo se describen en
la literatura y son bien conocidos a los especialistas del campo,
ver por ejemplo WO 94/29469 o WO 97/00957.
Para obtener la expresión sólo en el órgano
diana, por ejemplo el tumor a tratar, los ácidos nucleicos
codificantes de, por ejemplo, un ARN antisentido o una ribozima,
pueden ser unidos a un promotor tejido-especifico y
usados para terapia génica. Estos promotores son bien conocidos por
los especialistas del campo (ver p. ej. Zimmermann et al,
(1994) Neuron 12, 11-24; Vidal et al.,
(1990) EMBO J. 9, 833-840; Mayford et
al., (1995), Cell 81, 891-904; Pinkert
et al., (1987) genes & De. 1,
268-76).
Para el uso en la investigación diagnostica
discutida arriba, en la presente invención se proveen Kits. Tales
kits son útiles para detección de un componente celular diana, el
cual es ACA o alternativamente el ARNm codificante de ACA. Estos
kits comprenden una sonda para detectar ACA o alternativamente el
ARNm codificante de ACA. La sonda puede ser marcada para su
detección. Tal sonda puede ser un anticuerpo específico o un
oligonucleótido especifico. La secuencia del ácido nucleico de
dicho oligonucleótido hibridado con el ADN de ACA, está constituida
de al menos 12 bases, y preferiblemente 15, o mejor 20 bases. En una
materialización preferida, dicho kit contiene un anticuerpo
anti-ACA y permite esta diagnosis (por ejemplo por
ELISA) y contiene el anticuerpo unido a un soporte sólido, como una
placa de poliestireno o papel de nitrocelulosa, utilizando técnicas
bien conocidas en el campo. Alternativamente estos kits se basan en
la técnica RIA y contienen dicho anticuerpo marcado con un isótopo
radioactivo. En una materialización preferida del kit en la presente
invención, el anticuerpo es marcado con enzimas, compuestos
fluorescentes, compuestos luminiscentes, sondas ferromagnéticas o
compuestos radioactivos.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se centrifugó a 1500 g, 4ºC durante 10 min.
sangre humana extraída de un donante sano. El plasma y la capa
leuco-plaquetaria fueron eliminadas por aspiración,
y las células acumuladas fueron lavadas dos veces en 150 mM/15 mM
fosfato sodico (pH 7.6) y lisadas en CH_{3}COOH/agua destilada.
Las membranas fueron concentradas a 10,000 g, 15 min y lavadas con
tampón de extracción, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM
DTT, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 0.25M sacarosa. Se repitió este paso
hasta que los "ghosts" no mostraron indicios visibles de
hemoglobina residual (normalmente tres pasos de lavado). Después
del último lavado, los "ghosts" fueron resuspendidos en el
mismo tampón. El pellet fue congelado en nitrógeno líquido durante
15 min y descongelado a 25ºC. Se repitió tres veces este
procedimiento. Se ajustó el homogenado a 400 mM de KCl y se
centrifugó a 25,000 g durante 60 min. El sobrenadante fue recogido
y ajustado a 70% de saturación de sulfato amónico (Sigma, Munich,
Alemania), agitando durante 30 min. Las proteínas precipitadas
fueron recogidas por centrifugación, se
re-disolvieron en tampón de extracción y se
precipitaron de nuevo con sulfato amónico al 40% de saturación
(figura 2A). Las proteínas precipitadas se agitaron de nuevo 30 min
en hielo, se re-disolvieron en tampón de extracción,
se dializaron frente al tampón de almacenamiento (40 mM
Tris-HCl pH 7.5, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.25M
sacarosa) y se guardaron a -20ºC. La forma pura anfifílica de la
proteína se obtuvo mediante más pasos preparatorios, incluyendo
electroforesis en gel SDS. Las bandas de la proteína fueron
extraídas del gel, disgregadas en 25 mM Tris-base,
192 mM glicina y 0,035% SDS (pH 8.3) y el sobrenadante se recogió
después de una incubación a 4ºC toda la noche. La proteína
purificada fue dializada frente a tampón de almacenamiento
(NH_{4})_{2}
CO_{3}, precipitada con acetona fría en un baño de etanol/hielo seco y guardada a 4ºC. La concentración de la proteína fue medida por métodos de Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 284-254).
CO_{3}, precipitada con acetona fría en un baño de etanol/hielo seco y guardada a 4ºC. La concentración de la proteína fue medida por métodos de Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 284-254).
Se realizó SDS-PAGE en geles de
poliacrilamida con un gradiente lineal de 4-15% en
el tampón discontinuo de Laemmli (Laemmli, Nature 227,
(1970), 680-685). Las muestras se hirvieron 2 min.
en tampón reductor antes de la electroforesis. Las bandas de las
proteínas fueron identificadas por tinción de plata, o por tinción
negativa con CuCl_{2}. Los tamaños moleculares fueron evaluados
comparando con la posición del marcador de pesos moleculares
comprado a Bio-Rad Laboratories (Munich, Alemania).
Los geles se fijaron con metanol/ácido acético o etanol/ácido
acético y visualizados con Azul de Coomassie o tinción de plata.
Se sometió a medio de gradiente PhastGel IEF
(suministrado por Pharmacia, Freiburg, Alemania) un total de 1 a 5
nanogramos de proteína en total por banda. Las muestras se colocaron
aproximadamente a 10 mm del cátodo. Se hicieron controles
adicionales colocando muestras junto al ánodo y al cátodo. Las
bandas fueron visualizadas mediante tinción de plata siguiendo el
protocolo del fabricante. Se usó como estándar el Kit Pharmacia
Broad pl Calibración kit en PhastGel IEF 3-9.
Se realizó deglicosilación química para preparar
el análisis de la estructura primaria de la proteína ACA. La
muestra del proteína libre de sales, iones metálicos y detergentes
fue tratada con ácido trifluorometanosulfónico anhídrido (TMSF)
(Oxford GlykoScience, Reino Unido) durante 4,5 horas en el
congelador; se neutralizó y se recuperó en 0.5% bicarbonato de
amonio. La mezcla de reacción neutralizada fue entonces dializada
frente al mismo tampón y se aisló directamente por centrifugación
la proteína precipitada y deglicosilada.
La proteína deglicosilada químicamente se trató
con tripsina o Asp-N a 37ºC durante 18 h. Se
separaron los péptidos por HPLC de C18 de fase reversa. Las
secuencias N-terminales fueron determinadas por
degradación de Edman en un secuenciador de fase gaseosa
automatizado.
La Preparación de "ghosts" se realizó según
el protocolo aprobado por el "Institutional Review Board" del
"New York Blood Centre". Brevemente, se lavaron con tampón PBS
a 5000 rpm durante 5 min 2.3x10^{6}/ml de células rojas y células
de eritroleucemia (K-562). Tras decantar el
sobrenadante, las células se lisaron con PBS en agua destilada
(diluído 1:20,5), y se centrifugaron a 15,000 rpm durante 10 min. Se
decantó el sobrenadante y se eliminó el sedimento de células
blancas adheridas al tubo de la centrifuga. (Dodge et al.,
Arch. Biochem. Biophys. 100 81963), 119-130).
Los "ghosts" resuspendidos fueron lavados en 10 mM
Tris-HCl (pH 7.8) hasta que fueron blancos y
esponjosos. Se añadió el mismo volumen de tampón de muestra y se
hirvió durante 2 min antes de someterlo a SDS-PAGE
usando un gel concentrador del 4.5% y geles separadores del
4-15%.
Alternativamente, se lavaron dos veces con el
mismo volumen de PBS células de sangre (2x10^{6}) a 5000 rpm
durante 5 min. El pellet fue disuelto en PBS/agua (1:20,5), incubado
en hielo durante 10 min y centrifugado para eliminar material
insoluble. El sobrenadante fue recogido y guardado. El pellet fue
extraído con 10 mM Tris-HCl (pH 7.8) y centrifugado
a 15,000 g durante 15 min. Se analizó el sobrenadante por
SDS-PAGE e Immunoblot. Las proteínas liberadas de
la membrana de los granulocitos tras el tratamiento de las células
con PI-PLC, fueron precipitadas añadiendo 5
volúmenes de acetona helada e incubándolas en un baño de
etanol/hielo seco durante 30 min. La proteína precipitada fue
centrifugada a 13,500 g durante 10 min, se quitó con cuidado la
acetona del pellet, y éste se secó al aire hasta la evaporación de
la acetona residual. Se analizo por SDS-PAGE e
Immunoblot la proteína recuperada.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Para preparar fracciones de proteína de membrana
de piel normal y muestras de tejido del tumor melanoma, se
incubaron 20 crio-cortes de 20 m\mu en hielo y en
tampón A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM KCl, 3 mM
MgCl_{2}, 0,25M sacarosa, 1 mM PMSF, 2 mM dithiotheitol, 1 mM
EDTA) durante 30 min, para homogeneizar posteriormente con el
aparato Ultra Turrax T8. Los extractos se centrifugaron a 1300 rpm,
a 4ºC durante 10 min para quitar el material insoluble, y los
sobrenadantes se recogieron y guardaron. El pellet restante fue
extraído una vez más con tampón A, centrifugado y añadido a los
sobrenadantes previos. La proteína de los sobrenadantes fue
precipitada con 5 volúmenes de metanol helado y se centrifugaron las
muestras a 13500 rpm. Las proteínas precipitadas se disolvieron en
tampón B (40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 1 mM
EDTA y 0,25M sacarosa) y la concentración de la proteína se midió
según el método de Bradford.
Se mezclaron proteínas de la membrana
(10-30 \mug) preparadas de los "ghosts" del
eritrocito y tejido homogeneizado de las células de eritroleucemia
(K-562) con tampón de muestra reductor. Se
sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida en dodecil
sulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfirieron las
proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Los filtros fueron
bloqueados con 3% BSA en PBS y utilizados para probar la reactividad
del anticuerpo. Se utilizó suero policlonal de ratón contra la
proteína GPI de 65 kDa a una dilución 1:5000. La visualización fue
realizada con un anticuerpo secundario anti-IgG
conjugado con fosfatasa alcalina (AP) y BCIP/NTB, un sustrato
cromogénico para AP (Promega, EEUU).
Alternativamente, extractos libres de células y
sobrenadante tras la digestión con PI-PLC, se
sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras en
un gel con gradiente 4-15%. A continuación, se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Estas membranas de
nitrocelulosa se bloquearon con TBS con 0.1%
Tween-20 y 3% de BSA, seguido de una hora de
incubación con anticuerpo primario. Los anticuerpos fueron usados en
las siguientes concentraciones: anticuerpos monoclonales de ratón
(AC1, AB12) a una dilución 1:1000, anticuerpo policlonal de conejo
(AL1) a una dilución 1:500. Los anticuerpos secundarios, cabra
anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina y cabra
anti-conejo IgG (Promega, Heidelberg, Alemania)
fueron usados a una dilución de 1:10000. El sistema líquido de
sustrato 5-bromo 4-cloro
3-indolilfosfato nitrotetrazolio (BCIP/NTB)
(Boehringer Mannheim GMBH, Alemania) fue usado como sustrato
cromogénico para fosfatasa alcalina.
Se realizaron incubaciones con 5 mU de
fosfolipasa C fosfatidilinositol específica,
(PI-PLC) (Bacillus cereus, Boehringer
Mannheim, Alemania) en tampón trietanolamina (50 mM trietanolamina,
10 mM EDTA, y 10 mM azida sódica, pH 7.5) durante 1 h a 37ºC. La
digestión con fosfolipasa D especifica del anclaje (de suero bovino
EC 3.1.4.50 Boehringer Mannheim) se realizó en 20 mM
Tris-HCl pH 7.4, 0.1 mM CaCl_{2}, Triton
X-100 0.008% (peso/vol.), durante 60 min a 37ºC.
Una vez que terminaron las re acciones, se añadieron 10 \mul de
tampón de muestra reductor. Las mezclas de reacción se hirvieron en
un baño con agua durante 5 min, y se sometieron a
SDS-PAGE y tinción de plata (PhastGel Sistema de
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) alícuotas de las
muestras.
Alternativamente se realizaron ensayos de
digestión usando 10^{6} granulocitos purificados en 25 \mul de
PBS con glicosilfosfatidilinositol fosfolipasa C
(GPI-PLC) (Bacillus thuringiensis, Oxford
GlycoScience, Reino Unido) a distintas diluciones
(1-5 U/ml) en tampón Tris/HCl (pH 7.4) durante 1 h a
37ºC. Para la solubilización de ACA en linfocitos de B, se añadió
Triton X-100 0.03% a estos. Se realizaron
simultáneamente experimentos control en células HEL ACA positivas,
tras la digestión con PI-PLC de Bacillus
cereus en las mismas condiciones que las descritas para las
células sanguíneas. Se realizó digestión con
fosfatidilinositol-fosfolipasa D
(PI-PLD) (5 mU) con granulocitos purificados en
tampón de 20 mM Tris/HCl (pH 7.4), 0.1 mM CaCl_{2}, 0.008% Triton
X-100, durante 60 min a 37ºC en 25 \mul de
volumen de reacción.
Se sometieron a SDS-PAGE
proteínas cortadas por GPI-PLC,
PI-PLC y GPI-PLD y se transfirieron
a nitrocelulosa. Después del bloqueo, los antígenos fueron
visualizados con anticuerpo anti-CRD purificado por
afinidad (Oxford, GlycoScience). Después de lavar, se detectó el
anti-CRD unido incubándolo con
anti-conejo IgG biotinilado de asno, y visualizado
con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano. Como
controles positivos y negativos, la forma soluble de una variante
de la glicoproteína de superficie (sVSG) y la forma de membrana de
ACA fueron analizadas simultáneamente y reveladas con anticuerpo
anti-CRD.
La proteína purificada ACA fue digerida con
fosfolipasas CPI- y GPI-, y sometida a más hidrólisis con
triacilglicerol acilhidrolasa (300U) (Rhizopus arrhizus EC
3.1.1.3., Boehringer Mannheim, Alemania) seguida de hidrolasa de
éster carboxílico (30U) (de hígado del cerdo EC 3.1.1.1., Boehringer
Mannheim) en tampón de reacción con 0.1 mg de dodecilsulfato
sódico/ml, durante 25 min a 25ºC. Se determinó el glicerol según lo
descrito por el proveedor (Boehringer Mannheim) con glicerokinasa
(GK), piruvato kinasa (PK) y lactato deshidrogenasa (LDH) como
enzimas auxiliares e indicadores (Boehringer Mannheim). La Lipasa,
Esterasa, PK, LDH, GK eran libres de hexokinasa, asi como de otras
kinasas y fosfatasas que pudieran interferir. El ATP (Boehringer
Mannheim) fue sustancialmente libre de ADP, y el fosfoenolpiruvato
PEP (Boehringer Mannheim), de piruvato. Se midió la reducción en la
extinción a 340 m, 334 y 365 nm debido al oxidación del nicotín
adenín dinucleótido (NADH) (figura 1).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Proteínas purificadas fueron marcadas con
3-trifluorometil)-3-(m-[^{125}I]
iodofenil) diazirina ([^{125}I]TID) (Amersham) mediante
fotólisis a 350 nm durante 15 min, según lo descrito por Roberts y
Rosenberry (Biochemistry 25 (1986),
3091-3098). Se añadió una alícuota de 10 \mul de
[^{125}I]TID en etanol (5-200 \muCi) a
500 \mul de proteína ACA de glóbulos rojos tamponados en un tubo
de 1 cm^{2} de vidrio borosilicatado con tapa de goma, y se agitó
suavemente para asegurar la mezcla completa. La fotólisis fue
realizada durante 20 min en un espectrofotómetro Beckman, con las
rajas quitadas.
Muestras de proteínas marcadas con TID
[^{125}I]y cortadas con GPI-PLC y
PI-PLC fueron sometidas a más hidrólisis con
triacilglicerol-proteína-acilhidrolasa,
seguida de hidrolasa de ester carboxílico. Los productos lipídicos
de la reacción fueron extraídos con cloroformo/metanol/HCl (22:50:1)
y centrifugados durante 15 min a 300 g. La fase inferior fue
quitada y evaporada hasta sequedad bajo nitrógeno. Los residuos
fueron resueltos en 0.1 ml cloroformo/metanol (2:1) y esas
soluciones fueron aplicadas a placas de TLC. La cromatografía en
capa fina fue realizada en placas de silica gel de 10x20 cm (Merck,
Darmstadt, Alemania) sin activación. El revelado fue con disolvente
B [hexano/dietil eter/ácido acético (60:30:1)] o con disolvente A
[hexano/2-propanol, (96:4)]. Las posiciones de los
compuestos radioactivos fueron identificadas por
auto-radiografía con películas Kodak
XAR-5. Las posiciones de los estándares fueron
localizadas exponiendo placas secadas con vapor de yodo.
La proteína nueva de la membrana de eritrocito
ACA fue aislada de eritrocitos humanos normales como se ha descrito
arriba. Se generó un anticuerpo policlonal de conejo inmunizando
animales con 100 \mug de proteína purificada con adyuvante
completo de Freund para la inoculación inicial y 50 \mug de mezcla
de antígeno con adyuvante incompleto de Freund para tres
inmunizaciones adicionales. El titulo del anticuerpo fue
determinado por ELISA e immunoblot con proteínas purificadas y
extractos libres de células.
Se generaron dos anticuerpos monoclonales de
ratón (AC1 y AB12) según el protocolo estándar (Fazekas et
al., J. Immunol. Methods 35 (1981), 1-21).
Brevemente, se inmunizaron tres veces ratones BALB/C con ACA y
adyuvante de Freund.
Las células del bazo fueron recogidas, se generó
el hibridoma y se clonó. La unión del anticuerpo fue verificada por
ELISA e immunoblot.
Sangre periférica humana de donantes sanos fue
heparinizada y utilizada como material inicial. Se aislaron
granulocitos de sangre mediante centrifugación en gradiente de
densidad de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Freiburg,
Alemania). Se quitaron las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC), y se sedimentaron los granulocitos a 2000 g tras
su incubación con solución de dextrano/fosfato en tampón fosfato
salino(PBS) (Pharmacia), 30 min a temperatura ambiente. Los
eritrocitos contaminantes fueron eliminados mediante lisis
hipotónica. Los Linfocitos T y B fueron separados según un método
descrito anteriormente (Nicholson-Weller et
al., Blood 65 (1985), 1237-1244). Brevemente,
PBMC aislados por centrifugación en gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque fueron resuspendidos en medio RPMI
1640 (Gibco, Eggenstein, Alemania), suplementado con 10% albúmina de
suero de bovino (BSA) (Gibco, Eggenstein, Alemania) e incubados con
eritrocitos de oveja tratados con neuraminidasa. Linfocitos de T y
B fueron separados de linfocitos en roseta tras la centrifugación en
gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Las
células se lavaron con PBS dos veces y se guardaron hasta su uso a
4ºC. La pureza de cada población celular fue mayor del 95%. La
viabilidad fue mayor del 95% (determinada por tinción con azul
tripán).
Para generar líneas de linfocitos B
transformadas con EBV de PNH (GPI-deficientes), se
separaron PBMCs con Ficoll-Hypaque, y se incubaron
con anticuerpo anti-CD48 (un marcador de leucocito
con anclaje GPI) (Immuntech, Hamburgo, Alemania). A continuación se
realizó lisis complementada con suero AB humano (Taylor et
al., 1997), 919-925; Tomita, Biochimica et
Biophysica Acta 1455 (1999), 269-286). Las células
de PNH, deficientes en CD48 y otros antígenos de superficie con
anclaje GPI, permanecen tras la lisis complementada con suero AB
humano (Taylor et al., 1997).
Linfocitos GPI-positivos
aislados de donantes normales y linfocitos
GPI-negativos de pacientes PNH fueron incubados con
una suspensión de EBV durante 3 horas a 37ºC y analizados por
citometría de flujo. Células B CD48 y CD48^{+} fueron cultivadas
en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO)
suplementado con 20% de suero bovino fetal inactivado por calor
(FBS) y 2 mM de glutamina. Para generar líneas de células T, se
obtuvieron poblaciones homogéneas de linfocitos CD48^{-} y
CD48^{+} mediante dilución límite según el protocolo estándar
(Fleisher, J. Immunol. Methods 109 (1988), 215; Hertenstein et
al., Blood 86 (1995), 1487-1492). Brevemente,
PBMCs de pacientes con PNH fueron aislados y los linfocitos T
separados como se ha descrito arriba.
Linfocitos-GPI afectados fueron enriquecidos como se
ha descrito anteriormente para linfocitos B. Las células se
crecieron en placas de histología (Nunc, Roskilde, Danmark) usando
PBMC alogénico irradiado como capa de alimentación y sobrenadante
de PBMC fitohemaglutinina-estimulado. Los linfocitos
T fueron sembrados a 0.1, 0.3, o 1 célula/pocillo. Los clones
crecidos fueron transferidos a pocillos más grandes y
re-estimulados semanalmente con PBMC irradiado como
se ha descrito ya ^{16}. Se cultivaron clones de células T en
medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 7,5% suero AB humano y
20U/ml interleukina-2 humana recombinante, y se
analizaron por citometría de flujo de dos colores. Líneas de células
T como MOLT4, CEM, Jurkat J6 se cultivaron en RPMI 1640
suplementado con 10% FBS y 2 mM glutamina. La línea celular de
eritroleucemia humana (HEL) se creció en medio de cultivo RPMI 1640
suplementado con 2 mM glutamina y 10% FBS.
Se realizó citometría de flujo para sangre
completa utilizando un método en dos pasos como se ha descrito en
otros trabajos (Schrezenmeier et al., Exp. Hematol. 23
(1995), 81-87). Brevemente, se añadieron 50 \mul
PBS con 0.1% BSA y 5% suero de caballo a 100 \mul de
EDTA-sangre y se incubó 30 min a 37ºC. La mezcla fue
entonces incubada durante 20 min a temperatura ambiente con 2
\mul de anticuerpo monoclonal de ratón AC1 o AB12, o con control
de isotipo irrelevante, seguida de cabra anti-ratón
IgG (Dako, Hamburgo, Alemania) marcados con
fluoresceina-isotiocianato (FITC). Después de lavar
e incubar con 1 ml de solución IMMUNO-LYSIS (Coulter
Clone, Hialeah, FL) durante 2 min, se fijaron las células con 1%
paraformaldehído y se analizaron con un citómetro de flujo FACScan
(Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Los datos fueron
analizados con el programa informático LYSISII (Becton Dickinson).
La Intensidad de la fluorescencia se presentó en escala logarítmica.
Se identificaron los granulocitos, monocitos y linfocitos por su
desviación característica de la luz frontal y lateralmente, y se
agruparon. Al menos 10000 eventos fueron analizados por cada
muestra. Para el análisis de células rojas, se añadieron 2 \mul
de muestra de sangre venosa a 200 \mul del reactivo PBS/BSA/suero
de caballo. Se incubó durante 30 min a 37ºC, seguido de incubación
de 20 min con AC1, AB12 o anticuerpo monoclonal irrelevante de la
misma sub-clase como control. Después de lavar, se
resuspendió el pellet en 2 ml dePBS con 0.1% BSA y paraformaldehído
a una concentración final de 2%. Los eritrocitos se analizaron sin
agruparlos midiendo 10000 células. Para el análisis de
reticulocitos, se incubó 1 ml PBS con 0.1% BSA y 2 \mul
EDTA-sangre con 1 ml de la solución naranja de
tiazol (Reticcount) (Becton Dickinson) durante 20 min a temperatura
ambiente. La tinción de reticulocitos por el colorante naranja de
tiazol permitió un análisis separado de eritrocitos y reticulocitos.
Se realizó análisis de dos colores como se ha descrito arriba,
excepto por los distintos anticuerpos monoclonales marcados con
FITC- o ficoeritrina (PE) disponibles comercialmente y específicos
de marcadores celulares (anti-TCR y CD2; Coulter
Immunotech, Hamburgo, Alemania), (CD19, CD20, CD38; Becton
Dickinson), (CD5; Dako, Hamburgo, Alemania), los cuales fueron
utilizados a las diluciones recomendadas por el fabricante. La
compensación del color para el cruce de las señales de
fluorescencia entre los dos detectores fue ajustada para un análisis
óptimo. En los dos análisis de uno y dos-colores,
la fracción negativa fue definida como células que tienen
aproximadamente la misma baja intensidad que la población del
control negativo. La fracción positiva fue definida como la
población celular con intensidad similar a la población del control
positivo.
Se realizó el Inmunofenotipado de granulocitos
aislados, linfocitos B y T como se ha descrito arriba. Brevemente,
se incubaron en oscuridad 20 minutos a temperatura ambiente 100
\mul de suspensiones celulares en PBS con 2 \mul de los
anticuerpos primarios AC1 y AB12 o una dilución apropiada de un
anticuerpo monoclonal irrelevante. Se lavó y se incubó con IgG de
cabra-anti-ratón conjugado a PE o
FITC. Se realizó análisis de dos colores usando directamente
anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE específicos de
marcadores celulares como CD19, CD20, CD3, CD4, CD8, (Becton
Dickinson) en diluciones recomendadas. Para un análisis óptimo, se
ajustó la compensación de color por el cruce de las señales de
fluorescencia entre los dos detectores. Se realizó análisis de
inmunofluorescencia de líneas celulares después de lavar las células
tres veces con PBS, y resuspenderlas a 10^{6}/ml en tampón FACS
(1% BSA y 0.2% Azida Sódica en PBS). Todos los pasos de la tinción
se realizaron en hielo. Varias células se incubaron con los
anticuerpos primarios AC1, AB12 (30 \mug/ml), o CD55 (Serotec,
Wiesbaden, Alemania) durante 30 minutos, seguido de incubación con
anticuerpos secundarios conjugados a FITC. Las células se lavaron 3
veces en tampón FACS y se fijaron con formaldehído 1%. Se midió la
susceptibilidad al corte por PI-PLC incubando las
células como se ha descrito anteriormente. Las células se lavaron,
se tiñeron y se analizaron por citometría de flujo.
Se recibieron muestras frescas de tejido
representativas, de piel normal y lesiones de melanocitos cutáneos
extirpadas de pacientes en la Universidad de Heidelberg. Las
muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -80ºC hasta su procesamiento. Se realizaron cortes
criostáticos de 5 micras de muestras de piel normal y de distintas
fases de progresión del tumor melanocítico y de diferentes tumores
de piel. Los cortes se secaron toda la noche a temperatura ambiente
y se fijaron 20 min en un recipiente adecuado relleno de acetona a
-20ºC. Los portas se secaron 10 min a temperatura ambiente y se
incubaron 30 min con PBS 5% de BSA en la cámara de tinción para
eliminar uniones inespecíficas. A continuación se incubaron con
anticuerpos primarios de ACA a las diluciones 1:2000 y 1:4000. Tras
lavar, los cortes se incubaron en serie con anticuerpo
(inmunoglobulina biotinilada de conejo anti ratón), con el complejo
estreptavidina-biotina, con el agente de
amplificación y con estreptavidina-peroxidasa. Los
anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con AEC, el cual
genera un cromógeno rojo. Los cortes se tiñeron con hematoxilina y
se montaron finalmente en medio acuoso de montaje.
Se obtuvieron melanocitos y queratinocitos de
epidermis humana normal comercial (Promo-Cell,
Alemania) y se cultivaron como monocapa en medio de crecimiento
libre de melanocitos (queratinocitos) con suero y ester de forbol
acetato-miristato (PMA). Para la tinción
inmunohistológica, se crecieron células en cámaras especiales como
monocapa. Se fijaron y se tiñeron como se ha descrito anteriormente.
Las líneas celulares human erytroleukemia (HEL), human histiocytic
lymphoma (U 937), human promyelocytic leukemia
(HL-60) y human chronic myelogenous leukemia (K562)
se crecieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con con 2 mM
de glutamina y 10% de FBS. Se realizó citometría de flujo de un
color de las líneas celulares siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicó un procedimiento de purificación de
dos pasos para la preparación de la proteína. El primer paso
incluye la disgregación de la membrana libre de hemoglobina, seguido
de continuada precipitación con sulfato amónico de varios grados de
saturación y electroforesis preparativa (figura 2A). Se evaluó la
pureza de las preparaciones mediante SDS-PAGE
(figura 2, A y B). Las preparaciones se obtuvieron de varios lotes
de eritrocitos humanos recolectados. No se observaron productos de
degradación en ninguna preparación.
Se realizó secuenciación de los aminoácidos
N-terminales de ACA purificada y deglicosilada
químicamente. No se obtuvo ninguna secuencia, indicando que el
extremo N-terminal está bloqueado. Por tanto, se
inactivó y se tripsinizó la proteína y se estableció secuencia para
11 péptidos internos (figura 4). Sólo el péptido A tiene homología
con la región #1230#1248 de la espectrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prestó atención a la caracterización
biológica de esta proteína, particularmente a la porción lipídica,
y se comparó con otras moléculas ancladas con GPI expresadas en la
superficie de eritrocitos humanos. Muchas proteínas de células
eucariotas están ancladas covalentemente a un
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Estas proteínas carecen de un
dominio transmembrana, no tienen cola citoplásmica y se localizan
exclusivamente en el lado extracelular de la membrana plasmática.
Las moléculas con anclaje de fosfoinositoles glicosilados son una
familia estructuralmente diversa de biomoléculas que incluyen:
componentes de la cubierta de protozoos, antígenos de activación,
proteínas reguladoras del complemento, moléculas de adhesión,
enzimas asociadas a membrana y muchas otras glicoproteínas. Este
tipo de anclaje a la membrana celular implican que los motivos
proteicos de estos antígenos se localicen fuera de la membrana, que
tengan potencialmente alta movilidad lateral y que puedan ser
liberados de la célula por acción de la fosfolipasa C específica del
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los anclajes GPI pueden
considerarse como una clase bien definida de estructuras porque
elementos importantes de estos se encuentran conservados
filogenéticamente, desde parásitos protozoos a mamíferos. Este
anclaje contiene un esqueleto lineal de glicano
etanolamina-PO_{4}-6Man\alpha1-2Man\alpha1-6Man\alpha1-4GlcNH_{2}-\alpha1-6myo-inositol-1-PO4-lípido.
La heterogeneidad entre las distintas proteínas con anclaje GPI
viene dada por la composición lipídica. Los anclajes VSG contienen
solo dimiristoil fosfatidilinositol mientras que los GPI de la
proteinasa de superficie de Leishmania promastigote y de
muchas proteínas con anclaje GPI de mamíferos ((entre las que se
incluyen en eritrocitos la
acetilcolinesterasa-AchE, el
decay-accelerating factor (DAF) y el
inhibidor de lisis reactiva (MIRL)) contienen casi exclusivamente
1-alquil-2-acilinositol
fosfolípido, el cual parece ser característico de anclajes humanos
en general (Ratnoff et al., Clin. Exp. Immunol. 87 (1992),
415-421). Además, algunos anclajes GPI contienen un
ácido graso adicional (palmitato) con un enlace hidroxiester al
anillo inositol, el cual proporciona resistencia la fosfolipasa C
específica de fosfatidilinositol bacteriana (PI-PLC)
y a la fosfolipasa C específica de GPI (GPI-PLC) de
Trypanosoma brucei. Las bases de esta resistencia frente a la
fosfolipasa fueron descritas por primera vez para la
acetilcolinesterasa humana y posteriormente para el DAF de
eritrocitos. La presencia de una sustitución en la posición 2 del
anillo inositol explicaría la resistencia a PI-PLC
de los anclajes palmitoilados puesto que las enzimas PLC
bacterianas operan mediante un ataque nucleofílico en el átomo de
fósforo del grupo hidroxilo de la posición 2 del anillo inositol.
Este descubrimiento llevó a sugerir que la ocupación del
myo-inositol en la posición 2 del grupo hidroxilo
por palmitato impediría automáticamente la actuación de la enzima.
Como se muestra para el DAF y otras proteínas unidas a GPI, pueden
existir distintas acetilaciones del inositol y esta variación
estructural es regulada específicamente en cada célula, pero también
puede ser proteína-dependiente (Chen et al.,
PNAS USA 95 (1998) 9512-9517). La relevancia
biológica de la variabilidad estructural de los anclajes GPI en los
distintos tipos de células sanguíneas es aún desconocida. La
presencia de cadenas de ácidos grasos adicionales (acilación) en el
dominio hidrofóbico posiblemente mejore el anclaje de la molécula
al lado externo de la membrana. La presencia de esta cadena acilada
en el anillo inositol en anclajes asociados a eritrocitos le
confiere a estas estructuras resistencia al corte por
PI-PLC y menor sensibilidad a los cortes por
PI-PLD cuando se purifican. La resistencia a ser
liberadas por fosfolipasas, tanto por bloqueo del mecanismo de
ruptura de una fosfolipasa C fosfatidil específica como por la
retención de la asociación a la membrana tras el corte del ácido
fosfatídico por la fosfolipasa D específica, puede potenciar la
estabilidad en la membrana de estas proteínas en el tiempo, lo que
es consistente con la larga vida en circulación de los eritrocitos
(120 días) en comparación con los leucocitos.
\newpage
Los siguientes experimentos se realizaron
primeramente para determinar la estructura primaria y los
parámetros moleculares de la estructura lipídica de ACA y para
comparar estos parámetros con los de otras proteínas unidas a GPI.
La susceptibilidad de una proteína a ser liberada de la superficie
de la membrana por la fosfolipasa C bacteriana específica de
fosfatidilinositol (PI-PLC) es el indicador original
de la presencia de un anclaje GPI. Sin embargo, como ya se ha
mencionado anteriormente, algunos anclajes GPI son resistentes a la
hidrólisis por PI-PLC bacteriana, como las proteínas
de membrana de eritrocitos, y su resistencia depende de acilaciones
adicionales en el anillo inositol.
Para investigar si ACA está anclada en la
membrana bicapa por uniones covalentes al aminoácido
C-terminal mediante un glicosilfosfatidilinositol,
se estudió la hidrólisis específica del enlace fosfodiester usando
distintas enzimas que digieren este anclaje. Primero se observó que
el efecto de PI-PLC en la fracción proteica de
membranas de eritrocitos llevaba a la desaparición electroforética
de una banda muy débil, la cual fue posteriormente identificada
como una proteína eritrocítica nueva. Dado que esta proteína es muy
poco abundante en la superficie de los eritrocitos, se estudió a
continuación la porción lipídica de esta molécula en la proteína
purificada. Las fosfolipasas C hidrolizan el enlace fosfodiester
produciendo 1,2-diacilglicerol, alquilacilglicerol
y el grupo polar fosforilado, mientras que las fosfolipasas D
hidrolizan el enlace fosfodiester produciendo un
1,2-diacilglicerol o alquilglicerol fosforilado y el
grupo polar con un grupo hidroxilo expuesto. Como se muestra en la
figura 5A, no hubo ninguna porción de la proteína ACA que fuese
resistente a la degradación del anclaje por fosfolipasas. La
proteína nativa e intacta muestra una migración más lenta, indicando
una asociación detergente-micelar. La proteína RBC
ACA hidrolizada por PI y GPI-PLC, mostró una
migración más rápida, característica de especies hidrofílicas sin
detergente.
La proteína ACA tratada con
glicosilfosfatidilinositol fosfolipasa D no muestra cambios en la
movilidad electroforética al compararla con la proteína nativa
(figura 5B). La menor movilidad electroforética de la proteína
digerida con GPI-PLD con respecto a la digerida con
PI-PLC es debida a la falta de un fosfato (cargado
negativamente) en el anillo inositol de la proteína degradada.
\vskip1.000000\baselineskip
Existe reacción cruzada de un anticuerpo
generado contra la forma soluble de la glicoproteína variable de
superficie (sVSG) hacia otras proteínas ancladas con GPI no
relacionadas. Este "determinante de reacción cruzada" (CRD)
solo es expuesto cuando la proteína se convierte a una forma
hidrofílica mediante la acción de PI-PLC bacteriana
o GPI-PLC eucariota. En el caso de la forma soluble
de glicoproteína variable de superficie (sVSG), están involucrados
en este reconocimiento tres epítopos solapantes: el fosfato inositol
1,2-cíclico generado en el corte del anclaje por
fosfolipasa C, el residuo de glucosamina acetilado y la ramificación
variable de galactosa. También es conocido que, en el caso de las
proteínas de mamífero, el principal epítopo involucrado en este
reconocimiento es el inositol 1,2-cíclico fosfato.
Por tanto, el reconocimiento de una proteína por el anticuerpo
anti-CRD tras el corte de la fosfolipasa C es la
mayor evidencia de la presencia de un anclaje GPI. El siguiente
grupo de experimentos fue encaminado a determinar si los anticuerpos
anti-CRD reconocían una forma soluble de la
proteína ACA aislada. Como se demuestra aquí, ACA de eritrocitos
humanos muestra más de un 99% de sensibilidad a la acción de
fosfolipasas C. Se sometió a electroforesis la proteína digerida
por glicosilfosfatidilinositol fosfolipasa C y se realizó un
western-blot usando un anticuerpo
anti-CRD (figura 6). Se utilizó como control
positivo la forma de membrana de la glicoproteína variable de
superficie (mVSG) digerida con las mismas fosfolipasas. Como
control negativo se hizo western-blot frente a la
forma nativa de ACA y a la proteína digerida por
GPI-PLD y se marcaron con anticuerpo antiCRD. Las
moléculas cortadas con GPI-PLD no reaccionan con
anticuerpos anti-CRD, indicando que esta enzima deja
el fosfodiacilglicerol y el 1,6myo-inositol como
productos de reacción, destruyendo el determinante antigénico CRD
al impedir la formación de
D-myo-inositol
1,2-fosfato cíclico. La forma de membrana de ACA se
usó como control negativo y, como se esperaba, no fue reconocida
por anticuerpos anti-CRD.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína purificada y digerida con PI y
GPI-PLC fue a continuación digerida con
triacilglicerol acil hidrolasa, obteniéndose 1,2 diglicérido y
ácido graso como primeros productos de la reacción. A continuación
se digirió con hidrolasa ester carboxílica (una enzima que acelera
la hidrólisis total por un corte específico del glicérido soluble,
obteniendo como productos finales de la reacción glicerol y ácidos
grasos. A continuación se determinó el glicerol enzimáticamente con
GK, PK y LDH como enzimas indicadoras auxiliares. En la figura 1 se
muestra el esquema de todas las reacciones enzimáticas de la
hidrólisis total de la cola lipídica del anclaje de ACA. También se
muestran las reacciones enzimáticas para la determinación del
glicerol. Se midió el descenso en la extinción a 340 nm, 334 nm y
365 nm debido a la oxidación de NADH, y se calculó el glicerol
liberado en g/l. Las cantidades de glicerol liberado por hidrólisis
con PI y fosfolipasas específicas de
GPI-fosfatidilinositol seguido de deacetilación
específica fueron similares, indicando la misma actividad específica
de ambas enzimas en ACA (tabla 1).
Los datos muestran la cantidad de glicerol
liberado tras la hidrólisis total de la cola lipídica de ACA.
Para seguir investigando la estructura del
dominio hidrofóbico de ACA de células rojas sanguíneas, en
particular la composición de ácidos grasos, se analizaron los
fragmentos generados por hidrólisis total del anclaje. Se utilizó
el agente fotoactivable [^{125}I]TID, el cual se asocia y
marca preferentemente los grupos lipídicos de proteínas integrales
de membrana. Las muestras marcadas con [^{125}I]TID fueron
proteínas purificadas y se sometieron a hidrólisis con
GPI-fosfolipasa C. Los productos lipídicos de estas
reacciones fueron a continuación hidrolizados con lipasas altamente
específicas, triacilglicerol acilhidrolasa e hidrolasa
ester-carboxílica como se describe en los
Procedimientos Experimentales. Los fragmentos liberados
radiomarcados se extrajeron y se analizaron por cromatografía en
capa fina y autoradiografía. Se utilizó como control la forma de
membrana de la glicoproteína variable de superficie (mfVSG) de
trypanosoma brucei marcada con [^{125}I]TID e
hidrolizada del mismo modo que ACA, y se sometió a cromatografía en
capa fina (figura 7).
La principal especie lipídica que se obtuvo
mediante la hidrólisis total del anclaje de ACA mostró la misma
movilidad que la cola de ácido graso marcada del VSG comercial
utilizado como control, indicando la misma estructura de
1,2-diacil miristato, lo que difiere de otras
proteínas de eritrocitos unidas a GPI, las cuales poseen
alquil-acil glicerol y otros ácidos grasos como cola
lipídica de la molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estableció un método de purificación para
obtener grandes cantidades de proteína necesaria para la
inmunización de 6 ratones BALB/c siguiendo procedimientos estándar.
Para mejorar la comprensión de esta molécula, se produjo en primer
lugar un anticuerpo policlonal y se probó su especificidad con
distintas muestras de extractos crudos de proteína, proteína
purificada, membrana de células rojas y extractos libres de células.
La especificidad del anticuerpo policlonal se comprobó por
western-blot, con distintas fracciones de proteína.
El extracto de proteína obtenido de membranas de eritrocitos con
sulfato amónico (como se describe en el Ejemplo 1), se disolvió en
tampón de almacenamiento, dializado en el mismo tampón y sometido a
SDS-PAGE en condiciones reductoras. La proteína
homogénea purificada ACA y los extractos proteicos obtenidos del
ghost de eritrocitos y ghost obtenido de la línea
celular humana de eritroleucemia K-562 se sometieron
a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. El suero de anticuerpo policlonal reaccionó
específicamente con la banda de 65 kD correspondiente a la proteína
ACA (figura 8). No se observó reacción con otras proteínas. La débil
banda del extracto crudo de proteínas de eritrocitos muestra una
alta especificidad del anticuerpo a este nuevo antígeno y una muy
baja abundancia de esta molécula en la membrana plasmática de las
células rojas sanguíneas, comparado con células malignas de sangre
humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó citometría de flujo y análisis de
inmunoblot para estudiar la expresión in vivo de ACA. Para ello se
utilizaron los anticuerpos monoclonales AC1 y AB12 y el anticuerpo
policlonal AL1 contra la proteína ACA. Los resultados se muestran
en la figura 9 (a-f) y en la figura 16 (a,b). Se
encontró que los dos anticuerpos monoclonales reaccionaron
enormemente con granulocitos, monocitos y una pequeña subpoblación
de linfocitos, indicando la expresión de ACA en estas células. El
porcentaje de células positivas en cada población obtenida en el
análisis de 20 voluntarios sanos se muestra en la figura 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la forma en la que ACA está
embebida en la bicapa lipídica, se analizaron granulocitos y
linfocitos purificados de voluntarios sanos. Dichas células se
trataron con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol
(PI-PLC), la cual hidroliza el anclaje GPI y libera
proteínas ancladas mediante GPI de la membrana. Tras una hora de
exposición a PI-PLC, los granulocitos empezaron a
ser negativos para ACA, confirmando la presencia de la proteína
anclada mediante GPI. En la figura 11b se muestra un histograma
representativo del tratamiento de granulocitos con
PI-PLC. Se realizó un control negativo adicional con
glicofosfatidilinositol fosfolipasa D (GPI-PLD) en
granulocitos purificados. Se sabe que esta enzima reacciona con
proteínas unidas a GPI, incluso a las que tienen el anillo inositol
acetilado (dicha modificación química confiere a muchas proteínas
resistencia a la acción de PIPLC). Sin embargo, la enzima no puede
solubilizar proteínas de membranas intactas con anclaje GPI, sino
que solo las separa de su anclaje si las proteínas han sido
solubilizadas de la membrana. Se trataron granulocitos de de
donantes sanos con GPI-PLD y, como se esperaba, se
eliminó de la superficie celular a ACA (figura 11c). En
experimentos control se realizó digestión de PI-PLC
en la línea celular humana de eritroleucemia (HEL) y se monitorizó
la expresión de ACA y de la proteína anclada por GPI DAF (CD55). Las
células HEL fueron negativas para ACA y CD55 tras la acción de
PI-PLC en las mismas condiciones usadas para los
granulocitos (figura 11 d-f).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la figura 9, solo una
subpoblación de linfocitos expresa ACA. Para definir esta
subpoblación, se analizó la expresión de ACA en linfocitos B de
sangre periférica. En un primer experimento se aislaron células B
de donantes sanos mediante rosetting. Mediante análisis con
un solo color con anticuerpos monoclonales anti-ACA
se encontró que más del 90% de las células aisladas mostraban
expresión de ACA (figura 12a). Se eliminó parcialmente a ACA de la
superficie de estas células con PI-PLC en distintas
condiciones de reacción como las que se usaron para la digestión de
granulocitos. Se añadió a la solución enzimática el detergente
Tritón X-100 para aumentar la actividad específica.
La tinción con anticuerpos anti-ACA se vio muy
reducida, sugiriendo que este antígeno también está unido a
fosfatidilinositol (PI) (figura 12b). Sin embargo, el tratamiento
con altas concentraciones de PI-PLC no obtuvo un
mayor descenso en la unión de ACA con los anticuerpos, sugiriendo
que no todas las moléculas son sensibles a esta enzima (figura 12b).
Mediante análisis de dos colores de linfocitos B purificados se
observa que todas las células CD19 y CD20 positivas son ACA
positivas (figura 12 c-e), los linfocitos de sangre
periférica muestran que un 10-15% de las células
co-expresan CD19, CD20 y ACA, lo que corresponde a
la subpoblación de linfocitos B (figura 12 f-h).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la expresión de ACA en linfocitos B
transformados con EBV normales o de pacientes con PNH. La
hemoglobinuria paroximal nocturna es un desorden hematológico
adquirido que se caracteriza por anemia hemolítica mediada por
complemento causada por proteínas deficientes ancladas por GPI. Por
citometría de flujo de un solo color, los linfocitos B PNH
transformados con EBV mostraron una reducción significativa de la
fluorescencia (figura 13b) al usar el anticuerpo
anti-ACA en comparación con los linfocitos B
transformados con EBV obtenidos de voluntarios sanos (figura
13a).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la expresión de ACA mediante doble
tinción y con anticuerpos específicos anti-ACA en
linfocitos T de sangre periférica purificados (figura 14). Las
células T se aislaron de sangre periférica como se describe en
Materiales y Métodos y se tiñeron doblemente con marcadores típicos
de células T (CD3, CD4 y CD8). De los linfocitos T purificados, más
del 95% fueron ACA negativos (figura 14 a-d).
Además, mediante análisis de dos colores de PBMCs se confirmaron
los resultados previos. Las células que expresan marcadores típicos
de células T como CD2 y CD5 fueron negativas para ACA (figura 14
e-h). Incluso la subpoblación de células T gd fue
ACA negativa (figura 14f). Se analizaron por citometría de dos
colores los clones de células T GPI-positivos y
GPInegativos de pacientes con PNH. Incluso las células que
expresaban el antígeno CD48 (con anclaje GPI) fueron completamente
negativas para ACA. Se muestran histogramas representativos en la
figura 15 a,b,c. También se analizaron varias líneas celulares
derivadas de malignidades provenientes de células T (MOLT4, CEM,
JURKAT J6). Ninguna de ellas mostró expresión en superficie de ACA
(figura 15 d-f). Los resultados nos llevaron a
concluir que ACA se expresa exclusivamente en células B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se separó electroforéticamente y se transfirió a
nitrocelulosa ACA solubilizada de distintas células de sangre
periférica. Los filtros se probaron con anticuerpos
anti-ACA. Los anticuerpos reconocieron una proteína
de 65 kD correspondiente a ACA en granulocitos y células B
solubilizadas (figura 16a). Además, la proteína ACA se
inmunodetectó en sobrenadantes de cultivos de granulocitos después
(pero no antes) del tratamiento con PI-PLC (figura
16b). Al contrario que los resultados negativos obtenidos por
citometría de flujo en cuanto a la expresión de ACA en eritrocitos
(con muy baja abundancia de ACA en estas células), se observa
claramente por inmunoblot con anticuerpos policlonales y
monoclonales anti-ACA la presencia de ACA en
eritrocitos (figura 16).
\vskip1.000000\baselineskip
Para elucidar el posible papel de ACA en rutas
de transducción de señales específicas durante la carcinogénesis,
se estudió la expresión y distribución de ACA en un gran número de
lesiones celulares benignas y malignas y sus metástasis.
ACA se expresa en piel normal en melanocitos
dispersa sobre la capa basal. Las células de Langerhans (derivadas
de monocitos) en la capa supra basal están teñidas, pero en
menor medida (figura 17 a,b).
Los melanocitos se tiñen heterogéneamente con el
anticuerpo monoclonal anti-ACA. La mayor expresión
de ACA se encontró cuando las células se dividieron (progresión de
la fase G2 a mitosis) (figura 18 a,b).
Queratinocitos humanos primarios y la línea
celular de queratinocito HaCaT (cedida por el Profesor Fusenig,
German Cancer Research Center) no muestran expresión de ACA por
tinción inmunocitológica (figura 19 a,b) o
western-blot (figura 19c).
Melanocitos de lunar congénito en la capa de
epidermis basal y superior reaccionan fuertemente con anticuerpos
anti-ACA. Un tercio del lunar congénito expresaba
ACA en pequeños grupos de células pigmentadas, correspondiente a lo
que se denomina nódulos proliferativos. El mismo tipo celular en la
capa de dermis (formado principalmente por melanocitos que no se
dividen) no se tiñó. Estos resultados confirman los descubrimientos
previos sobre la preferencia de la expresión de ACA en células en
división e indican el potencial metastático que tiene la elevada
expresión de ACA (figura 20).
La expresión de ACA es altamente elevada en
melanoma primario metastático (figura 21 a,b). Además, pueden
usarse anticuerpos anti-ACA para la detección de
metástasis de ACA (figura 22 a,b).
La expresión de ACA es específica de melanocitos
y de lesiones de melanoma. Otros tipos de tumores de piel como el
basalioma y el espinalioma son ACA negativos (figura 23 a,b).
Se confirmó la especificidad de los anticuerpos
y la elevada expresión de la proteína ACA en melanoma en
comparación con tejidos normales mediante análisis de Inmunoblot de
piel normal homogeneizada y tejidos tumorales (figura 24).
Se muestra la expresión del antígeno ACA en
cáncer de riñón, pulmón, mama, colon, estómago, melanoma y mieloma
por análisis de inmunoblot de tejidos tumorales frescos
homogeneizados (figura 25).
Se analizó una preparación de células
progenitoras purificadas de médula ósea por citometría de flujo de
uno o dos colores como se describe en el ejemplo 1 en relación a la
co-expresión de ACA con varios marcadores
celulares. En la figura 26 b-d se analiza la
población celular progenitora usada en este estudio
(co-expresión de CD34/CD38, CD34/CD90, CD34/CD117).
Las figuras 26e-h muestran la
co-expresión de ACA en células positivas para
CD34/
CD38-, CD34/CD90-, CD34/CD117-, CD34/HLA-. Las figuras 26j-l muestran la co-expresión de ACA con los siguientes marcadores: CD13 (marcador mieloide) (figura 26j), CD33 (marcador panmieloide) (figura 26k), CD34 (marcador de precursores de células hematopoyéticas) (figura 26I). Las figuras 26a,i muestran controles negativos representativos.
CD38-, CD34/CD90-, CD34/CD117-, CD34/HLA-. Las figuras 26j-l muestran la co-expresión de ACA con los siguientes marcadores: CD13 (marcador mieloide) (figura 26j), CD33 (marcador panmieloide) (figura 26k), CD34 (marcador de precursores de células hematopoyéticas) (figura 26I). Las figuras 26a,i muestran controles negativos representativos.
Se muestra en histrogramas de citometría de
flujo de un solo color la expresión de ACA en eritroleucemia humana
(HEL) (figura 27a), leucemia humana promielocítica
(HL-60) (figura 27b) y leucemia mieloide crónica
humana (K-562) (figura 27c). El análisis por
inmunoblot con anticuerpos anti-ACA de extractos
libres de células de líneas celulares de leucemia humana confirma
la expresión de ACA y muestra que ACA posee el mismo tamaño
molecular que el originalmente descrito para eritrocitos (figura
28).
ACA se expresa en granulocitos PNH pero no en
linfocitos B PNH, aunque células B normales expresan la proteína.
PNH es un desorden de clones de células madre que se caracteriza por
hemólisis mediada por complemento, deficiencia en hematopoyesis y
ocasionalmente leucemia. La alteración bioquímica en PNH implica la
síntesis defectiva de anclajes GPI. Como resultado de este defecto,
las células afectadas no poseen todas las proteínas de superficie
que usan anclajes GPI, incluyendo proteínas implicadas en la
regulación del complemento, receptores inmunológicos, enzimas y
muchas otras de función desconocida.
El defecto molecular encontrado en PNH se debe a
una o más mutaciones adquiridas en PIG-A, el cual
es un gen ligado al cromosoma X implicado en el primer paso de la
biosíntesis del anclaje GPI. Se encontró un patrón de expresión
inusual de ACA en células rojas con PNH. Linfocitos B transformados
con EBV de pacientes con PNH poseen una reducción drástica de la
expresión de ACA, mientras que granulocitos con PNH poseen una
expresión en superficie normal de este antígeno (figura 29).
Los histogramas representativos muestran:
expresión normal en superficie de ACA en granulocitos con PNH
(figura 29 a,b).
Análisis de inmunoblot con anticuerpo
anti-ACA de la fracción proteica de membranas de
granulocitos obtenida de donantes sanos (carril 1) frente a
pacientes con PNH (carril 2) (figura 29c). Análisis por inmunoblot
con anticuerpo anti-ACA de la fracción proteica de
membranas de granulocitos antes y después del tratamiento con
fosfolipasa C (figura 29d). Forma soluble de ACA en sobrenadantes de
granulocitos de donantes sanos (figura 29e) y de pacientes de PNH
(figura 29f).
La presencia de ACA en granulocitos PNH puede
explicar probablemente algunas propiedades de granulocitos PNH
anormales no relacionados con la mutación PIG-A. Se
sabe desde hace tiempo que las células PNH anormales poseen
dominancia clonal en la médula ósea y en la sangre periférica. En
muchos pacientes con PNH, más del 80% de los granulocitos y
eritrocitos circulantes son deficientes en GPI, lo que sugiere que
un clon anormal de PNH posee una ventaja de crecimiento sobre otros
progenitores normales. Las células PNH son también relativamente
resistentes a la apoptosis y esta característica parece ser el
principal mecanismo por el que las células PNH mantienen una
ventaja de crecimiento sobre los progenitores normales y pueden
jugar un papel en la propensión de la enfermedad a transformarse en
un desorden hematológico más agresivo. El crecimiento clonal no
regulado puede provenir de señales que favorezcan la proliferación
o alternativamente de señales que bloqueen la apoptosis y
favorezcan la supervivencia celular. La presencia de ACA en
granulocitos PNH puede conferir esta ventaja proliferativa a las
células madre hematopoyéticas mutadas y puede jugar un papel en el
desarrollo de la leucemia.
¿Cómo puede expresarse ACA en la superficie de
granulacitos PNH a pesar de la mutación PIG-A?. Ya
se ha demostrado el potencial único de las proteínas con anclaje
GPI para transferirse de una membrana celular a otra. Se ha visto
también que las proteínas ancladas con GPI transfieren intacta su
funcionalidad. Existen implicaciones de este fenómeno en muchas
áreas entre las que se incluyen transmisiones de enfermedades
(priones), protección celular (células endoteliales) o ingeniería
de proteínas de superficies celulares, lo que es una tecnología
potencialmente poderosa por la que se puede modificar la composición
proteica de las superficies celulares sin transferencia génica.
Esta observación demuestra el potencial de proteínas GPI para ser
"painted" en células que de otro modo serían incapaces
de expresar proteínas exógenas. Es posible que ACA
"paint" a una célula PNH con la mutación
PIG-A de una célula a otra (probablemente una célula
madre) capaz de sintetizar anclajes y, según las ya sugeridas
funciones de ACA, pudiera ser responsables de las anomalías ya
descritas en granulocitos PNH.
La expresión de ACA en piel normal y en melanoma
muestra el mismo fenómeno. En piel normal, ACA se expresa en
melanocitos dispersos por el estrato basal y en menor medida en la
capa suprabasal. Se encontró la expresión esperada en células de
Langerhans (derivadas de monocitos) y también una discreta reacción
("desvanecimiento") de los anticuerpos
anti-ACA con queratinocitos. Los queratinocitos en
cultivo no muestran reacción con anticuerpos
anti-ACA. El análisis de inmunoblot de
queratinocitos con anticuerpo anti-ACA también fue
negativo. Estos datos indican que probablemente ACA se mueva de
otras células y las "paint" como queratinocitos. Criocortes de
melanoma primario y metástasis de melanoma teñidos con anticuerpo
anti-ACA muestran fuerte expresión de esta proteína
y el mismo fenómeno de "desvanecimiento" visto en piel
normal.
El lunar congénito posee gran expresión de ACA
en melanocitos más allá de la membrana basal, de nuevo con el
fenómeno de "desvanecimiento". Todos estos datos sugieren
firmemente que existe un mecanismo general que permite el
movimiento de ACA entre células. Teniendo en cuenta que ACA posee un
anclaje con diacil miristato (DAG) como cola lipídica, el cual es
conocido como un potente activador de algunas proteínas quinasas y
estimulador de la síntesis del ADN, es posible que ACA se mueva
desde células malignas de melanoma (probablemente por modificación
del anclaje) y se incorpore a nuevos melanocitos contribuyendo a su
crecimiento descontrolado. El tiempo tan corto para el desarrollo
de la metástasis en piel podría ser explicado por esta habilidad de
la proteína ACA.
\vskip1.000000\baselineskip
El aislamiento y la purificación de dos formas
moleculares distintas de ACA se hizo como se ha descrito en el
Ejemplo 1 (A).
Se han realizado métodos electroforéticos
como los descritos en el Ejemplo 1 (B).
Se ha realizado radiomarcaje con dos
proteínas ACA como se describe en el Ejemplo 1 (K).
Se ha realizado cromatografía en capa
fina (TLC) con las formas de ACA de 68 kD y 65 kD como se
describe en el Ejemplo 1 (L).
Se ha realizado Inmunoblot de proteínas
ACA como se describe en el Ejemplo 1 (G). Proteínas purificadas
homogéneamente se sometieron a electroforesis en condiciones
reductoras en SDS-PAGE 8.5%. Tras boquear, se
revelaron los antígenos con anticuerpo policlonal generado contra la
proteína ACA purificada homogéneamente de 65 kD. Tras lavar, el
anticuerpo unido se detectó incubándolo con anticuerpo de ratón
anti-IgG conjugado a peroxidasa.
Para el tratamiento con sialidasa se
incubaron 10 \mug de proteínas purificadas en 40 mM
Tris-HCl, 4 mM CaCl_{2} pH 7.8 con 100 mU de
sialidasa de Vibrio cholerae (100 mU) a 37ºC 16 horas. Se
analizaron las alícuotas en
SDS-PAGE.
SDS-PAGE.
Para el tratamiento con
Péptido-N-(acetil-\beta-glicosaminil)
asparragin amidasa F (PNGaseF) se trataron 10 \mug de
proteínas purificadas en tampón fosfato 100 mM, 25 mM EDTA pH 7.2
con 25 mU de PNGaseF de Flavobacterium meningosepticum a
37ºC 16 horas. Las alícuotas se analizaron por
SDS-PAGE. Para estimar el número de
N-glicanos unidos al polipéptido se realizaron
hidrólisis a distintos tiempos con PNGase F hasta que se obtuvo un
peso molecular constante indicativo de la completa
desglicosilación. El número de bandas en SDS-PAGE
entre las muestras sin tratar y las completamente desglicosiladas
indica el número aproximado de N-glicanos en la
glicoproteína orginal (Alexander, S and Elder, J (1989) Methods
Enzymol. 179, 505-518).
Para el tratamiento con endoglicosaminidasa
H, se incubaron 10 \mug de proteínas purificadas en tampón
fosfato salino 50 mM pH 6.0 conteniendo 0.1 mg/ml de SDS en un
volumen final de 0.1 ml con 5 mU de endoglicosaminidasa H a 37ºC 16
horas. Las alícuotas se analizaron por SDS-PAGE.
Para el tratamiento con
O-glicosidasa, se incubaron 10 \mug de
proteínas purificadas en tampón acetato sódico 100 mM pH 5 en un
volumen final de 200 \mul con 5 mU de
O-glicosidasa 17 horas a 37ºC. Las alícuotas se
analizaron por SDS-PAGE.
Para la completa deglicosilación
enzimática, se incubaron las proteínas sucesivamente con
sialidasa en el tampón apropiado descrito anteriormente, se
dializaron exhaustivamente en tampón acetato sódico pH 5.0 y se
incubaron con O-glicosidasa. Se dializaron de nuevo
en tampón 100 mM fosfato sódico pH 7.2 y se incubaron con PNGase F
como se ha descrito anteriormente.
La deglicosilación química de la proteína
ACA se realizó como se describe en el Ejemplo 1 (D).
Se han aislado dos formas de distinto peso
molecular. Mediante electroforesis de las proteínas ACA purificadas
se muestra que ACA de eritrocitos existe como una proteína de 65 kD
(forma principal) y de 68 kD (figura 30). Se midió en un
espectrofotómetro Beckman el espectro de UV de las dos proteínas
aisladas a una concentración de 1 mg/ml en 0.5% NaH CO_{3} en
comparación con el del tampón solo y se observó una alta pureza de
las especies aisladas (figura 31 a y b).
Inmunoblot de las proteínas ACA purificadas con
anticuerpo policlonal anti-ACA. El
western-blot se realizó según el Ejemplo
1(G). Ambas formas moleculares de la proteína ACA fueron
reconocidas por anticuerpos policlonales de ratón generados contra
la proteína homogéneamente purificada de 65 kD, indicando que el
distinto grado de glicosilación puede generar la
microheterogeneidad de ACA (figura 32).
Análisis de TLC en sílica gel de los fragmentos
generados por hidrólisis de los anclajes: Se hidrolizaron proteínas
purificadas (marcadas con [^{125}I]TID) con
GPI-PLC. Los productos lipídicos de la reacción se
hidrolizaron a continuación con lipasas altamente específicas. Los
fragmentos radiomarcados se extrajeron y analizaron por TLC
(Ejemplo 1(K) y (L)). Los resultados muestran que las dos
formas moleculares de ACA de eritrocitos poseen un anclaje sensible
a PI-PLC, consistente en diacil miristato, una
estructura muy similar al de mVSG de T. brucei (figura
33).
Deglicosilación enzimática de proteínas ACA: Las
proteínas purificadas de 65 kD y 68 kD fueron digeridas con PNGasa
F, una enzima conocida que corta todo los tipos de
N-glicanos unidos a asparragina. Se realizaron
experimentos de digestión a distintos tiempos con ambas proteínas
para estimar el número de cadenas de N-glicanos
asociadas en una muestra de glicoproteína. Ambas proteínas fueron
incubadas sucesivamente con 25 mU de enzima y se analizaron
alícuotas por SDS-PAGE tras 0.5, 1, 1.5, 2, 5,
horas. El número de bandas de SDS-PAGE entre las
proteínas no tratadas y las proteínas completamente desglicosiladas
indica el número aproximado de N-glicanos de la
glicoproteína original. Los resultados muestran que la proteína de
68 kD lleva dos cadenas de N-glicano, en
comparación con una única cadena de N-glicano
presente en la proteína de 65 kD (figura 34).
La Incubación sucesiva de ACA de 65 kD de
eritrocitos con sialidasa, O-glicosidasa y PNGasa F
conduce a una única especie proteica de ACA con un peso molecular
aproximado de 59 kD (deducido por SDS-PAGE). Se
obtuvo el mismo resultado mediante desglicosilación química usando
TMSF anhidro, el cual elimina de modo no selectivo las cadenas de
carbohidrato unidas mediante enlaces O- y N- (figura 35).
Los experimentos de digestión con glicosidasa
indican claramente que la heterogeneidad molecular de ACA de
eritrocitos humanos es principalmente debida a diferencias en
N-glicosilación. Los resultados permiten la
conclusión que la proteína de eritrocitos humanos ACA (65 kD) lleva
covalentemente unido a su esqueleto peptídico un complejo
N-glicano, mientras que la proteína de eritrocitos
humanos ACA de 68 kD lleva dos complejos de
N-glicanos. Los datos también muestran que la
proteína ACA es un antígeno GPI de superficie fuertemente sializado
en su extremo, conteniendo O- y N-glicanos
covalentemente unidos en la superficie de su esqueleto
peptídico.
Claims (23)
1. Una glicoproteína de superficie ACA que posee
las siguientes características:
- a)
- Está anclada a la superficie mediante un motivo GPI
- b)
- Puede ser retirada de la membrana celular mediante tratamiento con PI-PLC.
- c)
- Su anclaje GPI se caracteriza por un anillo inositol no acetilado y un diacilglicerol como cola lipídica del anclaje.
- d)
- Posee un punto isoeléctrico de pH 5.5
- e)
- Está presente en células sanguíneas progenitoras, granulocitos, monocitos, células B (y no células T), melanocitos y otras células.
- f)
- Se expresa preferentemente durante la división celular y en células tumorales.
También aplicable a su forma salina.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La glicoproteína de superficie ACA de la
reivindicación 1 que se obtiene de la sangre humana mediante:
- a)
- Aislamiento y lisis de células
- b)
- Aislamiento disgregación y concentración de membranas libres de hemoglobina de dicha células.
- c)
- Desalinización continuada de dichas membranas con sulfato amónico (70%-40% de saturación).
- d)
- SDS-PAGE preparativo en condiciones reductoras de las proteínas precipitadas en el paso (c).
- e)
- Aislamiento de la proteína de la banda del gel.
\vskip1.000000\baselineskip
3. La glicoproteína de superficie ACA de las
reivindicaciones 1 y 2 que posee un peso molecular de unos 65 a 68
kD cuando se analizan por SDS-PAGE en condiciones
reductoras.
4. La glicoproteína de superficie ACA de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que posee al menos una de
las siguientes secuencias de aminoácidos:
- (A)
- D-L-V-P-L-E-D-K-V-T-I-L-G-M-T-A
- (B)
- K-L-A-L-S-A-D-D-P-G-F-H-N-F-S-H-Q-R-Q-T
- (C)
- D-Q-Q-T-T-S-H-S-S
- (D)
- V-L-E-I-M-L-P
- (E)
- F-Q-D-E-S-E-A-N-K
- (F)
- M-K-Y-V-N-F-K-F-Y-F
- (G)
- N-L-D-F-M-T-W-G-V-T-K-V-T-Y-I-G-Q-P-T-G-G
- (H)
- L-L-M-D-N-N-E-A-V-H
- (I)
- F-D-Q-A-W-A-D-T-A-H-T-W
- (J)
- K-L-D-D-I-Q-K-D-M-Y-S-Q-Q-D-T
- (K)
- G-V-W-I-M-K-N-Q-I-T
\vskip1.000000\baselineskip
5. La glicoproteína de superficie ACA de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es aislada de células
sanguíneas.
\newpage
6. Un proceso de aislamiento de la glicoproteína
de superficie ACA que comprende:
- a)
- Aislamiento y lisis de células de muestra de sangre humana.
- b)
- Aislamiento disgregación y concentración de membranas libres de hemoglobina de dicha células.
- c)
- Desalinización continuada de dichas membranas con sulfato amónico (70%-40% de saturación).
- d)
- SDS-PAGE preparativo en condiciones reductoras de las proteínas precipitadas en el paso (c).
- e)
- Aislamiento de la proteína de la banda del gel.
\vskip1.000000\baselineskip
7. La glicoproteína de superficie ACA de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es producida por el
proceso de la reivindicación 6.
8. La glicoproteína de superficie ACA de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es una proteína
recombinante.
9. La glicoproteína de membrana ACA de la
reivindicación 8 que es producida en células de mamífero.
10. La molécula de ácido nucleico que comprende
la secuencia de nucleótidos codificante de la glicoproteína de
superficie ACA de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde
dicha glicoproteína de superficie ACA contiene al menos una de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
- (A)
- D-L-V-P-L-E-D-K-V-T-I-L-G-M-T-A
- (B)
- K-L-A-L-S-A-D-D-P-G-F-H-N-F-S-H-Q-R-Q-T
- (C)
- D-Q-Q-T-T-S-H-S-S
- (D)
- V-L-E-I-M-L-P
- (E)
- F-Q-D-E-S-E-A-N-K
- (F)
- M-K-Y-V-N-F-K-F-Y-F
- (G)
- N-L-D-F-M-T-W-G-V-T-K-V-T-Y-I-G-Q-P-T-G-G
- (H)
- L-L-M-D-N-N-E-A-V-H
- (I)
- F-D-Q-A-W-A-D-T-A-H-T-W
- (J)
- K-L-D-D-I-Q-K-D-M-Y-S-Q-Q-D-T
- (K)
- G-V-W-I-M-K-N-Q-I-T
\vskip1.000000\baselineskip
11. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 10 donde la secuencia de nucleótidos es de una
secuencia de ADN genómico o una secuencia de ADN copia.
12. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11.
13. Una célula huésped transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 12.
14. La célula huésped de la reivindicación 13 la
cual es una célula huésped de mamífero.
15. Un proceso de producción de la glicoproteína
de superficie ACA que comprenden los siguientes pasos:
- a)
- cultivo de células huéspedes transformadas según las reivindicaciones 13 o 14 en un medio de cultivo adecuado
- b)
- aislamiento de la proteína de las células o del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un anticuerpo contra la glicoproteína de
superficie ACA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a
9.
17. El anticuerpo de la reivindicación 16 el
cual es un anticuerpo monoclonal.
18. Un método de diagnóstico de un tumor
asociado con la sobre-expresión de ACA o una
predisposición a este tumor comprende
- a)
- Poner en contacto la muestra diana con un compuesto capaz de unirse específicamente (i) a la glicoproteína de superficie ACA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 9 o (ii) un ARNm transcrito de la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 10 u 11 y la determinación del nivel de ACA o del ARNm de ACA
- b)
- Comparar el nivel de la proteína ACA o del ARNm de ACA de la muestra determinado mediante el uso del compuesto del paso (a) con una muestra control obtenida de un individuo sano, donde un elevado nivel de la glicoproteína de superficie ACA o de su correspondiente ARNm es indicativo de un tumor o de una predisposición al mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
19. El método de la reivindicación 18, donde el
compuesto es un anticuerpo de las reivindicaciones 16 o 17 o un
oligonucleótido capaz de hibridar con ARNm transcrito de la molécula
de ácido nucleico de las reivindicaciones 10 u 11.
20. Una composición farmacéutica que contiene un
compuesto capaz de reducir o eliminar (a) la expresión de la
secuencia de ácido nucleico codificante de la glicoproteína de
superficie ACA y/o (b) la actividad biológica de ACA, donde el
compuesto es (a) un ARN antisentido o una ribozima y/o (b) un
anticuerpo.
21. El uso de un compuesto capaz de reducir o
eliminar (a) la expresión de la secuencia del ácido nucleico
codificante de la glicoproteína de superficie ACA y/o (b) la
actividad biológica de ACA para la preparación de un medicamento
para el tratamiento del cáncer o su profilaxis, donde el compuesto
es (a) un ARN antisentido o una ribozima o (b) un anticuerpo.
22. El método de las reivindicaciones 18 o 19 o
el uso acorde a la reivindicación 21, donde el cáncer es melanoma,
leucemia, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer gástrico o alguna otra forma de cáncer.
23. Un kit conteniendo el anticuerpo de las
reivindicaciones 16 o 17 o un oligonucleótido capaz de hibridar con
ARNm transcrito de la molécula de ácido nucleico de las
reivindicaciones 10 u 11.
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