ES2322307A1 - Sistema de fermentacion in vitro con flujo discontinuo de las fases liquida y solida. - Google Patents
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Abstract
Sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida. La presente invención se refiere a un sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida que tiene aplicación en el campo de la producción animal, especialmente, en la valoración nutritiva de alimentos para rumiantes y otros herbívoros. Este sistema puede aplicarse como herramienta de simulación in vitro por grupos de investigación que mantengan líneas enfocadas al estudio del ecosistema microbiano digestivo y los procesos de fermentación digestiva, así como de los factores que inciden sobre ellos.
Description
Sistema de fermentación in vitro con
flujo discontinuo de las fases líquida y sólida.
La presente invención se refiere a un sistema de
fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases
líquida y sólida que tiene aplicación en el campo de la producción
animal, especialmente, en la valoración nutritiva de alimentos para
rumiantes y otros herbívoros.
En los animales herbívoros, la utilización
digestiva del alimento depende en gran medida de la interacción
digestiva con su ecosistema microbiano digestivo, compuesto por un
amplio número de especies de bacterias, protozoos y hongos,
establecido en uno o varios compartimentos del tracto digestivo.
Esta variada población microbiana fermenta los componentes del
alimento rindiendo productos útiles para el balance energético del
hospedador. Por tanto, en los herbívoros, la fisiología digestiva y
en último término la valoración nutritiva dependen en gran medida
de la determinación del potencial de fermentación de la población
microbiana, que a su vez está determinado por el tipo de alimento,
las condiciones ambientales de fermentación, y con ellas las
características de la población microbiana, además de por el tiempo
de permanencia del alimento en el órgano de fermentación.
Los estudios de fisiología digestiva y
valoración nutritiva in vivo son laboriosos y costosos, por
lo que desde hace décadas se han propuesto alternativas in
vitro que permitan estimar las características de la
fermentación microbiana a partir de simulaciones en laboratorio.
Las diferencias entre ellas residen en el compromiso entre el
grado de simplicidad del sistema, en función del número de variables
que afectan a la fermentación que se controlen, y la exactitud y
precisión que se pretende alcanzar con los resultados. Además, el
diseño de los sistemas varía en función de su enfoque hacia los
parámetros específicos que se pretenden medir.
Como consecuencia de las diferencias entre los
sistemas de fermentación en cuanto a su simplicidad, el rango de
variación de su coste económico es extremadamente amplio.
Czerkawski (1986) clasifica los distintos tipos de sistemas de
fermentación in vitro en: sistemas sin intercambio de sólido
o líquido, sistemas de flujo continuo y sistemas semipermeables.
Los primeros consisten en un tubo o botella de vidrio en el que se
incuba durante cierto tiempo un sustrato determinado con una mezcla
de inóculo microbiano con distintas proporciones de soluciones
tampón para mantener un pH constante óptimo para la actividad
microbiana, de minerales y una solución reductora para minimizar la
concentración de oxígeno en el medio. La temperatura del sistema se
controla manteniendo la incubación en una estufa o en un baño de
agua. En algunos casos, el contenedor dispone de una válvula tipo
Bunsen para permitir la salida de los gases de fermentación
producidos (Tilley y Terry 1963), estimando la fermentación
gravimétricamente, por diferencia en función del residuo de
incubación. En otros, la fermentación se estima en función del
volumen de gas producido en el contenedor, bien a presión constante
mediante el desplazamiento del émbolo de jeringas de vidrio en las
que se realiza la incubación (Menke y col. 1979) o bien a volumen
constante, registrando los cambios de presión en una botella
cerrada (Theodorou y col. 1994). En las dos últimas décadas se han
registrado algunas variantes de este último sistema, según la
medición del gas producido sea manual (Beuvink y Spoelstra 1992;
Theodorou y col. 1994) o automática (Pell y Schofield 1993; Cone y
col. 1996; Davies y col. 2000).
La determinación de la fermentación microbiana
de los alimentos mediante la producción de gas se ha difundido por
numerosos laboratorios de alimentación animal en todo el mundo,
debido a que aporta un valor más ajustado de la fermentación que la
estimación gravimétrica y permite seguir en el tiempo la cinética
de fermentación con un elevado número de muestras. Además, los
sistemas más sencillos (Menke y col. 1979; Theodorou y col. 1994)
cuentan con la ventaja de un fácil manejo y bajo coste.
Sin embargo, estos sistemas no tienen en cuenta
el efecto del flujo de líquido y sólido sobre la eficiencia de
síntesis microbiana y la retroinhibición de la actividad
enzimática, por lo que pueden conducir a desviaciones en la
estimación de la fermentación.
En los sistemas de cultivo continuo, éste es
previamente inoculado con microorganismos, y una solución tampón se
bombea continuamente al contenedor, aunque el flujo de salida del
rumen no es realmente constante en condiciones fisiológicas. El
flujo de salida del líquido se establece por salida a través de un
filtro o por simple extravasación. El material sólido se administra
en dosis repartidas en el tiempo (Hoover y col. 1976; Teather y
Sauer 1988) o mediante introducción escalonada en bolsas de nylon,
como en el Rusitec (Czerkawski y Breckenridge 1977) o en el
Cositec, una adaptación de este último a los monogástricos (Stuck y
col. 1995). Excepto en el caso del modelo de Teather y Sauer,
basado en la estratificación del contenido del fermentador y su
salida homogénea, de forma similar a la del contenido ruminal, los
otros modelos se basan en un flujo diferente de entrada/salida de
las fases sólida y líquida para mantener estables las poblaciones
microbianas, tanto bacterias como protozoos, más sensibles a un
flujo rápido.
Sin embargo, este tipo de aparatos no son aptos
para incubaciones a corto plazo, ya que requieren varios días para
alcanzar el equilibrio. Además, para el control de cada una de las
vasijas de estos modelos de fermentación, todos ellos requieren una
bomba peristáltica para la infusión de solución líquida y salida de
efluente, un sistema de regulación constante del pH mediante
infusión de solución ácida o básica, y un sistema de agitación, de
control de temperatura y de flujo continuo de gas para mantener las
condiciones de anaerobiosis.
Además, el modelo de Hoover incluye un sistema
de alimentación de distribución automática. Estos aparatos
confieren complejidad a los sistemas, además de suponer un precio
considerable.
Basándose en que la pared ruminal es
semipermeable, algunos autores han intentado simular in
vitro las condiciones de fermentación mediante el uso de
membranas semipermeables de diálisis para el flujo diferenciado de
la fase líquida, con el fin de hacerlo más próximo a la situación
in vivo. Abe y Kumeno (1973) y Nakamura y Kurihara (1978)
desarrollaron modelos de este tipo, pero con el inconveniente de
una gran complejidad y de no poder utilizar sustratos sólidos.
Una demostración de su escasa aplicabilidad es
que estos modelos no han sido utilizados de nuevo, ni siquiera por
sus creadores.
Una versión más simple, enfocada inicialmente a
la fermentación en monogástricos, es la propuesta por Iversen y
col. (1989), aunque este modelo sólo controla el flujo de fase
líquida, y está enfocado básicamente al estudio de cambios en las
poblaciones microbianas, y no a la estimación de los procesos
fermentativos.
Para evitar los inconvenientes que estos
sistemas de cultivo continuo tienen, tanto en su capacidad de
simular las condiciones de fermentación ruminal como, sobre todo,
en su potencial de aplicación en condiciones prácticas, se
proporciona el presente sistema de fermentación in vitro.
El sistema que aquí se describe puede aplicarse
como herramienta de simulación in vitro por grupos de
investigación que mantengan líneas enfocadas al estudio del
ecosistema microbiano digestivo y los procesos de fermentación
digestiva, así como de los factores que inciden sobre ellos. Del
mismo modo, puede emplearse por laboratorios agropecuarios como
técnica rutinaria de valoración de alimentos para rumiantes,
caballos, conejos y otros herbívoros, con objeto de estimar
parámetros digestivos y rendimientos productivos del ganado, así
como por distintas empresas dedicadas a la alimentación animal,
para valorar el potencial de distintos tratamientos físicos y
químicos de los alimentos, o de aditivos incorporados en la dieta
de los herbívoros.
El sistema de fermentación in vitro con
flujo discontinuo de las fases líquida y sólida comprende al menos
una unidad de fermentación bajo condiciones, la cual está provista
en su parte superior de una primera boca, inclinada respecto del
eje de altura de la unidad. La primera boca estará provista de un
tapón/septum de goma sujeto por una rosca.
Según un primer aspecto, el sistema dispone
novedosamente de una segunda boca, situada perpendicularmente a la
base de la unidad, a través de la cual se inocula y extrae
periódicamente la fase líquida mediante un elemento tubular que la
atraviesa, introduciéndose parcialmente en dicha unidad, y que se
conecta, por su extremo situado en el exterior de la unidad, a una
válvula de dos vías, en tanto que su extremo alojado en la unidad
está provisto, adherido a él, de un medio filtrante.
La primera boca está configurada para permitir
la introducción de la fase sólida, la cual pasa directamente a la
unidad de fermentación, en una sola pesada, a fin de estimar la
cinética de fermentación microbiana con flujo de fase líquida.
Además, la primera boca es atravesada por un elemento punzante que
discurre hasta el interior de la unidad, cuyo extremo no punzante
conecta con una sonda de presión que actúa en un intervalo de
medición de presión entre 0 y 1 bar, y porque se mantiene dicha
unidad de fermentación en condiciones de incubación a una
temperatura entre 37 y 39ºC.
Según una realización opcional, el elemento
tubular se introduce hasta que su extremo alcanza el último tercio
de la altura de la unidad de fermentación.
Según otra realización, el medio filtrante
consiste en una malla de nailon.
Según otra realización, la fase sólida que pasa
a través de la primera boca puede añadirse envasado en bolsas de
nylon con un tamaño de poro similar al tamaño medio de las
partículas que salen del rumen, tal que permita el acceso de los
microorganismos al sustrato, a fin de estudiar el efecto del flujo
de las fases sólida y líquida sobre el ambiente de
fermentación.
Figura 1: representa una unidad de fermentación
completa, formada por una botella de vidrio con el medio filtrante
montado en una de sus bocas y el tapón para introducción de
substratos y muestreo de gases en la otra.
El sistema de fermentación puede fabricarse a
partir de unidades de fermentación que consisten en botellas de
vidrio pirex de 2,2 mm de grosor, de 60 mm de diámetro, de 90 a 95
cm de alto, provista de una primera boca (1) de 3-4
cm de longitud consistentes en un tubo roscado vime R18 (18 mm de
diámetro, 14 mm diámetro interno), soldado a 45º del eje de altura
de la botella y de una segunda boca (2) consistente en un tubo
roscado vime R15 (15 mm de diámetro, 11 mm de diámetro interno),
soldado perpendicular a la base de la botella. La primera boca (1)
dispondrá de un tapón de goma de butilo, fijado por una rosca de 5
mm con un taladro central.
A través de la segunda boca (2) discurrirá un
tubo de vidrio (3) de 1,5 mm de grosor, 8 mm de diámetro y 120 mm
de longitud, que termina en uno de sus extremos con un diámetro de
4 mm. El tubo (3) se sujetará a dicha boca mediante una rosca SVL
provista de una arandela de silicona revestida de PTFE, y se
sellará mediante una junta tórica de silicona.
Unos 4 cm del extremo del tubo de vidrio (3) se
introducirán en una bolsa (4) de 50 mm de longitud y 20 mm de
anchura, consistente en una malla de nylon de 150 \mum, adherida
al tubo de vidrio mediante cinta de teflón. Así, se dispone de un
medio para filtrar la fase líquida. El medio filtrante (4) adherido
al extremo del tubo de vidrio (3) se introduce en la botella hasta
alcanzar el último tercio de la botella, aproximadamente.
El extremo que queda fuera de la botella se
conectará, mediante un tubo de silicona, a una válvula de doble vía
(5) de PVC resistente a la presión provista de
entrada-salida macho-hembra tipo
"Luer". Se procurará que el tubo de silicona sea lo más corto
posible, para que no sobrepase la unión entre el extremo del tubo
de vidrio (3) y la salida macho de la válvula (5).
La incubación de las botellas se llevará a cabo
en un baño de agua con agitación.
La determinación de la presión interna de la
botella a intervalos regulares se determinará mediante un manómetro
comercial provisto de una sonda de presión (6) con intervalo de
medida entre 0 y 1 bar. La sonda del manómetro estará acoplada a
una válvula de 3 vías con salida macho tipo "Luer", a la que
se ajustará una aguja hipodérmica (7) con la que se pinchará a
través del tapón de goma de la primera boca.
La simulación del flujo de líquido se realizará
extrayendo a intervalos regulares volúmenes conocidos de líquido a
través de la válvula del filtro mediante una jeringa acoplada a su
salida hembra, y posterior introducción por la misma vía del mismo
volumen de solución de incubación.
Claims (4)
1. Sistema de fermentación in vitro con
flujo discontinuo de las fases líquida y sólida que comprende al
menos una unidad de fermentación bajo condiciones, la cual está
provista en su parte superior de una primera boca (1), inclinada
respecto del eje de altura de la unidad, caracterizado
porque dispone de una segunda boca (2), situada perpendicularmente
a la base de la unidad, a través de la cual se inocula y extrae
periódicamente la fase líquida mediante un elemento tubular (3) que
la atraviesa, introduciéndose parcialmente en dicha unidad, y que
se conecta, por su extremo situado en el exterior de la unidad, a
una válvula de dos vías (5), en tanto que su extremo alojado en la
unidad está provisto, adherido a él, de un medio filtrante (4),
mientras que dicha primera boca (1) está configurada para la
introducción de la fase sólida y para ser atravesada por un
elemento punzante (7) que discurre hasta el interior de la unidad,
cuyo extremo no punzante conecta con una sonda de presión (6) que
actúa en un intervalo de presión entre 0 y 1 bar, y porque se
mantiene dicha unidad de fermentación en condiciones de incubación
a una temperatura entre 37 y 39ºC.
2. Sistema de fermentación in vitro según
la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento
tubular (3) se introduce hasta que su extremo alcanza el último
tercio de la altura de la unidad de fermentación.
3. Sistema de fermentación in vitro según
las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el medio
filtrante (4) consiste en una malla de nailon.
4. Sistema de fermentación in vitro según
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fase
sólida que pasa a través de la primera boca (1) consiste en bolsas
de nylon porosas.
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| ES200600043A Active ES2322307B1 (es) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Sistema de fermentacion in vitro con flujo discontinuo de las fases liquida y solida. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2322307B1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022062626A1 (zh) * | 2020-09-28 | 2022-03-31 | 苏州海路生物技术有限公司 | 肠道菌群发酵气体的成分的检测方法及其仪器 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3647632A (en) * | 1968-04-11 | 1972-03-07 | Little Inc A | Apparatus for cell culture |
| EP0965632A1 (de) * | 1998-06-02 | 1999-12-22 | Büchs, Jochen, Prof. Dr.-Ing. | Anordnung zur kontinuierlichen Fermentation |
| US20050277188A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-15 | Ellis Samuel A | Fermentation flask for cultivating microorganisms |
-
2005
- 2005-12-27 ES ES200600043A patent/ES2322307B1/es active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3647632A (en) * | 1968-04-11 | 1972-03-07 | Little Inc A | Apparatus for cell culture |
| EP0965632A1 (de) * | 1998-06-02 | 1999-12-22 | Büchs, Jochen, Prof. Dr.-Ing. | Anordnung zur kontinuierlichen Fermentation |
| US20050277188A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-15 | Ellis Samuel A | Fermentation flask for cultivating microorganisms |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BARRIOS-URDANETA, A. et al. Fermentación in vitro de forrajes lignocelulósicos suplementados con distintos tipos y niveles de carbohidratos. ALPA. Noviembre 1997. Vol. 5, Suplemento 1, páginas 199-201. ISSN 1022-1301. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022062626A1 (zh) * | 2020-09-28 | 2022-03-31 | 苏州海路生物技术有限公司 | 肠道菌群发酵气体的成分的检测方法及其仪器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2322307B1 (es) | 2010-04-07 |
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| EC2A | Search report published |
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