ES2316765T3 - Colorantes fluorogenos. - Google Patents
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- Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
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Abstract
Un coloorante fluorógeno que tiene la estructura **ver fórmula**. en la que R 5 es un resto espirocíclico que tiene la fórmula: **ver fórmula** en la que el anillo fenilo de R 5 está orientado por encima o por debajo de la cara del plano definido por el sistema de anillos condensados del compuesto; en la que R2 y R8 tienen independientemente la estructura: **ver fórmula** en la que los índices m y n son independientemente números enteros entre 0 y 5 inclusive, de tal modo que la suma m + n es igual o menor que diez; en la que R1, R3, R4, R6, R7 y R9-16 se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, halo, ciano, amino, azido, aldehído, mercapto, hidroxi, nitro y, opcionalmente sustituidos, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, mono o di o trialquilamonio, guanidino, carboxamido, carboxi, metilamino, haloacetamido, hidrazido, maleimido, ceto, oxima, (mono, di, tri)halometilo, ácido hidroxámico, hidroxilamino, alcoxi, sulfato, sulfonato, fosfato, fosfonato, sulfonilo, sulfonamida, isotiocianato, halosulfonilo, carboxiazido, semicarbazido, tiosemicarbazido, sulfonilhidrazido, carbodimida; y en la que X 1-X 5 se seleccionan independientemente del grupo constituido por oxígeno, azufre y NR 17, en el que R17 es hidrógeno o alquilo inferior opcionalmente sustituido.
Description
Colorantes fluorógenos.
La presente invención se refiere al uso de
colorantes fluorógenos como moléculas informadoras para detectar la
entrada en células por una molécula específica. La presente
invención tiene aplicación en ensayos celulares, incluyendo ensayos
de alta capacidad que utilizan informadores fuorógenos para detectar
el transporte de una molécula a través de una membrana celular.
Se han usado numerosos colorantes fluorescentes
y fluorógenos como informadores en ensayos de fluorodetección. En
particular, se ha informado de numerosos derivados de fluoresceína
que poseen grupos funcionales que son adecuados para reaccionar con
otras moléculas y se han usado como indicadores en aplicaciones
analíticas que van desde el sondeo de funciones celulares a la
comprobación del nivel de uno o más fármacos en muestras de ensayos
fisiológicos. Véase, por ejemplo, C. Dive et al., Mol.
Cell Probes 211 (1988); Graber et al., Anal.
Biochem. 156:202 (1986); P.J. Brynes et al., Patente de
los EE.UU. Nº 4.869.132 y N.Y. Wang et al., documento EP
264797. Los ejemplos de aplicaciones analíticas en las que se usan
tales compuestos incluyen, como ejemplo, inmunoensayos de
polarización fluorescente (FPIAs) de uso en instrumentos disponibles
comercialmente tales como los instrumentos Abbott AD_{x} y Abbott
TD_{x} (ambos disponibles de Abbott Labs, Abbott Park, Illinois).
Los ejemplos de tales derivados incluyen 5 y 6-amino
fluoresceína (M.T. Ship Chandler et al., Anal.
Biochem. 162:89; Mattingly, Patentes de los EE.UU. Nº 5.573.904
(1996) y 5.756.771 (1996), y Ghoshal et al., Patente de los
EE.UU. Nº 5.986.094 (1999)).
Se han usado particularmente colorantes de
fluoresceína para detectar la entrada en células. Por ejemplo, se
ha empleado especialmente fluoresceína 1 para detectar la entrada en
células por péptidos. Adicionalmente, el diacetato de
carboxifluoresceína 2 y sus derivados encuentran aplicación conocida
en la coloración de células del hígado porque al entrar una
esterasa celular divide el resto éster produciendo la generación de
fluoresceína, que es altamente fluorescente (A. Laurent et
al., Bioconjugate Chem. 8:856 (1997)). Se ha usado también para
detectar la entrada en células monobromobimano 3, que no fluoresce
hasta reaccionar con un tiol. En particular, este compuesto no
fluoresce hasta tomar contacto con el citoplasma celular e
interactuar con glutationa, un tripéptido tiol. Así, puede usarse 3
para detectar la entrada en células o los niveles de tiol
intracelular en base a un aumento de fluorescencia con relación al
entorno extracelular, que contiene típicamente poco o nulo tiol
libre. Además, se han usado colorantes fluorescentes sustituidos con
heterociclo deficientes en electrones como moléculas informadoras
fluorimétricas (véase, por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº
6.221.604).
Sin embargo, aunque se han usado ampliamente
derivados de fluoresceína como moléculas informadoras para detectar
la entrada en células, los derivados de fluoresceína conocidos
padecen desventajas significativas. Por ejemplo, el uso de
colorantes de fluoresceína conocidos para detectar la entrada en
células requiere una separación tediosa de fluorescencia
intracelular de fluorescencia extracelular y, por tanto, el uso de
colorantes de fluoresceína para detectar entrada en células no es
susceptible para ensayos de alta capacidad. Además, el diacetato de
carboxifluoresceína 2 padece una vida media corta, que se ha
atribuido a la hidrólisis de sus restos éster a pH fisiológico.
Se reconoce que ciertos péptidos poseen la
capacidad de entrar en células así como transportar a células
moléculas incorporadas. Los ejemplos de tales péptidos incluyen los
derivados de proteína tat de HIV, polímeros de lisina, homeodominio
de Antennapedia y Arg 9 entre otros. (Véase, por ejemplo, Patente de
los EE.UU. Nº 5.804.604 de Frank et al., relativa al uso de
derivados de proteína tat de HIV para facilitar el suministro
intracelular de moléculas de carga; el documento WO 98/52614, que
describe el uso de polímeros de arginina que contienen cadenas
secundarias de guanidino o amidino para facilitar la entrada en
células; el documento WO 79/00515, que describe el uso de polímeros
de lisina de alto peso molecular para facilitar la entrada en
células de moléculas objetivo; y el documento WO 94/04686 (1984) y
Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA
91:664-668 (1994), cada uno de los cuales describe
el uso de péptidos derivados de tat de HIV para promover el
transporte de moléculas a través de membranas celulares). Se ha
demostrado también que ciertas secuencias de peptoides facilitan el
transporte intracelular (Wender et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 97:13003-13008 (2000)). Se ha
informado también de que oligómeros de arginina suministran
tópicamente un fármaco péptido cíclico, ciclosporina A, a células
para inhibir inflamación (Rothbard et al., Nature Med.
6:1253-7 (2000)).
Se han desarrollado métodos fisicoquímicos para
facilitar el suministro de macromoléculas a células. Tales métodos
incluyen, a título de ejemplo, electroporación, fusión a membrana
con liposomas, precipitación de ADN con fosfato cálcico,
transfección mediada por DEAE-dextrano, infección
con ácidos nucleicos modificados y microinyección directa en
células.
Sin embargo, a pesar de las descripciones
anteriores de compuestos fluorógenos y moléculas vehículo, serían
beneficiosos la identificación de nuevas moléculas fluorógenas que
se transporten efectivamente a células y métodos más eficaces para
identificar tales moléculas.
La presente invención proporciona nuevos
compuestos fluorógenos y composiciones asociadas y métodos que
incluyen tales compuestos. Los compuestos, composiciones y métodos
proporcionados por la invención son útiles en aplicaciones que
requieren una detección cuantitativa de la absorción celular de
compuestos.
Así, en un aspecto, la presente invención
proporciona nuevos compuestos fluorógenos que producen una señal
detectable tras absorción por una célula. En una realización, los
nuevos compuestos proporcionados por la invención tienen la
estructura mostrada a continuación (4):
El sustituyente R_{5} es un resto
espirocíclico que tiene la fórmula:
en la que el anillo fenilo de
R_{5} puede orientarse por encima o por debajo de la cara del
plano definido por el sistema de anillos condensados del compuesto
4. R_{2} y R_{8} tienen independientemente la
estructura:
en las que los índices m y n son
independientemente números enteros entre 0 y 5 inclusive, de tal
modo que la suma m + n es igual o menor que diez. R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{6}, R_{7} y R_{9-16} se
seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno,
halo, ciano, amino, azido, aldehído, mercapto, hidroxi, nitro y,
opcionalmente sustituidos, alquilo, cicloalquilo, alquenilo,
alquinilo, arilo, acilo, mono o di o trialquilamonio, guanidino,
carboxamido, carboxi, metilamino, haloacetamido, hidrazido,
maleimido, ceto, oxima, (mono, di, tri)halometilo, ácido
hidroxámico, hidroxilamino, alcoxi, sulfato, sulfonato, fosfato,
fosfonato, sulfonilo, sulfonamida, isotiocianato, halosulfonilo,
carboxiazido, semicarbazido, tiosemicarbazido, sulfonilhidrazido,
carbodimida. X_{1}-X_{5} pueden ser
independientemente oxígeno, azufre o NR_{17}, en el que R_{17}
es hidrógeno o alquilo inferior opcionalmente sustituido. Los
índices m y n son independientemente números enteros entre 0 y 20
inclusive.
En algunas realizaciones, m y n se seleccionan
independientemente entre números enteros de 1 a 3 inclusive. En
realizaciones más particulares, m y n se seleccionan
independientemente entre números enteros de 1 a 3 inclusive, y
R_{3}-R_{6} se seleccionan independientemente
entre hidrógeno, alquilo y cicloalquilo. En realizaciones más
particulares todavía, m y n se seleccionan independientemente entre
números enteros de 1 a 3 inclusive, y
R_{3}-R_{6} se seleccionan independientemente
entre hidrógeno, alquilo y cicloalquilo; y
X_{1}-X_{7} son cada uno oxígeno.
En otro aspecto todavía, la invención
proporciona métodos mejorados para identificar moléculas capaces de
entrar en células y, más particularmente, moléculas útiles para
facilitar la entrada de otras moléculas en células, tales como
colorantes fluorógenos, cuyos colorantes pueden incorporarse
opcionalmente a otro compuesto tal como un compuesto terapéutico.
En algunas realizaciones, los métodos para identificación de
moléculas comprenden ensayos de alta capacidad para detectar la
entrada de células.
Específicamente, la invención proporciona un
método de examen de alta capacidad para identificar compuestos de
una biblioteca de compuestos que son compuestos de transporte, en
los que un compuesto de transporte se refiere a un compuesto que es
internalizado por una célula, que comprende:
- a)
- incorporar los compuestos individuales de una biblioteca de compuestos a una fase sólida mediante un enlace divisible, en el que cada uno de dichos compuestos individuales se incorpora directa o indirectamente a un informador fluorógeno que se hace fluorescente tras entrar en la célula, en el que el informador fluorógeno es un colorante fluorógeno como se ha definido antes;
- b)
- liberar de la fase sólida el conjugado informador-compuesto;
- c)
- poner en contacto con una célula los conjugados informador-compuesto liberados; y
- d)
- determinar si dicho compuesto es una molécula transportadora en base a si hay un cambio de fluorescencia detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
En otras realizaciones, las moléculas a
identificar son peptoides. En realizaciones más particulares, los
peptoides se conjugan con un compuesto fluorógeno de la invención,
de manera que puede determinarse eficazmente la absorción celular
del peptoide.
En otro aspecto todavía, la invención
proporciona un método para determinar si un compuesto es una
molécula transportadora que se internaliza por una célula que
comprende:
- a)
- poner en contacto una célula con un conjugado que comprende un compuesto informador que sólo genera fluorescencia después de la entrada en la célula, cuyo informador está unido covalentemente a un compuesto de transporte potencial del que ha de examinarse su capacidad para ser internalizado por la célula contactada, y en el que el informador fluorógeno es un colorante fluorógeno como se ha definido antes;
- b)
- detectar si se genera fluorescencia después de dicha etapa de puesta en contacto; y
- c)
- correlacionar la generación de fluorescencia con la internalización del compuesto de transporte por la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se proporciona una biblioteca de
compuestos de la que ha de examinarse la capacidad de los compuestos
para ser internalizados por una célula, comprendiendo la biblioteca
una pluralidad de diferentes compuestos, en la que los diferentes
compuestos de la biblioteca están incorporados covalentemente a una
molécula informadora fluorógena según la invención.
También se proporciona un método para determinar
si tal biblioteca contiene compuestos que son transportados a una
célula, en el que dicho método comprende:
- a)
- proporcionar una biblioteca de conjugados informador-compuesto como se ha definido antes;
- b)
- poner en contacto los diferentes conjugados informador-compuesto con un cultivo de células; y
- c)
- determinar si dicho cultivo de células fluoresce cuando se pone en contacto con el conjugado informador-compuesto y correlacionar la generación de fluorescencia con la internalización del compuesto por la célula.
En otras realizaciones específicas, la presente
invención incluye métodos que comprenden examinar bibliotecas de
peptoides combinatorias para identificar peptoides que cruzan la
membrana celular y/o peptoides que funcionan para facilitar
transporte molecular, en los que los peptoides examinados están
incorporados covalentemente a una molécula informadora fluorógena,
y determinar si el conjugado resultante produce fluorescencia
aumentada cuando se pone en contacto con una célula. Los peptoides
pueden conjugarse con un compuesto fluorógeno de la invención.
Éstos y otros aspectos y ventajas se
evidenciarán de la lectura de la siguiente descripción conjuntamente
con los dibujos que se acompañan.
La Figura 1 muestra la fluorescencia de
bis(4-(2'-(trimetilamino)etanoditio)-2-2-dimetilbutiril)carboxifluoresceína
(compuesto 9, véanse Ejemplos) a lo largo del tiempo a pH 7,5 y
37ºC en un ensayo basado en células HeLa.
La Figura 2 muestra la fluorescencia del
compuesto 9 y un análogo no sustituido a lo largo del tiempo a pH
7,5, 37ºC.
La Figura 3 muestra la fluorescencia del
compuesto 9 después de 60 minutos en presencia de
\beta-mercaptoetanol
("\beta-ME") a pH 7,5, 37ºC, con
concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 mM de
\beta-ME.
Un "peptoide" es una poli(amida
N-sustituida), preferiblemente una
poli(glicina N-sustituida), como se conoce
en las técnicas de química y química bioorgánica, por ejemplo, en
las Publicaciones PCT de propiedad común WO 94/06451, WO 98/06437,
WO 99/08711 y las Patentes de los EE.UU. Nº 5.877.278, 6.251.433,
6.197.332, 6.075.121, 5.977.301, 5.965.695, 5.877.278 y 5.831.005.
En algunas realizaciones de la invención, los peptoides tienen la
estructura mostrada a continuación:
R^{a} y R^{c} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por alquilo, arilo,
aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los cuales
puede estar sustituido. En algunas realizaciones, R^{a} y/o
R^{c} está sustituido con un resto lípido, en el que el resto
lípido puede estar conjugado a un resto enlazador. R^{b} se
selecciona independientemente del grupo constituido por alquilo,
arilo, aralquilo, aralquenilo y aralquinilo, cualquiera de los
cuales puede estar sustituido. R_{21} y R_{22} se seleccionan
independientemente entre hidrógeno y alquilo inferior y alcoxi
inferior opcionalmente sustituidos. El índice p es un número entero
seleccionado de 2 a aproximadamente 50, más específicamente entre
alrededor de 4 y aproximadamente 30, todavía más específicamente
entre alrededor de 6 y aproximadamente 20 y aún más específicamente
entre alrededor de 8 y aproximadamente 15. Según se usa aquí, el
término "peptoide" abarca lipitoides y colesteroides, que se
describen en la Sección 1.1.3 y en las Patentes de los EE.UU. de
propiedad común Nº 6.251.433 y 6.197.332 y en las Publicaciones PCT
Nº WO 99/08711 y WO 98/06437.
Un "resto lípido" es un resto hidrófobo que
tiene un componente hidrocarbonado sustancial, que comprende
preferiblemente un grupo seleccionado entre alquilo, alquenilo o
alquinilo C_{10}-C_{50} ramificado o no
ramificado, arilo, aralquilo, aralquenilo o aralquinilo
C_{14}-C_{50}, o un núcleo esteroide. Los
ejemplos de restos lípidos incluyen dialquil o
dialquenilfosfolípidos, tales como fosfatidilcolinas,
fosfatidiletanolaminas y fosfatidilinositoles, glicolípidos, tales
como cerebrósidos y gangliósidos, diacilglicéridos grasos,
glicosilglicéridos, esfingolípidos y esteroides, incluyendo
esteroles.
Un "lipitoide" es un peptoide sustituido
con lípido, es decir, un compuesto descrito en la Sección 1.1.1 en
el que R^{a} comprende un resto lípido. Un "colesteroide" es
un peptoide sustituido con colesterol, es decir, un compuesto
descrito en la Sección 1.1.1 en el que R^{a} comprende un resto
colesterilo. Aunque se prefieren colesteroles en algunas
aplicaciones, se encuentra una descripción adicional de esteroides
útiles para incorporar a conjugados
esteroide-peptoide en la publicación PCT WO 97/46223
(Fasbender et al.) y en la correspondiente Patente de los
EE.UU. Nº 5.935.936.
"Alquilo" se refiere a un radical
monovalente acíclico totalmente saturado que contiene carbono e
hidrógeno que puede ser de cadena ramificada o recta. Son ejemplos
de grupos alquilo metilo, etilo, n-butilo,
t-butilo, n-heptilo e isopropilo.
"Alquenilo" se refiere a un radical monovalente acíclico que
contiene carbono e hidrógeno, que puede ser de cadena ramificada o
recta, y que contiene al menos un doble enlace
carbono-carbono. El grupo alquenilo puede ser
monoinsaturado o poliinsaturado. De modo similar, "alquinilo"
se refiere a un radical tal que tiene al menos un triple enlace
carbono-carbono. Alquilo (alquenilo, alquinilo,
alcoxi, etc.) "inferior" se refiere a un grupo que tiene de 1
a 6 carbonos, preferiblemente de 1 a 4 carbonos. Un grupo alquilo,
alquenilo o alquinilo puede estar sustituido opcionalmente; en
algunas realizaciones, el sustituyente se selecciona del grupo
constituido por halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, nitro,
amida, amino terciario, hidroxi y halo(alquilo
inferior).
"Arilo" se refiere a un radical aromático
monovalente sustituido o no sustituido que tiene un anillo simple
(por ejemplo, benceno) o dos o tres anillos condensados (por
ejemplo, naftilo o fenantrilo). Se prefieren generalmente grupos
que tienen un anillo simple (monocíclicos) o dos anillos condensados
(bicíclicos), siendo particularmente preferidos grupos
monocíclicos. El término incluye grupos heteroarilo, que son grupos
anillos aromáticos que tienen uno o más átomos de nitrógeno,
oxígeno o azufre en el anillo, tales como furano, pirrol, piridina,
imidazol e indol. Por "sustituido" se quiere decir que uno o
más átomos de hidrógeno del anillo en el grupo arilo están
sustituidos con un grupo no hidrógeno, seleccionado preferiblemente
entre halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, nitro, amida,
amino terciario, hidroxi y halo(alquilo inferior).
En un aspecto, la presente invención proporciona
nuevos compuestos fluorógenos que tienen la estructura mostrada a
continuación (4):
El sustituyente R_{5} es un resto
espirocíclico que tiene la fórmula:
en la que el anillo fenilo de
R_{5} puede orientarse hacia arriba o hacia abajo de la cara del
plano definido por el sistema de anillos condensados del compuesto
4. R_{2} y R_{4} tienen independientemente la
estructura:
en las que los índices m y n son
independientemente números enteros entre 0 y 5 inclusive, de tal
modo que la suma m + n es igual o menor que diez. R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{6}, R_{7} y R_{9-16} se
seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno,
halo, ciano, amino, azido, aldehído, mercapto, hidroxi, nitro y,
opcionalmente sustituidos, alquilo, cicloalquilo, alquenilo,
alquinilo, arilo, acilo, mono o di o trialquilamonio, guanidino,
carboxamido, carboxi, metilamino, haloacetamido, hidrazido,
maleimido, ceto, oxima, (mono, di, tri)halometilo, ácido
hidroxámico, hidroxilamino, alcoxi, sulfato, sulfonato, fosfato,
fosfonato, sulfonilo, sulfonamida, isotiocianato, halosulfonilo,
carboxiazido, semicarbazido, tiosemicarbazido, sulfonilhidrazido,
carbodimida. X_{1}-X_{5} pueden ser
independientemente oxígeno, azufre o NR_{17}, en el que R_{17}
es hidrógeno o alquilo inferior opcionalmente
sustituido.
En algunas realizaciones, X_{1} es oxígeno. En
realizaciones más particulares, X_{1}-X_{3} son
oxígeno. En realizaciones todavía más particulares,
X_{1}-X_{5} son oxígeno. Entre estas
realizaciones en las que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, realizaciones más específicas incluyen aquellas en las que
m es 2 y n es 3. La invención incluye además realizaciones en las
que X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3 y
R_{16} es trialquilamonio. En realizaciones más específicas,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones aún más
específicas aquellas en las que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 3, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es trialquilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre
estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{5}
son oxígeno, m es 2, n es 3, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
También se proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones todavía en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2 y n es 3,
R_{16} es dialquilamino. En realizaciones más específicas,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones más específicas
todavía aquellas en las que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 3, R_{16} es dialquilamino y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es dialquilamino, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo, y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre
estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 3, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo, y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
También se proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3,
R_{16} es dimetilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente
metilo o etilo, y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno o carboxilo; y, aún
más específicamente, X_{1}-X_{5} son oxígeno, m
es 2, n es 3, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo, y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2 y n es 0. La
invención incluye además realizaciones en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 3 y
R_{16} es trialquilamonio. En realizaciones más específicas,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones aún más
específicas aquellas en las que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 0, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es trialquilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre
estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 0, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
También se proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones todavía en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0, y
R_{16} es dialquilamino. En realizaciones más específicas,
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones aún más
específicas aquellas en las que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 0, R_{16} es dialquilamino y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es dialquilamino, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre
estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{5} son
oxígeno, m es 2, n es 0, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
También se proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{5} son oxígeno, m es 2, n es 0,
R_{16} es dimetilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente
metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno o carboxilo; y, aún
más específicamente, X_{1}-X_{5} son oxígeno, m
es 2, n es 0, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}. Entre estas realizaciones, realizaciones más específicas
incluyen aquellas en las que m es 2 y n es 3. La invención incluye
además realizaciones en las que X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3 y
R_{16} es trialquilamonio. En realizaciones más específicas
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son alquilo inferior opcionalmente sustituido. Son
realizaciones aún más específicas aquellas en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es trialquilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
Entre estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3,
R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son
independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno. También
se proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno
o carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemen-
te metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13} es carboxilo.
te metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13} es carboxilo.
En otras realizaciones todavía en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2 y n es 3, R_{16} es dialquilamino. En
realizaciones más específicas, X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3,
R_{16} es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones aún más
específicas aquellas en las que X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16}
es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son independientemente
metilo o etilo. Otras realizaciones más específicas incluyen
aquellas en las que X_{1}-X_{3} y X_{5} son
oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es
dialquilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente metilo o
etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre estas
últimas realizaciones, la invención proporciona una realización
específica en la que X_{1}-X_{3} y X_{5} son
oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es
dimetilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente metilo o
etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno. También se
proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 3, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno
o carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2 y n es 0. La invención incluye además
realizaciones en las que X_{1}-X_{3} y X_{5}
son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 3 y R_{16} es
trialquilamonio. En realizaciones más específicas,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son alquilo inferior opcionalmente sustituido. Son
realizaciones todavía más específicas aquellas en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es trialquilamonio y R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo. Otras realizaciones
más específicas incluyen aquellas en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es trialquilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno.
Entre estas últimas realizaciones, la invención proporciona una
realización específica en la que X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16}
es trimetilamonio, R_{14} y R_{15} son independientemente
metilo o etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno. También se
proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es trimetilamonio, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno
o carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
En otras realizaciones todavía en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0 y R_{16} es dialquilamino. En
realizaciones más específicas, X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 0,
R_{16} es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son alquilo
inferior opcionalmente sustituido. Son realizaciones aún más
específicas aquellas en las que X_{1}-X_{3} y
X_{5} son oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16}
es dialquilamino y R_{14} y R_{15} son independientemente
metilo o etilo. Otras realizaciones más específicas incluyen
aquellas en las que X_{1}-X_{3} y X_{5} son
oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es
dialquilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente metilo o
etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno. Entre estas
últimas realizaciones, la invención proporciona una realización
específica en la que X_{1}-X_{3} y X_{5} son
oxígeno y X_{4} es NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es
dimetilamino, R_{14} y R_{15} son independientemente metilo o
etilo y R_{3}, R_{4}, R_{6}, R_{7} y
R_{10}-R_{13} son hidrógeno. También se
proporcionan realizaciones en las que
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno o
carboxilo; y, aún más específicamente,
X_{1}-X_{3} y X_{5} son oxígeno y X_{4} es
NR_{17}, m es 2, n es 0, R_{16} es dimetilamino, R_{14} y
R_{15} son independientemente metilo o etilo y R_{3}, R_{4},
R_{6}, R_{7} y R_{10}-R_{13} son hidrógeno
o carboxilo, y al menos uno de los R_{10}-R_{13}
es carboxilo.
Los ejemplos particulares de las realizaciones
descritas antes incluyen los siguientes compuestos:
\newpage
Los compuestos de la invención pueden
sintetizarse usando procedimientos y materiales conocidos por los
que tienen experiencia en las técnicas de síntesis de química
orgánica, como se muestran en general en los siguientes Esquemas y
se ilustran en los Ejemplos. El siguiente Esquema 1 ilustra la
metodología de síntesis general para compuestos en los que R_{2}
y R_{8} son:
Esquema
1
Se proporciona seguidamente una metodología de
síntesis general (Esquema 2) para realizaciones de la invención en
las que R_{2} y R_{8} son:
\newpage
Esquema
2
En otro aspecto, los compuestos de la invención
son útiles como informadores para detectar la entrada en células
por compuestos específicos. Más específicamente, la incorporación de
un compuesto de la invención a otra molécula permite la detección y
cuantificación del transporte de la molécula a través de una
membrana celular. En una realización, el compuesto de la invención
se incorpora a una molécula a ensayar usando un grupo funcional
contenido en el compuesto fluorógeno de la invención, tal como,
aunque sin limitarse a él, un grupo ácido carboxílico situado en el
anillo aromático inferior del compuesto fluoróforo. Otros grupos
funcionales apropiados que pueden usarse en lugar de un ácido
carboxílico incluyen a modo de ejemplo amino, aminometilo,
halometilo, haloacetamido, mercapto, maleimido, hidrazido, oxima,
aldehído y ceto. La elección del grupo funcional será familiar para
los que tengan experiencia en las técnicas de síntesis orgánica y
bioquímica. Los compuestos a examinar por su capacidad para
facilitar la entrada en células por el informador fluorógeno de la
invención incluirán un grupo funcional que sea reactivo
adecuadamente con el grupo funcional del informador fluorógeno. Los
ejemplos de compuestos que pueden examinarse para entrada en células
con un fluoróforo según la invención incluyen, aunque sin limitarse
a ellos, péptidos, peptoides, proteínas, hidratos de carbono, ácidos
nucleicos, hidratos de carbono, pequeñas moléculas y bibliotecas
que contengan tales compuestos, bibliotecas aleatorias y no
aleatorias.
Pueden usarse también elementos enlazadores para
facilitar la incorporación a la molécula de ensayo. En algunos
casos puede ser beneficioso incorporar también un enlazador
divisible, por ejemplo, un enlace disulfuro o éster entre la
molécula informadora y el grupo transportador para permitir al
colorante fluorescente resultante salir de la célula al medio
circundante. La fluorescencia se detecta por fluorimetría u otros
métodos, según sea apropiado. La elección del enlazador será
familiar para los que tengan experiencia en las técnicas de
síntesis orgánica y bioquímica.
En una realización, el informador sujeto se usa
para examinar bibliotecas de peptoides combinatorias que contienen
moléculas transportadoras a células potenciales. Tales bibliotecas y
métodos para su síntesis se han discutido antes con detalle. En
realizaciones más específicas, las moléculas informadoras
fluorógenas de la invención se usan para examinar bibliotecas por
metodologías de examen de alta capacidad para identificar moléculas
de transporte que faciliten la entrada en células de moléculas
activas biológicamente, por ejemplo, agonistas o antagonistas de
enzimas, antibióticos, agonistas o antagonistas de hormonas,
moduladores de la expresión de genes y similares. La molécula de
transporte puede incluir además una molécula de "carga" que ha
de transportarse por el peptoide al medio intracelular.
En una realización, se sintetizan diversas
bibliotecas combinatorias de peptoides en una resina en fase sólida,
por ejemplo, una perla de resina, de tal modo que se incorpore un
compuesto a cada perla. El informador de la invención se conjuga
después con el compuesto peptoide en cada perla. En algunas
realizaciones, los peptoides incluirán además una molécula de
"carga" que ha de transportarse por el peptoide al medio
intracelular. Los ejemplos de moléculas de carga incluyen, aunque
sin limitarse a ellas, antibióticos, agonistas o antagonistas de
enzimas, análogos de hormonas, agentes promotores del crecimiento de
células, agentes inhibidores del crecimiento de células, agentes
anti-tumores y agentes inductores de apoptosis.
Después de la incorporación, el informador
putativo-molécula de transporte se divide de la
perla de resina y se examina en un ensayo basado en células para
determinar si se ha conseguido la entrada en células (en base a la
generación de fluorescencia por el compuesto de la invención).
Alternativamente, el informador fluorógeno de la invención puede
incorporarse a la molécula de transporte putativa (por ejemplo, el
peptoide) en solución después de la división de la perla de
resina.
El sistema informador proporcionado por la
presente invención es susceptible a cualquier célula en la que haya
de examinarse la entrada por compuestos deseados. Los ejemplos de
tales células incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, células
procariotas, células eucariotas, células de mamífero y células de
plantas. Los ejemplos más específicos de tipos de células incluyen:
fibroblastos, células epiteliales, células neurales, células
intestinales, células estaminales embriónicas y de adulto, células
de ovario, células de hígado, células de próstata, células de
riñón, células de vejiga, células de sangre, células de levadura,
células de bacterias y células inmunes. Los ejemplos de linajes
celulares de mamífero humano y no humano incluye, aunque sin
limitarse a ellos: HeLa, COS, CHO, BHK, Vero, SP2/0, DG44, HT1080,
NIH3T3, THP-1 y NR833.
El conjugado de
informador-molécula transportadora según la
invención puede añadirse a un cultivo de células, por ejemplo, un
cultivo de células HeLa, y medirse los niveles de fluorescencia del
cultivo de células para identificar si el compuesto transportador
putativo facilita la entrada en células (en base a un aumento de
fluorescencia). Esto puede conseguirse por adición a cultivos de
células de micropocillos, por ejemplo, un formato de 96 o 384
pocillos o en platinas. La fluorescencia se observará sólo en
cultivos de células cuando el compuesto de transporte putativo haya
entrado en las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar ciertos aspectos de la presente invención y para ayudar a
los expertos en la técnica a poner en práctica la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió potasio
bis(trimetilsilil)amida (4,62 g, 22 mmoles) a 100 ml
de THF anhidro bajo argón ("Ar") con agitación. La mezcla de
reacción se enfrió a -78ºC y se añadió gota a gota
\gamma-tiobutirolactona (10 mmoles, 0,87 ml)
seguida por yoduro de metilo (40 mmoles, 2,49 ml), y se dejó
calentarse gradualmente la mezcla de reacción hasta temperatura
ambiente mientras se agitaba durante la noche. El disolvente se
separó por evaporación con una corriente de N_{2} y el residuo se
sacudió con Na_{2}S_{2}O_{5} acuoso al 5% y EtOAc. La capa
acuosa se separó y extrajo con EtOAc (2x). Las capas orgánicas
combinadas se lavaron con NaHSO_{4} 1 N y la capa acuosa se
separó y extrajo con EtOAc (2x). Las capas orgánicas se
recombinaron, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se
concentraron. La purificación por cromatografía en gel de sílice
(2,5% de EtOAc en hexanos) dio la tiobutirolactona dimetilada (370
mg, rendimiento 28%). MH^{+} = 131,2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se preparó según un procedimiento
de la bibliografía: Pugh et al., Int. J. Peptide Prot.
Res. 1993, 42, 159. El rendimiento global fue 71%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 12 ml de ácido acético
("HOAc") a la tiobutirolactona 5 (349 mg, 2,68 mmoles) bajo Ar,
seguido por adición gota a gota (16 ml/h) de una solución de HOAc
(55 ml) que contenía el cloruro de sulfenilo 6 (664 mg, 3,48
mmoles). La solución se agitó durante la noche seguido por adición
de agua en exceso y agitación durante 1 h. La mezcla de reacción se
concentró, se co-evaporó con MeOH (3x), se
resuspendió en MeOH y se filtró (enjuague con MeOH). Los filtrados
de MeOH se concentraron y purificaron por cromatografía en gel de
sílice (1% de MeOH/0,2% de HOAc en CH_{2}Cl_{2}). Las fracciones
deseadas se agruparon, el disolvente se separó bajo vacío y el
residuo se co-evaporó con MeOH/MePh (3x) para
proporcionar el producto deseado 7 como un sólido amarillo (345 mg,
rendimiento 43%). MH^{+} = 303,4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió yoduro de S-acetiltiocolina
(100,5 g, 0,348 moles) a NaOH 1 N (600 ml) que se había burbujeado
con Ar. Se añadió NaOH 6 N (102 ml) adicional para ajustar el pH en
\sim 14. Después de agitar durante la noche, se enfrió la
reacción en un baño de hielo y se apagó por adición cuidadosa de HCl
concentrado (100 ml) bajo Ar. La solución se concentró, se
co-evaporó con MeOH (3x) y se secó bajo alto vacío
durante varios días para dar el producto tiol (152,4 g que
contenían 2,28 mmoles/g de tiocolina suponiendo rendimiento 100%). A
una solución en AcOH (10 ml) de 7 (333 mg, 1,1 mmoles) se añadió
una solución en AcOH (10 ml) de la tiocolina cruda (1 g, 2,28
mmoles) seguido por un enjuague con 20 ml de DMF para completar la
transferencia. Después de agitar durante la noche, se concentró la
reacción y se co-evaporó inicialmente con MeCN
(precaución: ebullición intermitente) y después con MeOH. El
residuo se redisolvió en MeCN/H_{2}O (20 ml), se filtró y se
purificó por HPLC de escala preparativa (columna C18 de fase
inversa; fases móviles: 0,1% de TFA/H_{2}O y 0,1% de TFA/MeCN).
Las fracciones deseadas se liofilizaron, y se liofilizaron después
2x de HCl 1,2 N y 1x de H_{2}O para dar el producto 8 deseado (79
mg, rendimiento 24%). M^{+} = 266,5.
Se añadió DMF (0,1 ml) a un matraz secado en
horno que contenía el ácido 8 (4,5 mg, 15 \mumoles, 3 eq) y HATU
(11,4 mg, 30 \mumoles, 6 eq) seguido por adición de
diisopropiletilamina (5,2 \mul, 30 \mumoles, 6 eq). Después de
agitar durante 0,5 h, se añadió fluoresceína (1,7 mg, 5 \mumoles,
1 eq) seguida por 4-(dimetilamino)piridina (1,8 mg, 15
\mumoles, 3 eq). Se añadió DMF adicional (0,2 ml) después de 1 h y
se agitó la reacción durante la noche. Se realizó una segunda
reacción a la misma escala que la primera, pero en la que se
sustituyó la DMF con dimetilacetamida como disolvente. Se permitió
transcurrir ambas reacciones durante unos pocos días (con adición
continua de disolvente) y se trataron después secuencialmente con
0,1% de TFA (0,5 ml) seguido por TFA puro (0,02 ml). Las mezclas
crudas se combinaron, solubilizaron en DMF, filtraron y purificaron
por HPLC preparativa (columna C18 de fase inversa; fases móviles
0,1% de TFA/H_{2}O y 0,1% de TFA/MeCN) para dar el producto
deseado 9 (2,4 mg, rendimiento 23%).
(M/2)^{2+} = 414,5.
(M/2)^{2+} = 414,5.
Se añadieron POCl_{3} (5 ml) y PCl_{5} (500
mg) con agitación a
5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína
(50 mg, 112 \mumoles). La mezcla de reacción se calentó a 115ºC
durante 1 h, y se dejó después enfriarse a temperatura ambiente. El
disolvente se separó bajo vacío y el residuo se
co-evaporó tres veces con CH_{2}Cl_{2}. Se
añadió al residuo agua con agitación a 0ºC. Se filtró la mezcla y se
lavó después el sólido con agua y se secó al aire. El sólido se
co-evaporó dos veces en cianonitrilo (CH_{3}CN)
para producir 52 mg (96%) del compuesto del título como un sólido
blanco. La identidad del producto se verificó por MS de
electropulverización (MH^{+} = 483).
Se añadieron al compuesto 10 (52 mg, 108
\mumoles) 5 ml de EtOH y NaSH\bulletxH_{2}O (235 mg, 1,08
mmoles) con agitación, y la mezcla se calentó a reflujo durante 90
min. Se dejó enfriarse la mezcla de reacción a temperatura ambiente
y se evaporó el disolvente con una corriente de nitrógeno. Se añadió
al residuo ácido clorhídrico (HCl) 0,1 N que contenía 5% de
Na_{2}S_{2}O_{5} con agitación, y se filtró la mezcla. El
sólido se lavó con HCl 0,1 N y se secó al aire para proporcionar el
compuesto del título como un sólido beige. La identidad del
producto se verificó por MS de electropulverización (MH^{+} =
477/479).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 11 se disolvió en SO_{2}Cl_{2}
(4 ml) y CH_{2}Cl_{2} (4 ml) con agitación y se calentó a
reflujo durante 1 h. La reacción se enfrió a temperatura ambiente,
el disolvente se separó bajo vacío y el residuo se
co-evaporó tres veces con CH_{2}Cl_{2}. El
residuo se disolvió en 5 ml de AcOH, se añadió con agitación
tiocolina (sal de ácido trifluoroacético, 111 mg, 477 \mumoles) y
la mezcla se calentó a reflujo durante 2 h. La mezcla de reacción
se enfrió a temperatura ambiente y se purificó después por HPLC de
fase inversa para proporcionar el compuesto del título. La
identidad del producto se verificó por MS de electropulverización
(M/2^{2+} = 357).
Se realizó un experimento para determinar el
efecto de condiciones reductoras frente a condiciones no reductoras
en un compuesto informador según la invención (compuesto 9). Se
realizaron dos incubaciones con el compuesto 9 en una concentración
de 50 mM. Se realizó una incubación testigo que comparaba la misma
concentración molar del compuesto 9 en fosfato de Na 10 mM a pH
7,5. Se hizo una composición de reacción reductora que comprendía
el mismo tampón y ditiotreitol (DTT) 10 mM. Después de un minuto de
incubación a temperatura ambiente, se midió una fuerte
fluorescencia verde. En consecuencia con estos resultados de
fluorescencia, el análisis de espectrometría de masas reveló que la
reacción testigo contenía sólo compuesto 9, y que la composición de
reacción que contenía DTT contenía sólo fluoresceína. Para este
ejemplo, se realizó la síntesis del compuesto como se ha descrito
previamente.
La Figura 1 contiene la fluorescencia
(excitación 485 nm, emisión 535 nm) del compuesto 9 a lo largo del
tiempo en diversas condiciones. Para las condiciones marcadas
"optimem" (círculo rojo completo), se incubó 9 en Optimem
(Gibco BRL), un medio de cultivo de células de suero reducido. Para
las condiciones marcadas "lisado de células" (cuadrado verde
completo), se incubó 9 en un lisado de células HeLa preparado a
partir de 2 x 10^{6} células lisadas por
congelación/descongelación en un tampón que contenía
Tris-HCl 20 mM, NaCl 137 mM, 1% de Triton y 15% de
glicerol en un volumen de 100 \mul. Para las condiciones marcadas
"tampón + sal" (triángulo marrón completo), se incubó 9 en
fosfato de Na 10 mM que contenía NaCl 154 mM, y para las condiciones
marcadas "\beta-ME 10 mM" (diamante naranja
completo), se incubó 9 en fosfato de Na 10 mM que contenía NaCl 154
mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM. La concentración
de 9 fue 50 \muM en cada caso, diluido desde una solución madre 2
mM en DMF. Todos los experimentos se realizaron a 37ºC, y a un pH
de 7,5, excepto "lisado de células" para el que el pH fue
aproximadamente 7,8. El volumen total de cada incubación fue 100
\mul. Los resultados se expresan como porcentaje de la
fluorescencia de un testigo de fluoresceína en la misma
concentración y en las mismas condiciones.
La Figura 2 muestra la fluorescencia (excitación
485 nm, emisión 535 nm) a lo largo del tiempo del compuesto 9 y un
análogo en el que los sustituyentes
\alpha,\alpha-dimetilo en los grupos acilo se
han reemplazado por sustituyentes
\alpha,\alpha-dihidrógeno. Cada compuesto se
incubó con una concentración de 50 \muM (diluido desde una
solución madre 2 mM en DMF) en fosfato de Na 10 mM, pH 7,5, que
contenía NaCl 154 mM, a 37ºC. El volumen de cada incubación fue 100
\mul. Los resultados se expresan como porcentaje de la
fluorescencia de un testigo de fluoresceína en la misma
concentración y en las mismas condiciones.
La Figura 3 muestra la fluorescencia (excitación
485 nm, emisión 535 nm) del compuesto 9 después de una incubación
de 60 minutos en fosfato de Na 10 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 154
mM y \beta-mercaptoetanol con concentraciones de
0,1, 1, 10 y 100 mM. El volumen de cada incubación fue 100 \mul y
la temperatura fue 37ºC. Los resultados se expresan como porcentaje
de la fluorescencia de un testigo de fluoresceína en la misma
concentración y en las mismas condiciones.
Se realizó un experimento para ensayar la
capacidad del compuesto 12 para responder a condiciones reductoras.
Se efectuaron dos incubaciones: en la primera, una incubación
testigo, se añadió una muestra de compuesto 12 a tampón de pH 7,5.
En una segunda incubación (+DTT), se añadió la misma cantidad de
compuesto 12 a tampón de pH 7,5 y se añadió después DTT hasta una
concentración final de 10 mM. En un minuto tras la adición de DTT a
la segunda incubación, la solución se volvió azul clara, indicando
la formación del colorante de dicloroditiofluoresceína libre. La
incubación testigo permaneció incolora.
Claims (30)
1. Un colorante fluorógeno que tiene la
estructura
en la que R_{5} es un resto
espirocíclico que tiene la
fórmula:
en la que el anillo fenilo de
R_{5} está orientado por encima o por debajo de la cara del plano
definido por el sistema de anillos condensados del
compuesto;
en la que R_{2} y R_{8} tienen
independientemente la estructura:
en la que los índices m y n son
independientemente números enteros entre 0 y 5 inclusive, de tal
modo que la suma m + n es igual o menor que
diez;
en la que R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{6},
R_{7} y R_{9-16} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por hidrógeno, halo,
ciano, amino, azido, aldehído, mercapto, hidroxi, nitro y,
opcionalmente sustituidos, alquilo, cicloalquilo, alquenilo,
alquinilo, arilo, acilo, mono o di o trialquilamonio, guanidino,
carboxamido, carboxi, metilamino, haloacetamido, hidrazido,
maleimido, ceto, oxima, (mono, di, tri)halometilo, ácido
hidroxámico, hidroxilamino, alcoxi, sulfato, sulfonato, fosfato,
fosfonato, sulfonilo, sulfonamida, isotiocianato, halosulfonilo,
carboxiazido, semicarbazido, tiosemicarbazido, sulfonilhidrazido,
carbodimida; y
en la que X_{1}-X_{5} se
seleccionan independientemente del grupo constituido por oxígeno,
azufre y NR_{17}, en el que R_{17} es hidrógeno o alquilo
inferior opcionalmente sustituido.
2. El colorante fluorógeno de la reivindicación
1ª, en el que la estructura se selecciona del grupo constituido
por.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El colorante de la reivindicación 1ª, en el
que la estructura es:
4. El colorante la la reivindicación 1ª, en el
que la estructura es:
5. Un método de examen de alta capacidad para
identificar compuestos en una biblioteca de compuestos que son
compuestos de transporte, en el que un compuesto de transporte se
refiere a un compuesto que es internalizado por una célula, que
comprende:
a) incorporar los compuestos individuales de una
biblioteca de compuestos a una fase sólida mediante un enlace
divisible, en el que cada uno de dichos compuestos individuales se
incorpora directa o indirectamente a un informador fluorógeno que
se hace fluorescente tras entrar en la célula, en el que el
informador fluorógeno es un colorante fluorógeno según una de las
reivindicaciones 1ª-4ª;
b) liberar de la fase sólida el conjugado
informador-compuesto;
c) poner en contacto con una célula los
conjugados informador-compuesto liberados; y
d) determinar si dicho compuesto es una molécula
transportadora en base a si hay un cambio de fluorescencia
detectable.
6. El método de la reivindicación 5ª, en el que
la fase sólida es una perla.
7. El método de la reivindicación 5ª, en el que
la biblioteca combinatoria es una biblioteca de peptoides.
8. El método de la reivindicación 5ª, en el que
la biblioteca combinatoria se selecciona entre una biblioteca de
péptidos, peptoides, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o
moléculas pequeñas.
9. El método de la reivindicación 5ª, en el que
la molécula de transporte incluye además una molécula de carga.
10. El método de la reivindicación 9ª, en el que
la molécula de carga es un agente activo.
11. El método de la reivindicación 10ª, en el
que dicho agente activo es un antibiótico, inhibidor de enzimas,
agonista o antagonista de hormonas o modulador del crecimiento de
células.
12. El método de la reivindicación 11ª, en el
que el agente activo es un antibiótico.
13. Un método para determinar si un compuesto es
una molécula de transporte que se internaliza por una célula, que
comprende:
a) poner en contacto una célula con un conjugado
que comprende un compuesto informador que sólo genera fluorescencia
después de la entrada en la célula, cuyo informador está unido
covalentemente a un compuesto de transporte potencial del que ha de
examinarse su capacidad para ser internalizado por la célula
contactada, y en el que el informador fluorógeno es un colorante
fluorógeno según una de las reivindicaciones 1ª-4ª;
b) detectar si se genera fluorescencia después
de dicha etapa de puesta en contacto; y
c) correlacionar la generación de fluorescencia
con la internalización del compuesto de transporte por la
célula.
14. El método de la reivindicación 13ª, en el
que el compuesto de transporte potencial se incorpora a una fase
sólida por un enlace divisible y se libera de ella antes de poner en
contacto con la célula.
15. El método de la reivindicación 14ª, en el
que la fase sólida es una perla resinosa.
16. El método de la reivindicación 13ª, en el
que el compuesto de transporte potencial se selecciona del grupo
constituido por un péptido, proteína, ácido nucleico, peptoide,
hidrato de carbono y un esteroide.
17. El método de la reivindicación 13ª, en el
que el compuesto de transporte potencial está contenido en una
biblioteca química combinatoria.
18. El método de la reivindicación 17ª, en el
que la biblioteca química combinatoria es una biblioteca de
peptoides.
19. El método de la reivindicación 13ª, en el
que el informador es incorporado químicamente al compuesto de
transporte potencial a examinar por su capacidad para ser
internalizado por una célula mientras está en solución.
20. El método de la reivindicación 13ª, en el
que el informador es incorporado químicamente al compuesto de
transporte potencial del que examinar si es internalizado por una
célula mientras tal compuesto está incorporado a una fase
sólida.
21. Una biblioteca de compuestos de la que ha de
examinarse la capacidad de los compuestos para ser internalizados
por una célula, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de
diferentes compuestos, en la que los diferentes compuestos de la
biblioteca se incorporan covalentemente a una molécula informadora
fluorógena que se hace fluorescente después de internalizarse en
una célula, en la que la molécula informadora fluorógena es un
colorante fluorógeno según una de las reivindicaciones 1ª-4ª.
22. La biblioteca de la reivindicación 21ª, en
la que el informador fluorógeno es un colorante fluorógeno según la
reivindicación 2ª.
23. La biblioteca de la reivindicación 21ª, en
la que cada uno de dichos conjugados de compuesto diferentes se
incorpora a una fase sólida.
24. La biblioteca de la reivindicación 23ª, en
la que cada uno de dichos conjugados de compuesto diferentes está
comprendido en micropocillos diferentes.
25. La biblioteca de la reivindicación 23ª, en
la que dichos conjugados diferentes están comprendidos en platinas
o discos o pociones discretas de dichas platinas o discos
diferentes.
26. Un método para determinar si una biblioteca
contiene compuestos que se transportan a una célula que
comprende:
a) proporcionar una biblioteca de conjugados
informador-compuesto según la reivindicación
21ª;
b) poner en contacto los conjugados
informador-compuesto diferentes con un cultivo de
células; y
c) determinar si dicho cultivo de células
fluoresce cuando se pone en contacto con el conjugado
informador-compuesto y correlacionar la generación
de fluorescencia con la internalización del compuesto por la
célula.
27. El método de la reivindicación 26ª, en el
que el cultivo de células está comprendido en un micropocillo.
28. El método de la reivindicación 26ª, en el
que el cultivo de células está en una platina cubierta.
29. El método de la reivindicación 26ª, en el
que la fluorescencia se detecta por formación de imagen directa.
30. El método de la reivindicación 26ª, en el
que la fluorescencia se detecta por citometría de flujo.
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