ES2314895T3 - Reactivo y procedimiento para evitar la expresion dependiente del tiempo en celulas biologicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para evitar la expresión ilegítima dependiente del tiempo de ARNm en células biológicas en una muestra ex vivo, caracterizado porque la muestra se mezcla con un reactivo que contiene un donante de formaldehído, así como dado el caso un líquido.
Description
Reactivo y procedimiento para evitar la
expresión dependiente del tiempo en células biológicas.
La presente invención se refiere a un reactivo
para evitar la expresión inducida dependiente del tiempo en células
biológicas en una muestra. De la misma manera se refiere a un
procedimiento para ello, así como a preparados celulares tratados
de este modo.
Los reactivos de este tipo y los procedimientos
de este tipo se necesitan especialmente en el campo del análisis
biológico molecular y del diagnóstico médico, especialmente del
diagnóstico de tumores.
Muchos procedimientos de detección van dirigidos
a analizar la expresión génica a nivel de ARNm. En este sentido,
los genes expresados pueden evaluarse como detección de células
especiales. Pero también puede usarse el modelo de expresión de
todos los genes investigados para sacar conclusiones del estado de
una célula o para caracterizar sus diferencias comparando dos
muestras biológicas.
Se describió que entre la toma de la muestra y
el análisis de la muestra puede producirse la degradación de ARNm
transcrito en la muestra debido a modificaciones en las condiciones
ambiente de la muestra posteriores a la toma de la muestra (Becker
S. y col., 2004 Clin Chem 50 (4), 785-786).
Pero de manera sorprendente se produce otro
problema grave en el procedimiento descrito en la solicitud para
detectar ARNm asociado a células, y concretamente una expresión
ilegítima dependiente del tiempo de ARNm ex vivo (ex
vivo = fuera del cuerpo humano o animal). Después de la toma de
la muestra puede inducirse la expresión de nuevo ARNm. Esta
expresión inducida dependiente del tiempo falsea el resultado del
análisis. La presente invención se ocupa de este problema.
Una expresión inducida dependiente del tiempo
ilegítima de este tipo ya se describe en una pluralidad de
publicaciones, por ejemplo en Baechler y col., Genes Immun. tomo 5,
página 347 a 353 (2004).
Últimamente se han desarrollado procedimientos
de análisis altamente sensibles, por ejemplo tal como se describen
en el documento EP 02 732 726 A1. La detección de células tumorales
en sangre humana según el procedimiento del documento EP 02 732 726
depende de que el estado de expresión en el momento de la extracción
de sangre se mantenga hasta el análisis. Con el procedimiento
descrito en el documento EP 02 732 726, células tumorales se
enriquecen inmunomagnéticamente mediante al menos dos anticuerpos
cuyo ARNm se aísla y se investiga la expresión de al menos dos
marcadores de ARNm asociado a tumores. Sin embargo, ya después de
algunas horas (valor de 24 h mostrado en la figura 3) se detectan
transcritos sin tratamiento especial de las muestras de sangre que
no estaban presentes en el momento de la extracción de sangre. Esta
transcripción ilegítima lleva a un resultado positivo
falso.
falso.
Los procedimientos descritos, que sólo van
dirigidos a evitar la degradación de ARNm presente, así como a
estabilizar la morfología y la estructura de los antígenos de
células, no son adecuados para ser combinados con el procedimiento
del documento EP 02 732 726. Se probaron, por ejemplo, los reactivos
CellSave® (Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA, EE.UU.) y
Cyto-Chex® (Streck Laboratories, Omaha, NE, EE.UU.),
con los que se estabilizaron muestras contra la degradación de ARNm
según las indicaciones del fabricante. Sin embargo, en este sentido
se ha mostrado que la detección de células tumorales según el
procedimiento del documento EP 02 732 726 ya no es posible ya que
no puede obtenerse ningún resultado significativo (véase la figura
5). En consecuencia, el problema de la expresión inducida
dependiente del tiempo no se resuelve con los procedimientos
conocidos.
Por tanto, la presente invención se pone como
objetivo facilitar un reactivo, así como un procedimiento para
evitar y reducir la expresión inducida dependiente del tiempo en
células biológicas en una muestra, así como sus preparados
celulares tratados.
Este objetivo se alcanza mediante el reactivo
según la reivindicación 1, el preparado celular según la
reivindicación 9, así como el procedimiento según la reivindicación
15. Variantes ventajosas del reactivo, del preparado celular, así
como del procedimiento para evitar la expresión inducida dependiente
del tiempo se dan en las reivindicaciones dependientes
respectivas.
La presente invención también se ocupa
satisfactoriamente por primera vez de impedir la nueva síntesis de
ARNm (expresión inducida dependiente del tiempo). Esto posee en la
utilización de métodos de análisis modernos altamente sensibles una
importancia al menos igual que la estabilización considerada hasta
la fecha de los antígenos de superficie o el ARNm de las células
diana. Sólo así es posible caracterizar inequívocamente las células
diana mediante su expresión de ARNm.
Se encontró de manera sorprendente que la
adición de un donante de formaldehído en concentración muy baja a
una muestra biológica, concretamente en una concentración \leq
0,075% (p/v), de manera ventajosa < 0,045% (w/v), de manera
ventajosa \leq 0,025% (p/v) lleva a un impedimento de la expresión
ilegítima dependiente del tiempo. En este sentido, como donante de
formaldehído puede utilizarse urea de imidazolidinilo (IDU), urea
de diazolidinilo (DU),
dimetilol-5,5-dimetilhidantoína,
urea de dimetilol,
2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol
(bronopol),
1,3-bis(hidroximetil)-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona
(DMDM hidantoína), ácido
N5-metil-tetrahidrofólico, ácido
N10-metil-tetrahidrofólico o una
mezcla de éstos.
Por tanto, con el reactivo según la invención,
así como el procedimiento según la invención, es posible por
primera vez evitar la expresión inducida dependiente del tiempo en
células biológicas en una muestra ex vivo, así como hacer
posible una conservación de células tumorales diseminadas en
muestras de sangre de pacientes con cáncer.
Para esto, después de la extracción de sangre,
el reactivo, dado el caso disuelto en solución de cloruro de sodio
tamponada con fosfato (PBS), así como con adición del inhibidor de
la coagulación EDTA en la concentración final especificada, se
mezcla inmediatamente con la sangre. Entonces, la muestra puede
guardarse durante un periodo de tiempo de varios días, por ejemplo
hasta al menos 72 h a 4ºC, sin que se produzca expresión ilegítima
dentro de la muestra. Además, a la muestra puede añadírsele otras
sustancias estabilizadoras de células, como por ejemplo
polietilenglicol (PEG) y/o inhibidores de proteasas.
Para demostrar el efecto según la invención, en
los siguientes ejemplos se investigó el efecto de los aditivos
según la invención en la especificidad de una detección de células
tumorales mediante análisis de muestras de sangre de donantes
sanos, así como de pacientes con tumores. Además, se investigó el
efecto de los aditivos según la invención en la sensibilidad de la
detección de células tumorales mediante análisis de muestras de
sangre de donantes sanos con células tumorales inoculadas. En este
sentido, el análisis se realiza mediante selección celular previa y
posterior análisis del perfil de expresión como se describe en la
solicitud de patente europea EP 02 732 726. Esta solicitud de
patente europea se adopta en su totalidad en la presente solicitud
con respecto al procedimiento de análisis allí dado a conocer.
Además, se determinó la sensibilidad clínica
mediante análisis de muestras de sangre estabilizadas de pacientes
con cáncer de mama y colorrectal. Todos los pacientes investigados
se encontraban en un estadio avanzado de enfermedad (M1) y fueron
tratados con terapias paliativos. Los aditivos según la invención se
mezclaron inmediatamente después de la extracción de las muestras
de sangre con las muestras de sangre y se analizaron inmediatamente,
después de
24 h, 48 h y después de 72 h de almacenamiento a 4ºC.
24 h, 48 h y después de 72 h de almacenamiento a 4ºC.
En este sentido debe mencionarse que todos los
siguientes ejemplos se refieren concretamente a muestras de sangre,
pero el procedimiento según la invención también es adecuado para
investigar otras suspensiones celulares o muestras de tejido. En
este sentido, suspensiones celulares pueden ser fluidos corporales o
también células de tejidos en suspensión, por ejemplo, porciones de
tejido, cortes de tejidos y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestran
Figura 1 la detección de la transcripción
inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre tratadas con
IDU 24 h después de la extracción;
figura 2 la detección de la transcripción
inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre tratadas con
IDU 48 h después de la extracción;
figura 3 la detección de la transcripción
inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre sin
tratar;
figura 4 el registro de 2 células tumorales de
mama en muestras de sangre tratadas con IDU;
figura 5 el registro de células tumorales de
mama en muestras de sangre tratadas con distintos sistemas;
figura 6 ejemplos típicos de la detección de
células tumorales diseminadas en muestras de sangre tratadas con
IDU de pacientes con cáncer de mama;
figura 7 la detección de la transcripción
inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre tratadas con
DU;
figura 8 la detección de la transcripción
inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre tratadas con
bronopol.
En todos los ejemplos representados a
continuación se realizó un análisis como se describe en el documento
EP 02 732 726. En este sentido, para la selección celular se
acoplaron anticuerpos a partículas magnéticas. En este sentido,
como anticuerpos se usaron los anticuerpos representados a
continuación en la tabla 1.
En este sentido, las partículas magnéticas se
usaron en una concentración de 4 x 10^{8} perla/ml (kit
CELLection^{TM} Pan Mouse IgG, empresa Dynal). Las relaciones
entre la concentración de anticuerpos y los anticuerpos acoplados a
ellas se reproducen en la tabla 2.
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Las partículas magnéticas así preparadas se
mezclaron a partes iguales y se añadieron a la sangre (EDTA)
en
100 \mul de PBS por cada 5 ml de muestra.
100 \mul de PBS por cada 5 ml de muestra.
Después de 30 min de incubación en el agitador
superior, las partículas magnéticas, que dado el caso se presentaron
como complejos de partículas magnéticas
célula-anticuerpo, se lavaron 3 veces con PBS
mediante un concentrador de partículas magnéticas (MPC®-S, empresa
Dynal) y las células adhesivas se trataron a continuación
correspondientemente al protocolo de aislamiento de ARNm descrito a
continuación.
El aislamiento de ARNm se realizó mediante
partículas magnéticas acopladas a Oligo(dT), Dynabeads® mRNA
Direct^{TM} Micro Kit (empresa Dynal). Este aislamiento se
realizó correspondientemente a las indicaciones del fabricante
especificadas en el kit.
Al aislamiento del ARNm le sigue una
transcripción inversa en la que el ARNm se trascribe en ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de ADNc se realiza en una mezcla de
reacción de 20 \mul.
La síntesis de ADNc (tabla 3) se realizó a 37ºC
durante una hora con posterior inactivación de la transcriptasa
inversa mediante calentamiento durante 5 minutos a 95ºC y posterior
enfriamiento en hielo. Para esto se usó un kit Sensiscript Reverse
Transcriptase, empresa Qiagen, Hilden según los protocolos allí
especificados.
A continuación de la transcripción del ARNm en
ADNc se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con
\beta-actina como control interno.
En este sentido se usaron los oligonucleótidos
citados en la tabla 4 como cebadores de PCR para la amplificación
de ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR se realizó con la mezcla especificada en
la tabla 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis por PCR se realizó en una mezcla de
reacción de 50 \mul.
Las condiciones de PCR (número de ciclos,
control de ciclos, etc.) se indican en la tabla 6; las
modificaciones de temperatura se realizaron con 2ºC/s.
Los amplificados así producidos de ADNc se
separaron electroforéticamente mediante un bioanalizador 2100
(empresa Agilent). Para esto, 1 \mul del producto de PCR se
separó en el bioanalizador sobre un chip de ADN 1000 y el resultado
de la separación se documentó electrónicamente. El resultado del
análisis dio positivo cuando la intensidad de bandas de al menos un
marcador tumoral es > 6,7. La intensidad de bandas se corresponde
con la unidad "altura del pico" de Agilent. Los picos con una
altura de < 4,0 se evalúan negativamente. Los picos cuya altura
se encuentre de 4,0 a 6,7 no pueden evaluarse ni como positivos ni
como negativos. De esta manera se produjeron y se evaluaron las
figuras 1 a 6.
La figura 1 muestra la detección de la
transcripción inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre
tratadas con IDU.
En este sentido, la banda 1 muestra una escala
con marcadores de tamaño, las bandas 2 a 11 muestran los fragmentos
de ADN amplificados de los transcritos asociados a tumores que van a
detectarse en diez donantes sanos distintos y un control interno de
\beta-actina. La posición de las bandas
respectivas para \beta-actina (actina) y los tres
transcritos asociados a tumores GA733-2 (384 pb),
MUC-1 (292 pb) y Her-2 (265 pb) se
describen en la fig. 1.
En este sentido, las muestras de los diez
donantes sanos se mezclaron con 0,045% (p/v) de IDU y a continuación
se guardaron a 4ºC durante 24 h. Los fragmentos de ADN amplificados
se detectaron después del análisis de las muestras de sangre
mediante electroforesis capilar en gel de alto voltaje en un
bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). Puede verse que el
análisis en los diez donantes sanos (donante 1 a donante 10 en las
bandas 2 a 11) ha resultado negativo (alturas de picos por debajo
del valor umbral). Es decir, no puede detectarse ningún tipo de
expresión inducida dependiente del tiempo ilegítima.
La figura 2 muestra la misma investigación, pero
ahora después del almacenamiento de las muestras de los diez
donantes sanos durante 48 h. Aquí tampoco pudo detectarse expresión
dependiente del tiempo de transcritos asociados a tumores.
Por el contrario, la figura 3 muestra las mismas
muestras de sangre que en la figura 1 y en la figura 2 pero sin
adición de 0,025% (p/v) de IDU. Puede verse que en estas muestras de
sangre no tratadas se produjo expresión ilegítima de transcritos
asociados a tumores.
Con las investigaciones según las figuras 1 a 3
se detectó claramente que con las concentraciones especificadas de
un donante de formaldehído puede suprimirse eficazmente la expresión
inducida dependiente del tiempo ilegítima en células dentro de un
preparado celular. Los aditivos según la invención obtienen una alta
especificidad.
Por el contrario, la figura 4 muestra el
registro de células tumorales de mama en muestras de sangre tratadas
con 0,045% (p/v) de IDU de diez donantes sanos (bandas 2 a 10). En
estas muestras se inocularon en cada 5 ml de sangre dos células de
cáncer de mama (MCF7). La investigación representada en el modelo de
expresión de los transcritos asociados a tumores
Her-2, MUC-1 y GA733.2 se realizó
después de un almacenamiento de las muestras de sangre a 4ºC
durante 48 h. Todos los otros parámetros de análisis se corresponden
con los de las figuras 1 a 3. Puede verse que los transcritos
asociados a tumores Her-2, MUC-1 y
GA733.2, que fueron introducidos en las muestras de sangre mediante
la inoculación de células de cáncer de mama MCF7, se detectan
claramente. La figura 4 muestra claramente con esto que también
pueden detectarse cantidades de células tan pequeñas, como 2
células/5 ml de sangre, incluso después de 48 h cuando la muestra de
sangre se trató según la invención sin impedir la detección
mediante expresión inducida dependiente del tiempo ilegítima.
Mediante el procedimiento según la invención también se evita una
pérdida de sensibilidad de la detección de células tumorales
buscada.
La figura 5 muestra experimentos comparativos
con la solución de estabilización habitual en el mercado
"CellSave" de Immunicon. Para esto, en cada 5 ml de sangre de
donantes sanos se inocularon respectivamente 5 células de cáncer de
mama (HCC1954). Dos de las muestras se trataron con 0,025% (p/v) de
IDU según la invención y se guardaron a 4ºC (bandas 2 y 3). Otras
dos muestras se trataron de modo correspondiente, pero se guardaron
a 25ºC (bandas 6 y 7). Otras dos muestras se estabilizaron con el
producto CellSave según las indicaciones del fabricante y se
guardaron a 4ºC (bandas 4 y 5). Las dos últimas muestras en la
figura 5 (bandas 8 y 9) también se estabilizaron con CellSave según
las indicaciones del fabricante y se guardaron a 25ºC.
Como puede verse, se registra la expresión de
los marcadores tumorales Her-2,
MUC-1 y GA733.2 en las células de cáncer de mama
inoculadas, así como del marcador \beta-actina, en
las muestras tratadas según la invención (bandas 2, 3, 6, 7). Con
las muestras estabilizadas con la solución de estabilización
comercial CellSave (bandas 4, 5, 8, 9) no fue posible una detección
sensible ni del marcador \beta-actina ni de los
marcadores tumorales Her-2, MUC-1 y
Ga733.2.
Esto muestra que, en comparación con el estado
de la técnica, mediante el tratamiento según la invención se logra
una conservación muy eficaz del modelo de expresión en una muestra
biológica que permite realizar el análisis posterior de forma
altamente selectiva y sensible.
La figura 6 muestra el análisis de muestras de
sangre de pacientes con cáncer de mama inmediatamente después de la
extracción de muestras de sangre, después de 24 h, así como después
de 48 h. Todas estas muestras se mezclaron inmediatamente después
la extracción de sangre con 0,025% (p/v) de IDU y se guardaron a
4ºC.
La figura 6 muestra en las bandas 2 a 4 los
resultados de la investigación de la muestra de sangre de un
paciente inmediatamente después de la extracción de sangre, después
de 24 h y 48 h después de la extracción de sangre. Se muestra que
el modelo de expresión respecto al tiempo permanece en gran parte
igual y por lo tanto la adición de IDU lleva a una conservación del
modelo de expresión. En este sentido es decisivo que tampoco se
produzca ningún tipo de expresión inducida dependiente del tiempo
ilegítima. Esto también es el caso de la muestra del segundo
paciente, que se siguió respecto al tiempo en las bandas 5 a 7.
Obviamente, éste no presenta células tumorales circulantes en la
muestra de sangre. Tampoco se estableció una expresión inducida
dependiente del tiempo. La muestra del paciente 3 también muestra
en las bandas 8 a 10 que con el tratamiento mediante el 0,025%
(p/v) de IDU pudo lograrse una conservación del modelo de expresión
durante más de 48 h.
Resumiendo puede establecerse que la detección
de células tumorales en muestras de sangre tratadas con 0,025%
(p/v) de IDU de pacientes con cáncer de mama muestra resultados
uniformes inmediatamente después de la extracción, después de 24 h
y después de 48 h, es decir, muestras de sangre en las que en el
momento de la extracción pudieron detectarse células tumorales,
también muestran después de 24 h y 48 h una detección de células
tumorales positiva, mientras que muestras sin células tumorales
también permanecen negativas después de 24 y 48 h, es decir, no
producen resultados positivos falsos que pudieran producirse ex
vivo mediante una expresión dependiente del tiempo. Las
muestras de sangre investigadas también muestran durante un periodo
de tiempo de 48 h un modelo de expresión constante, es decir,
muestras que al principio eran negativas permanecieron negativas y
muestras positivas permanecieron positivas.
La figura 7 muestra la detección de la
transcripción inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre
tratadas con DU. La detección se realizó según los protocolos
descritos para IDU.
En este sentido, la banda 1 muestra una escala
con marcadores de tamaño, las bandas 2 a 4 muestran los fragmentos
de ADN amplificados de los transcritos asociados a tumores que van a
detectarse en un donante sano y un control interno de
\beta-actina. Las bandas 5 a 7 muestran los
transcritos de las muestras con 2 células inoculadas de la línea de
células tumorales Calu-3 en los momentos 0 h, 24 h y
48 h. La posición de las bandas respectivas para
\beta-actina (actina) y los tres transcritos
asociados a tumores GA733-2 (384 pb),
MUC-1 (292 pb) y Her-2 (265 pb) se
describen en la fig. 7.
En este sentido, las muestras se mezclaron con 2
células Calu-3 inoculadas con 0,01% (p/v) de DU y a
continuación se guardaron a 4ºC durante 48 h como máximo. Los
fragmentos de ADN amplificados se detectaron después del análisis
de las muestras de sangre mediante electroforesis capilar en gel de
alto voltaje en un bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). Puede
verse que el análisis en todas las muestras sin células inoculadas
(bandas 2 a 4) ha resultado negativo (alturas de picos por debajo
del valor umbral). Es decir, no puede detectarse ningún tipo de
expresión inducida dependiente del tiempo ilegítima.
En las bandas 5 a 7 puede verse que los
transcritos asociados a tumores, que se introdujeron en las muestras
de sangre mediante la inoculación de células cancerosas
Calu-3, se detectan claramente. La figura 7 muestra
claramente con esto que también pueden detectarse pequeños números
de células incluso después de 48 h cuando la muestra de sangre se
trató según la invención sin impedir la detección mediante expresión
inducida dependiente del tiempo ilegítima. Mediante el
procedimiento según la invención también se evita una pérdida de
sensibilidad de la detección de células tumorales buscada.
La figura 8 muestra la detección de la
transcripción inducida dependiente del tiempo en muestras de sangre
tratadas con bronopol
(2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol).
En este sentido, las bandas 1, 4 y 7 muestran
una escala con marcadores de tamaño, las bandas 2, 5 y 8 muestran
los fragmentos de ADN amplificados de los transcritos asociados a
tumores que van a detectarse en un donante sano y un control
interno de \beta-actina. Las bandas 3, 6 y 9
muestran los transcritos de las muestras con 2 células inoculadas
de la línea de células tumorales Calu-3. La posición
de las bandas respectivas para \beta-actina
(actina) y los tres transcritos asociados a tumores
GA733-2 (384 pb), MUC-1 (292 pb) y
Her-2 (265 pb) se describen en la fig. 8.
En este sentido, las muestras de un donante sano
se mezclaron con 0,025% (bandas 2 y 3), 0,05% (bandas 5 y 6) y
0,075% (p/v) (bandas 8 y 9) de bronopol y a continuación se
guardaron a 4ºC durante 24 h. Los fragmentos de ADN amplificados se
detectaron después del análisis de las muestras de sangre mediante
electroforesis capilar en gel de alto voltaje en un bioanalizador
2100 (Agilent Technologies). Puede verse que el análisis a las tres
concentraciones de bronopol (bandas 2, 5 y 8) ha resultado negativo
(alturas de picos por debajo del valor umbral). Es decir, no puede
detectarse ningún tipo de expresión inducida dependiente del tiempo
ilegítima. Las bandas 3, 6 y 9 muestran que los transcritos
asociados a tumores, que se introdujeron en las muestras de sangre
mediante la inoculación de células de cáncer Calu-3,
se detectan claramente. La figura 8 muestra con esto claramente que
también pueden detectarse números de células tan pequeños, como 2
células, incluso después de 24 h cuando la muestra de sangre se
trató según la invención sin impedir la detección mediante
expresión inducida dependiente del tiempo ilegítima. Mediante el
procedimiento según la invención también se evita una pérdida de
sensibilidad de la detección de células tumorales buscada.
Los resultados de los experimentos anteriormente
representados muestran claramente tanto una alta efectividad como
fiabilidad del reactivo según la invención y del procedimiento según
la invención en el tratamiento de preparados celulares,
especialmente de células tumorales diseminadas en sangre de
pacientes con cáncer de mama. Se lograron resultados comparables en
pacientes con cáncer colorectal.
Los presentes resultados de los experimentos
también muestran que se logra un impedimento de una expresión
inducida dependiente del tiempo en células biológicas en una muestra
ex vivo. Además, pudieron detectarse células tumorales
diseminadas en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y
colorrectal mediante la adición de los reactivos según la
invención. No se detectó transcripción inducida dependiente del
tiempo durante más de 48 h. Sin embargo, en muestras de sangre no
tratadas ya se observó una expresión inducida dependiente del
tiempo muy fuerte después de 24 h.
Los reactivos según la invención y el
procedimiento según la invención también hacen posible un
impedimento de una expresión inducida dependiente del tiempo en
células biológicas en una muestra (especialmente ex vivo) y
al mismo tiempo una conservación de células tumorales diseminadas en
sangre periférica de pacientes con cáncer. Por tanto, poseen un
elevado valor logístico y diagnóstico ya que con éstos también se
hace posible un transporte más largo y un mayor intervalo de tiempo
entre la toma de la muestra y el análisis de la muestra. Por tanto,
los reactivos según la invención y el procedimiento según la
invención son adecuados para la utilización en sistemas de
extracción de sangre.
<110> Adnagen AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Reactivo y procedimiento para evitar
la expresión dependiente del tiempo en células biológicas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Adnagen 060431
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 060431
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2006-03-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10 2005 013 261.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-03-22
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<160> 8
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Claims (7)
1. Procedimiento para evitar la expresión
ilegítima dependiente del tiempo de ARNm en células biológicas en
una muestra ex vivo, caracterizado porque la muestra
se mezcla con un reactivo que contiene un donante de formaldehído,
así como dado el caso un líquido.
2. Procedimiento según la reivindicación
precedente, caracterizado porque la mezcla del reactivo con
la muestra contiene el donante de formaldehído en una concentración
\leq 0,075% (p/v).
3. Procedimiento según la reivindicación
precedente, caracterizado porque la concentración del donante
de formaldehído en la mezcla del reactivo con la muestra asciende a
\leq 0,045% (p/v), de manera ventajosa \leq 0,025% (p/v).
4. Procedimiento según una de las tres
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el donante
de formaldehído contiene urea de imidazolidinilo, urea de
diazolidinilo,
dimetilol-5,5-dimetilhidantoína,
urea de dimetilol,
2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol,
1,3-bis(hidroximetil)-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona
(DMDM hidantoína), ácido
N5-metil-tetrahidrofólico, ácido
N10-metil-tetrahidrofólico o una
mezcla de éstos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el líquido es un
tampón, solución fisiológica de cloruro de sodio o similar.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las células
biológicas tratadas con esto se separan mediante anticuerpos o
mediante otros procedimientos convencionales.
7. Uso de un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes para evitar la expresión dependiente
del tiempo de ARNm en una muestra con células biológicas,
especialmente en un fluido corporal, sangre, líquido, ascitis,
orina o en una porción de tejido o una suspensión que contiene
células de muestras de tejido, especialmente para detectar las
células tumorales contenidas en su interior.
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