ES2319724T3 - Tratamiento del cancer con antagonistas del receptor de endotelina. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto que es un antagonista selectivo del receptor B para endotelinas (ETB), en la fabricación de una formulación farmacéutica para prevenir y/o tratar un melanoma metastásico.
Description
Tratamiento del cáncer con antagonistas del
receptor de endotelina.
La presente invención se refiere en general al
campo de la prevención y tratamiento del cáncer. Más en particular,
la presente invención se refiere a composiciones y métodos para usar
esas composiciones para la prevención y/o el tratamiento del
melanoma metastásico.
La presente invención también se refiere a
formulaciones farmacéuticas que contienen las composiciones de la
invención.
En los Estados Unidos, el cáncer es responsable
de más de 500.000 muertes al año, un número de víctimas en segunda
posición, sólo por detrás del de las enfermedades cardiovasculares.
Las estadísticas actuales indican que aproximadamente un 30 por
ciento de los norteamericanos desarrollaran cáncer en el transcurso
de sus vidas, de los cuales aproximadamente unas dos terceras
partes fallecerán como resultado de su enfermedad.
El cáncer no es del todo conocido a nivel
molecular. Se sabe que la exposición de una célula a un carcinógeno,
como también a determinados virus, a algunos compuestos químicos o
a radiación, da lugar a una alteración del DNA que inactiva un gen
"supresor" o que activa un "oncogén". Los genes supresores
son genes reguladores del crecimiento que, después de una mutación,
ya no son capaces de controlar el crecimiento celular. Los oncogenes
son inicialmente genes normales (denominados
proto-oncogenes) que a causa de una mutación o de un
contexto de expresión alterado, se vuelven genes transformantes.
Los productos de los genes transformantes producen un crecimiento
celular incorrecto. Más de veinte genes diferentes de células
normales se pueden volver oncogenes a causa de una alteración
genética. Las células transformadas difieren de las células normales
en muchos aspectos, que incluyen la morfología celular, las
interacciones célula-célula, el contenido de las
membranas, la estructura citoesquelética, la secreción de
proteínas, la expresión génica y la mortalidad (las células
transformadas son capaces de crecer indefinidamente).
Todos los diferentes tipos de células del
organismo se pueden transformar en células tumorales benignas o
malignas. El sitio más frecuente de aparición de un tumor es el
pulmón, seguido del tracto colorrectal, mama, próstata vejiga,
páncreas y luego ovario. Otros tipos prevalentes de cáncer incluyen
leucemia, cánceres del sistema nerviosos central que incluyen
cáncer de cerebro, melanoma, linfoma, leucemia eritroide, cáncer
uterino y cáncer de cabeza y cuello.
Hoy en día el cáncer se trata principalmente con
uno, o con una combinación, de estos tres tipos de tratamientos:
cirugía, radiación y quimioterapia. Sin embargo, los resultados
obtenidos con estos tratamientos, aunque beneficiosos en el caso de
algunos cánceres, han tenido solamente un efecto marginal o no han
tenido efecto alguno en muchos otros cánceres. Además estos
tratamientos suelen estar asociados con una toxicidad
inaceptable.
Tanto la radiación como la cirugía adolecen del
mismo inconveniente teórico. Se ha admitido que, dado que una única
célula maligna es capaz de dar lugar a una progenie suficiente para
matar al individuo que la hospeda, se debe erradicar la totalidad
de la población de células neoplásicas. Véase, en líneas generales,
Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics
(Pergamon Press, 8ª edición) (págs.
1202-1204). Este concepto de "destrucción celular
total" implica que la escisión total de un tumor es necesaria en
el caso de una estrategia quirúrgica, y que la destrucción completa
de todas las células cancerosas es necesaria en una estrategia
basada en radioterapia, si una de estas estrategias quiere conseguir
la curación. En la práctica, esto raramente es posible; de hecho,
en los casos en los que hay metástasis, es imposible.
El término "quimioterapia" significa
simplemente el tratamiento de una enfermedad con sustancias
químicas. El padre de la quimioterapia, Paul Ehrlich, imaginó el
compuesto quimioterapéutico perfecto como una "bala mágica";
un compuesto quimioterapéutico de este tipo destruiría los
organismos invasores sin dañar al organismo hospedador. Esta
especificidad por la diana es la que se busca en todos los tipos de
compuestos quimioterapéuticos, que incluyen los agentes
anticancerosos.
La especificidad por la diana, sin embargo ha
constituido el principal problema de los agentes anticancerosos. En
el caso de los agentes anticancerosos, el fármaco necesita
distinguir entre las células hospedadoras que son cancerosas y las
células hospedadoras que no son cancerosas. La inmensa mayoría de
los fármacos anticancerosos no discriminan a este nivel.
Típicamente, los agentes anticancerosos tienen efectos hematológicos
negativos (p. ej., el cese de la mitosis y la desintegración de
elementos formados en el tejido medular y el tejido linfático) y
una acción inmunosupresora (p. ej., recuentos celulares
disminuidos), así como una repercusión importante sobre tejidos
epiteliales (p. ej., mucosa intestinal), tejidos reproductores (p.
ej., disfunción de la espermatogénesis) y el sistema nervioso.
Véase, P. Calabresi y B.A. Chabner. En: Goodman y Gilman, The
Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8ª
edición) (págs. 1209-1216).
Aunque se han identificado varios agentes
quimioterapéuticos y en la actualidad se usan en el tratamiento del
cáncer, se buscan nuevos agentes que sean eficaces y que exhiban una
baja toxicidad frente a las células sanas.
El documento WO 00/36918 describe una
composición farmacéutica que comprende el antagonista Ro61 tanto del
receptor A para endotelinas (ETA) como del receptor B para
endotelinas (ETB), usada en el tratamiento de células de melanoma
(página 55, líneas 23-29). El documento WO 98/41206
también describe composiciones farmacéuticas que son agonistas
tanto de ETA como de ETB (véase la tabla A de la página 38). Estos
dos documentos no describen el uso de antagonistas que inhiben ETB
de manera específica. Kikuchi y col. (Biochem. Biophys. Res.
Commun., 27 de febrero de 1996; 219(3):
734-9) describen un antagonista de ETB que inhiben
ETB de manera específica, es decir, BQ788, pero no ilustran sobre
el uso de ese compuesto para la prevención y/o tratamiento del
melanoma o de otra forma de cáncer. El documento
EP-A 0 499 266 describe péptidos que se unen a
receptores para endotelinas en animales de sangre caliente, pero
que no exhiben actividad constrictora como la de las endotelinas
(página 9, líneas 53-55). Este documento no dice
nada sobre el uso de esos compuestos en el tratamiento del cáncer.
Li M.H. y col., Journal of the American Society of
Nephrology, vol. 9, núm.. Programa y resúmenes, ejemplar de
1997, página 477a, ISSN: 1046-6673, describe el uso
de moléculas de DNA antisentido correspondientes a
ET-1. Sin embargo, estos compuestos no se usan en el
tratamiento del cáncer. Ohno A. y col., (J. Hypertens.,
agosto de 1992; 10(8): 781-785) describen que
los anticuerpos específicos contra endotelinas disminuyen la
presión sanguínea y aumentan la velocidad de filtración glomerular y
el flujo plasmático renal en ratas con hipertensión espontánea,
pero tampoco dice nada sobre el cáncer. Nelson y col., Cancer
Research, American association for Cancer Research,
Baltimore, MD, EE. UU., vol. 56, núm. 4, 15 de febrero de 1996,
páginas 663-668, ISSN:0008-5472,
describen que la expresión de ETB está disminuida en cáncer avanzado
de próstata.
Los melanomas son neoplasias malignas que son
agresivas, con frecuencia tumores metastásicos derivados de
melanocitos o de nevocitos relacionados con los melanocitos
("Cellular and Molecular Immunology" (1991), Abbas
A.K., Lichtman, A.H., Pober, J.S. (compiladores). W.B. Saunders
Company, Filadelfia: páginas 340-341). Los
melanomas aparecen muy frecuentemente en la piel de cualquier parte
del cuerpo, o en los ojos, y raras veces en las membranas mucosas
de los genitales, el ano, la cavidad bucal u otros sitios.
Los melanocitos, que son las células de la
epidermis productoras del pigmento, experimentan una transformación
maligna en el melanoma maligno. A través de sus numerosos procesos
dendríticos, los melanocitos entran en contacto con múltiples
queratinocitos, el tipo celular predominante de la epidermis. La
molécula de adhesión E-caderina media en el
contacto entre los queratinocitos y los melanocitos. I.T.
Valyi-Nagy y col., Lab. Invest., 69:
152-9 (1993); A. Tang y col., J. Cell. Sci.,
107: 983-992 (1994).
En la piel normal, los melanocitos están
restringidos a la capa basal de la epidermis, aunque sin embargo,
en el melanoma maligno, las células de melanoma crecen a través de
todas las capas de la epidermis, así como también en la dermis
subyacente. La adquisición de la capacidad invasora casi siempre va
acompañada de la regulación por disminución de la
E-caderina, que es un supresor de la invasión
tumoral. S. Vermeulen y col., Pathol. Res. Pract., 192:
694-707 (1996). Además, la pérdida de contacto con
los queratinocitos, hace que los melanocitos se desdiferencien y
expresen antígenos de superficie celular asociados con melanoma.
I.M. Shih y col., Am. J. Pathol.,145:
837-845 (1994).
Los melanomas, que constituyen aproximadamente
el tres por ciento de todos los cánceres de piel, son la principal
causa de muerte entre las enfermedades de la piel. Además, el
aumento del melanoma en todo el mundo, no es superado por ninguna
otra neoplasia, con la excepción del cáncer de pulmón en mujeres
("Cellular and Molecular Immunology" (1991). Abbas,
A.K., Lechtiman, A.H., Pober, J.S.; W.B. Saunders Company
Philadelphia, pages: 340-342; Kirkwood y
Agarwala (1993), Principles and Practice of Oncology 7:
1-16). Aún cuando el melanoma en apariencia se
localiza en la piel, hasta el 30% de los pacientes desarrollarán una
metástasis sistémica y la mayoría de ellos fallecerán (Kirkwood y
Agarwala (1993), Principles and Practice of Oncology 7:
1-16).
Durante las últimas cuatro décadas, la
incidencia del melanoma ha ido aumentando a mayor velocidad mayor
que la de otros tipos de cáncer. En el Registro Civil de
Connecticut, entre 1935 y 1939, la incidencia del melanoma era de
1,2/10^{5} personas/año; esta incidencia aumentó a 4,8/10^{5}
personas/año en 1965-1969, a 7,2/10^{5}
personas/año en 1976-1977 y a 9/10^{5}
personas/año en 1979-1980. Para el año 2000, se
espera que uno de cada 90 individuos caucasianos de los Estados
Unidos desarrolle esta enfermedad (Rigel y col., 1987, J. Am.
Acad. Dermatol. 17: 1050-1053). Además, debido
al agotamiento de la capa de ozono terrestre, la Agencia de
Protección Medioambiental ha estimado un aumento anual de 2 millones
de casos de melanoma hacia el año 2050. Aunque una proporción
creciente de los malanomas se diagnostican en una fase lo
suficientemente temprana para responder al tratamiento quirúrgico y
alcanzar una tasa de supervivencia a los diez años mayor que el
90%, se estima que más de 7.000 individuos afectados de melanoma
metastásico fallecerán cada año en los Estados Unidos.
Los melanomas presentan una elevada variabilidad
con respecto a la expresión de genes aberrantes y a las lesiones
cromosómicas pero comparten la característica común de una
independencia adquirida de factores de crecimiento del entorno, que
son necesarios para la proliferación de los melanocitos normales
(Halaban, 1991, Cancer Metastasis Rev. 10:
129-140). En la proliferación normal de los
melanocitos, así como en el crecimiento incontrolado de los
melanomas, los receptores con actividad de
tirosina-quinasa, tales como determinados receptores
para factores de crecimiento, parecen desempeñar un papel
importante (ídem; Becker y col., 1992, Oncogene 7:
2303-2313). Diversos estudios han indicado que en la
melanomagénesis pueden estar implicados varios factores de
crecimiento (Kock y col., 1991, Cancer Treat. Res. 54:
41-66; Rodeck y Herlyn, 1991, Cancer Metastasis
Rev. 10: 89-101; Rodeck y col., 1991, J.
Invest. Dermatol. 97: 20-26); esos factores de
crecimiento incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos
básico (Albino y col., 1991, Cancer Res. 51:
4815-4820; Rodeck y Herlyn, 1991, Cancer
Metastasis Rev. 10: 89-101; Dotto y col., 1989,
J. Cell Biol. 109: 3115-3128; refutado por
Yamanishi y col., 1992, Cancer Res. 52:
5024-5029); los factores alfa y beta de crecimiento
transformante (Albino y col., 1991, Cancer Res. 51: 48
5-4820; Rodeck y Herlyn, 1991, Cancer Metastasis
Rev. 10: 89-101); factor de crecimiento/factor
de dispersión hepatocitario (Halaban y col., 1992, Oncogene
7: 2195-2206); factor alfa y/o beta de necrosis
tumoral (Kimbauer y col., 1992, J. Invest. Dermatol. 98:
320-326; Krutmann y col., 1992, J. Invest.
Dermatol. 98: 923-928); factor de crecimiento
derivado de plaquetas (Rodeck y Herlyn, 1991, Cancer Metastasis
Rev. 10: 89-101); y diversas interleuquinas
(Kimbauer y col., 1992, J. Invest. Dermatol. 98:
320-326; refutado en parte por Lu y col., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 9215-9219).
En el caso de los pacientes con melanoma
metastásico no susceptible a una extirpación quirúrgica, las
opciones de tratamiento son limitadas. La
5-(3,3-dimetil-1-triazenil)-1-H-imidaz-ol-4-carboxamida
(dacarbazina, DTIC) es el agente quimioterapéutico individual más
eficaz contra el melanoma, que tiene una tasa de respuesta total
del 24%. Pero la duración de la respuesta a DTIC generalmente es
bastante escasa. Una terapia combinada con otros agentes sintéticos
y recombinantes, que incluyen
N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosourea
(carmustina, BCNU), cisplatino, tamoxifeno,
interferón-alfa (INF-\alpha) e
interleuquina-2 (IL-2), tiene una
tasa de respuesta más alta (p. ej., del 30% - 50%) en algunos
estudios, pero una tasa de respuesta completa y duradera es poco
común y la toxicidad se aumenta. La quimioterapia secuencial es
prometedora pero, evidentemente, las opciones actuales de
tratamiento para los individuos que padecen melanoma metastásico no
son satisfactorias.
Diversos fármacos derivados de productos
naturales, tales como los derivados de adriamicina (doxorrubicina),
bleomicina, etopósido y vincristina, y sus derivados, se han
sometido a ensayos para determinar su eficacia contra el melanoma,
tanto como agentes individuales como en una terapia combinada. Sin
embargo, al igual que sucede con los compuestos sintéticos o
recombinantes, estos compuestos exhiben índices de respuesta bajos,
respuestas completas transitorias y toxicidades elevadas.
Por lo tanto, la literatura científica es
diversa y en ocasiones contradictoria en lo que respecta a la
génesis y progresión del melanoma, así como al tratamiento de los
melanomas. Además, no se conoce bien qué factores están implicados
en la iniciación de los eventos que conducen al melanoma, a
diferencia de los que intervienen en la progresión de la
enfermedad.
En endotelio vascular libera diversas sustancias
vasoactivas, que incluyen el péptido vasoconstrictor derivado del
endotelio, endotelina (ET) (véanse, E. Vanhoutte y col., (1986)
Annual Rev. Physiol. 48: 307-320; Furchgott
y Zawadski (1980) Nature 288: 373-376). La
ET, que se identificó por primera vez en el sobrenadante de un
cultivo de células endoteliales de aorta porcina (véase, Yanagisawa
y col., (1988) Nature 332: 411-415), es un
potente péptido vasoconstrictor de veintiún aminoácidos. Es uno de
los más potentes vasodepresores conocidos y la producen numerosos
tipos de células, que incluyen las células de endotelio, tráquea,
riñón y cerebro. La ET se sintetiza en forma de un precursor de
doscientos tres aminoácidos, la preproendotelina, que contiene una
secuencia señal que es escindida por una proteasa endógena para
producir un péptido de treinta y ocho aminoácidos (humano) o de
treinta y nueve aminoácidos (porcino). Este intermediario,
denominado ET grande, es procesado in vivo para dar lugar a
la forma madura biológicamente activa, por acción de una enzima
putativa covertidora de ET (ECE) que parece ser una proteasa neutra
dependiente de metal (véase, p. ej., Kashiwabara y col. (1989)
FEBS Lettrs. 247: 73-76). La escisión de la
ET grande se requiere para la inducción de respuestas fisiológicas
(véase, p. ej., von Geldem y col. (1991) Peptide Res. 4:
32-35). En células de endotelio aórtico porcino, el
intermediario ET grande de treinta y nueve aminoácidos es
hidrolizado en el enlace Trp^{21}-Val^{22} para
generar ET-1 y un fragmento
C-terminal. Una escisión similar tiene lugar en
células humanas en un intermediario de treinta y ocho aminoácidos.
Se han identificado tres isopéptidos de ET diferentes,
ET-1, ET-2 y ET-3,
que exhiben una potente actividad vasoconstrictora.
La familia de los tres isopéptidos
ET-1, ET-2 y ET-3
está codificada por una familia de tres genes (véase, Inoue y col.
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
2863-2867; véase también, Saida y col. (1989) J.
Biol. Chem. 264: 14613-14616). Las secuencias de
nucleótidos de los tres genes humanos están muy conservadas dentro
de la región que codifica los péptidos maduros de 21 aminoácidos y
las porciones C-terminales de los péptidos son
idénticas.
La liberación de ET por células endoteliales en
cultivo está modulada por diversos estímulos físicos y químicos y
parece estar regulada a nivel de transcripción y/o a nivel de
traducción. La expresión del gen que codifica ET-1
se incrementa por acción de estímulos químicos, que incluyen
adrenalina, trombina y el ionóforo de Ca^{2+}. La producción y
liberación de ET por el endotelio es estimulada por angiotensina II,
vasopresina, endotoxina, ciclosporina y otros factores (véase,
Brooks y col. (1991) Eur. J. Pharm.
194:115-117) y es inhibida por óxido nítrico. Las
células endoteliales se ha mostrado que secretan factores de
relajación derivados del endotelio (EDRF) de vida corta, que
incluyen óxido nítrico o sustancias relacionadas (Palmer y col.
(1987) Nature 327: 524-526), cuando son
estimuladas con agentes vasoactivos, tales como acetilcolina y
bradiquinina. La vasoconstricción inducida por ET es así mismo
atenuada por acción del péptido natriurético atrial (ANP).
Los péptidos de ET exhiben numerosas actividades
biológicas in vitro e in vivo. ET provoca una potente
y mantenida vasoconstricción in vivo en ratas y en
preparaciones aisladas de músculo liso vascular; también provoca la
liberación de eicosanoides y del factor de relajación derivado de
endotelio (EDRF) desde lechos vasculares perfundidos. La
administración intravenosa de ET-1 y su adición
in vitro a tejidos vasculares y a otros tejidos de músculo
liso producen efectos depresores de larga duración y contracción,
respectivamente (véase, E., Bolger y col. (1991) Can. J.
Physiol. Pharmacol. 69: 406-413). En segmentos
vasculares aislados, por ejemplo, la ET-1 es un
potente agente contráctil (EC_{50} = 4 x 10^{-10} M), de acción
lenta pero persistente. In vivo, una dosis única eleva la
presión sanguínea en aproximadamente de veinte a treinta minutos.
La vasoconstricción inducida por ET no se ve afectada por acción de
antagonistas de neurotransmisores conocidos ni por factores
hormonales, pero es suprimida por acción de antagonistas de los
canales de calcio. El efecto de los antagonistas de los canales de
calcio, sin embargo, es muy probablemente el resultado de la
inhibición de la entrada de calcio, ya que la entrada de calcio se
ha mostrado que se requiere para una respuesta contráctil de larga
duración a ET.
La ET-1, que también es
secretada por los queratinocitos, estimula la proliferación,
quimiotaxis y producción de pigmento en melanocitos y células de
melanoma. G. Imokawa y col., Biochem. J., 314:
305-12 (1996). Además, la radiación ultravioleta
(UVR), que está implicada en la formación de los melanomas, induce
un notable aumento de la secreción de ET-1 por
parte de los queratinocitos. G. Imokawa y col., J. Biol.
Chem., 267: 24675-80 (1992).
La ET también media en la liberación de renina e
induce una acción inotrópica positiva en aurículas de cobaya. En
los pulmones, ET-1 actúa como un potente
broncoconstrictor (Maggi y col. (1989) Eur. J. Pharmacol.
160: 179-182). La ET aumenta la resistencia vascular
renal, disminuye el flujo de sangre al riñón, y disminuye el índice
de filtrado glomerular. Es un potente mitógeno de las células
mesangiales glomerulares y pone en marcha la cascada de los
fosfoinosítidos en esas células (Simonson y col., (1990) J. Clin.
Invest. 85: 790-797).
Existen sitios de unión de alta afinidad
(constantes de disociación en el intervalo de 2 x 10^{-10} M - 6 x
10^{-10} M) específicos para las ET en el sistema vascular y en
otros tejidos, que incluyen intestino, corazón, pulmones, riñones,
bazo, glándulas adrenales y cerebro. La unión no es inhibida por
catecolaminas, péptidos vasoactivos, neurotoxinas o antagonistas de
los canales de calcio. ET se une e interacciona con sitios de
receptores que son distintos de otros receptores autonómicos y de
canales de calcio dependientes de voltaje. Estudios de unión
competitiva indican que existen múltiples clases de receptores con
diferentes afinidades para los isopéptidos de ET. Las
sarafotoxinas, grupo de toxinas peptídicas procedentes del veneno de
la serpiente Atractaspis eingadensis, que producen
vasoespasmo coronario grave en las víctimas de la mordedura de la
serpiente, poseen una homología estructural y funcional con la
ET-1, y se unen de manera competitiva a los mismos
receptores en la membrana cardíaca (Kloog y col. (1989) Trends
Pharmacol. Sci. 10: 212-214).
Se han identificado dos receptores distintos
para ET, denominados ETA y ETB, y se han aislado clones de DNA que
codifican cada uno de estos receptores (Arai y col., (1990)
Nature 348: 730-732; Sakurai y col., (1990)
Nature 348: 732-735). Sobre la base de las
secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por el DNA
clonado, se observa que cada receptor contiene siete dominios que se
extienden por la membrana y exhibe similitudes estructurales con
las proteínas de membrana acopladas a proteína G. El RNA mensajero
que codifica estos dos receptores se ha detectado en diversos
tejidos, que incluyen corazón, pulmón, riñón y cerebro. La
ET-1 se une con igual afinidad a ambos receptores
para ET. H.Y. Kang, y col., Pflugers Arch., 435:
350-6 (1998).
La distribución de los subtipos de los
receptores es específica de tejido (Martin y col., (1989)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 162:
130-137). Los receptores ETA se ha observado que son
selectivos para ET-1 y predominan en tejidos
cardiovasculares. Los receptores ETB predominan en tejidos no
cardiovasculares, que incluyen el sistema nervioso central y el
riñón, e interaccionan con los tres isopéptidos de ET (Sakurai y
col., (1990) Nature 348: 732-734). Además,
los receptores ETA se encuentran en músculo vascular liso, están
relacionados con vasoconstricción y se les ha asociado con
enfermedades cardiovasculares, renales y del sistema nervioso
central; en cambio los receptores ETB están situados sobre el
endotelio vascular, están relacionados con vasodilatación
(Takayanagi y col., (1991) FEBS Lttrs. 282:
103-106) y se les ha asociado con trastornos
broncoconstrictores. Además, los dos receptores para ET son
expresados por los melanocitos, mientras que la mayoría de los
melanomas expresan únicamente ETB.
En virtud de la distribución de los tipos de
receptores y de la afinidad diferencial de cada isopéptido por cada
tipo de receptor, la actividad de los isopéptidos de ET varía en los
diferentes tejidos. Por ejemplo, ET-1 inhibe la
unión de ET-1 marcado con ^{125}I en tejidos
cardiovasculares, de cuatrocientas a setecientas veces más
potentemente que ET-3. La unión de
ET-1 marcado con ^{125}I en tejidos no
cardiovasculares, tales como riñón, glándula adrenal y cerebelo, es
inhibida en la misma medida por ET-1 y por
ET-3, lo que indica que los receptores ETA
predominan en tejidos cardiovasculares y que los receptores ETB
predominan en tejidos no cardiovasculares.
Los niveles plasmáticos de ET están elevados en
determinadas enfermedades (véanse, p. ej., la solicitud
internacional PCT, documento WO 94/27979, y la Patente de EE. UU.
núm. 5.382.569). Los niveles plasmáticos de ET-1 en
individuos sanos, medidos mediante radioinmunoensayo (RIA) (del
inglés, " RadioImmunoAssay"), son
aproximadamente de 0,26 pg/ml - 5 pg/ml. Los niveles en sangre de
ET-1 y de su precursor, la ET grande, están elevados
en choque, infarto de miocardio, angina vasoespástica, fracaso
renal y en diversos trastornos del tejido conjuntivo. En pacientes
que están sometidos a hemodiálisis o trasplante de riñón, o que
padecen de choque cardiogénico, infarto de miocardio o hipertensión
pulmonar, se han observado niveles tan altos como de 35 pg/ml
(véase, Stewart y col., (1991) Annals Internal Med. 114:
464-469). Debido a que es probable que la ET sea un
factor regulador local, más que un factor regulador sistémico, es
probable que los niveles de ET en la interfase
endotelio-músculo liso sean mucho más altos que los
niveles circulantes.
También se han medido niveles elevados de ET en
pacientes que padecen enfermedad isquémica cardíaca (Yasuda y col.
(1990) Amer. Heart J. 119: 801-806, Ray y
col. (1992) Br. Heart J. 67: 383-386). La
inmunorreactividad de la ET tisular y circulante aumenta más del
doble en pacientes con ateroesclerosis avanzada (Lerman y col.,
(1991) New Engl. J. Med. 325: 997-1001). El
aumento de inmunorreactividad de ET también se ha asociado con la
enfermedad de Buerger (Kanno y col. (1990) J. Amer. Med.
Assoc. 264: 2868) y con el fenómeno de Raynaud (Zamora y col.
(1990) Lancet 336: 1144-1147). Se observaron
niveles aumentados de la ET circulante en pacientes que habían
experimentado una angioplastia coronaria transluminal percutánea
(PTCA) (Tahara y col. (1991) Metab. Clin. Exp. 40:
1235-1237; Sanjay y col. (1991) Circulation
84(Supl. 4): 726), y en individuos (Miyauchi y col. (1992)
Jpn. J. Pharmacol. 58: 279P; Stewart y col., (1991) Ann.
Internal Medicine 114:464-469) con hipertensión
pulmonar.
Debido a que la ET está asociada con
determinadas enfermedades y está implicada en numerosos efectos
fisiológicos, los compuestos que pueden interferir con, o que
pueden potenciar, actividades asociadas con ET, tales como la
actividad de interacción con los receptores para ET, y la actividad
vasoconstrictora, son compuestos de interés. Se han identificado
compuestos que exhiben una actividad antagonística de ET. Por
ejemplo, un producto resultante de la fermentación de
Streptomyces misakiensis, designado
BE-18257B, se ha identificado como antagonista del
receptor ETA. BE-18257B es un pentapéptido cíclico,
ciclo(D-Glu-L-Ala-allo-D-Ile-L-Leu-D-Trp),
que inhibe la unión de ET-1 marcado con ^{125}I
en tejidos cardiovasculares, de una manera dependiente de la
concentración (IC_{50} 1,4 \muM en músculo liso de aorta, 0,8
\muM en membranas ventriculares y 0,5 \muM en células en
cultivo de músculo liso de aorta), pero que no es capaz de inhibir
la unión a receptores en tejidos en los que los receptores ETB
predominan en concentraciones hasta 100 \muM. Se han sintetizado
pentapéptidos cíclicos relacionados con BE-18257B,
tales como el
ciclo(D-Asp-Pro-D-Val-Leu-D-Trp)
(BQ-123), y se ha demostrado que exhiben actividad
como antagonistas del receptor ETA (véase, la Patente de EE. UU.
núm. 5.114.918 concedida a Ishikawa y col.; véase también, el
documento EP A1 0 436 189, concedido a BANYU PHARMACEUTICAL CO.,
LTD (7 de octubre de 1991)). Estudios que miden la inhibición
producida por estos péptidos cíclicos, de la unión de
ET-1 a receptores específicos de ET, indican que
estos péptidos cíclicos se unen preferentemente a los receptores
ETA. Se han identificado otros antagonistas peptídicos y no
peptídicos de ETA (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. núms.
5.352.800, 5.334.598, 5.352.659, 5.248.807, 5.240.910, 5.198.548,
5.187.195, 5.082.838). Estos otros antagonistas peptídicos y no
peptídicos de ETA incluyen otros pentapéptidos cíclicos,
aciltripéptidos, análogos de hexapéptidos, determinados derivados de
antraquinona, ácidos indanocarboxílicos, determinadas
N-pirimidinilbencenosulfonamidas, determinadas
bencenosulfonamidas y determinadas naftalenosulfonamidas (Nakajima
y col., (1991) J. Antibiot. 44: 1348-1356;
Miyata y col. (1992) J. Antibiot. 45: 74-8;
Ishikawa y col. (1992) J.Med. Chem.
35:2139-2142; Patente de EE. UU. núm. 5.114.918
concedida a Ishikawa y col.; documento EP A1 0 569 193; documento EP
A1 0 558 258; documento EP A1 0 436 189 concedido a BANYU
PHARMACEUTICAL CO., LTD (7 de octubre de 1991); solicitud de
Patente canadiense 2.067.288; solicitud de Patente canadiense
2.071.193; Patente de EE. UU. núm. 5.208.243; Patente de EE. UU.
núm. 5.270.313; Patente de EE. UU. núm. 5.464.853; Cody y col.,
(1993) Med. Chem. Res. 3: 154-162; Miyata y
col., (1992) J. Antibiot. 45: 1041-1046;
Miyata y col., (1992) J. Antibiot. 45:
1029-1040, Fujimoto y col., (1992) FEBS
Lett. 305: 41-44; Oshashi y col., (2002) J.
Antibiot. 45: 1684-1685; documento EP A1 0 496
452; Clozel y col. (1993) Nature 365:
759-761; solicitud de Patente internacional
WO93/08799; Nishikibe y col., (1993) Life Sci. 52:
717-724; y Benigni y col., (1993) Kidney Int.
44: 440-444). En general, los compuestos
identificados poseen actividades en ensayos in vitro como
antagonistas de ETA a concentraciones del orden de aproximadamente
50 \muM - 100 \muM o menores. También se ha demostrado que
varios de esos compuestos poseen actividad in vivo en modelos
animales. Se han identificado muy pocos antagonistas selectivos de
ETB.
Se ha admitido que los compuestos que exhiben
actividad a concentraciones IC_{50} o EC_{50} del orden de
10^{-4} o inferiores en ensayos estándar in vitro que
determinan la actividad de agonista o antagonista de ET, poseen
utilidad farmacológica (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU.
núms. 5.352.800, 5.334.598, 5.352.659, 5.248.807, 5.240.910,
5.198.548, 5.187.195, 5.082.838). En virtud de esta actividad, estos
compuestos son considerados útiles para el tratamiento de la
hipertensión, tal como en el fracaso circulatorio periférico, de
enfermedades coronarias tales como la angina de pecho, de
cardiomiopatías, arteriosclerosis, infarto de miocardio,
hipertensión pulmonar, vasoespasmo, reestenosis vascular, enfermedad
de Raynaud, embolia cerebral tal como en el espasmo arterial
cerebral, isquemia cerebral, espasmo cerebral en fase tardía,
posterior a una hemorragia subaracnoidea, asma, broncoconstricción,
fracaso renal, en particular el fracaso renal
post-isquémico, nefrotoxicidad causada por
ciclosporina como en el fracaso renal agudo, colitis, así como otras
enfermedades inflamatorias, choque endotóxico causado por, o
asociado con, ET y otras enfermedades en las que se ha implicado a
ET.
A la vista de los numerosos efectos fisiológicos
de la ET y de sus asociación con determinadas enfermedades, se
piensa que la ET desempeña un papel crítico en estos estados
patofisiológicos (véase, p. ej., Saito y col. (1990)
Hypertension 15: 734-738; Tomita y col.
(1989) N. Engl. J. Med. 321: 1127; Kurihara y col. (1989)
J. Cardiovasc. Pharmacol. 13(suplemento 5):
S13-S17; Doherty (1992) J. Med. Chem. 35:
1493-1508; Morel y col. (1989) Eur. J.
Pharmacol. 167: 427-428). Un conocimiento más
detallado de la función y estructura de la familia de péptidos de
ET, proporcionaría una nueva percepción en la progresión y
tratamiento de estos estados.
Para contribuir a obtener una mejor comprensión
de, y para desarrollar los tratamientos para, los trastornos
mediados o relacionados con ET, es necesario identificar los
compuestos que modulan o alteran la actividad de ET. La
identificación de compuestos que modulan la actividad de ET, tales
como los que actúan como antagonistas o agonistas específicos,
puede no solamente ayudar a dilucidar la función de ET, sino que
pueden dar lugar a compuestos terapéuticamente útiles. En
particular, los compuestos que interfieren de manera específica con
la interacción de los péptidos de ET y los receptores ETA o ETB,
podrían ser útiles para identificar características esenciales de
los péptidos de ET, ayudarían en el diseño de agentes terapéuticos y
pueden ser útiles como agentes terapéuticos específicos de
enfermedades.
In vivo, la adhesión
célula-célula desempaña un importante papel en una
amplia variedad de eventos que incluyen la morfogénesis y la
formación de órganos, la modulación del sistema inmunitario, la
formación de uniones entre células y la metástasis e invasión de
tumores. Además de esto, la adhesión célula-célula
es crucial para el mantenimiento de la integridad de los tejidos,
p. ej., de la barrera del epitelio intestinal, de la barrera
hemato-encefálica y del músculo cardíaco.
La adhesión intercelular está mediada por
moléculas de adhesión específicas del tipo de célula. Las moléculas
de adhesión se han clasificado en al menos tres superfamilias que
incluyen la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), la
superfamilia de las integrinas y la superfamilia de las caderinas.
Todos los tipos celulares que forman tejidos sólidos expresan
algunos miembros de la superfamilia de las caderinas, lo que sugiere
que las caderinas están implicadas en la adhesión selectiva de la
mayoría de los tipos de células.
Las caderinas se han descrito de modo general
como proteínas glicosiladas, integrales de membrana, que poseen un
dominio extracelular N-terminal que determina la
especificidad de unión, (los 113 aminoácidos
N-terminales parecen estar directamente implicados
en la unión), un dominio hidrófobo que se extiende por la membrana y
un dominio citoplásmico C-terminal (altamente
conservado entre los miembros de esta superfamilia) que interacciona
con el citoesqueleto a través de las cateninas y de otras proteínas
asociadas con el citoesqueleto. Algunas caderinas carecen sin
embargo de dominio citoplásmico, y se ha visto que actúan en la
adhesión célula-célula a través de un mecanismo
diferente al de las caderinas que sí poseen dominio citoplásmico. El
dominio citoplásmico se requiere para la función de unión del
dominio extracelular de las caderinas que sí poseen un dominio
citoplásmico. Las uniones entre miembros de la familia de las
caderinas expresadas en diferentes células es principalmente de
carácter homófilo (es decir, un miembro de la familia de las
caderinas se une a caderinas de su propia subclase o de una
subclase estrechamente relacionada) y es dependiente de
Ca^{2+}.
Las primeras caderinas descritas
(E-caderina de células epiteliales de ratón,
L-CAM de hígado aviar, uvomorulina de blastocisto
de ratón y CAM 120/80 de células epiteliales humanas) se
identificaron por su participación en la adhesión celular
dependiente de Ca^{2+}, y por sus características inmunológicas
particulares y su localización en tejidos. Con la posterior
identificación inmunológica de la N-caderina, de la
que se encontró que tenía una distribución tisular diferente de la
de la E-caderina, se evidenció que se había
descubierto una nueva familia de moléculas de adhesión
célula-célula, dependiente de Ca^{2+}.
La clonación molecular de los genes que
codifican la E-caderina de ratón (véase Nagafuchi y
col., Nature, 329: 341-343 (1987)), la
caderina de pollo (Hatta y col., J. Cell Biol., 106:
873-881 (1988)) y la P-caderina de
ratón (Nose y col., EMBO J. 6: 3655-3661
(1987)), proporcionó la evidencia estructural de que las caderinas
comprendían una familia de moléculas de adhesión celular. La
clonación de la L-CAM de pollo (Gallin y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2808-2812
(1987)) y de la uvomorulina de ratón (Ringwald y col., EMBO
J., 6: 3647-3653 (1987)) reveló que eran
idénticas a la E-caderina. Las comparaciones de las
secuencias de aminoácidos de la E-caderina,
N-caderina y P-caderina mostró un
nivel de similitud de las secuencias de aminoácidos de
aproximadamente 45% - 58% entre las tres subclases.
La determinación de la expresión en tejidos de
las diferentes caderinas revela que cada subclase de caderinas
presenta un patrón particular de distribución en tejidos. Por
ejemplo, la E-caderina se encuentra en tejidos
epiteliales mientras que la N-caderina se encuentra
en tejidos no epiteliales tales como el tejido nervioso y el
tejido muscular. El patrón de expresión particular de las diferentes
caderinas es particularmente importante cuando se considera el
papel que cada una de las subclases de caderinas puede desempeñar
in vivo en eventos normales (p. ej., el mantenimiento de la
barrera epitelial intestinal) y en eventos anormales (p. ej.,
metástasis tumoral o inflamación).
También se ha implicado la supresión de la
función de las caderinas en la progresión de diversos cánceres.
Véase Shimoyama y col., Cancer Res., 52:
5770-5774 (1992). De hecho, se ha demostrado que la
E-caderina es un supresor de la invasión tumoral.
M.Y. Hsu y col., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 1:
188-94 (1996). Además, se ha encontrado que la
pérdida de expresión de la E-caderina (asociada a la
membrana) está correlacionada con: la metástasis del carcinoma de
células escamosas en nódulos linfáticos (J.H. Schipper y col.,
Cancer Research 1991, 51: 6328-6337); la
desdiferenciación de meningiomas (Y. Tohma y col., Cancer
Research, 1992, 52: 1981-1987); un grado de
Gleason elevado de carcinomas de próstata (R. Umbas y col.,
Cancer Research, 1992, 52: 5104-5109); un
crecimiento infiltrativo del carcinoma de células basales (A.
Pizarro y col., Breast J. Cancer, 1994, 69:
157-162); desdiferenciación y metástasis de
carcinoma de mama (C. Gamallo y col., American Journal of
Pathology, 1993, 142: 987-993; R. Moll y col.,
American Journal of Pathology, 1993, 143:
1731-1742; H. Oka y col., Cancer Research,
1993, 53: 1696-1701); desdiferenciación, estadio de
Dukes elevado y metástasis de carcinoma de colón (S. Dorudi y col.,
American Journal of Pathology, 1993, 142:
981-986; A.R. Kinsela y col., Cancer
Research, 1994, 67: 904-909); un mal pronóstico
del cáncer de vejiga (en combinación con gp78) (T. Otto y col.,
Cancer Research, 1994, 54: 3120-3123);
desdiferenciación de carcinoma de tiroides (C. Brabant y col.,
Cancer Research, 1993, 53: 4987-4993); y
estadio avanzado y de alto grado de carcimoma pancreático, con
metástasis en nódulos linfáticos (M. Pignatelli y col., Journal
of Pathology, 1994, 174:243-248).
Recientemente, se ha demostrado que la
E-caderina se expresa en melanocitos en cultivo, en
los que media en la adhesión a queratinocitos. Danen y col., 1996,
Mel. Res., 6: 127-131. La pérdida de contacto
con queratinocitos hace que los melanocitos se desdiferencien y
expresen antígenos de superficie celular asociados a melanoma. I.M.
Shih y col., Am. J. Pathol., 145: 837-45
(1994). Además, la adquisición de capacidad invasora de los
melanocitos va casi siempre acompañada por la regulación por
disminución de la E-caderina. Además, la expresión
de la E-caderina está disminuida en la mayoría de
las líneas celulares de melanoma. Por lo tanto, el contacto celular
entre melanocitos y queratinocitos, mediado por
E-caderina, puede ser crítico para el mantenimiento
del fenotipo normal de los melanocitos.
Las cateninas se han clasificado en \alpha,
\beta y \gamma sobre la base de sus movilidades electroforéticas
(The EMBO Journal, 8, págs. 1711-1717
(1989)). Las cateninas son proteínas citoplásmicas que son críticas
para la función de la E-caderina en la adhesión
celular. J.M. Daniel y col., Bioessays, 19:
883-91 (1997). Se unen a la región citoplásmica de
las caderinas y actúan para modular la adhesión y/o para unir las
caderinas al citoesqueleto de actina. Las cateninas transmiten una
señal de adhesión y anclan la caderina al citoesqueleto de actina.
Las caderinas clásicas, E, N y P, se unen directamente a la
\beta-catenina. Estas caderinas, a su vez, se
asocian con la proteína \alpha-catenina, similar a
la vinculina, que se piensa que une los complejos con caderina al
citoesqueleto de actina, ya sea mediante interacción directa o
indirectamente a través de la \alpha-actinina.
Daniel y col., 1997, BioEssays, 19(10):
883-891. Por lo tanto, la alteración de la función
de caderinas/cateninas podría ser esencial en numerosas enfermedades
asociadas con un descenso de la unión de las caderinas.
Las caspases, que son proteasas más conocidas
por su papel en la muerte celular apoptósica, se conocen también
por participar en procesos inflamatorios. Varios estudios han
demostrado recientemente que proteasas pertenecientes a la familia
de las caspasas son capaces de escindir la
\beta-catenina con una regulación por disminución
concomitante de la E-caderina.
Las caspasas se activan en una cascada en serie
que comienza con las caspasas apicales, tales como la caspasa 8,
que activan luego a las caspasas distales, tales como las caspasas 3
y 7, las cuales ejecutan la muerte celular apoptósica a través de
la escisión de diversos sustratos celulares críticos. La caspasa 8
puede escindir directamente proteínas cateninas o puede activar
otras caspasa(s) aún no identificadas que escinden proteínas
cateninas, y esta escisión probablemente da lugar a una
desestabilización y alteración de los complejos
E-caderina:catenina situados en la membrana
plasmática. De hecho, se ha demostrado que la escisión llevada a
cabo por las caspasas impide la interacción de la
\beta-catenina con la
\alpha-catenina, sirviendo esta última para anclar
el complejo E-caderina:catenina al citoesqueleto de
actina.
Por lo tanto, la activación de las caspasas
puede desempeñar un papel en la regulación por disminución y en la
desestabilización de los complejos caderinas:cateninas. Además,
según se ha tratado en lo que antecede, la regulación por
disminución de los complejos caderinas-cateninas
puede desempeñar un papel en la progresión de diversos
cánceres.
La presente invención se refiere al tratamiento
y prevención del melanoma metastásico. Lo que se reivindica es el
uso de un compuesto que es un antagonista selectivo del receptor B
para endotelinas (ETB), en la fabricación de una formulación
farmacéutica para prevenir y/o tratar un melanoma metastásico.
La invención se basa, en parte, en el
descubrimiento sorprendente de los solicitantes, de que el péptido
ET-1 de 21 aminoácidos, que es sintetizado y
secretado por los queratinocitos en respuesta a la radiación
ultravioleta (UVR), y su receptor presente sobre los melanocitos,
conocido como receptor B para endotelinas (ETB), son componentes
clave que inician el desarrollo de un cáncer, y específicamente, de
un melanoma. Los datos aquí presentados por los solicitantes,
demuestran que el bloqueo de ETB con antagonistas, o con formas
inactivas de ET-1, inhibe los eventos tempranos
asociados con el desarrollo del melanoma.
En particular, los ejemplos prácticos,
infra, demuestran que la ET-1 ejerce una
regulación por disminución las proteínas
E-caderina, p120^{CTN} y
\beta-catenina en melanocitos y en células de
melanoma a través de la activación del ETB. Los datos también
demuestran que ET-1 activa de manera transitoria la
caspasa-8 y que la inhibición de la actividad de
caspasa-8 bloquea la regulación por disminución de
las proteínas E-caderina y catenina ejercida por
ET-1. Además, los ejemplos prácticos muestran que
ET-1 no es capaz de activar las caspasas 3 y 7 y no
induce apoptosis, pero sin embargo, sí induce una total alteración
morfológica de los melanocitos y la pérdida de los contactos
normales célula:célula. Por último, los ejemplos demuestran que la
expresión de ET-1 inducida por UVR en
queratinocitos, promueve el desarrollo de neoplasias melanocíticas
inducidas por UVR, a través de la regulación por disminución de la
E-caderina, a supresor de la invasión tumoral.
La presente invención abarca diversos métodos y
compuestos que están dirigidos a las actividades de ETB. En
particular, estos compuestos incluyen, pero no se limitan a,
antagonistas de ETB y formas peptídicas inactivas de
ET-1 (compuestos miméticos de ET-1),
que se unirían a ETB, pero que no activarían el receptor para
iniciar la cascada que conduce a los eventos tempranos asociados
con el desarrollo del melanoma. La invención abarca antagonistas de
ETB conocidos y compuestos miméticos de ET-1. Los
ejemplos de esos compuestos incluyen, pero no se limitan a, todas
las composiciones de proteínas, RNA obtenidos con la metodología de
SELEX, inhibidores de moléculas pequeñas, moléculas antisentido y
ribozimas. Los antagonistas específicos y conocidos de ETB
incluyen, pero no se limitan a, IRL-1038 (Urade y
col., 1992, FEBS Lett., 311: 12-16), BQ788
(Karaki y col., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun., 205:
168-173),
RES-701-1 (Kohzuma y col.,
1994, Neuroreport, 5: 2653-2656),
PD-142893 (Nishiyama y col., 1995, J.
Pharmacol. Japón, 69: 391) y H-3596 (Shibata y
col., 1996, Peptide Chemistry 1995, Proc. of the 33rd
Symp. on Peptide Chem., Sapporo, Japón, página 281).
Ejemplos de compuestos miméticos de ET-1 incluyen,
pero no se limitan a [Ala^{3,11,18},
Nle^{7}]-ET-1 (Hunt y col., 1991,
Biorganic and Medic. Chem. Lett., 1: 33),
ET-1 (11-21) (Urade y col., 1992,
FEBS Lett., 311:12),
ciclo(-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-\beta-Asp)-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Trp-OH
(Tanaka y col., 1994, Mol. Pharmacol., 45: 724 y
ciclo(-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-\beta-Asp)-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH
(Shibata y col., 1996, Peptide Chemistry 1995, Proc. of
the 33rd Symp. on Peptide Chem., Sapporo, Japón, página
281).
La presente invención también se refiere a
inhibidores de efectores aguas abajo de compuestos que están
implicados en la cascada que conduce al desarrollo del melanoma.
Ejemplos de esos efectores son las caspasas, las cateninas y las
caderinas. Ejemplos de esos compuestos incluyen, pero no se limitan
a, todas las composiciones de proteínas, RNA obtenidos con la
metodología de SELEX, inhibidores de moléculas pequeñas, moléculas
antisentido, ribozimas, péptidos y bloqueadores de proteasas. Los
inhibidores específicos de las caspasas conocidas incluyen, pero no
se limitan a, cualquiera de los péptidos o proteínas que tienen las
siguientes secuencias: (a) IETD, (b) DEVD, (c) AEVD, (d) WEHD, (e)
VAD y (f) FLIPs (Scaffidi y col., 1999, J. Biol. Chem., 3:
1541-1548).
En otra realización de la invención, se pueden
usar estrategias de terapia génica en la práctica de la invención.
Aunque en los métodos y composiciones de la presente invención se
puede usar un número cualquiera de secuencias de DNA, las
secuencias de DNA preferidas son las que codifican productos
traduccionales (es decir, proteínas) o productos transcripcionales
(es decir, moléculas antisentido o ribozimas) que (a) inhiben el ETB
o (b) son capaces de interrumpir la progresión de la iniciación del
cáncer (es decir, del melanoma). Por ejemplo, el DNA puede
comprender genes que codifican proteínas terapéuticamente útiles
tales como factores de crecimiento, citoquinas, hormonas, etc.
Adicionalmente, el DNA puede codificar moléculas antisentido o
moléculas de ribozima que pueden inhibir la traducción de los mRNA
que codifican proteínas que están implicadas en la iniciación de un
cáncer. En otra realización de la invención, efectores aguas arriba
y aguas abajo que están implicados en la cascada que conduce al
desarrollo del melanoma, pueden ser el objetivo a través de
estrategias de terapia génica para inhibir el cáncer.
La presente invención se refiere además a
anticuerpos que reconocen específicamente uno o más epítopos de ETB
o de ET-1. La presente invención se refiere también
a anticuerpos que reconocen específicamente compuestos efectores
que son críticos para la cascada que conduce al desarrollo del
cáncer.
La presente invención se refiere además a
ensayos de escrutinio para identificar compuestos que inhiben la
activación de ETB y/o efectores que son críticos en la cascada que
conduce a la iniciación del cáncer o a una metástasis.
La invención se ilustra por medio de ejemplos
prácticos que demuestran que ET-1 y ETB son
componentes clave que inician el desarrollo del melanoma. Los
ejemplos prácticos de la invención también demuestran la cascada de
eventos que conduce al desarrollo del melanoma. Los ejemplos de
trabajo de la presente invención demuestran además la capacidad de
los inhibidores de la activación de ETB para inhibir los eventos
tempranos asociados con el desarrollo del melanoma.
Según aquí se usa, el término "melanoma"
incluye, pero no se limita a, melanomas, melanomas malignos,
melanomas metastásicos, melanomas derivados de melanocitos o de
melanocitos relacionados con nevocitos, melanocarcinomas,
melanoepiteliomas, melanosarcomas, melanomas amelanóticos, melanomas
desmoplásicos malignos, melanomas con halo, melanomas in
situ, melanomas de extensión superficial, melanomas nodulares,
melanomas sobre lentigo maligno, melanomas acrolentiginosos,
melanomas subungueales, melanomas de desviación mínima, melanomas
invasivos o síndrome familiar de mola atípica y melanoma
(FAM-M). Esos melanomas en mamíferos pueden estar
causados por anormalidades cromosómicas, crecimiento degenerativo y
trastornos embrionarios, agentes mitogénicos, radiación
ultravioleta (UVR), infecciones víricas, expresión inadecuada de un
gen en tejidos, alteraciones en la expresión de un gen y
presentación sobre una célula o agentes carcinogénicos. Los
melanomas anteriormente mencionados se pueden diagnosticar, evaluar
o tratar mediante métodos que se describen en la presente
solicitud.
solicitud.
Según aquí se usa, la expresión, "mola
atípica" se refiere a una mola con características que son
anormales y que pueden ser precancerosas.
Según aquí se usa, la expresión "estar
dirigido a" significa inhibir, bloquear o prevenir la expresión
génica, la actividad enzimática o la interacción con otros factores
celulares o víricos, o contener una deleción o mutación en la
porción catalítica o enzimática de la proteína diana.
Según aquí se usa, la expresión "mutante
dominante negativo" quiere hacer mención a las proteínas o los
polipéptidos que son formas funcionalmente incompetentes de la
proteína diana y/o que inhiben o modulan la actividad enzimática de
la proteína diana, o inhiben o modulan la interacción de la proteína
diana con otros factores celulares o víricos.
Según aquí se usa, la expresión "agente
terapéutico" se refiere a cualquier molécula, compuesto o
tratamiento que se puede usar para prevenir y/o tratar el
cáncer.
Según aquí se usa, la expresión "vehículo
farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio transportador
que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del
principio activo, que es químicamente inerte y que no es tóxico
para el paciente al que se le administra.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar más
ampliamente determinados aspectos de la presente invención. La
invención se puede entender mejor tomando como referencia uno o más
de estos dibujos junto con la descripción detallada de las
realizaciones específicas que aquí se presentan.
Figura 1: Regulación por disminución de la
E-caderina ejercida por ET-1.
Lisados normalizados con respecto al contenido en proteína se
analizaron para determinar los niveles de la proteína
E-caderina mediante análisis de
inmunotransferencia. (A) Estimulación de las células con
ET-1 10 nM a lo largo de un tiempo de 40 horas.
Controles no estimulados se encuentran en las pistas primeras de los
paneles superior e inferior. (B) Regulación por disminución de la
E-caderina ejercida por ET-1 en
otras líneas de melanocitos y de células de melanoma. (C) Efecto de
antagonistas del receptor para ET. Las células se estimularon
durante 40 horas con ET-1 10 nM y se incubaron con
BQ123, antagonista de ETA, o con BQ788, antagonista de ETB, según se
indique. (D) Respuesta frente a la dosis. Las células se
estimularon 40 horas con: ausencia de ET-1,
ET-1 0,5 nM, ET-1 1,0 nM,
ET-1 10 nM y ET-3 10 nM, pistas
1-5 respectivamente.
Figura 2: Regulación por disminución de la
\beta-catenina y de p120^{CTN} ejercida por
ET-1. Lisados normalizados con respecto al
contenido en proteína, se analizaron para determinar los niveles de
las proteínas \beta-catenina y p120^{CTN}
mediante análisis de inmunotransferencia. Las células se estimularon
con ET-1 según se ha descrito previamente. (A)
\beta-catenina. (B) Efecto de los antagonistas del
receptor para ET. (C) p120^{CTN}.
Figura 3: Activación de la
caspasa-8 ejercida por ET-1. (A) La
inhibición de la caspasa-8 bloquea la regulación
por disminución de la E-caderina ejercida por
ET-1. Células SKMEL28 se trataron con diversos
inhibidores de caspasas a las concentraciones indicadas. Las
muestras se analizaron para determinar los niveles de la proteína
E-caderina según se ha descrito previamente. (B) La
inhibición de la caspasa-8 bloquea la regulación por
disminución de E-caderina,
\beta-catenina and p120^{CTN} en células FM2030.
La inhibición de la caspasa-8 también bloqueó la
regulación por disminución de \beta-catenina y
p120^{CTN} en células SKMEL28. (C) ET-1 activa a
la caspasa-8. Panel superior: se prepararon
extractos citoplásmicos en crudo procedentes de células FM2030 a
los puntos de tiempo indicados después de la estimulación con
ET-1 y activación de la caspasa-8
estudiada mediante análisis de inmunotransferencia. Se obtuvieron
resultados similares usando células SKMEL28. Los asteriscos indican
las posiciones de los fragmentos inducidos por la estimulación de
ET-1 Panel inferior: Fracciones en crudo de
membrana correspondientes a muestras del panel superior se
estudiaron con respecto a los niveles de la proteína
E-caderina mediante análisis de inmunotransferencia.
(D) La ET-1 no activa a las caspasas 3 y 7. Los
resultados mostrados proceden de células SKMEL28. Se obtuvieron
resultados idénticos usando células FM2030.
Figura 4: La ET-1 altera la
localización subcelular de E-caderina y
\beta-catenina. Las células se estimularon
durante 96 con ET-1 10 nM, a continuación se fijaron
o se tiñeron con anticuerpos
anti-E-caderina o
anti-\beta-catenina, seguidos por
los anticuerpos IgG anti-ratón conjugados con Cy3.
La incubación de los melanocitos y de células de melanoma con un
anticuerpo secundario solo reveló la ausencia de una tinción de
fondo.
La presente invención se refiere a protocolos
terapéuticos y a composiciones farmacéuticas diseñadas para su
direccionamiento hacia la iniciación de un cáncer mediada por
ET-1, y a efectores de la cascada iniciada por
ET-1 que conduce a trastornos y enfermedades
relacionadas con un cáncer, en concreto, con un melanoma.
La invención se basa, en parte, en el
sorprendente descubrimiento de que la ET-1, que es
sintetizada y secretada por los queratinocitos en respuesta a UVR,
y su receptor ETB, son componentes clave en la cascada molecular
implicada en el desarrollo del cáncer. Los solicitantes han
demostrado que antagonistas del ETB, o formas peptídicas inactivas
de ET-1, son capaces de inhibir los eventos
tempranos asociados con el desarrollo de cánceres tales como
el
melanoma.
melanoma.
La presente solicitud describe diversos
protocolos para tratar o prevenir el desarrollo del cáncer, que
incluyen, pero que no se limitan a: (1) protocolos que están
dirigidos a, y que inhiben, la expresión de ET-1, o
que inhiben las actividades esenciales del receptor ETB; (2)
protocolos que están dirigidos a, y que inhiben, efectores aguas
arriba de la cascada que conduce al desarrollo temprano de un
cáncer; y (3) protocolos que están dirigidos a, y que inhiben,
efectores aguas abajo de la cascada que conduce al desarrollo
temprano de un cáncer.
En particular, la presente invención abarca el
uso de compuestos conocidos que inhiben específicamente el receptor
ETB y de esa manera modulan la activación de la cascada que conduce
al desarrollo temprano de un cáncer. La presente invención también
abarca el uso de compuestos conocidos que imitan a
ET-1 y que se unen a, pero no activan, el receptor
ETB, inhibiendo de esta manera la cascada que conduce al desarrollo
temprano de un cáncer.
La presente invención también se refiere a
estrategias de terapia génica, que incluyen el uso de secuencias de
DNA que codifican productos traduccionales (es decir, proteínas) o
productos transcripcionales (es decir, moléculas antisentido o
ribozimas) que (a) inhiben el ETB o (b) son capaces de interrumpir
la progresión de la iniciación de un cáncer (es decir, de un
melanoma). Por ejemplo, el DNA puede comprender genes que codifican
proteínas terapéuticamente útiles tales como factores de
crecimiento, citoquinas, hormonas, etc. De manera adicional, el DNA
puede codificar moléculas antisentido o moléculas de ribozimas que
pueden inhibir la traducción de los mRNA que codifican proteínas
que están implicadas en la iniciación de un cáncer. En otra
realización de la invención, efectores aguas arriba y efectores
aguas abajo que están implicados en la cascada que conduce al
desarrollo de un melanoma, pueden ser el objetivo de las estrategias
basadas en terapia génica para inhibir el cáncer.
La presente solicitud describe ensayos de
escrutinio basados en células y basados en modelos animales, para
identificar nuevos agentes que inactivan y/o imitan a la
ET-1. Además, la presente solicitud describe ensayos
de escrutinio para identificar nuevos antagonistas de ETB o de
otras moléculas efectoras aguas arriba o aguas abajo, que están
implicadas en la cascada que conduce al evento temprano asociado con
el desarrollo de un cáncer.
La presente invención también abarca
composiciones farmacéuticas que contienen los nuevos agentes que
aquí se describen. Las modalidades terapéuticas de la invención
también abarcan terapias combinadas en las que un agente que
interfiere con la interacción, y/o con la activación, de
ET-1 con el receptor ETB, y al menos otro agente
terapéutico, se administran o bien al mismo tiempo, p. ej., en forma
de una mezcla, por separado pero de manera simultánea o
concurrente; o bien de manera secuencial, que incluyen la terapia
administrada por ciclos. La terapia administrada por ciclos implica
la administración de un primer compuesto terapéutico durante un
período de tiempo y la repetición de esta administración en veces
sucesivas, es decir, repetir el ciclo, con el fin de disminuir el
desarrollo de una resistencia a uno de los tratamientos.
La endotelina-1
(ET-1), péptido de 21 aminoácidos secretado a
niveles altos en piel irradiada con UV (ultravioleta), estimula la
producción de melanina y la proliferación de melanocitos. La
presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los
solicitantes de que la ET-1 ejerce una regulación
por disminución de las proteínas E-caderina,
p120^{CTN} y \beta-catenina en malanocitos y en
células de melanoma, a través de la activación del receptor B para
endotelinas (ETB), y de esta manera inicia los eventos tempranos
asociados con el desarrollo del melanoma. Los solicitantes
demuestran que la ET-1 activa de manera transitoria
a la caspasa-8, y que la inhibición de la actividad
de la caspasa-8 bloquea la regulación por
disminución de las proteínas E-caderina y catenina
ejercida por ET-1. Los solicitantes muestran además
que, aunque ET-1 no es capaz de activar a las
caspasas 3 y 7 y no induce apoptosis, sí induce una total alteración
morfológica de los melanocitos y la pérdida de los contactos
normales célula:célula. Los solicitantes muestran además que, debido
a que la E-caderina es un supresor de la invasión
tumoral, la expresión de ET-1 promueve el desarrollo
de neoplasias melanocíticas inducidas por luz UV, a través de la
regulación por disminución de la E-caderina.
Los melanocitos son las células productoras de
pigmento de la epidermis, que experimentan una transformación
maligna en el melanoma maligno. A través de sus numerosos procesos
dendríticos, los melanocitos contactan con múltiples
queratinocitos, tipo celular predominante en la epidermis. Este
contacto queratinocito:melanocito está mediado por la molécula de
adhesión E-caderina. En la piel normal, los
melanocitos están restringidos a la capa basal de la epidermis,
aunque por el contrario, en el melanoma maligno, las células de
melanoma crecen a través de todas las capas de la epidermis así
como también en la dermis subyacente. Esta adquisición de capacidad
invasora casi siempre está acompañada por la regulación por
disminución de la E-caderina, que es un supresor de
la invasión tumoral. Además, la desdiferenciación de los melanocitos
y la expresión de antígenos de superficie celular asociados con el
melanoma, está asociada con la pérdida del contacto con los
queratinocitos. Por lo tanto, el factor ET-1
derivado de queratinocitos modula la expresión de antígenos de
superficie celular en los melanocitos, y la
E-caderina, a través de mediar en el contacto
celular con los queratinocitos, es crítica para el mantenimiento
del fenotipo normal de los
melanocitos.
melanocitos.
Como se ha indicado en lo que antecede, la
ET-1 es un péptido de 21 aminoácidos secretado por
los queratinocitos, que estimula la proliferación, quimiotáxis y
producción de pigmento en los melanocitos y en células de melanoma.
La UVR (radiación ultravioleta), que está implicada en el desarrollo
del melanoma, induce un marcado aumento de la secreción de
ET-1 por los queratinocitos. En los ejemplos
prácticos que aquí se describen, los solicitantes demuestran que la
estimulación ejercida por ET-1 afecta a la adhesión
de la E-caderina en melanocitos y en células de
melanoma. Los solicitantes demuestran también que existe una marcada
disminución de los niveles de la proteína
E-caderina en melanocitos humanos de recién nacidos
(FM2030) y en células de melanoma humano (SKMEL28) después de una
estimulación con ET-1.
Los solicitantes demuestran también en los
ejemplos prácticos que aquí se describen, que la regulación por
disminución de la E-caderina, inducida por
ET-1, opera a través de la activación del receptor
ETB presente sobre los melanocitos. Aunque existen dos receptores
para ET-1 perfectamente caracterizados, ETA y ETB,
solamente los antagonistas de ETB bloquean la regulación por
disminución de la E-caderina ejercida por
ET-1, lo que sugiere que la activación de ETB se
requiere para que esta respuesta tenga lugar (Figura 1C). Los
solicitantes también demuestran que la regulación por disminución
de la E-caderina ejercida por ET-1
tiene una respuesta dependiente de la dosis tanto en melanocitos
como en células de melanoma (Fig. 1D).
Los solicitantes han demostrado además que las
cateninas, que son proteínas citoplásmicas que se unen a
E-caderina y que son críticas para la función de la
E-caderina en la adhesión celular, tanto en los
melanocitos como en células de melanoma, experimentaron una
regulación por disminución después de la estimulación con
ET-1. Más específicamente, los solicitantes
muestran que la estimulación con ET-1 hizo descender
los niveles de la proteína \beta-catenina y
aumentó su movilidad electroforética (Figura 2A). Las cinéticas de
esta respuesta también mostraron una buena correlación con las de
la regulación por disminución de la E-caderina.
Además, los ejemplos que aquí se describen muestran que BQ788, un
antagonista selectivo de ETB, bloqueó la regulación por disminución
de la \beta-catenina mediada por
ET-1 (Figura 2B). Por lo tanto, la regulación por
disminución tanto de la \beta-catenina como de la
E-caderina, está mediada por ETB.
ET-1 También ejerció una regulación por disminución
y aumentó la movilidad electroforética de p120^{CTN}, otro
miembtro de la familia de las cateninas, con cinéticas que son
paralelas a las observadas en el caso de la regulación por
disminución de la E-caderina y de la
\beta-catenina (Figura 2C). Dado que las proteínas
cateninas se unen a caderinas y son críticas para la función de las
caderinas en la adhesión celular, los solicitantes han demostrado
por primera vez que la estimulación de los melanocitos y de células
de melanoma ejercida por ET-1 está asociada con una
regulación por disminución de las proteínas cateninas, la cual
induce una regulación por disminución concomitante de la
E-caderina.
Los solicitantes a continuación demuestran que
la regulación por disminución de las proteínas cateninas está
regulada por caspasas, que son proteasas más conocidas por su papel
en la muerte celular apoptósica pero que también participan en
procesos inflamatorios. Más específicamente, los ejemplos que aquí
se describen demuestran que las caspasas se activan en respuesta a
una estimulación con ET-1 y que participan en la
regulación por disminución de E-caderina,
\beta-catenina y p120^{CTN}, en ausencia de
apoptosis. Además, inhibidores del procesamiento de la
caspasa-8 bloquearon la regulación por disminución
de E-caderina, \beta-catenina y
p120^{CTN}. Además, los solicitantes demuestran que los tiempos de
máxima regulación por disminución de E-caderina
coinciden con la aparición de subfragmentos de
caspasa-8 catalíticamente activos (Figura 3C, panel
inferior).
Aunque las caspasas son más conocidas por su
papel en la apoptosis, los solicitantes demuestran que la activación
de las caspasas inducida por ET-1 no está asociada
con apoptosis en melanocitos y en células de melanoma. Las caspasas
típicamente se activan en una cascada secuencial que comienza por
las caspasas apicales, tales como la caspasa-8, que
luego activan las caspasas distales, tales como las caspasas 3 y 7,
las cuales ejecutan la muerte celular apoptósica a través de la
escisión de diversos sustratos celulares críticos. La evidente
incapacidad de la ET-1 para activar a las caspasas
distales a pesar de la activación de la caspasa-8
(Figura 3D), concuerda con la incapacidad para inducir apoptosis en
melanocitos y en células de melanoma. Sin embargo, si se pudiera
vencer la inhibición de la apoptosis que sigue a la estimulación con
ET-1 de melanocitos y células de melanoma, los
melanocitos y células de melanoma estimulados por la
ET-1 cometerían suicidio. Para vencer la inhibición
de la apoptosis, se podrían usar varias estrategias. Por ejemplo, y
no a modo de limitación, se podría producir la inhibición de
inhibidores de la apoptosis (IAP) usando métodos muy conocidos por
los expertos en la técnica. Además, ya que la expresión de los IAP
se induce mediante la activación de NF-\kappaB,
la activación de NF-\kappaB se podría inhibir
mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica,
tales como mediante expresión de I-\kappaB, que es
un inhibidor de
NF-\kappaB.
NF-\kappaB.
Por lo tanto, los solicitantes han demostrado
por primera vez, una regulación por disminución de la
E-caderina y de cateninas después de una
estimulación con ET-1, y una regulación por
disminución de la E-caderina y de cateninas que
está directamente asociada con la activación de las caspasas
inducida con ET-1, sin la inducción concomitante de
apoptosis. Más concretamente, la ET-1 induce una
activación de la caspasa-8, que da lugar a la
proteólisis de proteínas cateninas. Esta proteólisis de proteínas
cateninas, que puede explicar el cambio en movilidad
electroforética de las cateninas después de la estimulación con
ET-1, está asociada con una regulación por
disminución concomitante de la E-caderina. Por
último, la regulación por disminución de la
E-caderina es un evento temprano asociado con el
desarrollo del melanoma. Por lo tanto, los solicitantes han
demostrado que los eventos tempranos asociados con el desarrollo
del melanoma, y del cáncer en general, se pueden inhibir bloqueando
ETB con antagonistas, o usando formas peptídicas inactivas de la
propia ET-1.
La presente solicitud describe varios
protocolos, métodos y compuestos terapéuticos para prevenir y/o
tratar el cáncer. Estos protocolos, métodos y compuestos se
refieren a antagonistas de ETB, compuestos miméticos de
ET-1 y antagonistas de compuestos efectores aguas
abajo, tales como caspasas, cateninas y caderinas, que están
implicados en la cascada que sigue a la estimulación inducida con
ET-1 que conduce al desarrollo del melanoma.
Los solicitantes han demostrado que el ETB es un
componente esencial de la cascada que conduce a los eventos
tempranos asociados con el desarrollo del melanoma. Además, los
solicitantes han demostrado por primera vez que los antagonistas de
ETB, tales como BQ788, son capaces de bloquear cascada que conduce
al desarrollo del melanoma. Existen varios mecanismos mediante los
que la activación del ETB puede estar ejerciendo sus efectos sobre
la cascada que conduce al desarrollo del melanoma. La presente
invención abarca los mecanismos tanto directos como indirectos
mediante los que se puede bloquear la cascada que conduce al
desarrollo del melanoma. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un
antagonista del ETB puede actuar bloqueando la activación de una
caspasa, tal como la caspasa-8. La ausencia de
activación de la caspasa-8 impediría la proteólisis
de las cateninas, tales como la \beta-catenina.
La \beta-catenina intacta sería entonces capaz de
unirse a caderinas, tales como la E-caderina, lo
cual promovería la unión de los queratinocitos a los melanocitos. De
esta manera, debido a que los niveles de E-caderina
descienden en el melanoma, un antagonista del ETB que bloquease la
activación de caspasa, bloquearía también los eventos tempranos
asociados con el desarrollo del melanoma.
Además de los mecanismos anteriormente descritos
para inhibir los eventos tempranos asociados con el desarrollo del
melanoma, otros mecanismos indirectos están también abarcados dentro
de la presente invención. Esos mecanismos podrían incluir, pero no
se limitan a, antagonistas de los mecanismos que conducen a: (a) la
activación de las caspasas por ETB, (b) la proteólisis de cateninas
por acción de caspasa, que promueve específicamente una inducción
por caspasa de la apoptosis de melanocitos y células de melanoma a
través de la unión ET-1-ETB o de la
activación caspasa-\beta-catenina,
o (c) la ruptura de la unión a E-caderina mediada
por catenina.
Ejemplos de antagonistas del ETB que se pueden
usar de acuerdo con la presente invención incluye, pero no se
limitan a, todas las composiciones de proteínas, RNA obtenidos con
la metodología de SELEX, inhibidores de moléculas pequeñas,
moléculas antisentido y ribozimas. Los antagonistas específicos y
conocidos de ETB incluyen, pero no se limitan a,
IRL-1038 (Urade y col., 1992, FEBS Lett.,
311: 12-16), BQ788 (Karaki y col., 1994,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 205:
168-173),
RES-701-1 (Kohzuma y col.,
1994, Neuroreport, 5: 2653-2656),
PD-142893 (Nishiyama y col., 1995, J.
Pharmacol. Japón, 69: 391) y H-3596 (Shibata y
col., 1996, Peptide Chemistry 1995, Proc. of the 33rd
Symp. on Peptide Chem., Sapporo, Japón, página 281).
Además de antagonistas del ETB, la presente
invención también abarca inhibidores de ET-1 y
compuestos miméticos de ET-1. Los inhibidores de
ET-1 disminuirían los niveles de
ET-1 dentro de las células, y de esta manera
disminuirían la activación del receptor ETB. Los compuestos
miméticos de ET-1, sin embargo, se unirían
eficientemente a ETB pero no inducirían la activación del receptor
ETB. Sin activación del receptor ETB, la cascada que conduce a los
eventos tempranos asociados con el desarrollo del melanoma se
bloquearía.
Ejemplos de inhibidores de ET-1
y/o de compuestos miméticos de ET-1 que se pueden
usar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, [Ala^{3,11,18},
Nle^{7}]-ET-1 (Hunt y col., 1991,
Biorganic and Medic. Chem. Lett., 1: 33),
ET-1 (11-21) (Urade y col., 1992,
FEBS Lett., 311:12),
ciclo(-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-\beta-Asp)-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Trp-OH
(Tanaka y col., 1994, Mol. Pharmacol., 45: 724 y
ciclo(-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-\beta-Asp)-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH
(Shibata y col., 1996, Peptide Chemistry 1995, Proc. of
the 33rd Symp. on Peptide Chem., Sapporo, Japón, página
281).
Compuestos adicionales que están abarcados
dentro de la presente invención son todos los compuestos que
inhiben, ya sea directa o indirectamente, un compuesto que
constituye un componente clave de la cascada que conduce al
desarrollo del melanoma. Serían ejemplos los compuestos que son
capaces de inhibir la activación de la caspasa-8,
la proteólisis de las cateninas y las propiedades de unión de las
caderinas. Los ejemplos de compuestos que inhiben indirectamente un
compuesto que constituye un componente clave de la cascada que
conduce al desarrollo del melanoma podrían ser compuestos
intermediarios que están implicados en la inhibición de la
activación de la caspasa-8, de la proteólisis de
las cateninas y de las propiedades de unión de las caderinas, e
incluyen compuestos que aún no han sido identificados pero que
desempeñan papeles clave en la cascada.
Compuestos adicionales que están abarcados
dentro de la invención incluyen, pero no se limitan a, todo
compuesto que está dirigido a ETB y que inhibe sus actividades,
ET-1, caspasa-8 y compuestos que
aumentan las actividades de unión de las cateninas y caderinas, que
incluyen, pero que no se limitan a, mutantes dominantes negativos,
moléculas antisentido y ribozimas. La presente invención se refiere
también a nucleótidos, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión,
anticuerpos y otros compuestos que también modulan los compuestos y
actividades anteriormente mencionados. Otros ejemplos de compuestos
incluyen, pero no se limitan a, péptidos u otros compuestos, que
incluyen moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas, dirigidas a
regiones de los compuestos anteriormente mencionados que son
requeridos ya sea directa o indirectamente para la activación del
ETB o para el desarrollo del melanoma.
De acuerdo con la presente invención, también se
pueden usar estrategias de terapia génica para inhibir la
activación de ETB que induce la cascada que conduce al desarrollo
del melanoma. Las estrategias de terapia génica que aquí se
describen, también se pueden aplicar a ET-1 y a
efectores aguas arriba y aguas abajo de la cascada que conduce al
desarrollo del melanoma, de acuerdo con la presente invención. Entre
los compuestos que pueden alterar las actividades del ETB y su
activación de la cascada de señalización del desarrollo del
melanoma se encuentran moléculas antisentido, moléculas de
ribozimas, moléculas en triple hélice y mutantes dominantes
negativos. Estas moléculas se diseñan de manera que inhiban la
expresión del gen diana en células hospedadoras. Las técnicas para
la producción y uso de moléculas antisentido, moléculas de ribozimas
y/o moléculas en triple hélice son muy conocidas por los expertos
en la técnica y se pueden diseñar con respecto a la secuencia de
cDNA del ETB y de los componentes de la cascada que conduce al
desarrollo del melanoma.
Las moléculas antisentido de RNA y DNA actúan
para bloquear directamente la traducción de un mRNA, hibridándose
al mRNA diana e impidiendo su traducción en proteína. Las ribozimas
son moléculas enzimáticas de RNA capaces de catalizar la escisión
específica de un RNA. (Para una revisión, véase Rossi, J., 1994,
Current Biology 4: 469-471). El mecanismo de
acción de las ribozimas implica una hibridación, específica de
secuencia, de la molécula de ribozima con un RNA complementario
diana, seguida de una escisión endonucleolítica. La composición de
las moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias
complementarias al mRNA del gen diana, y debe incluir la secuencia
catalítica muy conocida, responsable de la escisión del mRNA. Para
información sobre esta secuencia, véase la Patente de EE. UU. Núm.
5.093.246, que se incorpora como referencia en su totalidad. Así
pues, dentro del alcance de la invención, se construyen por
ingeniería genética moléculas de ribozima que catalizan específica
y eficientemente la escisión endonucleolítica de secuencias de RNA
que codifican proteínas del gen diana.
Los sitios específicos de escisión por ribozima,
presentes en un RNA diana potencial, se identifican inicialmente
sometiendo a escrutinio la molécula de interés con respecto a sitios
de escisión por ribozima que incluyen las siguientes secuencias:
GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, secuencias cortas de RNA, de
entre 15 y 20 ribonucleótidos, que corresponden a la región del gen
diana que contiene el sitio de escisión, se pueden evaluar con
respecto a características estructurales previstas, tales como una
estructura secundaria, que pueden que pueden hacer que la secuencia
oligonucleotídica sea inadecuada. La idoneidad de las secuencias
candidatas también se puede evaluar determinando su accesibilidad
para hibridarse con oligonucleótidos complementarios, usando
ensayos de protección contra ribonucleasas.
Las moléculas de ácido nucleico que se han de
usar en la formación de una triple hélice para inhibir la
transcripción deben ser monocatenarias y deben estar compuestas por
desoxinucleótidos. La composición en bases de estos
oligonucleótidos se debe diseñar con el fin de que promueva la
formación de una triple hélice mediante aplicación de las reglas de
apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren que
tramos de gran tamaño de purinas o de pirimidinas, estén presentes
en una de las cadenas de un dúplex. Las secuencias de nucleótidos
pueden ser de bases pirimidínicas, lo que dará como resultado
tripletes de TAT y CGC^{+} a través de las tres cadenas asociadas
de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en pirimidinas
proporcionan una complementariedad de bases con una región rica en
purinas de una sola de las cadenas del dúplex, en una orientación
paralela a la de esa cadena. Además, se pueden elegir moléculas de
ácido nucleico que sean ricas en purinas, por ejemplo, que
contengan un tramo de residuos de G. Estas moléculas formarán un
triple hélice con un dúplex de DNA que sea rico en pares GC, en el
que la mayoría de los residuos de purina se localizan en una sola de
las cadenas del dúplex diana, dando como resultado tripletes GGC a
través de las tres cadenas del tríplex.
Como alternativa, las secuencias potenciales que
pueden ser perfectas para la formación de la triple hélice, se
pueden incrementar creando una molécula de ácido nucleico del tipo
denominado "en zigzag". Las moléculas en zigzag se sintetizan
de una manera alternante 5'-3',
3'-5', de manera que esas moléculas forman los pares
de bases primero con una de las cadenas de un dúplex y luego con la
otra, eliminando la necesidad de que un tramo de gran tamaño de
purinas o de pirimidinas esté presente sobre una sola de las cadenas
de un dúplex.
En los casos en los que las moléculas
antisentido, moléculas de ribozimas y/o moléculas en triple hélice
que aquí se describen, se utilizan para inhibir la expresión
génica, es posible que esta técnica pueda disminuir o inhibir la
transcripción (triple hélice) y/o la traducción (molécula
antisentido, ribozima) del mRNA producido por los alelos normales
del gen diana de una manera tan eficiente que puede surgir la
posibilidad de que la concentración del producto normal del gen
diana presente pueda se menor que la que es necesaria en el caso de
un fenotipo normal. En esos casos, para garantizar que se mantengan
niveles sustancialmente normales de actividad del gen diana,
moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan polipéptidos
del gen diana que exhiben la actividad normal del gen diana, se
pueden introducir en las células a través de métodos de terapia
génica tales como los que se han descrito, moléculas de ácido
nucleico que no contengan secuencias susceptibles a cualquiera de
los tratamientos con moléculas antisentido, moléculas de ribozimas o
moléculas en triple hélice que se estén utilizando. Como
alternativa, en los casos en los que el gen diana codifica una
proteína extracelular, puede ser preferible coadministrar la
proteína normal del gen diana con el fin de mantener el nivel
requerido de actividad del gen diana.
Las moléculas de RNA y DNA
anti-sentido, moléculas de ribozimas y moléculas en
triple hélice de la invención, se puede preparar mediante
cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para sintetizar
moléculas de DNA y RNA. Estos métodos incluyen métodos de síntesis
química de oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos muy
conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la síntesis
química en fase sólida, basada en fosforamiditas. Como alternativa,
las moléculas de RNA se pueden generar mediante transcripción in
vitro e in vivo de secuencias de DNA que codifican la
molécula de RNA antisentido. Esas secuencias de DNA se pueden
incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan
promotores adecuados de RNA-polimerasas, tales como
los promotores de las polimerasas T7 o SP6. Como alternativa,
construcciones de cDNA antisentido que sintetizan RNA antisentido
de manera constitutiva o de manera inducible dependiendo del
promotor utilizado, se pueden introducir en líneas celulares de
manera estable.
Se pueden introducir diversas modificaciones muy
conocidas en las moléculas de DNA, como una manera de incrementar
la estabilidad intracelular y la semivida. Algunas modificaciones
posible incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias
flanqueantes de ribonucleótidos o desoxinucleótidos en los extremos
5' y/o 3' de la molécula, o el uso de enlaces de tipo fosforotioato
o 2'O-metilo en lugar de enlaces de tipo
fosfodiesterasa dentro de la cadena principal del
oligodesoxirribonucleótido.
Los ácidos nucleicos que codifican los mutantes
dominantes negativos de la invención, se pueden preparar mediante
cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para la síntesis
de moléculas de DNA y RNA. Los mutantes dominantes negativos de la
presente invención se pueden producir mediante la tecnología del DNA
recombinante, usando métodos muy conocidos en la técnica. Se pueden
usar métodos muy conocidos por los expertos en la técnica para
construir vectores de expresión que contengan las secuencias que
codifican el producto del gen mutante
dominante-negativo y señales adecuadas de control
transcripcional y traduccional. Estos métodos se describen aquí con
más detalle.
El suministro del ácido nucleico a un paciente
puede ser o bien directo, en cuyo caso el paciente es expuesto
directamente al ácido nucleico o a un vector que porta el ácido
nucleico, o puede ser indirecto, en cuyo caso las células primero
se transforman con el ácido nucleico in vitro y luego se
trasplantan en el paciente para una terapia de reemplazo celular.
Estas dos estrategias se conocen, respectivamente, como terapia
génica in vivo o ex vivo.
En una realización específica, el ácido nucleico
se administra directamente in vivo, se expresa in vivo
para producir el producto codificado. Esto se puede efectuar
mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la
técnica, p. ej., construyendo el ácido nucleico como parte de un
vector adecuado para la expresión de ácidos nucleicos y
administrándolo de manera que llegue a ser intracelular, p. ej.,
mediante infección, usando un vector retrovírico defectivo o
atenuado u otro vector vírico (véase la Patente de EE. UU. núm.
4.980.286), o mediante inyección directa de DNA desnudo, o mediante
el uso de bombardeo de micropartículas (p. ej., con una pistola
génica; Biolistic, Dupont), o mediante revestimiento con
lípidos o receptores de superficie celular o agentes
transfectantes, encapsulación en liposomas, micropartículas, o
microcápsulas, o administrándolo unido a un péptido que se sabe que
penetra en la célula o en el núcleo, p. ej., administrándolo en
unión a un ligando sujeto a una endocitosis mediada por receptores
(véase, p. ej., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:
4429-4432) (ligando que se puede usar para realizar
el direccionamiento hacia tipos de células que expresan
específicamente los receptores), etc. En una realización específica,
el ácido nucleico puede ser direccionado in vivo para su
incorporación y absorción específica de célula, dirigiéndolo hacia
un receptor específico (véanse, p. ej., las publicaciones de PCT,
documento WO 92/06180 fechado el 16 de abril de 1992 (Wu et col.);
documento WO 92/22635 fechada el 23 de diciembre de 1992 (Wilson y
col.); documento WO 92/20316 fechado el 26 de noviembre de 1992
(Findeis y col.); documento WO 93/14188 fechado el 22 de julio de
1993 (Clarke y col.,); WO 93/20221 fechado el 14 de octubre de 1993
(Young)). En otra realización, se puede formar un complejo de ácido
nucleico-ligando en el que el ligando comprende un
péptido vírico fusogénico que rompe los endosomas, permitiendo que
el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. Como alternativa,
el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente y se puede
incorporar dentro del DNA de la célula hospedadora para su
expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
8932-8935; Zijlstra y col., 1989, Nature
342: 435-438).
En una realización específica, se usa un vector
vírico que contiene el ácido nucleico que suprime el promotor
génico. Por ejemplo, se puede usar un vector retrovírico (véase
Miller y col., 1993, Meth. Enzymol. 217:
581-599). Estos vectores retrovíricos se han
modificado con el fin de suprimir secuencias retrovíricas que no
son necesarias para el empaquetamiento del genoma vírico. Los
vectores retrovíricos se mantienen en las células infectadas
mediante su integración en sitios genómicos después de la división
celular. El ácido nucleico que se ha de usar en la terapia génica
se clona dentro del vector, el cual facilita el suministro del gen
al paciente. Se pueden encontrar más detalles sobre vectores
retrovíricos en Boesen y col., 1994, Biotherapy 6:
291-302, que describe el uso de un vector
retrovírico para suministrar el gen mdr1 a células madre
hematopoyéticas con el fin de hacer a las células madre más
resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el
uso de vectores retrovíricos en terapia génica son: Clowes y col.,
1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem y
col., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons y
Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:
129-141; y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin.
in Genetics and Devel. 3: 110-114.
Los adenovirus son otros vectores víricos que se
pueden usar en terapia génica. Los adenovirus son vehículos
especialmente interesantes para suministrar genes al hígado y a los
epitelios de las vías respiratorias. Los adenovirus infectan de
manera natural los epitelios de las vías respiratorias, en donde
producen una enfermedad benigna. Otras dianas para los sistemas de
suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso
central, las células endoteliales y los músculos. Los adenovirus
presentan la ventaja de ser capaces de infectar células que no
están en fase de división. Kozarsky y Wilson, 1993, Current
Opinion in Genetics and Development, 3: 499-503
presentan una revisión sobre la terapia génica basada en adenovirus.
Bout y col., 1994, Human Gene Therapy, 5:
3-10 demostraron el uso de vectores adenovíricos
para transferir genes a los epitelios del aparato respiratorio de
monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica
se puede encontrar en Rosenfeld y col., 1991, Science, 252:
431-434; Rosenfeld y col., 1992, Cell,
68: 143-155; y Mastrangeli y col., 1993,
J. Clin. Invest., 91:
225-234.
225-234.
Se ha propuesto también el uso de virus
adenoasociados (AAV) en terapia génica (Walsh y col., 1993, Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300). Los
herpesvirus son otros virus que también se pueden usar.
Otra estrategia de terapia génica, para usar en
la terapia de reemplazo celular de la invención, implica transferir
un gen a células dispuestas en un cultivo de tejidos, mediante
métodos tales como electroporación, lipofección, transfección
mediada por fosfato cálcico o infección vírica. Normalmente, el
método de transferencia incluye la transferencia de un marcador de
selección a las células. Las células se someten luego a la selección
para aislar las células que han incorporado el gen transferido y lo
expresan. Esas células se suministran después a un paciente.
En esta realización, el ácido nucleico es
introducido en una célula antes de la administración in vivo
de la célula recombinante resultante. Esta introducción se puede
llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica, que incluyen pero que no se limita a, transfección,
electroporación, microinyección, infección con un vector vírico que
contiene las secuencias del ácido nucleico, fusión celular,
transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia de genes
mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. En la
técnica se conocen numerosos métodos para la introducción de genes
extraños en células (véanse, p. ej., Loeffler y Behr, 1993,
Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen y col.,
1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline,
1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) y se pueden
usar de acuerdo con la presente invención, con la condición de que
no se alteren las funciones de crecimiento y las funciones
fisiológicas necesarias de las células del receptor. La técnica
debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la
célula, de manera que el ácido nucleico se pueda expresar en la
célula, y preferiblemente, se pueda heredar y expresar en la
progenie de esa célula.
Las células recombinantes resultantes se pueden
suministrar a un paciente mediante diversos métodos conocidos en la
técnica. En una realización preferida, se inyectan células
epiteliales, p. ej., por vía subcutánea. En otra realización,
células recombinantes de la piel (p. ej., queratinocitos) se pueden
aplicar en forma de injerto de piel sobre el paciente. Las células
sanguíneas recombinantes (p. ej., células madre o células
progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía
intravenosa. La cantidad de células cuyo uso se contempla depende
del efecto que quiere obtener, del estado del paciente, etc., y
puede ser determinada por el experto en la técnica.
En una realización en la que se usan células
recombinantes en terapia génica, nucleótidos que codifican el
supresor de un gen o de un promotor, tal como una forma inhibidora
de ET-1, ETB o una molécula
pro-apoptósica, para la destrucción inducida por
caspasas de células de melanoma, que normalmente son resistentes a
la apoptosis, se introducen en las células de manera que ese
supresor pueda ser expresado por las células o por su progenie, y
las células recombinantes se administran luego in vivo para
obtener el efecto terapéutico. En una realización específica, se
usan células madre o células progenitoras. Cualquier célula madre o
célula progenitora que se pueda aislar y mantener in vitro,
se puede usar potencialmente de acuerdo con esta realización de la
presente invención.
Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a,
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb),
anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios,
fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos
producidos en una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos
anti-idiotipo (anti-Id) y fragmentos
de unión a epítopos pertenecientes a cualquiera de los anticuerpos
anteriormente mencionados.
Para la producción de anticuerpos, se pueden
inmunizar diversos animales hospedadores mediante inyección con
ETB, ET-1 o compuestos efectores implicados en la
cascada que conduce al desarrollo de un cáncer. Además, se pueden
usar dominios funcionales, porciones truncadas y equivalentes
funcionales de estas proteínas para inmunizar a diversos animales
hospedadores. Los animales hospedadores pueden incluir, pero no se
limitan a, conejos, ratones y ratas, por nombrar algunos. Se pueden
usar diferentes adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica,
dependiendo de la especie hospedadora, que incluyen, pero que no se
limitan a, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles
minerales tales como el hidróxido de aluminio, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa
californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles para
seres humanos, tales como BCG (bacilo de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de
moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de los animales
inmunizados.
Los anticuerpos monoclonales, que son
poblaciones homogéneas de anticuerpos dirigidos contra un antígeno
particular, se pueden obtener mediante cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por parte de
líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero
no se limitan a, la técnica de los hibridomas de Kohler y Milstein,
(Nature 256: 495-497 [1975]; y la Patente de
EE. UU. Núm. 4.376.110), la técnica de obtención de hibridomas de
células B humanas (Kosbor y col., 1983, Immunology Today 4:
72; Cole y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80:2026-2030) y la técnica de obtención de
hibridomas usando el EBV (Cole y col., 1985, Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs.
77-96). Esos anticuerpos pueden ser de cualquiera
de las clases de inmunoglobulinas, que incluyen IgG, IgM, IgE, IgA,
IgD y cualquiera de sus subclases. El hibridoma que produce el mAb
de esta invención se puede cultivar in vitro o in
vivo. La producción de títulos altos de los mAb in vivo
hace que éste sea el método de producción actualmente
preferido.
Además, se pueden usar técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y
col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:
6851-6855; Neuberger y col., 1984, Nature,
312: 604-608; Takeda y col., 1985, Nature,
314: 452-454), empalmando los genes de una molécula
de anticuerpo de ratón, de la especificidad antigénica adecuada,
con genes de una molécula de anticuerpo humano, de la actividad
biológica adecuada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la
que sus diferentes porciones derivan de especies animales
diferentes, tales como los anticuerpos que poseen una región
variable derivada de un mAb murino y una región constante de una
inmunoglobulina humana.
Además, se han desarrollado técnicas para la
producción de anticuerpos humanizados. (Véase, p. ej., Queen,
Patente de EE. UU. Núm. 5.585.089.) Una región variable de cadena
ligera o de cadena pesada de una inmunoglobulina consiste en una
región "estructural" interrumpida por tres regiones
hipervariables, denominadas regiones determinantes de la
complementariedad (CDR). La extensión de la región estructural y de
las CDR se ha definido de manera precisa (véase, "Sequences of
Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. y col.,
U.S. Department of Health and Human Services (1983)).
Brevemente expuesto, los anticuerpos humanizados son moléculas de
anticuerpo procedentes de especies distintas de la humana, que
poseen una o más CDR procedentes de la especie distinta de la
humana y una región estructural procedente de una molécula de
inmunoglobulina humana.
Como alternativa, las técnicas descritas para la
producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de EE. UU.
4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423-426;
Huston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
5879-5883; y Ward y col., 1989, Nature 334:
544-546) se pueden adaptar para producir anticuerpos
monocatenarios dirigidos contra ETB, contra ET-1 o
contra compuestos efectores implicados en la cascada que conduce al
desarrollo de un cáncer. Los anticuerpos monocatenarios se forman
uniendo los fragmentos de cadena ligera y de cadena pesada de la
región Fv a través de un puente de aminoácidos, obteniéndose como
resultado un polipéptido monocatenario.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que
reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por
ejemplo, esos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los
fragmentos F(ab')_{2} que se pueden producir mediante
digestión de la molécula de anticuerpo con pepsina, y los fragmentos
Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los
fragmentos F(ab')_{2}. Como alternativa, se pueden
construir bibliotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989,
Science, 246: 1275-1281) que permiten una
identificación fácil y rápida de fragmentos Fab monoclonales que
poseen la especificidad deseada.
Los anticuerpos dirigidos contra ETB, contra
ET-1 o contra compuestos efectores implicados en la
cascada que conduce al desarrollo de un cáncer, se pueden utilizar
a su vez para generar anticuerpos anti-idiotipo que
"imitan" a estos compuestos, usando métodos muy conocidos por
los expertos en la técnica. (Véanse, p. ej., Greenspan y Bona,
1993, FASEB J. 7(5): 437-444; y
Nissonoff, 1991, J. Immunol. 147(8):
2429-2438).
La presente invención abarca el uso de agentes
que bloquean de manera selectiva la activación del ETB, en
composiciones farmacéuticas y en modalidades terapéuticas para el
tratamiento de melanomas metastásicos. Los nuevos agentes
identificados a través de los ensayos de escrutinio aquí descritos,
se pueden usar en combinación con otros agentes conocidos para
tratar y/o prevenir el cáncer.
Las vías de administración adecuadas pueden
incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosal
o intestinal; el suministro parenteral, que incluye inyecciones
intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones
intratecales, intraventriculares directas, intravenosas,
intraperitoneales, intranasales o intraoculares, y opcionalmente,
la administración en una formulación depot o de liberación
prolongada. Además, se puede administrar el agente de la presente
invención en forma de un sistema dirigido de suministro de fármacos,
por ejemplo, en un liposoma.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención, se pueden fabricar de una manera por sí sola conocida,
p. ej., por medio de procedimientos convencionales de mezcla,
disolución, fabricación de grageas, levitación, emulsificación,
encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas para usar de
acuerdo con la presente invención se pueden por lo tanto formular
de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente
aceptables, que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que
facilitan el procesamiento de los compuestos activos para dar lugar
a las preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La
formulación adecuada depende de la vía de administración
elegida.
Para su inyección, los agentes de la invención
se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en
tampones fisiológicamente compatibles, tales como la disolución de
Hank, disolución de Ringer o tampón fisiológico salino. Para su
administración a través de mucosas, en la formulación se usan
agentes penetrantes adecuados para la barrera que se ha de
penetrar. Esos agentes penetrantes suelen ser conocidos en la
técnica.
Para administración oral, los compuestos se
pueden formular con facilidad mezclando los principios activos con
vehículos farmacéuticamente aceptables, muy conocidos por los
expertos en la técnica.
Esos vehículos permiten que los compuestos de la
invención sean formulados en forma de comprimidos, pastillas,
grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, formas líquidas
pastosas, suspensiones y formas similares, para su ingestión oral
por el paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas de uso
oral se pueden obtener junto con excipientes sólidos, opcionalmente
moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos,
después de añadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para
obtener comprimidos y los núcleos de las grageas. Son excipientes
adecuados, en particular, sustancias de relleno tales como azúcares,
que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones
de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de
trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de
tragacanto, metil-celulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes
disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o
ácido algínico o una de sus sales tales como alginato sódico.
Los núcleos de las grageas se proporcionan con
revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar disoluciones
concentradas de azúcares que pueden contener opcionalmente goma
arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol,
polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de barnizado y
disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden
añadir materias colorantes o pigmentos a los comprimidos o a los
revestimientos de las grageas para identificar o distinguir las
diferentes combinaciones de las dosis de los principios
activos.
activos.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden
usar por vía oral, incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así
como también cápsulas blandas, selladas, hechas de gelatina y de un
agente flexibilizante tal glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras
pueden contener los principios activos, en forma de una mezcla con
un agente de relleno como por ejemplo lactosa, agentes ligantes
como por ejemplo almidones, y/o agentes lubricantes como por
ejemplo talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, agentes
estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos se
pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como
aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos.
Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones
para administración oral, deben encontrarse en dosificaciones
adecuadas para ese tipo de administración.
En el caso de la administración por vía bucal,
las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas
para disolver en la boca, formuladas de manera convencional.
En el caso de la administración mediante
inhalación, los compuestos para usar según la presente invención se
suministran convenientemente en forma de una presentación en aerosol
en recipientes presurizados, o en forma de nebulizador, con el uso
de un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u
otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad
de dosificación se puede determinar proveyendo una válvula que
suministra una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, p.
ej., gelatina, de uso en un inhalador o insuflador, se pueden
formular de manera que contengan una mezcla una mezcla en polvo del
compuesto y de una base en polvo adecuada, tal como lactosa o
almidón.
Los compuestos se pueden formular para
administración parenteral mediante inyección, p. ej., mediante una
inyección en bolo o mediante infusión continua. Las formulaciones
para inyección se pueden presentar en forma de dosificaciones
unitarias, p. ej., en ampollas o en envases multidosis, con un
conservante añadido. Las composiciones pueden estar en formas tales
como suspensiones, disoluciones o emulsiones, en vehículos acuosos
u oleosos, y pueden contener agentes adecuados para la formulación,
como por ejemplo, agentes favorecedores de suspensión, agentes
estabilizantes y/o agentes dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los
principios activos presentes en una forma soluble en agua. De
manera adicional, se pueden preparar suspensiones de los principios
activos en forma de suspensiones oleosas adecuadas para inyección.
Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos
como por ejemplo el aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos
grasos, como por ejemplo el oleato de etilo o triglicéricos o
liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener
sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente,
la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes
adecuados que aumenta la solubilidad de los compuestos para
permitir la preparación de concentraciones altamente
concentradas.
Como alternativa, el principio activo puede
estar en forma de polvo para constituir con un vehículo adecuado,
p. ej., agua esterilizada libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos también se pueden formular en
composiciones para vía rectal tales como supositorios o enemas de
retención, p. ej., que contienen bases convencionales para
supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones previamente
descritas, los compuestos también se pueden formular en forma de
preparación depot. Estas formulaciones de acción prolongada se
pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, por vía
subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Así,
por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales
poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de
emulsión en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio
iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, en
forma de una sal moderadamente soluble.
Los liposomas y las emulsiones son ejemplos muy
conocidos de vehículos o soportes para el suministro de fármacos
hidrófobos. También se pueden utilizar determinados disolventes
orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa
de una mayor toxicidad. De manera adicional, los compuestos se
pueden suministrar usando un sistema de liberación prolongada, tal
como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que
contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos
materiales de liberación prolongada y son muy conocidos por los
expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación prolongada,
dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los compuestos
durante desde unas cuantas semanas hasta más de 100 días.
Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica
del reactivo terapéutico, se pueden utilizar estrategias
adicionales para la estabilización de proteínas.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
comprender vehículos o excipientes adecuados, en fase sólida o en
fase de gel. Ejemplos de esos vehículos o excipientes incluyen, pero
no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos
azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros
tales como polietilenglicoles.
Muchos de los compuestos de la invención,
identificados como inhibidores del ETB, se pueden proporcionar en
forma de sales junto con contraiones farmacéuticamente compatibles.
Se pueden formar sales farmacéuticamente compatibles con muchos
ácidos, que incluyen, pero que no se limitan a ácido clorhídrico,
sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc.; o
con bases. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes
acuosos o en otros disolventes protónicos que cuando están en las
correspondientes formas de base libre. Ejemplos de sales, vehículos
o excipientes farmacéuticamente aceptables son muy conocidos por los
expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, A.R.
Gennaro, compilador, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.
Esas sales incluyen, pero no se limitan a, sales de hidrocloruro,
hidrobromuro, hidroyoduro, acetato, citrato, tartrato y malato de
sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, hierro y zinc, y sales
similares.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los
principios activos están contenidos en una cantidad efectiva para
conseguir el fin requerido. De manera más específica, una cantidad
terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para
prevenir el desarrollo de, o para aliviar, los síntomas ya
existentes en el paciente que está siendo tratado. La determinación
de las cantidades efectivas está convenientemente incluida en la
capacitación de los expertos en la técnica, especialmente a la luz
de la descripción detallada que aquí se proporciona.
Para cualquiera de los compuestos usados en el
método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede
estimar inicialmente a partir de ensayos realizados en cultivos
celulares. Esta información se puede usar para determinar de manera
más precisa las dosis útiles en seres humanos.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a
la cantidad del compuesto que produce una disminución en la
intensidad de la infección o que produce la mejoría de los síntomas
o una alargamiento de la supervivencia en un paciente. La toxicidad
y la eficacia terapéutica de esos compuestos se puede determinar
mediante procedimientos farmacéuticos, farmacológicos y
toxicológicos estándar, en cultivos celulares o en animales de
experimentación, p. ej., determinando la LD_{50} (la dosis letal
para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis
terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). El cociente
de dosis entre las dosis que producen los efectos tóxicos y los
efectos terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar
en forma del cociente entre LD_{50} y ED_{50}. Se prefieren los
compuestos que exhiben índices terapéuticos elevados. Los datos
obtenidos a partir de ensayos en cultivos celulares o de estudios
realizados en animales, se pueden usar para formular un intervalo
de dosificaciones para uso en seres humanos. La dosificación de
estos compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un
intervalo de concentraciones en sangre circulante, que incluyen la
ED_{50} de baja o nula toxicidad. La dosificación puede variar
dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación
empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación
exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser
elegidas por cada médico a la vista del estado del paciente. (Véase,
p. ej., Fingl y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of
Therapeutics", Capítulo 1, pág. 1).
La cantidad y el intervalo de dosificación se
puede ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos
del resto activo que sean suficientes para mantener los efectos
moduladores deseados o la concentración mínima efectiva (MEC). La
MEC variará para cada compuesto, pero se puede estimar a partir de
los datos obtenidos in vitro. Las dosificaciones necesarias
para conseguir la MEC dependerán de las características del
individuo y de la vía de administración. No obstante, se pueden
usar ensayos de HPLC, ensayos biológicos o inmunoensayos para
determinar las concentraciones plasmáticas.
Los intervalos de dosificación también se pueden
determinar usando el valor de MEC. Los compuestos se deben
administrar usando un régimen que mantenga los niveles plasmáticos
por encima de la MEC durante el 10% - 90% del tiempo,
preferiblemente entre el 30% - 90% del tiempo y muy preferiblemente
entre el 50% - 90% del tiempo.
En los casos de una administración local o de
una incorporación selectiva, la concentración local efectiva del
fármaco puede no estar relacionada con su concentración en
plasma.
La cantidad de la composición administrada
dependerá, por supuesto, del paciente que está siendo tratado, del
peso del paciente, de la gravedad de la afección, del modo de
administración y del criterio del médico que la prescribe.
En procedimientos de inmunización, la cantidad
de inmunógeno que ha de ser usada y el programa de las
inmunizaciones serán determinados por un médico experto en la
técnica, y se administrarán tomando como referencia la respuesta
inmunológica y el título de anticuerpos del paciente.
Las composiciones se pueden presentar, si se
desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener
una o más formas de dosificaciones unitarias que contienen el
principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una
lámina fina de metal o de plástico, tal como un envase blíster. El
envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de las
instrucciones de administración. También se pueden preparar
composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado
en un vehículo farmacéutico compatible, se pueden colocar en un
recipiente adecuado y etiquetar para el tratamiento de la
enfermedad que se indique.
Los siguientes ensayos se diseñan para
identificar compuestos que sean capaces de prevenir y/o tratar
melanomas. Esos compuestos pueden actuar como base de la mejoría de
cánceres, incluyendo el melanoma como ejemplo. Esos compuestos
pueden incluir, pero no se limitan a, péptidos, anticuerpos, o
compuestos pequeños orgánicos e inorgánicos. Métodos para la
identificación de esos compuestos se encuentran descritos más
adelante en la Sección 5.5.1. Esos compuestos también pueden
incluir otras proteínas celulares.
Los compuestos identificados a través de ensayos
como los aquí descritos pueden ser útiles, por ejemplo, para
dilucidar la función biológica de los compuestos y para mejorar la
enfermedad del melanoma. En los casos en los que un melanoma es el
resultado de un nivel total más bajo de expresión del gen diana y/o
del producto del gen diana en una célula o un tejido, los
compuestos que interaccionan con el producto del gen diana pueden
incluir compuestos que acentúan o amplifican la actividad de la
proteína del gen diana a la que se unen. Esos compuestos harían que
se produjera un aumento efectivo en el nivel de actividad del
producto del gen diana, mejorando con ello los síntomas.
En algunos casos, un gen diana en el que se ha
observado que está regulado por incremento cuando está bajo las
condiciones de la enfermedad, puede estar ejerciendo un efecto
protector. Los compuestos que aumentan la expresión de esos genes
regulados por incremento, o la actividad de los productos de esos
genes, también mejorarían los síntomas de la enfermedad,
especialmente en individuos en los que el diana en condiciones
normales no está regulado por incremento.
En otros casos, mutaciones en el gen diana
pueden producir tipos aberrantes o cantidades excesivas de las
proteínas del gen diana que se van a sintetizar, las cuales poseen
un efecto deletéreo que conduce al desarrollo de melanomas. De
manera similar, algunas condiciones fisiológicas pueden producir un
incremento excesivo en la expresión del gen diana que conduce al
desarrollo de melanomas. En esos casos, se pueden identificar los
compuestos que se unen a la proteína del gen diana porque inhiben la
actividad de la proteína del gen diana a la que se unen.
Se pueden diseñar sistemas in vitro con
el fin de identificar compuestos capaces de unirse a los genes
dianas de la invención. Esos compuestos pueden incluir, pero no se
limitan a, péptidos formados por aminoácidos con configuración D
y/o configuración L (por ejemplo, en forma de bibliotecas de
péptidos aleatorios; véase, p. ej., Lam, K.S. y col., 1991,
Nature 354: 82-84), fosfopéptidos (por
ejemplo, en forma de bibliotecas de expresión directa de
fosfopéptidos, aleatorios o parcialmente degenerados; véase, p. ej.,
Songyang, Z. y col., 1993, Cell 72:
767-778), anticuerpos y moléculas pequeñas orgánicas
o inorgánicas. Los compuestos identificados pueden ser útiles, por
ejemplo, para modular la actividad de proteínas de los genes diana,
preferiblemente, de proteínas de genes diana mutantes, pueden ser
útiles para dilucidar la función biológica de la proteína del gen
diana, se pueden utilizar en escrutinios para identificar compuestos
que alteran las interacciones normales de los genes diana, o pueden
ellos mismos alterar esas interac-
ciones.
ciones.
El principio de los ensayos usados para
identificar compuestos que se unen a la proteína del gen diana
implica preparar una mezcla de reacción de la proteína del gen
diana y del compuesto en estudio en condiciones y durante un tiempo
suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se
unan, formando así un complejo que puede ser separado de, y/o
detectado en, la mezcla de reacción. Estos ensayos se pueden llevar
a cabo de diversas maneras. Por ejemplo, uno de los métodos para
llevar a cabo un ensayo de este tipo implicaría anclar el gen diana
o la sustancia en estudio sobre una fase sólida, y detectar los
complejos formados por el gen diana/sustancia en estudio, anclados
sobre la fase sólida, al final de la reacción. En uno de los
ejemplos de este método, la proteína del gen diana se puede anclar
sobre una superficie sólida, y el compuesto en estudio, que no está
anclado, se puede marcar, ya sea directamente o indirectamente.
En la práctica, se utilizan convenientemente
placas de microtitulación. El componente anclado se puede
inmovilizar a través de uniones covalentes o no covalentes. Las
uniones no covalentes se pueden llevar a cabo simplemente
revistiendo la superficie sólida con una disolución de la proteína y
dejándola secar. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo
inmovilizado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, específico
para la proteína, para anclar la proteína a la superficie sólida.
Las superficies se pueden preparar por adelantado y se pueden
almacenar.
Para llevar a cabo el ensayo, el componente no
inmovilizado se añade a la superficie revestida que contiene el
componente anclado. Una vez completada la reacción, se retiran los
componentes que no han reaccionado (p. ej., mediante lavado) en
condiciones tales que todos los complejos formados permanecerán
inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de los
complejos anclados sobre la superficie sólida se puede llevar a
cabo de varias maneras. En los casos en los que el componente antes
no inmovilizado esté pre-marcado, la detección del
marcador inmovilizado sobre la superficie indica que los complejos
se han formado. En los casos en los que el componente antes no
inmovilizado no esté pre-marcado, se puede usar un
marcador indirecto que detecta los complejos anclados sobre la
superficie; p. ej., usando un anticuerpo marcado, específico para el
componente antes no inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede
estar marcado directamente o indirectamente con un anticuerpo
anti-Ig marcado).
Como alternativa, se puede llevar a cabo una
reacción en una fase líquida, los productos de la reacción se
pueden separar de los componentes que no hayan reaccionado y se
pueden detectar los complejos; p. ej., usando un anticuerpo
inmovilizado, específico del producto del gen diana o del compuesto
en estudio, para anclar todos los complejos formados en la
disolución, y usando un anticuerpo marcado específico para el otro
componente del posible complejo, para detectar los complejos
anclados. Los compuestos que se demuestra que se unen a un producto
del gen diana particular a través de uno de los métodos descritos en
lo que antecede, se pueden ensayar de nuevo con respecto a su
capacidad para inducir una respuesta bioquímica por parte de la
proteína del gen diana.
Las proteínas de los genes diana de la invención
pueden interaccionar in vivo con una o más proteínas
celulares o extracelulares. Para los fines de esta disquisición, los
productos de los genes diana y esas proteínas celulares o
extracelulares se denominan aquí "parejas de unión". Los
compuestos que interfieren en esas interacciones pueden ser útiles
para regular la actividad de las proteínas de los genes diana,
especialmente de proteínas de genes diana mutantes. Esos compuestos
pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas tales como
anticuerpos, péptidos y moléculas similares descritas anteriormente
en la Sección 5.5.1.
El principio básico de los sistemas analíticos
usados para identificar compuestos que interfieren con la
interacción entre la proteína del gen diana y su pareja o parejas
de unión, del tipo de proteína celular o extracelular, conlleva
preparar una mezcla de reacción que contiene la proteína del gen
diana y la pareja de unión, en las condiciones y durante el tiempo
suficiente para permitir que las dos proteínas interaccionen y se
unan, formándose así un complejo. Con el fin de someter un
compuesto a ensayo con respecto a su actividad inhibidora, la mezcla
de reacción se prepara en presencia y en ausencia del compuesto en
estudio. El compuesto en estudio se puede incluir inicialmente en
la mezcla de reacción o se puede añadir en algún momento posterior a
la adición del gen diana y de su pareja de unión celular o
extracelular. Mezclas de reacción de control se incuban en ausencia
del compuesto en estudio o en presencia de un placebo. Se detecta
luego la formación de complejos entre la proteína del gen diana y
la pareja de unión celular o extracelular. La formación de un
complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de
reacción que contiene el compuesto en estudio, indica que el
compuesto interfiere en la interacción de la proteína del gen diana
y la proteína que es la pareja de unión interactiva. De manera
adicional, la formación de complejos en las mezclas de reacción que
contienen el compuesto en estudio y una proteína del gen diana
normal se puede comparar también con la formación de complejos en
las mezclas de reacción que contienen el compuesto en estudio y una
proteína de un gen diana mutante. Esta comparación puede ser
importante en los casos en los que es conveniente identificar
compuestos que interfieren en las interacciones de las proteínas de
los genes diana mutantes pero no en las interacciones de las
proteínas de los genes diana normales.
El ensayo para identificar compuestos que
interfieren con la interacción de las parejas de unión, se puede
llevar a cabo en un formato heterogéneo o en un formato homogéneo.
Los formatos heterogéneos implican anclar uno de los miembros de la
pareja de unión sobre una fase sólida y detectar los complejos
anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En los
ensayos homogéneos, la reacción completa se lleva a cabo en una
fase líquida. En cada una de estas dos estrategias, el orden de
adición de los compuestos reaccionantes se puede variar para
obtener diferente información sobre los compuestos sometidos al
ensayo. Por ejemplo, los compuestos en estudio que interfieren con
la interacción entre las parejas de unión, p. ej., mediante
competición, se pueden identificar llevando a cabo la reacción en
presencia de la sustancia en estudio; es decir, añadiendo la
sustancia en estudio a la mezcla de reacción antes de, o
simultáneamente con, la proteína del gen diana y la proteína
interactiva celular o extracelular. Como alternativa, los compuestos
en estudio que rompen complejos previamente formados, p. ej., los
compuestos con constantes de unión más altas, que desplazan a uno de
los miembros de la pareja de unión del complejo, se pueden ensayar
añadiendo el compuesto en estudio a la mezcla de reacción después
de que los complejos se hayan formado. Los diferentes formatos se
describen brevemente a continuación.
En un sistema analítico heterogéneo, tanto la
proteína del gen diana como la proteína pareja de unión interactiva,
celular o extracelular, se ancla sobre una superficie sólida, y su
pareja de unión, que no está anclada, se marca ya sea directa o
indirectamente. En la práctica, se utilizan convenientemente placas
de microtitulación. Las especies ancladas se pueden inmovilizar a
través de uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente
se puede realizar simplemente revistiendo la superficie sólida con
una disolución de la proteína y dejándola secar. Como alternativa,
un anticuerpo inmovilizado, específico de la proteína, se puede usar
para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies se
pueden preparar por adelantado y se pueden almacenar.
Con el fin de llevar a cabo el ensayo, la pareja
de unión de la especie inmovilizada se expone a la superficie
revestida en presencia o en ausencia del compuesto en estudio. Una
vez completada la reacción, se retiran los componentes que no han
reaccionado (p. ej., mediante lavado) y todos los complejos formados
permanecerán inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección
de los complejos anclados sobre la superficie sólida se puede
realizarse de diversas maneras. En los casos en los que la pareja de
unión esté pre-marcada, la detección del marcador
inmovilizado sobre la superficie indica que los complejos se han
formado. En los casos en los que la pareja de unión no esté
pre-marcada, se puede usar un marcador indirecto que
detecta los complejos anclados sobre la superficie; p. ej., usando
un anticuerpo marcado, específico para la pareja de unión (el
anticuerpo, a su vez, puede estar marcado directamente o
indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).
Dependiendo del orden de adición de los componentes de la reacción,
se pueden detectar los compuestos en estudio que inhiben la
formación de los complejos, o que rompen los complejos previamente
formados.
Como alternativa, la reacción se puede llevar a
cabo en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto en
estudio, los productos de la reacción se pueden separar de los
componentes que no han reaccionado y se pueden detectar los
complejos; p. ej., usando un anticuerpo inmovilizado, específico de
uno de los miembros de la pareja de unión, para anclar todos los
complejos formados en la disolución, y usando un anticuerpo marcado
específico del otro miembro de la pareja de unión, para detectar los
complejos anclados. También esta vez, dependiendo del orden de
adición de los compuestos reaccionantes a la fase líquida, se pueden
identificar los compuestos en estudio que inhiben la formación de
los complejos, o que rompen los complejos previamente formados.
En una realización alternativa de la invención,
se puede usar un ensayo homogéneo. En esta estrategia, se prepara
un complejo preformado de la proteína del gen diana y de la proteína
interactiva celular o extracelular, en el que uno de los miembros
de la pareja de unión está marcado, pero la señal generada por el
marcador está extinguida debido a la formación del complejo (véase,
p. ej., la Patente de EE. UU. núm. 4.190.496 de Rubenstein, que
utiliza esta estrategia en los inmunoensayos). La adición de una
sustancia en estudio que compite con, y que desplaza a, uno de los
miembros de la pareja de unión del complejo preformado, dará como
resultado la generación de una señal por encima del fondo. De esta
manera, se pueden identificar las sustancias en estudio interfieren
en la interacción entre la proteína del gen diana y la proteína
celular o extracelular.
En otra realización de la invención, estas
mismas técnicas se pueden utilizar usando fragmentos de péptidos
que corresponden a los dominios de unión de la proteína del gen
diana y a la proteína interactiva celular o extracelular,
respectivamente, en lugar de una o de las dos proteínas de longitud
completa. Cualquiera de los diversos métodos de rutina practicados
en la técnica se puede usar para identificar y aislar el sitio de
unión de las proteínas. Estos métodos incluyen, pero no se limitan
a, mutagénesis de uno de los genes que codifican las proteínas y la
realización de escrutinios con respecto a la ruptura de la unión en
un ensayo de co-inmunoprecipitación. Se pueden
seleccionar mutaciones compensatorias en el gen diana. El análisis
de las secuencias de los genes que codifican las respectivas
proteínas revelará las mutaciones que corresponden a la región de
la proteína implicada en la unión interactiva. Como alternativa, una
de las proteínas se puede anclar a una superficie sólida usando
métodos anteriormente descritos en esta sección, y se puede dejar
que interaccione con, y que se una a, su pareja de unión marcada,
que ha sido tratada con una enzima proteolítica, tal como tripsina.
Después del lavado, un péptido corto y marcado, que comprende el
dominio de unión, puede permanecer asociado con el material sólido,
y se puede aislar e identificar mediante secuenciación de
aminoácidos. Asimismo, una vez obtenido el gen que codifica la
proteína celular o extracelular, por ingeniería genética se pueden
preparar segmentos cortos del gen que expresan fragmentos peptídicos
de la proteína, que se pueden luego ensayar con respecto a la
actividad de unión y se pueden purificar o sintetizar.
Una realización particular de la invención
presenta un método para realizar el escrutinio de compuestos
candidatos con respecto a su capacidad para antagonizar la
interacción entre un ligando y el dominio del receptor del producto
de un gen diana. Ese método conlleva: a) mezclar un compuesto
antagonista candidato con un primer compuesto que incluye el
producto de un gen diana recombinante que comprende un dominio del
receptor (o un fragmento de unión al ligando o un análogo) por una
parte lado, y con un segundo compuesto que incluye el ligando por
otra parte; b) determinar si el primer compuesto y el segundo
compuesto se unen; y c) identificar los compuestos antagonistas
como aquellos que interfieren con la unión del primer compuesto al
segundo compuesto.
Por "antagonista" se entiende una molécula
que inhibe una actividad particular, en este caso, la capacidad de
un ligando para interaccionar con un dominio del receptor del
producto de un gen diana y/o para desencadenar los eventos
biológicos resultantes de esta interacción. Las composiciones
terapéuticas preferidas incluyen antagonistas, p. ej., fragmentos
de péptidos (en particular, fragmentos derivados del dominio
N-terminal extracelular), anticuerpos (en
particular, anticuerpos que reconocen y se unen al dominio
N-terminal extracelular), o fármacos, que bloquean
la función del ligando o del producto del gen diana interfiriendo
con la interacción ligando-receptor.
Debido a que componente receptor del producto
del gen diana se puede producir por medio de técnicas recombinantes,
y debido a que se pueden realizar escrutinios in vitro de
los antagonistas candidatos, la presente invención proporciona una
estrategia rápida y sencilla para la identificación de composiciones
terapéuticas útiles.
Los fragmentos de interés de un receptor
específico incluyen las porciones de los productos de los genes
diana que son capaces de interaccionar con el ligando, por ejemplo,
la totalidad o una parte del dominio N-terminal
extracelular. Esas porciones incluyen los segmentos
transmembranarios y porciones del receptor que se deduce que son
extracelulares. Esos fragmentos pueden ser útiles como antagonistas
(según se ha descrito en lo que antecede), y son también útiles
como inmunógenos para producir anticuerpos que neutralizan la
actividad del producto del gen diana in vivo (p. ej,
interfiriendo con la interacción entre el receptor y el ligando;
véase más adelante). Las regiones extracelulares se pueden
identificar mediante comparación con proteínas relacionadas de
estructura similar, y son regiones útiles aquellas que exhiben
homología con los dominios extracelulares de miembros de la familia
perfectamente caracterizados.
La unión de un ligando a su receptor se puede
ensayar mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos
en la Sección 5.5.1. Preferiblemente, las células que expresan el
producto del gen diana recombinante (o un fragmento o análogo
adecuado del producto del gen diana) se inmovilizan sobre un
sustrato sólido (p. ej., la pared de una placa de microtitulación o
de una columna) y se hacen reaccionar con el ligando marcado de
manera detectable (según se ha descrito en lo que antecede). La
unión se determina por medio del marcador de detección en
asociación con el componente (y por lo tanto, en asociación con el
sustrato sólido). La unión del ligando marcado a las células que
portan el receptor se usa como un "control" frente al que se
comparan los ensayos de antagonistas. Los ensayos de antagonistas
conllevan la incubación de las células que portan el producto del
gen diana con una cantidad adecuada de un antagonista candidato. A
esta mezcla se añade una cantidad equivalente del ligando
marcado.
Los antagonistas candidatos adecuados incluyen
fragmentos del producto del gen diana, en particular fragmentos que
contienen una porción de unión a ligando que está adyacente a, o que
incluye, uno o más segmentos transmembranarios o un dominio
extracelular del receptor (descrito en lo que antecede); esos
fragmentos incluirían preferiblemente cinco o más aminoácidos.
Otros antagonistas candidatos incluyen análogos del ligando y otros
péptidos así como también compuestos no peptídicos y anticuerpos
anti-producto del gen diana, diseñados o deducidos a
partir de análisis del receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
6 Ejemplo
1
Este ejemplo demuestra la regulación por
disminución de la E-caderina ejercida por
ET-1.
Células A375,
WM-266-4 y WM-1 15
de melanoma se adquirieron procedentes de la ATCC. Las condiciones
de los cultivos fueron según se describe en I.M. Shih y col.,
Am. J. Pathol., 145: 837-845 (1994). Dos
semanas antes de la estimulación con ET, el
12-miristato,13-acetato de forbol se
sustituyó por el 12,13-dibutirato de forbol,
soluble en agua, en el medio para melanocitos Las estimulaciones de
los melanocitos con ET se llevaron a cabo en un medio libre de
forbol. Las masas de células se incubaron durante 15 minutos en un
volumen de tampón RIPA (NP4O al 1%, ácido desoxicólico al 0,5%,
Tris 10 mM, pH 8,3, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, vanadato sódico 0,2 mM,
disolución 1X de inhibidores de proteasas, Complete,
procedente de Boehinger) igual a 6 volúmenes de las masas
celulares. Después de la centrifugación, los lisados se
cuantificaron usando un reactivo para ensayo de proteínas (Biorad).
Una cantidad de 2,5 \mug de proteína por muestra se sometieron a
SDS-PAGE excepto las muestras que se habían
preparado a partir de las células A375,
WM-266-4 o WM-1 15,
en cuyos caso se usaron 100 \mug de proteína por muestra. A las
células se añadieron BQ123 y BQ788 en concentración 100 nM una
hora antes de la adición de la ET-1. Anticuerpos:
anti-E-caderina (Transduction
labs), IgG anti-ratón conjugada con HRP
(Santa-Cruz). Sistema de detección ECL (Amersham).
ET-1, ET-3, BQ123, BQ788
(Peninsula labs).
Melanocitos humanos de recién nacido (FM2030) y
células de melanoma humano (SKMEL28) se estimularon con
ET-1 10 nM durante un período de tiempo de 40 horas
y los lisados con las proteínas se estudiaron con respecto a los
niveles de proteína E-caderina mediante análisis de
inmunotransferencia (Figura 1A). A las 40 horas, se evidenció un
notable descenso de la proteína E-caderina. Los
niveles de la proteína E-caderina regresaron a los
valores de referencia a las 72 horas. Una respuesta retardada y
prolongada a ET-1 ha sido también descrita en otros
tipos de células. R. Marsault y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 179: 1408-1413 (1991). Una línea
celular adicional de melanocitos (CL-NHEM) y 4
líneas celulares adicionales de melanoma se estimularon con
ET-1, y se observó una regulación por disminución de
la E-caderina en todas las líneas excepto en las
células de melanoma A375 y WM-115 melanoma, en las
que la proteína E-caderina fue indetectable en la
línea base de referencia (Figura 1B). Además de la
E-caderina, la expresión de las moléculas de
adhesión ICAM-1, CD44 y N-caderina
está alterada durante el desarrollo del melanoma. M.Y. Hsu y col.,
J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 1:
188-94 (1996); S. Vermeulen y col., Pathol. Res.
Pract., 192: 694-707 (1996). Sin embargo, los
análisis de inmunotransferencia de los lisados revelaron la ausencia
de efecto de la ET-1 sobre los niveles de proteínas
de estas moléculas de adhesión, por lo que el efecto de la
ET-1 era específico para la
E-caderina. Se realizaron análisis de transferencia
Northern y no se detectó un descenso de los niveles de mRNA de la
E-caderina, dependiente de ET-1, lo
que sugiere un mecanismo post-transcripcional de la
regulación por disminución.
Existen dos receptores para ET-1
que están muy bien caracterizados, un subtipo A (ETA) y un subtipo B
(ETB). A.G. Baynash y col., Cell, 79:
1277-85 (1994). Ambos suptipos son expresados por
los melanocitos mientras que la mayoría de las células de melanoma
expresan solamente ETB. La ET-1 se une con la misma
afinidad a ambos subtipos de receptores. G. Imokawa y col.,
Biochem. J., 314: 305-12 (1996). Para
determinar cual de los subtipos media en la respuesta observada, el
ensayo se repitió en presencia de un antagonista selectivo de ETA
(BQ123) y de un antagonista selectivo de ETB (BQ788). BQ788, pero no
BQ123, bloqueó la regulación por disminución de la
E-caderina ejercida por ET-1, lo que
sugiere que la activación del ETB se requiere para que esta
respuesta tenga lugar (Figura 1C). La regulación por disminución de
la E-caderina ejercida por ET-1 es
dependiente de la dosis, tanto en melanocitos como en células de
melanoma (Figura 1D). La ET-3, un agonista
selectivo del ETB, es también un potente regulador por disminución
de la E-caderina (Figura 1D, última pista) lo que
apoya los resultados de que ETB media en la respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
7 Ejemplo
2
Este ejemplo demuestra la regulación por
disminución de \beta-catenina y p120^{CTN}
ejercida por ET-1.
Para analizar proteínas cateninas asociadas a
membranas, se prepararon fracciones en crudo de membranas de la
siguiente manera: las masas de células se resuspendieron en un
volumen de tampón A (HEPES pH 7,5, 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl
10 mM, NaF 10 mM, vanadato sódico 0,2 mM, disolución 1X de
inhibidores de proteasas, Complete, procedente de Boehinger)
igual a 6 volúmenes de los sedimentos, y se dejó que se hincharan
durante 10 min. Las membranas celulares se rompieron mediante
agitación en vórtice durante 10 s y las membranas se sedimentaron
mediante centrifugación durante 10 s. Los sobrenadantes, que
contenían las proteínas citoplásmicas, se desecharon. Los
sedimentos de membranas se solubilizaron en tampón RIPA, descrito en
lo que antecede, y se sometieron a una congelación rápida sobre
hielo seco. Se usaron 0,5 \mug y 2,5 \mug de los lisados de
las proteínas para estudiar los niveles de las proteínas
\beta-catenina y p120^{CTN} respectivamente.
Anticuerpos: anti-\beta-catenina y
anti-p120^{CTN} (Transduction labs).
Las cateninas son proteínas citoplásmicas que se
unen a E-caderina y son críticas para la función de
la E-caderina en la adhesión celular. J.M. Daniel y
col., Bloessays, 19: 883-91 (1997).
Considerando la importancia de las cateninas en la función de la
E-caderina, se estudió el efecto de la estimulación
con ET-1 sobre los niveles de estas proteínas.
Tanto en melanocitos como en células de melanoma, la estimulación
con ET-1 hizo descender los niveles de la proteína
\beta-catenina y aumentó su movilidad
electroforética (Figura 2A). Las cinéticas de esta respuesta se
correlacionaron bien con las de la regulación por disminución de la
E-caderina. BQ788, un antagonista selectivo de ETB,
bloqueó la regulación por disminución de la
\beta-catenina mediada por ET-1
(Figura 2B). Al igual que con la E-caderina, los
análisis de transferencia Northern no pudieron revelar un descenso
en los niveles del mRNA de la \beta-catenina,
dependiente de ET-1, lo que sugiere un mecanismo
post-transcripcional de la regulación por
disminución. La ET-1 ejerció también una regulación
por disminución de p120^{CTN}, otro miembro de la familia de las
cateninas, e incrementó su movilidad electroforética, con cinéticas
paralelas a las observadas en la regulación por disminución de
E-caderina y \beta-catenina
(Figura 2C). Estos resultados sugieren que ET-1
regula por disminución a la E-caderina a través de
una modificación post-traduccional de las proteínas
cateninas, lo que probablemente las hace incapaces de formar
complejos estables con la E-caderina en la membrana
plasmática.
\vskip1.000000\baselineskip
8 Ejemplo
3
Todos los inhibidores de las caspasas contenían
un péptido señal de 16 aminoácidos derivado del Factor de
crecimiento de fibroblastos asociado al sarcoma de Kaposi, para
conferir permeabilidad celular (Calbiochem). Los inhibidores se
añadieron a las células 34 horas después de la estimulación con
ET-1 y las células se recogieron a las 40 horas. Se
prepararon fracciones citoplásmicas en crudo según se ha descrito
para la Figura 2, con la excepción de que los sobrenadantes que
contenían las proteínas citoplásmicas se transfirieron a tubos
nuevos, se complementaron con 0,11 volúmenes de tampón B (HEPES 0,3
M, pH 7,9, KCl 1,4 M, MgCl_{2} 0,03 M) y se clarificaron mediante
centrifugación. Se analizaron 10 \mug de proteína por muestra con
respecto a la activación de caspasa. Anticuerpos: Anticuerpo
anti-caspasa-8 (UBI), Anticuerpos
anti-caspase-3 y
anti-caspasa-7 (Transduction
labs). Se usó el sustrato Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (PIERCE) para la detección de las
proteínas caspasas por quimioluminiscencia. Las membranas se
revelaron inicialmente en una dilución 1:5 del reactivo preparado
en H_{2}O. En los casos necesarios, se realizó un lavado corto de
las transferencias en TBS (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM) y éstas
se revelaron de nuevo con el reactivo sin diluir para la
visualización de los fragmentos
pequeños.
pequeños.
Las caspasas son proteasas muy conocidas por su
papel en la muerte celular apoptósica pero también participan en
procesos inflamatorios. N.A. Thomberry y col., Science, 261:
1312-1318 (1998). Diversos estudios han mostrado
que proteasas pertenecientes a la familia de las caspasas escinden
la \beta-catenina durante la apoptosis, con una
regulación por disminución concomitante de la
E-caderina. B. Herren y col., Mol. Biol.
Cell., 9: 1589-1601 (1998). La escisión de la
\beta-catenina por acción de la
caspasa-3 en un sitio C-terminal,
genera un fragmento de 90 kDa de la proteína de 92 kDa. Este
fragmento de 90 kDa muestra un ligero aumento de movilidad
electroforética en comparación con el fragmento de 92 kDa. Además,
la capacidad de la ET-1 para inducir apoptosis en
un pequeño porcentaje de células derivadas de la línea A375 de
células de melanoma, sugiere que ET-1 es capaz de
activar miembros de la familia de las caspasas. M. Okazawa y col.,
J. Biol. Chem., 273: 12584-12592 (1998).
Para determinar si la activación de las caspasas
desempeña un papel en la regulación por disminución de la
E-caderina ejercida por ET-1, el
ensayo se repitió en presencia de inhibidores permeables a las
células, de varias caspasas diferentes (Figura 3A).
Sorprendentemente, los inhibidores que contenían las secuencias IETD
(inhibición de la caspasa-8) y DEVD (inhibición de
las caspasas-3, -7, -8) fueron capaces de bloquear
la regulación por disminución de la E-caderina
ejercida por ET-1. El inhibidor "DEVD" requirió
una concentración 10 veces más alta que el inhibidor "IETD"
con el fin de ser efectivo (Figura 3A, panel inferior). Los
inhibidores específicos para las caspasas 1, 4, 5, 6, 9 y 10 no
tuvieron efecto. La inhibición de la caspasa-8
también bloqueó la regulación por disminución de la
\beta-catenina y de p120^{CTN} (Figura 3B).
Estos resultados sugirieron que las caspasas 3, 7 y/u 8 se activan
en respuesta a la estimulación con ET-1 y participan
en la regulación por disminución de la E-caderina,
\beta-catenina y p120^{CTN}. Los análisis de
inmunotransferencia revelaron que de estas caspasas, únicamente la
caspasa-8 experimentó el procesamiento proteolítico
dependiente de ET-1, que fue detectable por primera
vez aproximadamente 36 horas después de la estimulación con
ET-1 y que duró 4-6 horas (Figura
3C, panel superior). Los puntos de tiempo de máxima regulación por
disminución de la E-caderina coincidieron con la
aparición de subfragmentos de la caspasa-8
catalíticamente activos (Figura 3C, panel inferior). El tratamiento
de las células con un inhibidor de la caspasa-8
permeable a la célula impidió su procesamiento proteolítico
proporcionando una evidencia adicional de que se requiere la
activación de la caspasa-8 para la regulación por
disminución de E-caderina,
\beta-catenina y p120^{CTN} ejercida por
ET-1.
Las caspasas se activan en una cascada
secuencial que comienza con las caspasas apicales tales como la
caspasa-8, que luego activan a las caspasas
distales tales como las caspasas-3 y -7, las cuales
ejecutan la muerte celular apoptósica a través de la escisión de
diversos sustratos celulares críticos. N.A. Thomberry y col.,
Science, 261: 1312-1318 (1998). La
manifiesta incapacidad de la ET-1 para activar las
caspasas distales a pesar de la activación de la
caspasa-8 (Figura 3D) es concordante con la
incapacidad para inducir la apoptosis en las células. La escisión
de \beta-catenina y de p120^{CNT}
inmunoprecipitadas por acción de la caspasa-8
recombinante in vitro tampoco se probó, por lo que su efecto
sobre las proteínas cateninas puede ser indirecto.
En su conjunto, estos resultados demuestran que
ET-1 regula por disminución la
E-caderina a través de un mecanismo que requiere la
activación de la caspasa-8. La
caspasa-8 puede escindir directamente proteínas
cateninas o puede activar otra(s) caspasa(s) de las
todavía no identificadas que escinden proteínas cateninas, y esta
escisión probablemente da lugar a la desestabilización y ruptura de
los complejos de E-caderina:catenina situados en la
membrana plasmática. De hecho, se ha demostrado que la escisión
llevada a cabo por las caspasas impide la interacción de la
\beta-catenina con
\alpha-catenina, la última de las cuales sirve
para anclar el complejo E-caderina:catenina al
citoesqueleto de actina. B. Herren y col., Mol. Biol. Cell.,
9: 1589-1601 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
9 Ejemplo
4
Las células se sembraron sobre portaobjetos
excavados de vidrio, revestidos con colágeno, en medio complementado
con ET-1 10 nM. A las 48 horas, el medio se aspiró
y se reemplazó con medio de nueva aportación complementado con
ET-1. A las 96 horas, las células se fijaron durante
10 minutos en formaldehído al 3,7%/CaCl_{2} 1 mM/PBS, se
permeabilizaron durante 10 minutos en Tritón X-100
al 0,2%/PBS y se bloquearon en BSA al 1%/PBS durante 10 minutos. La
tinción con anticuerpos contra E-caderina y
\beta-catenina diluidos en proporción 1:50 en
tampón de bloqueo se realizó durante 45 minutos, seguidos de una
incubación durante 30 minutos con IgG anti-ratón,
procedente de cabra, conjugada con Cy3 (Jackson Immunoresearch
labs), diluida en proporción 1:200 en el tampón de bloqueo. Las
células se lavaron con PBS entre las etapas de permeabilización y
fijación, y después de las incubaciones con los anticuerpos.
Para investigar el efecto de la
ET-1 sobre la localización subcelular de las
proteínas E-caderina y
\beta-catenina, se realizaron estudios de
inmunofluorescencia. Cuando se compararon con los controles no
estimulados, las células de melanoma estimuladas con
ET-1 presentaron una intensidad marcadamente
disminuida de la tinción de la membrana cuando se usó el anticuerpo
anti-E-caderina (Figuras 4a, b). La
estimulación de los melanocitos con ET-1 dio como
resultado una pérdida de concentración de la tinción de la
E-caderina en los puntos de contacto célula:célula
y la aparición de un patrón punteado de tinción perinuclear que
recuerda al observado en las células de melanoma (Figuras 4c, d).
Este patrón punteado parece que representa agregados intracelulares
de E-caderina disfuncional. Aunque las células de
melanoma no estimuladas presentaron tanto un patrón de tinción en
la membrana como un patrón de tinción en el núcleo cuando se usaron
anticuerpos anti-\beta-catenina,
la estimulación con ET-1 produjo la pérdida de la
mayor parte de la tinción de la membrana mientras que se conservó
una intensidad similar en la tinción del núcleo (Figuras 4e, f).
Esto demuestra que ET-1 se dirige específicamente a
todo el conjunto de \beta-catenina asociado a la
membrana, para ejercer la regulación por disminución en estas
células. La estimulación de los melanocitos con ET-1
produjo una pérdida de concentración de
\beta-catenina en los bordes laterales de las
células y en los puntos de contacto célula:célula (Figuras 4g, h).
El patrón difuso resultante de tinción de la membrana acentúa la
alteración morfológica inducida por la estimulación con
ET-1, que se observa más claramente en las
micrografías en campo brillante (Figuras 4i, j). Los melanocitos no
estimulados son bipolares, con núcleos pequeños y citoplasma escaso,
y participan en contactos precisos célula:célula. En marcado
contraste, los melanocitos estimulados con ET-1
poseen núcleos grandes con nucleolos prominentes, citoplasma
abundante, morfología poligonal y crecen de una manera desordenada
manifestando una pérdida de la inhibición por contacto. Estos
cambios son concordantes con la reorganización del citoesqueleto y
la regulación por disminución de la E-caderina en la
membrana plasmática.
Claims (8)
1. Uso de un compuesto que es un antagonista
selectivo del receptor B para endotelinas (ETB), en la fabricación
de una formulación farmacéutica para prevenir y/o tratar un melanoma
metastásico.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
compuesto se dirige a ETB inhibiendo, bloqueando o previniendo (i)
la expresión de ETB, (ii) la actividad enzimática de ETB, o (iii) la
interacción de ETB con otros factores celulares y víricos.
3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 2, en el que el compuesto se selecciona entre el grupo que
consiste en: IRL-1038, BQ788 y
RES-701-1.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 3, en el que el compuesto es BQ788.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 2, el que el compuesto es una forma
peptídica inactiva de la endotelina-1, forma
peptídica inactiva que es capaz de unirse a ETB pero que no induce
la activación del receptor ETB.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 2, en el que el compuesto es una molécula antisentido, o una
molécula de ribozima, que bloquea la traducción de ETB.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 2, en el que el compuesto es un anticuerpo dirigido contra
ETB.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 7, en el que dicha formulación farmacéutica comprende además
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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