ES2313978T3 - Proteinas urocortina y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un ADN que codifica un péptido relacionado con urocortina humana seleccionado del grupo constituido por: (a) ADN aislado y purificado que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos 2-4; (b) ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1, en el que las condiciones de alto rigor se caracterizan como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1; y (c) ADN aislado y purificado que difiere de los ADNs aislados de (a) anterior en secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2-4.

Description

Proteínas urocortina y sus usos.

Fundamento de la invención Leyenda de fondos federales

Esta invención se produjo en parte usando fondos del gobierno federal bajo la concesión nº DK.26741. Por consiguiente, el gobierno federal tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la neuroendocrinología y los mecanismos implicados en el estrés. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevos péptidos relacionados con factor de liberación de corticotropina, urocortina II y proteína relacionada con urocortina humana, que están implicados en la respuesta al estrés.

Descripción de la técnica relacionada

El factor de liberación de corticotropina (CRF) es un péptido de 41 aminoácidos mejor conocido por su papel indispensable en la iniciación de respuestas pituitaria-adrenales al estrés, un efecto mediado por receptores de CRF de tipo 1 (1). Además, el factor de liberación de corticotropina está ampliamente distribuido en el cerebro, y se ha mostrado repetidamente que participa en la movilización de ajustes autonómicos y de comportamiento complementarios a una variedad de circunstancias amenazadoras (2, 3). Esto ha fomentado la hipótesis mantenida ampliamente de que el factor de liberación de corticotropina y su familia de péptidos relacionada juegan papeles importantes en la regulación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) en condiciones basales y de estrés (4, 5). Se cree también que el factor de liberación de corticotropina está implicado también en otras respuestas neuroendocrinas y paracrinas en muchos tejidos. Los miembros de la familia de CRF integran respuestas endocrinas, autonómicas y de comportamiento a estresantes. Estos péptidos pueden estar implicados también en el control de las funciones de apetito, de despertar y cognitivas. Pueden tener lugar consecuencias psicológicas y fisiológicas graves como resultado de los efectos a largo plazo del estrés, tales como trastornos de ansiedad, anorexia nerviosa y depresión melancólica.

Los miembros de la familia de factor de liberación de corticotropina median en sus acciones biológicas uniéndose específicamente a receptores de CRF con altas afinidades (6, 7). Los receptores de CRF son receptores acoplados a proteína G que actúan a través de adenilato ciclasa y están relacionados estructuralmente con la familia de secretina. Esta familia incluye también CRF, VIP, PTH y el receptor de calcitonina. El gen de receptor de CRF tiene 13 exones y se han encontrado varias variantes de empalme de este receptor. El receptor de CRF-R1 está distribuido por todo el cerebro y se encuentra en lugares sensoriales y de relevo motor (8). El CRF-R2\alpha está distribuido en el tabique lateral, el hipotálamo medio ventral, el núcleo del tracto solitario y el núcleo del rafe dorsal, que son áreas en las que CFR-R1 se expresa muy poco o nada en absoluto (9). El CRF-R2\beta se encuentra mayormente en lugares periféricos incluyendo el corazón, los vasos sanguíneos, el tracto gastrointestinal, la epididimis, el pulmón y la piel (7, 10). La farmacología de los dos tipos de receptores difiere porque el factor de liberación de corticotropina tiene baja afinidad por CRF-R2 (Ki = 15-100 nM) pero alta afinidad por CRF-R1 (Ki = 1-2 nM). Otros péptidos relacionados tales como urotensina de carpa, sauvagina de rana y urocortina tienen alta afinidad por CRF-R2. Los ratones eliminados con CRF-R2 demuestran un comportamiento de tipo ansiedad aumentado causado por hipersensibilidad a estresantes (11).

Se ha encontrado que un cierto número de los grupos de células identificados como lugares de acción de péptidos para obtener respuestas autonómicas y de comportamiento de tipo estrés está carente o empobrecido en la expresión de ligando(s), receptor(es) o ambos imprescindibles (12, 13). Esto ha encendido la búsqueda de moléculas de señalización relacionadas con CRF adicionales, que cuentan actualmente con dos ligandos, receptores acoplados a proteína G derivados de dos genes distintos (CRF-R1 y CRF-R2), y una proteína de unión, cuya función permanece comprendida incompletamente (14, 15).

Se ha descubierto recientemente (16) un segundo neuropéptido relacionado con CRF de mamífero, urocortina (Ucn), y se ha mostrado que se une con alta afinidad por ambos tipos de receptores de CRF conocidos, mientras que CRF es unido de una manera altamente preferencial por CRF-R1. La urocortina administrada centralmente es más eficaz que CRF para suprimir apetito, pero menos así para generar efectos de tipo ansiedad aguda y activación de comportamiento generalizada (17). Esto se ha tomado para indicar que la urocortina podría mediar en algunos efectos relacionados con el estrés atribuidos inicialmente a CRF, al menos en parte sirviendo como ligando endógeno para CRF-R2. Esta visión se ha puesto en duda, no obstante, por observaciones tales como que las principales sedes celulares de expresión de urocortina en cerebro no son reconocidas como componentes integrales del conjunto de circuitos relacionado con estrés central, y que muchos lugares principales de expresión de CRF-R2 están escasamente enervados por proyecciones que contienen urocortina (18). Éstos y otros hallazgos soportan la posible existencia de uno o más ligandos de receptores de CRF adicionales en el cerebro del mamífero.

La técnica anterior es deficiente en la falta de reconocimiento de genes y proteínas de urocortina adicionales. La presente invención satisface esta necesidad y deseo existentes desde hace mucho tiempo en la técnica.

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Sumario de la invención

Los rápidos avances en la declaración de datos de secuencias para los genomas humano y de ratón proporcionan una oportunidad para identificar nuevos miembros de muchas familias de proteínas. Una nueva secuencia de péptido, péptido relacionado con urocortina (URP) humana se identificó de la base de datos de genoma humano pública. La secuencia de péptido relacionado con urocortina contiene homología con urocortina humana (44%), urotensina de carpa (39%) y CRF humano (36%). El péptido relacionado con urocortina sintetizado se une con mayor afinidad a CRF-R2 (Ki = 0,5 nM) que a CRF-R1 (Ki = 70 nM). El péptido relacionado con urocortina humana estimula la secreción de ACTH desde células pituitarias anteriores de rata, aunque con una eficacia significativamente más baja en comparación con urocortina o CRF. Usando herramientas de búsqueda de homología de secuencias, se identificó también un gen de ratón que codifica un péptido de 38 aminoácidos, que representa un nuevo miembro de la familia de CRF de neuropéptidos. Este péptido, denominado urocortina II (Ucn II) es distinto de los otros miembros de la familia conocidos porque se une con alta selectividad a CRF-R2. La evidencia para urocortina II en el cerebro de rata es proporcionada por estudios de inmunohistoquímica e hibridación in situ usando anticuerpos altamente específicos para urocortina II.

En una realización de la corriente invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica urocortina II. Esta secuencia puede seleccionarse del grupo constituido por: ADN aislado y purificado que codifica una urocortina II; ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1 en condición de alto rigor (definido como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC) y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1; y ADN aislado y purificado que codifica urocortina II pero que difiere en secuencia debido a la degeneración del código genético. Este ADN
codifica preferiblemente un precursor de proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 10.

En otra realización de la corriente invención, la presente invención se dirige a un vector capaz de expresar la urocortina II. Tal vector consiste en ADN que codifica urocortina II y elementos reguladores necesarios para la expresión de urocortina II en una célula. En una realización preferida, este vector codifica una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 11. La presente invención se dirige también a una célula hospedante transfectada con, y que expresa, urocortina II, de tal vector. La proteína puede expresarse en un tipo de célula seleccionado entre células bacterianas, células de mamífero, células de plantas y células de insectos. En una realización preferida, la proteína se expresa en E. coli.

En otra realización todavía de la presente invención, se proporciona una proteína urocortina II humana aislada y purificada codificada de ADN como se ha descrito antes. Preferiblemente, el péptido relacionado con urocortina humana purificado tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID No. 11.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la proteína urocortina II. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

En otra realización aún de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende proteína urocortina II. Tal composición farmacéutica puede usarse para reducir la temperatura corporal, suprimir el apetito y tratar o prevenir fallo cardíaco congestivo y diversos trastornos relacionados con el estrés.

En una realización adicional de la corriente invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica péptido relacionado con urocortina humana. Esta secuencia puede seleccionarse del grupo constituido por: ADN aislado y purificado que codifica un péptido relacionado con urocortina humana; ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido del ADN de péptido relacionado con urocortina humana en condiciones de alto rigor (definido como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC); y ADN aislado y purificado que codifica péptido relacionado con urocortina humana pero que difiere en secuencia debido a la degeneración del código genético. Este ADN tiene preferiblemente la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1 y codifica un precursor de proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 2.

En otra realización de la corriente invención, la presente invención se dirige a un vector capaz de expresar el péptido relacionado con urocortina humana. Tal vector consiste en ADN que codifica péptido relacionado con urocortina humana y elementos reguladores necesarios para la expresión de péptido relacionado con urocortina humana en una célula. En una realización preferida, este vector codifica una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3. La presente invención se dirige también a una célula hospedante transfectada con, y que expresa un péptido relacionado con urocortina humana, de tal vector. La proteína puede expresarse en un tipo de célula seleccionado entre células bacterianas, células de mamífero, células de plantas y células de insectos. En una realización preferida, la proteína se expresa en E. coli.

En otra realización todavía de la presente invención, se proporciona una proteína péptido relacionado con urocortina humana aislada y purificada codificada de ADN como se ha descrito antes. Preferiblemente, el péptido relacionado con urocortina humana purificado tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID No. 3.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un anticuerpo dirigido contra la proteína péptido relacionado con urocortina humana. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

En otra realización aún de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende proteína péptido relacionado con urocortina humana. Tal composición farmacéutica puede usarse para reducir la temperatura corporal, suprimir el apetito y tratar o prevenir fallo cardíaco congestivo y diversos trastornos relacionados con el estrés.

En otra realización de la presente invención, se describen diversas modificaciones de las proteínas urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana, incluyendo modificación de la secuencia y de aminoácidos individuales de las proteínas. Las modificaciones incluyen también conjugación de urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana a marcas fluorescentes, radionúclidos acomplejados y toxinas.

Descripción breve de los dibujos

Para que la materia en la que los aspectos, ventajas y objetos de la invención referidos antes, así como otros se aclaren, alcancen y puedan entenderse con detalle, pueden tomarse descripciones más particulares de la invención resumidas brevemente antes con referencia a ciertas realizaciones de ella que se ilustran en los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman parte de la memoria descriptiva. Ha de indicarse, no obstante, que los dibujos adjuntos ilustran realizaciones preferidas de la invención y no han de considerarse por tanto limitativos de su alcance.

La Figura 1 muestra una secuencia de ADN genómica humana que predice la existencia de un nuevo péptido relacionado con urocortina y CRF. Se identificaron secuencias genómicas en la base de datos pública y se usaron para predecir la nueva secuencia de péptido relacionado con urocortina humana. El lugar de inicio putativo está en posición 1 y la secuencia de péptido maduro se muestra con texto en negrita. Los lugares de división del péptido señal predichos se indican con flechas.

La Figura 2 muestra un precursor de péptido relacionado con urocortina humana putativo. La región subrayada representa una secuencia de cADN parcial que se aisló por PCR de una genoteca de cADN de islotes pancreáticos humanos.

La Figura 3 muestra una comparación de péptido relacionado con urocortina humana (URP) con Ucn humana, urotensina I, CRF, sauvagina de rana y CRF/Uro de cazón. Las áreas de mayor homología están dentro de las cajas blancas. Se indica el número de aminoácidos conservados.

La Figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos predicha de Ucn II. La metionina de inicio, marcada en negrita, está situada aguas arriba de la región de codificación del péptido, que está en caja. La secuencia de nucleótidos completa se ha depositado en Genbank (nº de admisión AF331517). La Figura 4B muestra el alineamiento de Ucn II de ratón con péptidos humano y de pez (URPs) homólogos y con Ucn de rata y CRF de rata/humano. Se ponen en caja residuos idénticos a la secuencia de Ucn II de ratón. A \blacksquare indica un lugar de amidación.

La Figura 5 muestra el desplazamiento mediado por péptido relacionado con urocortina humana de ^{125}I-sauvagina que se une a CRFR1 y CRFR2\beta. Las afinidades de péptidos de Ucn y URP por CRFR1 y CRFR2\beta expresados establemente en células CHO se determinaron por desplazamiento competitivo de la ^{125}I-sauvagina. El dato es representativo de 3 experimentos y los valores de la constante de disociación (K_{i}) inhibidora (límites de confianza del 95%) se calcularon usando el programa Prism.

Las Figuras 6A-6C muestran expresión de mARN de urocortina II en el cerebro de rata. Fotomicrografías de campo oscuro que muestran el marcado (granos blancos) observado sobre regiones selectas usando una sonda de cARN antisentido marcada isotópicamente generada a partir de un cADN de urocortina II de ratón. Se ven señales de hibridación positiva sobre el núcleo paraventricular del hipotálamo (Figura 6A), principalmente sobre su división magnocelular (pm), viéndose una señal más difusa sobre el aspecto parvocelular (mp) y ampliamente sobre el locus coeruleus (LC; Figura 6B), el núcleo motor facial (VII; Figura 6C) y meninges (men) en la superficie ventral del cerebro. Otras abreviaturas: CBL, cerebelo; v3, tercer ventrículo; v4 cuatro ventrículo. Aumentos: Figuras 6A y 6B, X75; Figura 6C, X50.

La Figura 7 muestra un autorradiograma de expresión de péptido relacionado con urocortina humana en el hipotálamo de primate. PVH, núcleos paraventriculares; SO, núcleos supraópticos; CN, núcleo caudado; och, quiasmo óptico; me, eminencia media; ac, comisura anterior; ic, cápsula interna; Sept, tabique.

Las Figuras 8A-8F muestran modelos de activación celular en respuesta a microinyección de urocortina II central. Figuras 8A-8C y 8E: fotomicrografías de campo claro de preparaciones de inmunoperoxidasa que muestran expresión de Fos inducida en ratas sacrificadas 2 h después de inyección icv de 1 \mug de urocortina II de ratón sintética. Fotomicrografías de campo oscuro que muestran localización histoquímica de hibridación de mARN de CRF-R2 en regiones correspondientes a las ilustradas en las Figuras 8C y 8E se proporcionan en las Figuras 8D y 8F, respectivamente. La inyección de urocortina II central provocó inducción de Fos principalmente en un conjunto de estructuras interconectadas implicadas en control autonómico y neuroendocrino central, incluyendo la división parvocelular del núcleo paraventricular (Figura 8A), el núcleo central de la amígdala (Figura 8B) y el núcleo del tracto solitario (NTS, Figura 8C). Entre éstos, sólo el NTS es un lugar de expresión de CRF-R2 (Figura 8D). Otros lugares principales de expresión de CRF-R2, incluyendo el núcleo ventromedial del hipotálamo (Figura 8F), no mostraron expresión de Fos inducida por urocortina II en el intervalo de dosis de péptido examinado (1-10 \mug). Todas las fotomicrografías son con un aumento de 75X.

La Figura 9 muestra la activación de grupos de células relacionadas con estrés central tras la inyección central de péptido relacionado con urocortina humana examinando el estímulo de expresión de FOS nuclear en la estría terminal (BST), núcleo paraventricular del hipotálamo (PVH), núcleo central de la amígdala (CeA), el núcleo parabraquial lateral (PBI), el locus coeruleus (LC) y el núcleo del tracto solitario (NTS). BSTov, núcleo de lecho de la estría terminal (subnúcleo oval); ic, cápsula interna; CP, caudoputamen; ac, comisura anterior; V3, tercer ventrículo; AHA, área hipotalámica anterior; pm, parte magnocelular posterior (núcleo paraventricular); fx, fórnix; CeAm, núcleo central de la amígdala (parte medial); BLA, núcleo basolateral de la amígdala; scp, pedúnculo cerebeloso superior; PBel, núcleo parabraquial (parte lateral externa); V4, cuarto ventrículo; ep, epéndima; AP, área postrema; DMX, núcleo motor dorsal del vago; ts, tracto solitario; y cc, canal central.

Las Figuras 10A y 10B muestran los efectos de urocortina II central en la admisión de alimentos y la actividad motora gruesa. La Figura 10A muestra la admisión de alimentos durante la noche acumulativa media (g) (\pm error típico de la media; n = 3-6 por grupo) tras la administración icv de 1 \mug de CRF, urocortina o urocortina II. CRF y urocortina redujeron significativamente la admisión de alimentos en comparación con testigos inyectados con solución salina, comenzando a las 4 h post-inyección, mientras que el efecto de urocortina II no fue manifiesto hasta 6 h después del tratamiento. *p < 0,002 (CRF y Ucn frente a solución salina), **p < 0,002 (CRF, urocortina y urocortina II frente a solución salina). La Figura 10B muestra medidas telemétricas de actividad motora gruesa que se elevaron significativamente en animales que recibieron inyecciones icv de CRF; ni urocortina ni urocortina II afectaron significativamente a la actividad motora. *p < 0,001 (CRF frente a solución salina).

La Figura 11 muestra estímulo de la secreción de ACTH de células de pituitaria anterior de rata por urocortina y péptido relacionado con urocortina humana. Las células de pituitaria anterior de rata se establecieron en cultivo y se trataron con urocortina de rata o péptido relacionado con urocortina humana. El ACTH segregado se midió usando un juego (Nichols Institute Diagnostics).

La Figura 12 muestra el efecto de péptido relacionado con urocortina humana en los niveles de cAMP en células A7R5, que expresan CRF-R2\beta nativo. Efectos dependientes de la dosis de la incubación con urocortina (círculo blanco) o hURP (círculo negro) durante 30 minutos en la producción de cAMP. Se midió cAMP por RIA (Biochemical Technologies).

La Figura 13 muestra los efectos de péptido relacionado con urocortina humana (hURP) en la actividad motora gruesa en ratas.

La Figura 14 muestra los efectos de inyección intracerebroventricular de péptido relacionado con urocortina humana (URP) en la temperatura corporal en ratas.

La Figura 15 muestra los efectos de inyección intracerebroventricular de péptido relacionado con urocortina humana (hURP) en la admisión de alimentos nocturna en ratas.

La Figura 16 muestra un modelo de cómo péptido relacionado con urocortina humana actúa en CRF-R1 y CRF-R2. El péptido relacionado con urocortina humana se une con alta afinidad a CRF-R2 pero no a CRF-R1, mientras que urocortina se une a ambos receptores. El CRF se une con alta afinidad a CRF-R1 y no a CRF-R2.

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Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, pueden emplearse técnicas de biología molecular, de microbiología y de ADN recombinante, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover red. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait red. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.T. Higgins reds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins reds. (1984); "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, red. (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Por tanto, si aparecen aquí, las siguientes expresiones tendrán las definiciones indicadas seguidamente.

Según se usa aquí, el término "cADN" se referirá a la copia de ADN del transcripto de mARN de un gen.

Según se usa aquí, la expresión "secuencia de aminoácidos derivada" significará la secuencia de aminoácidos determinada leyendo la secuencia triplete de bases de nucleótidos en el cADN.

Según se usa aquí, la expresión "examinar una genoteca" se referirá al procedimiento de usar una sonda marcada para comprobar si, en las condiciones apropiadas, hay una secuencia complementaria de la sonda presente en una genoteca de ADN particular. Además, "examinar una genoteca" podría realizarse por PCR.

Según se usa aquí, el término "PCR" se refiere a la reacción en cadena de polimerasa que es el sujeto de las Patentes de los EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.683.202 de Mullis, así como otras mejoras de la técnica conocidas ahora.

Todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan aquí por fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional de término amino a término carboxi. Además, debe indicarse que un guión en el comienzo o final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace péptido con una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos.

Se prefiere que los aminoácidos descritos aquí estén en forma isómera "L". Sin embargo, residuos en la forma isómera "D" pueden ser sustituidos por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que se conserve la propiedad funcional deseada de unión de inmunoglobulina. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido.

Pueden incorporarse a proteínas aminoácidos no estándares por modificación química de aminoácidos existentes o por síntesis artificial de una proteína. Un aminoácido no estándar se refiere a un aminoácido que difiere en estructura química de los veinte aminoácidos estándares codificados por el código genético. La modificación post-traducción in vivo puede llevar también a la presencia de un derivado no estándar o de aminoácido en una proteína. Los grupos NH_{2} N-terminal y COOH C-terminal de una proteína pueden modificarse también por modificación post-traducción natural o artificial de una proteína.

Pueden modificarse proteínas por sustituciones de aminoácidos. A menudo, algunos cambios producen cambios significativos de la actividad de proteínas mientras que otros tienen poco o ningún efecto. Es menos probable que las sustituciones conservadoras alteren drásticamente la actividad de una proteína. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" se refiere a sustitución de aminoácido con un aminoácido químicamente similar, es decir, sustitución aminoácidos no polares con otros aminoácidos no polares; sustitución de aminoácidos polares con otros aminoácidos polares, residuos ácidos con otros aminoácidos ácidos, etc. Se indican ejemplos de sustituciones conservadoras preferidas en la Tabla I:

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1

"Derivado químico" se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos derivados químicamente por reacción de un grupo secundario funcional. Tales polipéptidos derivados incluyen, por ejemplo, aquellos en los que se han derivado grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Pueden derivarse grupos carboxilo libes para formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los derivados químicos pueden incluir aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, serina puede sustituirse por 4-hidroxiprolina y lisina puede sustituirse por ornitina. Los péptidos abarcados por la presente invención incluyen también péptidos que tienen una o más adiciones y/o supresiones de residuos con relación al péptido específico cuya secuencia se muestra aquí, siempre que el péptido modificado mantenga la actividad biológica requerida.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al que puede incorporarse otro segmento de ADN para llevar a cabo la replicación del segmento incorporado.

Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polímera de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de cadena sencilla, o una hélice de doble cadena. Esta expresión se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Así, esta expresión incluye ADN de doble cadena encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Se discute la estructura aquí según la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3', a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al mARN).

Un "origen de replicación" se refiere a las secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.

Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena, que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación están determinados por un codón de iniciación en el término 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el término 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitado a ellos, secuencias procariotas, cADN de mARN eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo, mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción estarán situados usualmente 3' con la secuencia de codificación.

Las secuencias de control de transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, aumentadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula hospedante.

Una "secuencia de promotor" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación aguas abajo (dirección 3'). Con fines de definir la presente invención, la secuencia de promotor está unida en su término 3' por el lugar de iniciación de la transcripción y se extiende aguas arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia de promotor se encontrará un lugar de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión de proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión de polimerasa de ARN. Los promotores eucariotas contienen a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procariotas contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35.

Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando polimerasa de ARN transcribe la secuencia de codificación en mARN, que se traduce después en la proteína codificada por la secuencia de codificación.

Puede incluirse una "secuencia señal" cerca de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido señal, N-terminal para el polipéptido, que se comunica con la célula hospedante para dirigir el polipéptido a la superficie celular o segregar el polipéptido en el medio, y el péptido señal se corta por la célula hospedante antes de que la proteína deje la célula. Pueden encontrarse secuencias señal asociadas con una variedad de proteínas nativas de procariotas y eucariotas.

El término "oligonucleótido", según se usa aquí con referencia a la sonda de la presente invención, se define como una molécula constituida por dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función última y el uso del oligonucleótido.

El término "cebador" según se usa aquí se refiere a un oligonucleótido, de origen natural como un digerido de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de iniciación de síntesis cuando se pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador, que es complementario de una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una polimerasa de ADN y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser de cadena sencilla o de doble cadena y debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del cebador y uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el cebador oligonucleótido contiene típicamente 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos
nucleótidos.

Los presentes cebadores se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios con diferentes cadenas de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridarse con sus respectivas cadenas. Por tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede incorporarse al extremo 5' del cebador, siendo complementaria con la cadena el resto de la secuencia del cebador. Alternativamente, pueden entremezclarse en el cebador bases no complementarias o secuencias más largas, siempre que la secuencia de cebador sea suficientemente complementaria con la secuencia o se hibride con ella y forme por ello la plantilla para la síntesis del producto de extensión.

Según se usan aquí, las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, cada una de las cuales corta ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótido específica.

Una célula se ha "transformado" por ADN exógeno o heterólogo cuando tal ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede o no estar integrado (enlazado covalentemente) en el genoma de la célula. En procariotas, levadura y células de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a células eucariotas, una célula transformada establemente es una en la que el ADN transformante ha resultado integrado en un cromosoma, por lo que es heredado por células hijas mediante replicación de cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer linajes celulares o clones constituidos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula o antepasado simple por mitosis. Un "linaje celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro para muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" cuando al menos alrededor del 75% (preferiblemente al menos alrededor del 80% y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% o 95%) de los nucleótidos son iguales sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Pueden identificarse secuencias que son sustancialmente homólogas comparando las secuencias usando software estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas como se definen para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Así, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará flanqueado usualmente por ADN que no flanquea el ADN genómico del mamífero en el genoma del organismo de origen. En otro ejemplo, la secuencia de codificación es una construcción en la que la propia secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un cADN en el que la secuencia de codificación genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes que el gen nativo). Variaciones alélicas o sucesos mutacionales de origen natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define aquí.

Las marcas empleadas más comúnmente para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, productos químicos que fluorescen cuando se exponen a luz ultravioleta y otros. Se conoce un cierto número de materiales fluorescentes y pueden utilizarse como marcas. Éstos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, rojo Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer. Un material detector particular es anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato.

Un sistema de ensayo particular desarrollado y utilizado en la técnica se conoce como ensayo de receptor. En un ensayo de receptor, el material a ensayar se marca apropiadamente y se inoculan ciertas colonias de ensayo celulares con una cantidad de la marca, tras lo que se realizan estudios de unión para determinar la extensión en la que el material marcado se une a los receptores de las células. De esta forma, pueden determinarse diferencias de afinidad entre materiales.

Según se usa aquí, el término "hospedante" se entiende que incluye no sólo procariotas sino también eucariotas tales como levadura, células de plantas y animales. Una molécula o gen de ADN recombinante que codifica una proteína de la presente invención puede usarse para transformar un hospedante usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los de experiencia ordinaria en la técnica. Los hospedantes procariotas pueden incluir E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los hospedantes eucariotas incluyen levaduras tales como Pichia pastoris, células de mamíferos y células de insectos.

En general, se usan en conexión con el hospedante vectores de expresión que contienen secuencias de promotor que facilitan la transcripción eficaz del fragmento de ADN insertado. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, promotor(es), terminador(es), así como genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Los hospedantes transformados pueden fermentarse y cultivarse según medios conocidos en la técnica para conseguir un crecimiento de células óptimo.

Pueden usarse métodos muy conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. Un gen y sus secuencias de control de trancripción se definen como "enlazados operativamente" si las secuencias de control de la transcripción controlan eficazmente la transcripción del gen. Los vectores de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, vectores plásmidos y vectores víricos.

La corriente invención se dirige a una secuencia de ADN que codifica urocortina II. Esta secuencia puede ser un ADN aislado y purificado que codifica una urocortina II. Alternativamente, puede ser un ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1 en condiciones de alto rigor (definidas como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC) y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1. Finalmente, el ADN puede ser un ADN aislado y purificado que codifica urocortina II, pero que difiere en secuencia debido a la degeneración del código genético. Este ADN
codificará preferiblemente una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 10 o aminoácido SEQ ID No. 11.

La presente invención se dirige también a un vector capaz de expresar la urocortina II. Tal vector consiste en ADN que codifica urocortina II y elementos reguladores necesarios para la expresión de urocortina II en una célula. En una realización preferida este vector codifica una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 10 o aminoácido SEQ ID No. 11. La presente invención se dirige también a una célula hospedante transfectada con, y que expresa, una urocortina II de tal vector. La proteína puede expresarse en un tipo de células seleccionado entre células bacterianas, células de mamíferos, células de plantas y células de insectos. En una realización preferida, la proteína se expresa en E. coli.

La presente invención se dirige también a una proteína urocortina II aislada y purificada codificada a partir de ADN como se ha descrito antes. Preferiblemente, la urocortina II purificada tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID No. 10 o SEQ ID No. 11.

La presente invención se dirige también a un anticuerpo dirigido contra la proteína urocortina II. Este anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Además, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende la proteína urocortina II y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal composición farmacéutica puede usarse para reducir la temperatura corporal, suprimir el apetito, tratar o prevenir fallo cardíaco congestivo, tratar estrés y ansiedad y alterar niveles indeseablemente bajos de secreción de ACTH.

La corriente invención se dirige también a una secuencia de ADN que codifica péptido relacionado con urocortina humana. Esta secuencia puede ser un ADN aislado y purificado que codifica péptido relacionado con urocortina humana. Alternativamente, puede ser un ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1 en condiciones de alto rigor (definidas como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC) y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1. Finalmente, el ADN puede ser un ADN aislado y purificado que codifica péptido relacionado con urocortina humana, pero que difiere en secuencia debido a la degeneración del código genético. Este ADN tendrá preferiblemente la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1 y codificará preferiblemente una proteína precursora de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2 que se elabora proteolíticamente a una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3.

La presente invención se dirige también a un vector capaz de expresar el péptido relacionado con urocortina humana. Tal vector consiste en ADN que codifica péptido relacionado con urocortina humana y elementos reguladores necesarios para la expresión de péptido relacionado con urocortina humana en una célula. En una realización preferida, este vector codifica una proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3. La presente invención se dirige también a una célula hospedante transfectada con, y que expresa, polipéptido relacionado con urocortina humana de tal vector. La proteína puede expresarse en un tipo de células seleccionado entre células bacterianas, células de mamíferos, células de plantas y células de insectos. En una realización preferida, la proteína se expresa en E. coli.

La presente invención se dirige también a una proteína péptido relacionado con urocortina humana aislada y purificada codificada a partir de ADN como se ha descrito antes. Preferiblemente, el péptido relacionado con urocortina humana purificado tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID No. 3.

La presente invención se dirige también a un anticuerpo dirigido contra la proteína péptido relacionado con urocortina humana. Este anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Además, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende la proteína péptido relacionado con urocortina humana y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal composición farmacéutica puede usarse para reducir la temperatura corporal, suprimir el apetito, tratar o prevenir fallo cardíaco congestivo, tratar estrés y ansiedad y alterar niveles indeseablemente bajos de secreción de ACTH.

La presente invención se dirige también a urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana mutados para contener un residuo de tirosina, para radioyodación de la proteína. Una modificación particular es la adición de una secuencia consecuente en Tyr-Gly al extremo N-terminal de urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana.

La presente invención se dirige también a mutantes de supresión de urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana. Una supresión particularmente útil es una supresión de uno a cinco aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína.

La presente invención se dirige también a proteína urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana en los que los aminoácidos isómeros en "forma L" estándar están sustituidos con aminoácidos isómeros en "forma D". En proteína relacionada con urocortina humana, es particularmente útil la sustitución del residuo de isoleucina correspondiente a la posición 9 de SEQ ID No. 3 con D-isoleucina, D-fenilalanina y D-leucina u otros aminoácidos en forma D. Otra sustitución útil es la sustitución del residuo de ácido glutámico en posición 17 de SEQ ID 3 u 11 con D-ácido glutámico.

La presente invención se dirige también a urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana en los que diversos aminoácidos se han sustituido con aminoácidos no estándares. Leucina C_{\alpha}-metilada, alanina C_{\alpha}-metilada, N-im-bencil-histidina, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, homoserina y ornitina son ejemplos de tales aminoácidos no estándares.

La presente invención se dirige también a proteína urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana que tiene un término N acilado. Esta acilación de proteína puede usarse para enlazar una molécula tal como un ácido graso en el término N de la proteína para proteger Ucn II o URP de degradación enzimática o para cambiar diversas propiedades de la proteína tales como su hidrofilicidad/hidrofobicidad. Esta modificación puede usarse para alterar la duración o biodisponibilidad de la proteína in vivo.

La presente invención se dirige también a proteína urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana que se ha modificado para contener una marca fluorescente de uso en formación de imagen o ensayos biológicos.

La presente invención se dirige también a proteína urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana conjugada con un agente acomplejante para radionúclidos. Ucn II acomplejada a un radionúclido puede ser útil para escintigrafía o en diversos ensayos.

La presente invención se dirige también a urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana conjugados a una toxina. El conjugado tóxico resultante puede usarse para la destrucción con objetivo fijado de células que llevan receptor de CFR.

Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no pretender limitar en modo alguno la presente invención.

Ejemplo 1 Identificación de proteína relacionada con urocortina humana

En un esfuerzo por identificar nuevos ligandos de CRF-R, se construyó un modelo de Markov oculto (HMM) a partir de un alineamiento en W de grupo de proteínas de la familia de CRF conocidas, incluyendo CRF de rata/humano, Ucn de rata, Ucn humana, sauvagina de rana y urotensina I de rémora blanca, usando el paquete de software HMMER (Sean Eddy, Department of Genetics, Washington University, St. Louis, MO; véase ref. 19). Este HMM se usó para buscar la base de datos pública de genoma humano y se identificó un BAC (nº de admisión Genbank AC005903) derivado de cromosoma 3p21.3-4 que contenía una región de 109 pb que presentaba una homología de secuencias significativa pero que no era parte del gen identificado previamente. Esta región se extendía a 621 pb con la identificación de un clon de EST humano que se superponía con esta secuencia (nº de admisión Genbank BE622276). La secuencia humana, no obstante, carece de un lugar de división proteolítica de consenso que permitiría el tratamiento C-terminal del péptido. Por tanto, se diseñó la proteína como una secuencia de péptido relacionado con urocortina humana (hURP). La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 1) del marco de lectura abierto predicho de la proteína URP. Este gen codifica un péptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2.

Para confirmar la existencia y secuencia del gen de péptido relacionado con urocortina humana, se usaron cebadores de oligonucleótidos similares a los usados para multiplicar la secuencia del péptido relacionado con urocortina humana del clon genómico para aislar un fragmento de cADN parcial por PCR de una genoteca de cADN de islotes pancreáticos humanos. Este fragmento se subclonó también en vector pGEM y se determinó la secuencia. La secuencia del cADN correspondía a una porción de la secuencia genómica. La secuencia de cADN parcial corresponde a la secuencia subrayada en la Figura 2. Las secuencias mostradas en las Figuras 1 y 2 codifican un precursor de polipéptido del péptido relacionado con urocortina humana. Los primeros 19 nucleótidos de péptido relacionado con urocortina humana codifican un péptido señal que se divide durante la modificación post-traducción de la proteína para producir péptido relacionado con urocortina humana maduro de secuencia de aminoácidos:

2

La Figura 3 muestra los resultados de una comparación de homología entre los aminoácidos 72-109 de péptido relacionado con urocortina humana y segmentos equivalentes de urocortina humana, urotensina I humana, factor de liberación de corticotropina humana (CRF), sauvagina de rana y CRF/Uro de cazón. La homología en esta región varía del 26% al 42%.

Ejemplo 2 Identificación de urocortina II de ratón

Sondas de cADN fragmentarias basadas en la secuencia del gen humano se hibridan mutuamente de modo específico con tejido de rata (cerebro), sugiriendo que existe un grado razonable de homología entre las dos especies. En base a esta secuencia humana, se diseñaron cebadores para identificar el gen de ratón homólogo por el método de multiplicación rápida de extremos de cADN (RACE). Se preparó cADN dispuesto por RACE a partir de poli(A+) ARN de cerebro completo de ratón usando el juego de multiplicación de cADN SMART RACE (Clontech). Se realizaron reacciones de PCR en condiciones de bajo rigor (baja T_{m}) en un esfuerzo para permitir el cebado heterólogo máximo. Se realizó una multiplicación de primera ronda usando un método de contacto (94º, 30 s; incremento de 70º a 55º, 30 s; 72º, 3 min) seguida por una segunda ronda de multiplicación con conjuntos múltiples de cebadores incluidos (94º, 20 s; 55º, 20 s; 72º, 3 min). Los productos de PCR candidatos se clonaron en pCRII-TOPO (Invitrogen) para determinar la secuencia de ambas cadenas. Los productos de reacción 5' y 3' candidatos se identificaron en base a su tamaño predicho (deducido de la secuencia humana), se clonaron y se determinó su secuencia.

La secuencia de aminoácidos predicha para la Ucn II de ratón se lista en la Fig. 4A. El gen codifica un precursor de 112 aminoácidos, y el término C incluye la región de codificación para el péptido maduro putativo de 38 aminoácidos, indicado en una región en caja (Fig. 4A). La porción C-terminal de la secuencia de codificación es seguida por una glicina y residuos básicos apareados (R-R), de los que se presume están implicados en amidación y división del precursor, respectivamente.

Existen otros dos péptidos putativos o relacionados con urocortina conocidos: el humano, cuya secuencia de péptido se dedujo del EST humano publicado, así como un URP de pez globo clonado recientemente (20) (de Takifugu rubripes). El alineamiento con los péptidos humano y relacionado con urocortina de pez, Ucn de rata y CRF de rata/humano se muestra en la Fig. 4B. Al nivel de aminoácidos, la región de codificación de Ucn II de ratón presenta el 77% y el 45% de homología con los péptidos humano y relacionado con urocortina de pez, respectivamente. La Ucn II de ratón está relacionada comparablemente con miembros conocidos de esta familia de péptidos, compartiendo 36% y 44% de identidad de aminoácidos con CRF de rata y UCN de rata, respectivamente. Permitiendo sustituciones conservadoras, la conexión aumenta al 62% (con CRF) y al 59% (Ucn).

Ejemplo 3 Síntesis de péptidos

Se sintetizaron manualmente Ucn II de ratón y péptido relacionado con Ucn humana usando el método en fase sólida, una resina de metilbenzhidril amina y la estrategia Boc (21). Se usó ácido trifluoroacético, 60% en diclorometano, para separar el grupo Boc. El conjunto de cadena principal se medió por diisopropilcarbodiimida. Los péptidos se dividieron y desprotegieron en ácido fluorhídrico y se purificaron usando RP-HPLC y tres sistemas de disolventes (fosfato de trietilamonio a pH 2,25 y 6,5 y/o 0,1% de TFA) (22). Los péptidos fueron más del 95% puros usando criterios de HPLC y CZE independientes. Se usaron espectros de masas para confirmar la composición de las preparaciones.

Ejemplo 4 Acivación de receptor por Ucn II

La afinidad de Ucn II con los receptores de CRF-R1 y CRF-R2 se evaluó usando un ensayo de radiorreceptor. Se prepararon fracciones de membrana crudas a partir de células CHO que expresan establemente CRF-R1 o CRF-R2\beta clonados. Los péptidos de ensayo y el radioligando, ^{125}I-[Tyr^{0}, Glu^{1}, Nle^{17}]-sauvagina, se diluyeron en tampón de ensayo (HEPES 20 mM, EGTA 2 mM, 0,1% de BSA, 10% de sacarosa, pH 7,6) y se combinaron con las preparaciones de membrana de receptor en placas de microtitulación MAGV (Millipore) pre-revestidas con 0,1% de polietilenimina. La mezcla de reacción se incubó durante 90 min a temperatura ambiente seguido por lavado rápido dos veces con tampón de ensayo y filtración. El complejo de radioligando se cuantificó por recuento de radiación gamma. Las constantes de unión inhidora se determinaron usando software Prism. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2 Propiedades de unión y actividades funcionales de ligandos de receptor de CRF selectos

3

Los valores se determinaron a partir de 3-6 experimentos independientes usando células CHO transfectadas establemente o sus membranas para cada péptido de ensayo. Los valores EC_{50} y K_{i} se determinaron usando software Prism. Se promediaron los valores log_{10} (y). Las EC_{50} o K_{i} medias se tomaron para ser 10^{\gamma}. Se calculó la desviación típica de los valores log_{10} (\sigma). Los intervalos dados se tomaron para ser: [(10^{\gamma})10^{\sigma} o 10^{\gamma}10^{\sigma}].

En comparación con urocortina, Ucn II fue al menos 1.000 veces menos eficaz compitiendo en la unión de sauvagina marcada al CRF-RF1, mientras que fue casi equipotente a Ucn compitiendo en la unión a CRF-R2. Esta selectividad significativa para el receptor de tipo 2 se vio también en activación de receptor medida por aumulación de cAMP intracelular. Se pusieron en placa células CHO transfectadas establemente (cultivadas en DMEM/10% de FBS) en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos (Costar) y se las dejó recuperarse durante 24 horas. El medio se cambió a DMEM/0,1% de FBS al menos dos horas antes del tratamiento. Las células se preincubaron durante 30 min con 3-isobutil-1-metilxantina 0,1 mM y se expusieron después a péptidos durante 20 min a 37ºC. Se extrajo cAMP intracelular y se midió por duplicado a partir de pocillos triplicados usando un juego RIA (Biomedical Technologies). En el ensayo de cAMP, Ucn presentó una eficacia comparable para CRF-R2 con la de Ucn (Tabla 2). La afinidad extremadamente baja de Ucn II para CRF-R1 impidió una determinación de su eficacia en este receptor.

Ejemplo 5

Se realizó unión en placas Durapore de 0,2 \mum de 96 pocillos usando el sistema de ensayo multitamiz de filtración bajo vacío (Millipore). Cada pocillo contenía un volumen total de 200 \mul consistente en 50 \mul de tampón de unión (10% de sacarosa, 0,1% de BSA, EGTA 2 mM, tampón HEPES 20 mM, pH 7,5); 50 \mul de competidor no marcado (urocortina o péptido relacionado con urocortina humana) en diversas diluciones en tampón de unión; 50 \mul de ^{125}I-sauvagina en una concentración de 150.000 cpm/pocillo; y 50 \mul de membranas de células. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, se filtraron bajo vacío, se lavaron dos veces con tampón de unión y se las dejó secarse. Los filtros individuales de perforaron y se contaron usando un contador gamma.

El desplazamiento mediado por péptido relacionado con urocortina humana de la unión de ^{125}I-sauvagina a CRFR1 y CRFR2\beta expresado establemente en células CHO se muestra en la Figura 5. A partir de estos datos, se encontró que el péptido relacionado con urocortina humana tiene una constante de disociación (K_{i}) de 78 nM para CRF-R1 y 0,23 nM para CRF-R2\beta. Ucn, por otra parte, tenía una constante de disociación de 0,13 nM para CRF-R1 y 0,15 nM para CRF-R2\beta\beta. Por tanto, el péptido relacionado con urocortina humana es mucho más específico para el receptor de factor de liberación de corticotropina tipo II que la urocortina.

Ejemplo 6 Expresión de mARN de Ucn II

Se realizó histoquímica de hibridación para analizar el modelo de expresión de mARN de Ucn II en cerebro de ratón y rata. Se anestesió profundamente a los animales con hidrato de cloral (350 mg/kg, ip) y se sometieron a perfusión por la aorta ascendente con solución salina seguido por paraformaldehído al 4% enfriado con hielo en tampón de borato al 0,1% pH 9,5. Se fijaron posteriormente los cerebros durante 16 h y se crioprotegieron durante la noche en sacarosa del 10% en tampón fosfato 0,1 M. Se cortaron secciones congeladas de una serie de cuatro (ratones) o seis (ratas) de 30 \mum de espesor usando un micrótomo deslizante, se recogieron en crioprotector basado en etilenglicol frío y se guardaron a -20ºC hasta tratamiento histoquímico.

La hibridación in situ se realizó usando sondas (23) de cARN antisentido y sentido (testigo) marcadas con ^{35}S, construidas linealizando primero el plásmido TOPO-II que contenía el cADN de ratón. Se marcaron las sondas hasta actividades específicas de 1-3 x 10^{9} dpm/\mug, se aplicaron a platinas en concentraciones de aproximadamente 10^{7} cpm/ml y se hibridaron durante la noche a 56ºC bajo alto rigor (50% de formamida). Los lavados finales se realizaron en NaCl 15 mM/citrato sódico 1,5 mM a 65-68ºC. Se deshidrataron después las platinas y se expusieron a película de rayos X (\beta-Max; Kodak) durante 16 h, se revistieron después con emulsión líquida Kodak NTB-2 y se expusieron a 4ºC durante 21-28 días.

La histoquímica de hibridación reveló un modelo consecuente y restringido de expresión de mARN de Ucn II en cerebro de ratón y rata. Los tirajes de cadena sentido marcados hasta actividades específicas similares como sondas antisentido no produjeron señales de hibridación por encima del fondo. Se vio que la distribución observada de mARN de Ucn II era principalmente subcortical, con lugares principales de expresión incluyendo grupos de células relacionadas con estrés tales como los núcleos paraventricular, supraóptico y arqueado del hipotálamo, y el locus coeruleus del puente rostral (Fig. 6). Se identificaron también núcleos motores del tallo cerebral (trigeminal, facial, hipoglosal), así como el cuerno ventral espinal, como lugares de expresión de mARN de Ucn II. Entre elementos no neuronales, se observaron consecuentemente señales de hibridación positiva sobre las meninges, pero no el plexo coroideo o el epéndimo. No era evidente una sugerencia clara de expresión de mARN de Ucn II por elementos gliales.

Ejemplo 7 Expresión de péptido relacionado con urocortina en el cerebro de primate

La expresión de péptido relacionado con urocortina humana en el cerebro de primate se examinó por hibridación in situ. La hibridación in situ se realizó en secciones de tejido de cerebro de Macaca fascicularis usando una sonda de cARN antisentido marcada con ^{35}S correspondiente a aproximadamente 400 pares de bases de péptido relacionado con urocortina humana. La sonda se aplicó a la platina en una concentración de 10^{7} cpm/ml y se dejó transcurrir la hibridación durante la noche. Después de la hibridación, se trataron las platinas con 20 \mug/ml de ribonucleasa A durante 30 minutos a 37ºC y se lavaron en NaCl 15 nM/citrato sódico 1,5 mM/formamida del 50% a 70ºC. Se deshidrataron después las platinas y se expusieron a película de rayos X (BetaMax; Kodak) durante 24 horas. Un autorradiograma de la muestra se presenta en la Figura 7. Se observó una señal positiva para URP en los núcleos paraventricular (PVH) y supraóptico del hipotálamo del primate.

Ejemplo 8 Expresión de Fos inducida por Ucn II

Para identificar grupos de células que respondan a la administración central de Ucn II, y para evaluar la extensión en la que éstas pueden conformarse a lugares de expresión de CRF-R2, se comprobó la expresión inducida del producto génico inmediato-temprano, Fos, en respuesta a administración icv de péptido. Se alojaron ratas Sprague-Dawley machos adultos (250-300 g al comienzo de los experimentos) y ratones C57 BL/6 (25-40 g) en una cámara de colonia en un ciclo de luz:oscuridad 12:12, y con acceso libre a alimento y agua antes de la experimentación. Para inyecciones intracerebroventriculares (icv), se anestesiaron las ratas con cetamina/xilazina/acepromazina y se implantaron estereotáxicamente con una cánula de guía de ga 26 que terminaba en el ventrículo lateral. Para administración intravenosa (iv) de péptidos, se equipó a los animales con catéteres venosos yugulares residentes. Se implantó también intraabdominalmente a las ratas que recibían inyecciones icv un transmisor para comprobar remotamente los niveles de actividad gruesa y la temperatura corporal (Mini-Mitter). Después de la cirugía, se permitió recuperarse a los animales durante 7 días antes de cualquier experimentación, durante cuyo tiempo se manejaron diariamente. Todos los procedimientos estaban aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee del Salk Institute.

Para comprobar los modelos inducidos de expresión de Fos, se inyectaron ratas a las 10 de la mañana, icv o iv, con Ucn II sintética (1, 5 o 10 \mug/animal en 2 \mul de solución salina para inyecciones icv o 200 \mul para administración iv), o vehículo solo, y se sometieron a perfusión dos horas después. Para comprobar el efecto de la administración del péptido en la admisión de alimentos, se inyectó icv a los animales con Ucn II de ratón, Ucn de rata o CRF de rata/humano sintéticos 30 min antes de apagar. Se midió después horariamente el consumo durante 6 h y en 12 h. Se analizaron datos usando usando análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA), aplicándose como se justificaba la corrección de Bonferoni para comparaciones múltiples.

Para inmunohistoquímica, se pretrató tejido secuencialmente con 0,3% de peróxido de hidrógeno y 1% de borohidruro sódico. Se permeabilizó después con PBS/0,2% de Triton X-100 y se incubó con antisuero primario durante 48 h en PBS/2% de suero de bloqueo. La inmunorreactividad de Fos se localizó usando un antisuero policlonal producido en conejo contra un fragmento sintético N-terminal de proteína de Fos humano (Santa Cruz Biotechnology, 1:5K). La localización se realizó usando un método de avidina-biotina inmunoperoxidasa convencional con aumento de niquel, como se describe (24).

La inyección de 1 \mug de Ucn II sintética dio lugar a respuestas de activación que eran más destacadas en un grupo de estructuras interconectadas implicadas en control autonómico central (25, 26). Estas incluían aspectos discretos del núcleo de lecho de la estría terminal, el núcleo central de la amígdala, el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVH), el núcleo parabraquial y el núcleo del tracto solitario (NTS; Fig. 8). De éstos, sólo el NTS se ha descrito como lugar de expresión de CRF-R2 (27). La inducción de Fos en otros lugares principales de expresión de CRF-R2, incluyendo el tabique lateral, los núcleos de rafe de cerebro medio y el núcleo ventromedial del hipotálamo (27, 28), no era distinguible de la vista en testigos inyectados con solución salina. Mayores dosis de péptido (5 o 10 \mug) provocaron respuestas de activación más fuertes de distribución similar.

Para controlar los efectos sistémicos potenciales de inyecciones icv, se dio intravenosamente un intervalo similar de dosis de Ucn II a grupos de ratas separados. Sólo la dosis más alta (10 \mug) dio lugar a inducción de Fos que estuviera claramente por encima de los niveles testigo. Aunque el modelo era similar al visto en respuesta a inyecciones centrales, ni el número de células marcadas ni su intensidad de coloración se aproximaban a los vistos de manera fiable tras inyecciones icv de 1 \mug de Ucn II.

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Ejemplo 9 Péptidos relacionados con urocortina estimularon la expresión de FOS en el cerebro

Se examinó la activación de grupos de células relacionadas con estrés centrales por péptido relacionado con urocortina humana mediante detección del producto de gen de Fos en las células tras inyección con péptido relacionado con urocortina humana. Se implantaron a las ratas cánulas de guía en un ventrículo cerebral lateral siete días antes de la experimentación. El día de ensayo, se inyectaron a las ratas 5 \mug de péptido relacionado con urocortina humana sintético en 5 \mul de solución salina estéril. Se sacrificaron las ratas dos horas después y se prepararon platinas de diversas secciones de cerebro. Las platinas se colorearon por localización con inmunoperoxidasa de inmunorreactividad de Fos usando un suero policlonal producido en conejo contra los residuos 3-16 de la proteína de Fos humano.

Como se muestra en la Figura 9, se detectó inmunorreactividad de Fos en la nucleasa de lecho de la estría terminal (BST), el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVH), el núcleo central de la amígdala (CeA), el núcleo parabraquial lateral (PBI), el cocus coeruleus (LC) y el núcleo del tracto solitario (NTS). Cada uno de estos lugares se ha implicado previamente como lugar de actividad de péptido relacionada con CRF.

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Ejemplo 10 Efectos de comportamiento de Ucn II

Al igual que CRF y Ucn, Ucn II es capaz también de actuar centralmente para inhibir la admisión de alimentos (Fig. 10A). Las medidas de grupos separados de ratas inyectadas con estos péptidos (1 \mug, icv) al comienzo de la fase nocturna de su ciclo día-noche manifiestan una interacción significativa entre tratamiento y punto de tiempo [F (18,95) = 4,22, p < 0,0001), con ambos efectos principales consiguiendo también fiabilidad. Los tres péptidos redujeron significativamente la admisión de alimentos durante el intervalo de 12 h, variando el grado de supresión del 30% (CRF) al 35% (Ucn II) al 70% (Ucn). Estos efectos tendían a distribuirse diferencialmente a lo largo del tiempo, con ambos animales tratados con Ucn y CRF comiendo significativamente menos que los testigos inyectados con solución salina antes en el período de ensayo (4-5 h) que las ratas tratadas con Ucn II (6 h).

En estos mismos sujetos, se comprobaron telemétricamente (Fig. 10B) la actividad motora gruesa y la temperatura corporal. El análisis de los datos de actividad reveló una interacción significativa entre fármaco y punto de tiempo [F (33,110) = 1,94, p < 0,006), consiguiendo también significado ambos efectos principales. Las comparaciones post-hoc revelaron que los animales que recibieron CRF eran significativamente más activos que las ratas tratadas con vehículo en el intervalo de 2-6 horas post-inyección (p < 0,001). Ni el tratamiento con Ucn ni con Ucn II provocó alteraciones fiables en esta medida en cualquier punto de tiempo post-inyección. Se registró también la temperatura corporal de núcleo, provocando cada péptido respuestas hipotérmicas comparativamente suaves (0,5-1ºC) y transitorias (2 h) (datos no mostrados).

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Ejemplo 11 Bioensayo in vitro de efectos mediados por hURP en células de pituitaria anterior de rata

Para acciones de pituitaria, se midió la respuesta de secreción de ACTH a péptido relacionado con urocortina humana en cultivos primarios de células de pituitaria anterior de rata como se ha descrito (30). Los niveles de ACTH se determinaron usando el juego de inmunoensayo de ACTH de Nichols Institute Diagnostics. Las células de pituitaria anterior de rata se trataron con urocortina de rata o péptido relacionado con urocortina humana y se midió el nivel de ACTH segregado usando un juego (Nichols Institute Diagnostics). Los efectos de urocortina y péptido relacionado con urocortina humana en la secreción de ACTH se muestran en la Figura 11. Se encontró que el estímulo de la secreción de ACTH en células de pituitaria anterior era menos sensible a péptido relacionado con urocortina humana que a urocortina.

Ejemplo 12 Bioensayo in vitro de los efectos de hURP en células A7R5

Se determinó el efecto de hURP en los niveles de cAMP en células A7R5 que expresan CRF-R2\beta nativo. El linaje de células A7R5 se mantuvo en DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal, L-glutamina 2 mM, 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células se sembraron a razón de 10.000 células/cm^{2} y se desarrollaron durante 6 días. Se preincubaron células privadas de suero con 3-isobutil-1-metilxantina 0,1 mM en medio de ensayo durante 20 minutos y se trataron con las concentraciones indicadas de péptido durante 30 minutos. Los niveles de cAMP se midieron por RIA (Biochemical Technologies) y se muestran en la Figura 12. El péptido relacionado con urocortina humana tiene efectos similares en la producción de cAMP que la urocortina.

Ejemplo 13 Efectos de péptido relacionado con urocortina humana en actividad total

Para determinar si el péptido relacionado con urocortina humana juega un papel en la generación de respuesta al estrés, se examinó el efecto de péptido relacionado con urocortina humana en la actividad motora gruesa de ratas. Se introdujeron quirúrgicamente cánulas en el ventrículo lateral derecho mientras que se implantaron intraabdominalmente telémetros para permitir una comprobación continua de la actividad motora gruesa. Se permitió a los animales un período de recuperación post-quirúrgica de siete días. Durante este tiempo, se manejó a los animales diariamente para aclimatar los animales al procedimiento de inyección. El día de la inyección, se registró la actividad de línea de base durante cuatro horas. A las 6:00 de la tarde, que era el comienzo de apagado de luces, los animales recibieron una inyección de 5 \mul de solución salina o 5 \mul de solución salina que contenía un total de 5 \mug de péptido relacionado con urocortina humana. Las cuentas de actividad se sumaron durante un período de tiempo de cuatro horas. Los resultados se resumen en la Figura 13. No se vio una diferencia significativa de la actividad motora gruesa en animales inyectados con péptido relacionado con urocortina humana en comparación con animales testigos.

Ejemplo 14 Efectos de péptidos relacionados con urocortina humana en la temperatura corporal

Se examinó el efecto de péptido relacionado con urocortina humana en la temperatura corporal de ratas. Se introdujeron quirúrgicamente en el ventrículo lateral derecho cánulas para inyección de péptido relacionado con urocortina humana. Se implantaron intraabdominalmente telémetros para el análisis no molesto continuo de la temperatura corporal. Se permitió a los animales un período de recuperación post-quirúrgico de siete días. Durante este tiempo, se manejó a los animales diariamente para aclimatar los animales al procedimiento de inyección. El día de la inyección, se registró la temperatura de línea de base durante tres horas. A las 6:00 de la tarde (el comienzo de apagado de luces) los animales se inyectaron con 5 \mul de solución salina o 5 \mul de 1\mug/\mul de péptido relacionado con urocortina humana en solución salina. La temperatura corporal se comprobó cada cinco minutos durante doce horas. Como se ve en la Figura 14, los animales inyectados con péptido relacionado con urocortina humana tenían temperaturas corporales más bajas inmediatamente y siete horas después de las inyecciones.

Ejemplo 15 Efectos de péptido relacionado con urocortina humana en el apetito

Se examinó también en ratas el efecto de péptido relacionado con urocortina humana en el apetito. Se introdujeron quirúrgicamente en el ventrículo lateral derecho cánulas para inyección de péptido relacionado con urocortina humana y se dejó recuperarse a los animales durante siete días. Durante este tiempo, se manejó a los animales diariamente para aclimatar los animales al procedimiento de inyección. El día de la inyección, los animales se se inyectaron con 5 \mul de solución salina o 5 \mul de 1 \mug/\mul de péptido relacionado con urocortina humana en solución salina. Se registró la cantidad de alimento comida por cada animal cada hora durante seis horas y a las catorce horas.

El alimento total consumido en el transcurso de los experimentos se muestra para cada período de tiempo en a Figura 15A. Los animales inyectados con péptido relacionado con urocortina humana comieron significativamente menos alimento que los animales testigos. La Figura 15B resume la cantidad de alimento consumido durante cada período de tiempo. Los animales tratados con hURP comieron especialmente menos alimento durante la primera y tercera horas tras la inyección, así como durante las primeras ocho horas del experimento.

Ejemplo 16 Modificaciones útiles de urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana y derivados

La urocortina II y el péptido relacionado con urocortina humana descritos aquí representan más probablemente las formas de prohormona de estas proteínas. Se considera que la activación de las hormonas implicará elaboración proteolítica y otro tipo de modificación a las proteínas tales como modificación que produce formas no amidadas de las proteínas.

Los estudios previos con ligandos para otros receptores CRF han mostrado que puede hacerse a estos ligandos un cierto número de sustituciones de aminoácidos sin perder la capacidad para unirse a los receptores de la bioactividad de los ligandos. Un cierto número de estudios previos con urocortina han mostrado que se toleran fácilmente una, dos o incluso tres sustituciones. En algunos casos, las modificaciones de urocortina produjeron proteína con más propiedades farmacológicas deseables. Puesto que la urocortina II y el péptido relacionado con urocortina humana son proteínas pequeñas, tal modificación puede incorporarse más fácilmente por métodos de síntesis de péptidos muy conocidos por los expertos en la técnica. Éstos incluyen técnicas en fase sólida, fase sólida parcial, condensación de fragmentos y adición de solución clásica. Estos métodos son especialmente preferidos si han de incorporarse aminoácidos no estándares a urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana. Alternativamente, si las modificaciones consisten totalmente en aminoácidos naturales, pueden usarse técnicas de ADN recombinante para mutagénesis y expresión subsiguiente de urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana modificados.

El péptido relacionado con urocortina humana carece de un residuo de tirosina. Puesto que los residuos de tirosina se usan para radioyodación de proteínas, una posible modificación del péptido relacionado con urocortina humana sería sustituir en la proteína otro aminoácido por tirosina . Previamente, se ha descrito la adición de una secuencia consistente en Tyr-Gly al extremo N-terminal de urocortina. La proteína resultante conserva unión a receptor de CRF y bioactividad, pero sería útil en la radioyodación de la proteína. Pueden construirse también otras extensiones N-terminales de la proteína de la presente invención para marcar y otros fines.

Se encontró que la supresión de los primeros siete a diez residuos de urocortina produce la formación de antagonistas de urocortina eficaces. Estas proteínas eran capaces de unirse a receptores de CRF pero no estimulaban o activaban significativamente a los receptores. Se espera que la supresión de hasta cinco aminoácidos de urocortina II o péptido relacionado con urocortina humana produciría también antagonistas eficaces. También puede ser posible crear antagonistas a partir de otros fragmentos de urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana. Estos antagonistas pueden ser eficaces para elevar los niveles de los péptidos endógenos que son liquidados normalmente por proteína de unión a CRF. Por asociación con la proteína de unión a CRF y bloqueando la unión de CRF, urocortina, urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana a la misma proteína, se aumentan las concentraciones eficaces in vivo de CRF, Ucn y Ucn II endógenos. Tales antagonistas pueden coadministrarse con otros agonistas o antagonistas de CRF, Ucn, Ucn II o URP para aumentar sus efectos.

Un análisis extenso de otras proteínas de unión a receptor de CRF ha mostrado que la sustitución de aminoácidos normales con aminoácidos de isómero D o la ciclación de aminoácidos produce una afinidad aumentada para receptores de CRF. En particular, una sustitución especialmente útil es la sustitución del residuo de isoleucina correspondiente a la posición 9 de SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 11 con una aminoácido isómero en "forma D", preferiblemente D-isoleucina, D-fenilalanina y D-leucina. De igual modo, un residuo de ácido glutámico correspondiente a la posición 17 de SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 11 puede sustituirse con D-ácido glutámico. La ciclación de aminoácidos puede formarse por enlaces químicos entre las cadenas secundarias de dos o más residuos. Por ejemplo, pueden reaccionar residuos de ácido glutámico y lisina adyacentes para formar un enlace amida produciendo un anillo lactama. La sustitución con aminoácidos no estándares tales como leucina C_{\alpha}-metilada, alanina C_{\alpha}-metilada, N-im-bencilhistidina, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, homoserina y ornitina puede usarse también para formar agonistas o antagonistas de péptido relacionado con urocortina humana.

Las modificaciones de urocortina II y péptido relacionado con urocortina humana descritas aquí se pretende que sean ilustrativas de una modificación posible que puede realizarse y no se pretende que limiten la invención en modo alguno.

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Discusión

Se usó la búsqueda de homología por todo el genoma para identificar nuevos miembros de la familia CRF de neuropéptidos. Uno de los nuevos ligandos, Ucn II, se une selectivamente a CRF-R2, se expresa en áreas discretas del CNS de rata y activa neuronas centrales implicadas en el tratamiento de información sensorial visceral, y en la modulación de la salida autonómica. Además, Ucn II inhibe la admisión de alimentos, sin ningún efecto en la actividad motora gruesa.

Además de un péptido de ratón que presenta características estructurales, de unión, de actividad y de expresión esperadas de un miembro de la familia CRF, se identificó un URP humano (basado en una secuencia EST disponible públicamente) que es 80% idéntica a la secuencia de ratón al nivel de nucleótidos. Sin embargo, una diferencia importante evidente en el péptido humano es la ausencia de algún lugar de división proteolítica obvio que proporcionaría tratamiento C-terminal de un homólogo humano. Queda por determinar si y cómo puede generarse a partir de esta proteína algún péptido humano homólogo. No obstante, mientras que Ucn se une con alta afinidad por, y señala potentemente a través de, CRF-R1 y CRF-R2 (14-16), Ucn II de ratón y URP humano presentan un alto grado de selectividad de CRF-R2 en estas medidas, y serán sin duda valiosos en funciones de disociación mediadas por los dos tipos de receptores. La Figura 16 muestra un modelo de cómo urocortina II actúa en CRF-R1 y CRF-R2. Ucn II se une con alta afinidad a CRF-R2 y no a CRF-R1. La urocortina se une a ambos receptores mientras que CRF se une con alta afinidad a CRF-R1 pero no a CRF-R2.

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El mARN de Ucn II presenta una distribución subcortical limitada en cerebro de roedor que es única, aunque solapándose ostensiblemente en parte con las de CRF (núcleo paraventricular; por ejemplo, ref. 31) y Ucn (tallo cerebral y núcleos motores espinales; por ejemplo, ref. 18). Es de particular interés el hecho de que el transcripto se expresa en grupos de células implicados en funciones fisiológicas y de comportamiento relacionadas con estrés (véase ref. 13). Esto incluye el locus coeruleus, que emite proyecciones extendidas al manto cortical y se ha implicado en la generación de niveles de la acción de despertar y la ansiedad (por ejemplo, 32), el núcleo paraventricular, que aloja múltiples poblaciones de neuronas neurosecretoras relevantes y se proyecta dentro del CNS para modular el tráfico sensor y motor en el conjunto de circuitos autonómicos centrales (por ejemplo, 33) y el núcleo arqueado, que se ha identificado como un componente cardinal de un sistema extendido que favorece la regulación de la admisión de alimentos y el balance de energía (por ejemplo, 34). Aunque faltan aún datos anatómicos y funcionales para definir el nuevo lugar del péptido en tales contextos, el sistema de Ucn central contiene potencial para participar en funciones relacionadas con estrés implicadas durante mucho tiempo como la competencia de la red de CRF central más amplia. Esto contrasta con Ucn, cuya sede dominante de expresión celular en el cerebro, el núcleo de Edinger-Westphal, muestra capacidades muy limitadas a este respecto, en gran medida por una insuficiencia de proyecciones documentadas al cerebro anterior (16, 18).

A la vista de sus características de unión y actividad, el fallo del modelo de activación celular obtenido por Ucn II central hasta imitar estrechamente la distribución de CRF-R2, era inesperado. Un estudio reciente que compara la distribución de la expresión de Fos inducida por CRF o UCN icv documentaba modelos de activación consecuentes groseramente con las afinidades de unión de estos péptidos para CRF-Rs codificados por los dos genes conocidos (35). Esto es, CRF en dosis similares a las empleadas aquí activaba lugares de expresión de CRF-R1 de manera altamente preferencial, mientras que UCN provocaba inducción de Fos principalmente en subconjuntos de grupos de células que expresan cada receptor. Además, no obstante, ambos péptidos reclutaban el muy semejante conjunto de estructuras autonómicas centrales que se veían aquí como las sedes dominantes de respuestas de activación inducidas por Ucn II en el cerebro de rata. Esto es significativo porque elementos del sistema autonómico central están entre los lugares mejor documentados en los que péptidos de tipo CRF pueden actuar para obtener respuestas autonómicas y de comportamiento relacionadas con estrés. Estos hallazgos sugerirían que la activación de receptor de tipo 2, así como de tipo 1, es capaz de ocupar este sistema, aunque la base para esto no está clara. Entre los puntos nodales en la red autonómica central, sólo el núcleo parabraquial (R1) y el NTS (R2) se han identificado como lugares de expresión de CRF-R (27, 28, 35) y queda por determinar si la activación mediada por receptor de alguno o ambos de éstos es suficiente para alistar el sistema como un todo. Es importante indicar que las inyecciones sistémicas de Ucn II sintética no lograron obtener respuestas de activación comparablemente poderosas dentro de grupos de células autonómicas centrales en el mismo intervalo de dosis que se usaron para estudios de inyecciones icv. Éste es un control importante, porque la activación de CRF-R2 periférico puede producir una reducción marcada y persistente de la presión sanguínea (16, 17), y retos hipotensivos salientes son capaces de activar las estructuras autonómicas centrales muy semejantes que responden a administración central de Ucn II (36, 37).

La caracterización inicial de los efectos de Ucn II icv en la admisión de alimentos y la actividad complementa esfuerzos recientes para burlar los papeles de CRF-Rs individuales en comportamientos relacionados con estrés. Por ejemplo, mientras que ratones que llevan mutaciones nulas de cualquier receptor presentan admisión de alimentos basal normal, los animales deficitarios en CRF-R1 han mostrado ser refractarios a los efectos anoréxicos de UCN durante el período inmediatamente posterior a la inyección, pero no en puntos de tiempo más tardíos, mientras que lo contrario es cierto de ratones mutantes de CRF-R2 (11, 38, 39). Esto se ha tomado como sugerente de que la fase temprana y tardía de la supresión de alimentación mediada por Ucn pueden ser sucesos mediados por CRF-R1 y CRF-R2, respectivamente. El uso de un paradigma diferente (alimentación libre durante la noche en lugar de realimentación inducida por privación) proporcionó datos que soportan tal reconocimiento, porque el ligando específico de R2 no suprimió de manera fiable la admisión de alimentos en los puntos de tiempo tempranos, pero lo hizo más allá de 6 horas post-inyección.

Las medidas de actividad motora soportaron también una disociación de la implicación de CRF-R en este parámetro. En línea con la evidencia reciente en ratones eliminados que sugieren que la activación locomotora es un acontecimiento mediado por CRF-R1 (40), se encontró que el agonista selectivo de R1, CRF, aumentó significativamente la actividad motora gruesa, mientras que la administración de UCN II no lo hizo. De manera interesante, el tratamiento con UCN, que es unida con alta afinidad por ambos receptores, produjo una tendencia no significativa hacia actividad aumentada, siendo los valores fiablemente más bajos que los vistos en respuesta a CRF. Esto es consecuente groseramente con un cuerpo de evidencia creciente que soporta un antagonismo funcional entre los dos tipos de receptores conocidos. Mientras que ratones deficitarios en CRF-R1 muestran respuestas endocrina y de tipo ansiedad al estrés reducidas (41), los linajes mutantes de CRF-R2 presentan aumentos en estos parámetros (11, 39, 42) sugiriendo que la activación basal de CRF-R2 puede jugar un papel en oposición a respuestas al estrés actuadas por CRF-R1.

La identificación de un ligando selectivo de CRF-R2 endógeno permitirá un análisis más detallado de los papeles de moléculas de señalización relacionadas con CRF individuales en funciones fisiológicas y de comportamiento relacionadas con estrés. La expresión central de mARN de Ucn II identificó grupos de células que responden a la administración central del péptido, y confirmó respuestas de comportamiento que son consecuentes con consecuencias previamente hipotéticas de la activación de CRF-R2. Una penetración adicional en el lugar de este péptido en biología del estrés requerirá delinear las proyecciones centrales de células que contienen Ucn II, y la identificación de los factores y circunstancias que regulan la expresión de gen y liberación de péptido.

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Cualesquiera patentes o publicaciones mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Estas patentes y publicaciones se incorporan aquí como referencia en la misma extensión como si cada publicación se indicara específica e individualmente para ser incorporada como referencia.

Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a ella. Los presentes ejemplos, junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos aquí, son representativos actualmente de realizaciones preferidas, son ejemplos y no se pretenden como limitaciones del alcance de la invención. Se encontrarán por los expertos en la técnica cambios en ella y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones.

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<110> Vale, Wylie Walker Jr.

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Lewis, Kathy Ann

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Reyes, Teresa Marie

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Hogenesch, John Beren

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Sawchenko, Paul Emil

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Vaughan, Joan Maureen

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Rivier, Jean Edouard Frederic

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Perrin, Marilyn Heller

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<120> Urocortin Proteins and Uses Thereof

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<130> D6334PCT

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<141> 2001-08-04

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<150> US 60/273,969

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<151> 2001-03-07

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<160> 13

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<210> 1

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<211> 399

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> 7..345

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<223> DNA Sequence encoding human Urocortin-related peptide (hURP)

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Human Urocortin-related peptide (hURP) precursor peptide

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Péptido relacionado con urocortina humana (hURP)

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<400> 3

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7

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<210> 4

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Aminoácidos 1-38 de péptido relacionado con urocortina humana (hURP)

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<400> 4

8

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<210> 5

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Urocortina humana (hUcn)

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<400> 5

9

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<210> 6

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Factor de liberación de corticotropina humana

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<400> 6

10

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<210> 7

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Cyprinus carpio

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<220>

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<223> Urotensina de carpa (cUro)

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<400> 7

11

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<210> 8

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Sauvagina de rana (fSvg)

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<400> 8

12

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<210> 9

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Factor de liberación de corticotropina de cazón/urotensina (dCRF/Uro)

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<400> 9

13

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<210> 10

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Péptido precursor de urocortina II de ratón

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<400> 10

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14

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<210> 11

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<220>

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<223> Urocortina II de ratón

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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15

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<210> 12

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Takifugu rubripes

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Péptido relacionado con urocortina de pez globo

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<400> 12

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16

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<210> 13

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Rattus norwegicus

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<220>

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<223> Urocortina de rata

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<400> 13

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17

Claims (30)

1. Un ADN que codifica un péptido relacionado con urocortina humana seleccionado del grupo constituido por:

(a)

ADN aislado y purificado que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos 2-4;

(b)

ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1, en el que las condiciones de alto rigor se caracterizan como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1; y

(c)

ADN aislado y purificado que difiere de los ADNs aislados de (a) anterior en secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2-4.

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2. El ADN según la reivindicación 1ª, caracterizado porque el ADN tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1.

3. Un vector capaz de expresar el ADN de la reivindicación 1ª o la reivindicación 2ª, caracterizado porque el vector comprende dicho ADN y elementos reguladores necesarios para la expresión de dicho ADN en una célula.

4. Una célula hospedante transfectada con el vector según la reivindicación 3ª, caracterizada porque el vector expresa una proteína péptido relacionado con urocortina humana.

5. La célula hospedante según la reivindicación 4ª, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo constituido por células bacterianas, células de mamífero, células de plantas y células de insectos.

6. La célula hospedante según la reivindicación 5ª, caracterizada porque la célula bacteriana es E. coli.

7. Un péptido relacionado con urocortina humana seleccionado del grupo constituido por:

(a)

péptido relacionado con urocortina humana aislado y purificado que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de SEQ ID Nos. 2-4; y

(b)

péptido relacionado con urocortina humana aislado y purificado codificado por un ADN seleccionado entre los siguientes:

(i)

ADN aislado y purificado que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2-4;

(ii)

ADN aislado y purificado que se hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento antisentido de un ADN que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1, en el que las condiciones de alto rigor se caracterizan como lavado de membrana a alta temperatura y baja concentración de sal equivalente funcionalmente a 0,1 x SSC a 65ºC y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que se une con mayor afinidad a CRF-R2 que a CRF-R1; y

(iii)

ADN aislado y purificado que difiere de los ADNs aislados de antes en secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica un péptido relacionado con urocortina humana que tiene una secuencia indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2-4.

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8. Un anticuerpo dirigido contra el péptido relacionado con urocortina humana de la reivindicación 7ª.

9. El anticuerpo según la reivindicación 8ª, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. Un péptido relacionado con urocortina humana modificado que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2-4, en el que dicho péptido comprende una modificación seleccionada del grupo constituido por:

(a)

dicho péptido se ha mutado para contener un residuo de tirosina;

(b)

dicho péptido se ha modificado por adición de una secuencia Tyr-Gly al extremo N-terminal de dicho péptido;

(c)

dicho péptido se ha modificado por una supresión N-terminal, en el que dicha supresión comprende aminoácidos seleccionados del grupo constituido por el primer aminoácido, el primero y segundo aminoácidos, el primero al tercer aminoácidos, el primero al cuarto aminoácidos y el primero al quinto aminoácidos;

(d)

dicho péptido tiene una secuencia indicada en SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 4, y un residuo de isoleucina correspondiente a la posición 9 de dicho péptido es sustituido con un aminoácido isómero en "forma D";

(e)

dicho péptido tiene una secuencia indicada en SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 4, y un residuo de ácido glutámico correspondiente a la posición 17 de dicho péptido es sustituido con D-ácido glutámico;

(f)

dicho péptido está acilado en el término N de dicho péptido; y

(g)

dicho péptido está amidado en el término C de dicho péptido.

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11. El péptido según la reivindicación 10ª, caracterizado porque el aminoácido isómero en "forma D" se selecciona del grupo constituio por D-isoleucina, D-fenilalanina y D-leucina.

12. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10ª o 11ª, caracterizado porque uno o más aminoácidos están sustituidos con aminoácidos no estándares conocidos en la técnica.

13. El péptido según la reivindicación 12ª, caracterizado porque los aminoácidos no estándares se seleccionan del grupo constituido por leucina C_{\alpha}-metilada, alanina C_{\alpha}-metilada, N-imbencilhistidina, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, homoserina y ornitina.

14. El péptido según las reivindicaciones 10ª a 13ª, caracterizado porque el péptido está acilado con un ácido graso.

15. El péptido de la reivindicación 7ª o la reivindicación 10ª, caracterizado porque el péptido se ha modificado para contener una marca fluorescente.

16. Un conjugado del péptido según las reivindicaciones 7ª y 10ª a 15ª, caracterizado porque el péptido está enlazado a una toxina.

17. Un conjugado del péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 7ª y 10ª a 16ª y un agente acomplejante para radionúclidos.

18. El conjugado según la reivindicación 17ª, acomplejado con un radionúclido.

19. Una composición farmacéutica que comprende el péptido relacionado con urocortina humana según una cualquiera de las reivindicaciones 7ª a 18ª y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

20. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el péptido tiene una amida en el término C.

21. La composición farmacéutica según la reivindicación 18ª, caracterizada porque el péptido tiene una amida en el término C.

22. La composición farmacéutica según las reivindicaciones 18ª o 20ª, caracterizada porque dicho péptido tiene la secuencia indicada en SEQ ID No. 3.

23. La composición farmacéutica según las reivindicaciones 18ª o 20ª, caracterizada porque dicho péptido tiene la secuencia indicada en SEQ ID No. 4.

24. El péptido relacionado con urocortina humana de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para tratar un estado fisiológico en un individuo que necesite tal tratamiento.

25. El péptido relacionado con urocortina humana de la reivindicación 24ª, en el que dicho estado fisiológico se selecciona del grupo constituido por alta temperatura corporal, disfunción del apetito, fallo cardíaco congestivo, estrés, ansiedad y niveles indeseablemente bajos de secreción de ACTH.

26. El péptido relacionado con urocortina humana de la reivindicación 7ª, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 2.

27. El péptido relacionado con urocortina humana de la reivindicación 7ª, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 3.

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28. El péptido relacionado con urocortina humana de la reivindicación 7ª, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 4.

29. Un péptido relacionado con urocortina humana aislado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 4, en el que dicho péptido está amidado en el término C.

30. Un péptido relacionado con urocortina humana aislado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 3, en el que dicho péptido está amidado en el término C.