CN1484650A - 尿皮质素蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

鉴定了一种与CRF神经肽家族具有显著序列同源性的人尿皮质素相关肽。从全脑poly(A+)RNA分离小鼠cDNA，它编码预测的38个氨基酸肽蛋白(在本文中称为尿皮质素II)。人URP和鼠家属成员，CRF和尿皮质素(Ucn)。这些肽在基础和应激条件下，与下丘脑－垂体－肾上腺轴的调控有关，提示URP和Ucn II的类似作用。合成的Ucn－II与URP肽与CRF－R2具有比CRF－R1 Ucn II和人URP的结合有更高的亲和力，这似乎与体温和食欲调节有关，可能在其它应激相关现象中起作用。这些发现鉴定了Ucn II和人URP是神经肽的CRF家族的新成员，在中枢神经部分表达，并与CRF－R2结合。

Description

尿皮质素蛋白及其用途
发明背景
联邦基金说明
本发明部分使用基金号DK-26741的联邦政府的资助款完成。因此，联邦政府对该发明有某些权利。
发明领域
本发明一般涉及神经内分泌学领域和与应激有关的机制。更具体的，本发明涉及新的促肾上腺皮质素释放因子相关肽，尿皮质素II和人尿皮质素相关蛋白，它们与应激反应有关。
相关领域的描述
促肾上腺皮质素释放因子(CRF)是一种41-氨基酸的肽，以其引发对应激的垂体-肾上腺反应的不可缺少的作用著称，这是一种由1型CRF受体介导的作用(1)。另外，促肾上腺皮质素释放因子广泛分布于大脑中，重复地显示参与对各种有威胁的环境中互补自主的迁移和行为调节(2，3)。这鼓励了广泛的猜想，即促肾上腺皮质素释放因子及其相关肽家族在基础和应激条件下下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的调节中起重要的作用(4，5)。还相信，促肾上腺皮质素释放因子还与许多组织中的其它神经内分泌和旁分泌反应有关。CRF家族的成员使对应激物的内分泌、自主和行为反应结合在一起。这些肽还可以牵涉食欲、唤醒和认知功能的控制。长期应激作用可产生严重的心理和生理后果，例如焦虑症、神经性厌食症和忧郁症的抑郁。
促肾上腺皮质素释放因子通过与具有高亲和力的CRF受体特异性结合介导其生物作用(6，7)。CRF受体是G-蛋白偶联受体，它通过腺苷酸环化酶起作用，与促胰液素家族结构上相关。该家族还包括GRF、VIP、PTH和降钙素受体。CRF受体基因具有13个外显子，已发现了该受体的几个剪切变体。CRF-R1受体分布在整个大脑中，在感觉和运动中继位点找到。CRF-2α分布在外侧隔膜、腹内侧下丘脑、孤束核和中缝背核中，其中CRF-R1区域表达很少或几乎不表达(9)。CRF-R2β大部分在周围位点，包括心脏、血管、胃肠道、附睾、肺和皮肤中发现(7，10)。两类受体的药理学不同在于促肾上腺皮质素释放因子对于CRF-R2的亲和力低(Ki＝15-100nM)，但对CRF-R1具有高亲和力(Ki＝1-2nM)。其它相关的肽，例如鲤鱼紧张肽(urotensin)、蛙皮降压肽和尿皮质素具有对CRF-R2的高亲和力。CRF-R2敲除的小鼠显示对应激物的超敏感性导致的焦虑样行为增加了。
发现鉴定为引起应激样自主和行为反应中肽作用的位点的许多细胞类型缺乏或没有必需配体、受体或两者的表达(12，13)。这引起了对其它CRF-相关信号传递分子的搜索，目前共有两种配体，衍生自两个不同基因(CRF-R1和CRF-R2)的G蛋白偶联受体和结合蛋白，它的功能仍未被完全了解(14，15)。
近来发现了第二种哺乳动物CRF-相关神经肽，尿皮质素(Ucn)，显示以高亲和力与两种已知的CRF受体结合，而CRF以高度优先的方式与CRF-R1结合。中枢给药的尿皮质素在抑制食欲方面比CRF更强，但在产生急性焦虑样作用和普遍的行为激活中较差(17)。这已被用于表明尿皮质素可能介导一些应激相关作用，这些作用最初认为是CRF引起的，至少部分是作为CRF-R2的内源配体。然而该观点受到了攻击，因为有观察显示大脑中尿皮质素表达的主要胞内位置不被认为是中枢应激相关回路的必需的组成，CRF-R2表达的大多数主要位点很少被含尿皮质素投影神经刺激(18)。这些和其它发现支持在哺乳动物大脑中可能存在一种或多种其它CRF受体配体。
现有技术的缺陷在于缺乏对其它尿皮质素基因和蛋白质的认识。本发明满足了本领域中这种长期存在的需要。
发明简述
人和小鼠基因组序列数据保藏中的迅速进展提供了一个机会，以鉴别许多蛋白质家族的新成员。从公用的人基因组数据库中鉴定出新颖肽序列，人尿皮质素相关肽(URP)。尿皮质素相关肽序列含有与人尿皮质素(44％)、硬骨鱼紧张肽(39％)和人CRF(36％)的同源性。合成的尿皮质素相关肽与CRF-R2的结合亲和力(Ki＝0.5nM)比CRF-R1(Ki＝70nM)高。人尿皮质素相关肽刺激大鼠前叶垂体细胞分泌ACTH，虽然比尿皮质素或CRF能力明显低。用序列同源性检索工具，还鉴定出一条编码38个氨基酸的肽的小鼠基因，它代表神经肽的CRF家族的新成员。该肽称为尿皮质素II(Ucn II)，与其它已知的家族成员不同，因为它与CRF-R2以高选择性结合。用对尿皮质素II高度特异性的抗体进行的免疫组织化学和原位杂交研究，提供了大鼠大脑中尿皮质素II的证据。
在本发明的一个实施例中，提供了编码尿皮质素II的DNA序列。该序列可选自：分离和纯化的DNA，其编码尿皮质素II；分离和纯化的DNA，其在高严谨条件(定义为在高温和低盐浓度下洗涤膜，该在功能上等价于65℃的0.1×SSC)下与尿皮质素II DNA的反义补体杂交；和分离和纯化的DNA，其编码尿皮质素II但序列由于基因编码的简并性而不同。该DNA优选编码蛋白质前体，其具有SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施例中，本发明针对一种载体，其能表达尿皮质素II。这种载体由编码尿皮质素II的DNA和在细胞中表达尿皮质素II所需的调控元件组成。在一个优选例中，该载体编码氨基酸序列SEQ ID NO：11的蛋白质。本发明还针对一种宿主细胞，它被该载体转染，并表达来自该载体的尿皮质素II。该蛋白质可以在选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞的细胞类型中表达。在一个优选例中，该蛋白在大肠杆菌中表达。
在本发明的另一个实施例中，提供了上述DNA编码的分离和纯化的人尿皮质素II蛋白。优选纯化的人尿皮质素相关的肽具有对应于SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施例中，提供了针对尿皮质素II蛋白的抗体。该抗体可以是单克隆抗体。
在本发明的另一个实施例中，提供了含有尿皮质素II蛋白的药物组合物。可用这种药物组合物降低低温、抑制食欲、和治疗或预防充血性心力衰竭和各种应激相关疾病。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种编码人皮质素相关肽的DNA序列。该序列可选自：分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素-相关肽；分离和纯化的DNA，其在高严谨条件(定义为在高温和低盐浓度下洗涤膜，在功能上等价于65℃的0.1×SSC)下与人尿皮质素相关肽DNA的反义补体杂交；和分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素相关肽但序列由于基因编码的简并性而不同。该DNA优选具有SEQ IDNO：1所示的序列，编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质前体。
在本发明的另一个实施例中，本发明针对一种载体，其能表达人尿皮质素相关肽。这种载体由编码人尿皮质素相关肽的DNA和在细胞中表达人尿皮质素相关肽所需的调控元件组成。在一个优选例中，该载体编码氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质。本发明还针对一种宿主细胞，它被该载体转染，并表达来自该载体的人尿皮质素相关肽。该蛋白质可以在选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞的细胞类型中表达。在一个优选例中，该蛋白在大肠杆菌中表达。
在本发明的另一个实施例中，提供了上述DNA编码的分离和纯化的人尿皮质素相关肽蛋白。优选纯化的人尿皮质素关联的肽具有对应于SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施例中，提供了针对人尿皮质素相关肽蛋白的抗体。该抗体可以是单克隆抗体。
在本发明的另一个实施例中，提供了含有人尿皮质素相关肽蛋白的药物组合物。可用这种药物组合物降低低温、抑制食欲、和治疗或预防充血性心力衰竭和各种应激相关疾病。
在本发明的另一个实施例中，描述了各种尿皮质素II和人尿皮质素相关肽蛋白质的修饰，包括对序列和蛋白质的各氨基酸的修饰。修饰还包括尿皮质素II和人尿皮质素相关肽与荧光标记、复合的放射性核素和毒素的偶联。
附图简述
本发明的上述特征、优点和目的，以及其它将变得明显，并可详细理解，上面简述的本发明的更具体的描述可参考附图中所述的一些实施例。这些附图构成了本说明书的一部分。然而应该注意附图说明了本发明的优选例，因此不能被认为限制其范围。
图1显示了人基因组DNA序列，预测与尿皮质素和CRF相关的一种新肽的存在。在公用数据库中鉴定基因组序列，用于预测人尿皮质素相关肽的新颖序列。推定的起始位点在1位，黑体所示的是成熟肽序列。预测的信号肽切割位点用箭头标出。
图2显示了推测的人尿皮质素相关肽前体。下划线的区域代表一部分cDNA序列，它是通过PCR从人胰岛cDNA文库分离出来的。
图3显示了人尿皮质素相关肽(URP)与人Ucn、硬骨鱼紧张肽I、CRF、蛙皮降压肽和角鲨CRF/Uro的比较。最高同源性区域位于白色框内。标出了保守氨基酸数。
图4A显示Ucn II的预测的氨基酸序列。用黑体标出的起始甲硫氨酸位于加框的肽编码区域的上游。完整的核苷酸序列保藏在GenBank(登录号AF331517)。图4B显示小鼠Ucn II与同源人和鱼肽(URP)，和大鼠Ucn与大鼠/人CRF的排列。加框的是与小鼠Ucn II序列相同的残基。
Figure A0181578300101
表示酰胺化位点。
图5显示人尿皮质素相关肽介导125I-蛙皮降压肽与CRFR1和CRFR2β结合的置换。蛙皮降压肽的竞争性替代测定Ucn和URP对于CHO细胞中稳定表达的CRFR1和CRFR2β的亲和力。数据代表3个实验，用Prism程序计算抑制解离常数(Ki)值(95％置信限)。
图6A-6C显示尿皮质素II mRNA在大鼠大脑中的表达。暗视野显微照相显示在所选区域，用小鼠尿皮质素II cDNA产生的同位素标记的反义cRNA探针观察到的标记(白色颗粒)。在下丘脑室旁核(图6A)、主要在其大细胞部分(pm)中见到阳性杂交信号，在小细胞方面(mp)见到更扩散的信号，在大脑大腹侧面蓝斑(LC；图6B)、面部运动核(VII，图6C)和脑膜(men)中广泛分布。其它缩写：CBL，小脑；v3，第三脑室；v4，第四脑室。放大：图6A和6B，X75；图6C，X50。
图7显示了灵长类下丘脑中人尿皮质素相关肽表达的放射性自显影。PVH，室旁核；SO，视上核；CN，尾状核；och，视交叉；me，正中隆起；ac，前连合；ic，内囊；Sept，隔膜。
图8A-8F显示了响应中枢尿皮质素II显微注射的细胞激活模式。图8A-8C和8E：免疫过氧化物酶制备物的亮视野显微照片，显示脑室内(icv)注射1微克合成的小鼠尿皮质素II2小时后杀死的大鼠中Fos表达下降。图8D和8F分别提供了暗视野显微照片，显示CRF-R2 mRNA在对应于图8C和8E中所示的区域中的杂交免疫组织化学定位。中枢尿皮质素II注射主要在一组与中枢自主和神经内分泌控制有关的互连的结构中引起Fos诱导，包括室旁核的小细胞部分(图8A)，扁桃体的中央核(图8B)和孤束核(NTS，图8C)。在这些中，仅NTS是CRF-R2的表达的位点(图8D)。其它CRF-R2的表达的主要位点，包括下丘脑腹内侧核(图8F)在检测的肽剂量范围(1-10微克)上都不显示尿皮质素II诱导的Fos表达。所有显微照片放大75倍。
图9显示中枢注射人尿皮质素相关肽后，中枢应激相关细胞组的活化，通过检测终纹(BST)、下丘脑室旁核(PVH)、扁桃体中央核(CeA)、臂旁外侧核(PBI)、蓝斑(LC)和孤束核(NTS)中核FOS表达的刺激。BSTov，终纹床核(卵亚核)；ic，内囊；CP，尾核；ac，前连合；v3，第三脑室；AHA，下丘脑前区；pm，后大细胞部分(室旁核)；fx，穹隆；CeAm，扁桃体中央核(内侧部分)；BLA，扁桃体基底外侧核；scp，小脑上脚；PBel，臂旁核(外侧部分)；V4，第四脑室；ep，室管膜；AP，最后区；DMX，迷走神经背侧运动核；ts，孤束；和cc，中央管。
图10A和10B显示中枢尿皮质素II对食物摄取和总运动功能的作用。图10A显示icv注射1微克CRF、尿皮质素或尿皮质素II后，平均(±SEM；n＝3-6/组)累积夜间食物摄取(g)。CRF和尿皮质素与注射盐水的对照相比，从注射后4个小时开始明显减少了食物摄取，同时直到治疗后6个小时，不体现尿皮质素II的作用。*p＜0.002(CRF和Ucn对盐水)，**p＜0.002(CRF、尿皮质素和尿皮质素II对盐水)。图10B显示总运动功能的遥感测定，它在接受icv注射CRF的动物中显著升高；尿皮质素或尿皮质素II都不显著影响运动功能。*p＜0.001(CRF对盐水)。
图11显示尿皮质素和人尿皮质素相关肽对大鼠垂体前叶细胞的ACTH分泌的刺激。在培养物中建立大鼠垂体前叶细胞，用大鼠尿皮质素或人尿皮质素相关肽处理。用试剂盒(Nichols Institute Diagnositics)测定分泌的ACTH。
图12显示人尿皮质素相关肽对A7R5细胞中cAMP水平的作用，它表达天然CRF-R2β。与尿皮质素(空心圆)或hURP(实心圆)一起温育30分钟对cAMP生产有剂量依赖性作用。通过RIA(Biochemical Technologies)测定cAMP。
图13显示人尿皮质素相关肽(hURP)对大鼠中总运动功能的作用。
图14显示人尿皮质素相关肽(URP)脑室内(icv)注射对大鼠体温的作用。
图15显示了人尿皮质素相关肽(hURP)脑室内注射对大鼠夜间食物摄取的作用。
图16显示了人尿皮质素相关肽对CRF-R1和CRF-R2如何作用的模型。人尿皮质素相关肽以高亲和力与CRF-R2结合，但与CRF-R1不结合，而尿皮质素与两种受体结合。CRF以高亲和力与CRF-R1结合，但不与CRF-R2结合。
发明详述
根据本发明，可使用本领域技术人员能力范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完全解释。见例如Maniatis，Fritsch &Sambrook《分子克隆：实验室手册》(“Molecular Cloning，A LaboratoryMannual”)(1982)；《DNA克隆：实践方法》(“DNA Cloning：A Practical Approach”)卷I和II(D.N.Glover编，1985)；《寡核苷酸合成》“OligonucleotideSynthesis”)(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(“Nucleic AcidHybridization”)[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；《动物细胞培养》(“Animal Cell Culture”)[R.I.Freshney编，(1986)]；《固定化细胞和酶》(“Immobilized Cells And Enzymes”)[IRL Press(1986)]；B.Perbal，《分子克隆实践指南》(“A Practical Guide To Molecular Cloning”)(1984)。因此，如果在本文中出现，下列术语应该具有下面列出的定义。
本文所用的术语“cDNA”指基因mRNA转录物的DNA拷贝。
本文所用的术语“衍生的氨基酸序列”指通过阅读cDNA中核苷酸碱基的三联体序列确定的氨基酸序列。
本文所用的术语“筛选文库”指用标记的探针来检查在合适的条件下，在特定的DNA文库中是否存在与探针互补的序列。另外，“筛选文库”可通过PCR进行。
本文所用的术语“PCR”指聚合酶链式反应，它是MuUis的美国专利号4,683,195和4,683,202和其它本领域已知改进的主题。
本文所用的所有氨基酸残基序列用式代表，其左和右朝向是氨基末端到羧基末端的常规朝向。另外，应该注意在氨基酸残基序列的开始或结束的滤线表明与一个或多个氨基酸残基的其它序列的肽键。
本文所述的氨基酸优选是“L”异构型的。然而，“D”异构型的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要多肽维持免疫球蛋白结合的所需功能性质。NH2指多肽的氨基末端存在游离的氨基。COOH指多肽的羧基末端存在游离羧基。
非标准氨基酸可以通过化学修饰现有的氨基酸，或通过人工合成蛋白质掺入蛋白质。非标准氨基酸指化学结构与基因密码编码的20个标准氨基酸的化学结构不同的氨基酸。体内翻译后修饰也可导致蛋白质中非标准或氨基酸衍生物的存在。蛋白质的N-末端NH2和C-末端COOH基团也可通过蛋白质的天然或人工翻译后修饰来进行修饰。
可通过氨基酸取代修饰蛋白质。通常一些改变导致蛋白质活性显著改变，而另一些几乎或完全没有作用。保守取代最不可能急剧地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸取代”指用化学类似的氨基酸取代氨基酸，即用其它非极性氨基酸取代非极性氨基酸；用其它极性氨基酸取代极性氨基酸，用其它酸性氨基酸取代酸性残基等。优选保守取代的例子列于表I：
                          表I
    原始残基   优选保守取代     最优选保守取代
    Ala(A)   Val；Leu；Ile     Val
    Arg(R)   Lys；Gln；Asn     Lys
    Asn(N)   Gln；His；Lys；Arg     Gln
    Asp(D)   Glu     Glu
    Cys(C)   Ser     Ser
    Gln(Q)   Asn     Asn
    Glu(E)   Asp     Asp
    Gly(G)   Pro     Pro
    His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg     Arg
    Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe；Nle     Ile
    Leu(L)   Ile；Val；Met；Ala；Phe；Nle     Leu
    Lys(K)   Arg；Gln；Asn     Arg
    Met(M)   Leu；Phe；Ile     Leu
    Phe(F)   Leu；Val；Ile；Ala     Leu
    Pro(P)   Gly     Gly
    Ser(S)   Thr     Thr
    Thr(T)   Ser     Ser
    Trp(W)   Tyr     Tyr
    Tyr(Y)   Trp；Phe；Thr；Ser     Phe
    Val(V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala；Nle     Leu
“化学衍生物”指一种多肽，它具有一个或多个通过官能性侧基的反应化学衍生的残基。这些衍生的多肽包括例如，游离氨基已衍生形成胺化盐酸、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可衍生形成盐、甲基或乙基酯或其它类型的酯或肼。化学衍生物可包括那些含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可取代丝氨酸，鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明所述的肽还包括相对于本文所示序列的具体肽，具有一个或多个残基添加和/或缺失的肽，只要修饰的肽维持必需的生物活性。
“复制子”是作为体内DNA复制的自主单元，即能够在自身控制下复制的基因元件(例如质粒、染色体、病毒)。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一条DNA节段可与其结合从而使结合的节段复制。
“DNA分子”指单链形式或双螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，不限于任何三级形式。因此，该术语包括双链DNA，尤其是线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论本文的结构中，根据一般常规，仅使用沿DNA的非转录链5’-3’方向的序列(即与mRNA具有同源序列的链)。
“复制起始点”指参与DNA合成的DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，当在合适的调控序列控制下，它在体内转录和翻译成多肽。编码序列的边界是由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核生物mRNA的cDNA、真核(哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，提供编码序列在宿主细胞中的表达。
“启动子序列”是能在细胞中与RNA聚合酶结合，引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区域。为了限定本发明，启动子序列在其3’末端与转录起始位点连接，向上游(5’方向)延伸，以包含在高于背景的可检测水平引发转录所必需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列中可找到转录起始位点和蛋白质结合域(共有序列)，负责RNA聚合酶的结合。真核启动子常常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列还含有Shine-Dalgarno序列。
“表达控制序列”是DNA序列，它控制和调节另一条DNA序列的转录和翻译。当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA，然后翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制下”。
“信号序列”可在编码序列附近。该序列编码多肽N-端的信号肽，它与宿主细胞通讯以将多肽定向到细胞表面或将多肽分泌入介质，在蛋白质离开细胞前，该信号肽被宿主细胞切下。可发现信号序列与各种原核细胞和真核细胞天然的蛋白质有关。
本文所用的术语“寡核苷酸”指本发明的探针，定义为一个含有两个或多个，优选三个以上核糖核苷酸的分子。其确切大小将由许多因素决定，其反过来取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
本文所用的术语“引物”指寡核苷酸，不论是天然存在的还是在纯化的限制性消化物中，或合成产生的，当置于合成引物延伸产物的条件下时，它可作为引发合成的点，与核酸链互补，即在核苷酸和诱导剂，例如DNA聚合酶的存在下，和在合适的温度和pH下被诱导。引物可以是单链或双链的，必须足够长，以引发所需延伸产物在诱导剂存在下的合成。引物的确切长度由许多因素决定，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，为了诊断应用，由靶序列的复杂性决定，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多的核苷酸，虽然它可含有更少的核苷酸。
选择本文中的引物与特定靶DNA序列的不同链“基本”互补。这意味着引物必须足够互补，与其相关链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可在引物的5’末端连接非互补核苷酸片段，剩余的引物序列与链互补。另外，非互补碱基或较长的序列可引入引物中，条件是引物序列与序列充分互补或杂交，形成延伸产物合成的模板。
本文所用的术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指酶，各自在特定核苷酸序列处或附近切开双链DNA。
当DNA引入细胞内时，细胞被外源或异源DNA“转化”。转化性DNA可能或可能不是整合(共价连接)入细胞的基因组。在例如原核细胞、酵母和哺乳动物细胞中，转化性DNA可维持在附加型元件，例如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是一种转化性DNA整合入染色体，从而可通过染色体复制被子代细胞继承的细胞。真核细胞建立细胞系或克隆(其中包括一群含有转化性DNA的子代细胞)的能力证明了该稳定性。“克隆”是一群通过有丝分裂衍生自单个细胞或祖先的细胞。“细胞系”是原代细胞的克隆，能在体外稳定生长许多代。
当DNA序列的限定长度有至少约75％(优选至少约80％，最优选至少约90％或95％)的核苷酸匹配时，两条DNA序列“基本同源”。基本同源的序列可通过用序列数据库中获得的标准软件，或在Southern杂交实验中对于具体系统定义的严格条件下比较序列来鉴定。确定合适的杂交条件在本领域技术人员能力范围内。见例如Maniatis等，见上；DNA Cloning卷I&II，见上，Nucleic Acid Hybridization，见上。
DNA构建物的“异源”区域是较大的DNA分子中DNA的一种可鉴定节段，它在自然界中未发现与较大的分子有关。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，基因通常侧接在来源生物体的基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。在另一个例子中，编码序列是一种构建物，其中编码序列本身在自然界中未发现(例如基因组编码序列含有内含子或具有与天然基因不同的密码子的合成序列的cDNA)。等位变体或天然存在的突变事件不产生本文所定义的DNA的异源区。
在这些研究中，最常用的标记是放射性元素、酶、在接触紫外线时发荧光的化学物质等。许多荧光材料是已知的，可用作标记。这些包括例如荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和萤光黄。一种特别的检测性材料是在山羊中制备并与荧光素通过异硫氰酸盐偶连的抗兔抗体。
本领域中开发和使用的一种特定分析系统被称为受体分析。在受体分析中，要分析的物质被适当标记，然后用一定量的标记接种一些细胞测试集落。然后进行结合研究以确定标记的物质与细胞受体结合的程度。用这种方法，可确定物质之间亲和力的不同。
本文所用的术语“宿主”指不仅包括原核细胞，还包括真核细胞，例如酵母、植物和动物细胞。编码本发明的蛋白质的重组DNA分子或基因可用于用任何本领域普通技术人员已知的技术转化宿主。原核宿主包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌。真核宿主包括酵母，例如巴斯德毕赤酵母，哺乳动物细胞和昆虫细胞。
一般与宿主一起使用含有启动子序列的表达载体，该序列促进插入的DNA片段的有效转录。表达载体通常含有复制起点、启动子、终止子和在转化的细胞中能提供表型选择的特定基因。转化的宿主可根据本领域已知的方法发酵或培养，实现最佳细胞生长。
可用本领域技术人员已知的方法构建含有合适转录和翻译控制信号的表达载体。见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，ALaboratory Mannual)，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.所述的技术。如果转录控制序列有效控制该基因的转录，基因及其转录控制序列被定义为“可操纵性连接”。本发明的载体包括但不限于质粒载体和病毒载体。
本发明针对编码尿皮质素II的DNA序列。该序列可以是分离和纯化的DNA，编码尿皮质素II。另外，它可以是分离和纯化的DNA，其在高严谨条件(定义为在高温和低盐浓度下洗涤膜，在功能上等价于65℃的0.1×SSC)下与尿皮质素II DNA的反义补体杂交。最后，该DNA可以是分离和纯化的DNA，其编码尿皮质素II但序列由于基因编码的简并性而不同。该DNA优选编码蛋白质，其具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
本发明还针对一种载体，它能够表达尿皮质素II。这种载体由编码尿皮质素II的DNA和在细胞中表达尿皮质素II所必需的调控元件组成。在一个优选例中，该载体编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：10或11的蛋白质。本发明还针对一种宿主细胞，它被该载体转染并表达来自该载体的尿皮质素II。蛋白质可在选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞的细胞类型中表达。在一个优选例中，蛋白质在大肠杆菌中表达。
本发明还针对上述DNA编码的分离和纯化的尿皮质素II蛋白质。优选纯化的尿皮质素II具有对应于SEQ ID NO：10或11的氨基酸序列。
本发明还针对尿皮质素II蛋白的抗体。该抗体优选是单克隆抗体。
另外，本发明针对药物组合物，它含有尿皮质素II蛋白和药学上可接受的载体。这种药物组合物可用于降低体温、抑制食欲、治疗或预防充血性心力衰竭、治疗紧张和焦虑、并改变ACTH分泌的不良低水平。
本发明还针对编码人尿皮质素相关肽的DNA序列。该序列可以是分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素相关肽。另外，它可以是分离和纯化的DNA，其在高严谨条件(定义为在高温和低盐浓度下洗涤膜，在功能上等价于65℃的0.1×SSC)下与人尿皮质素相关肽DNA的反义补体杂交。最后，DNA可以是分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素相关肽但序列由于基因编码的简并性而不同。该DNA优选具有SEQ ID NO：1所示的序列，优选编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的前体蛋白，它可通过蛋白酶解加工成具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质。
本发明还针对一种载体，其能表达人尿皮质素相关肽。这种载体由编码人尿皮质素相关肽的DNA和在细胞中表达人尿皮质素相关肽所需的调控元件组成。在一个优选例中，该载体编码氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质。本发明还针对一种宿主细胞，它被该载体转染，并表达来自该载体的人尿皮质素相关肽。该蛋白质可以在选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞的细胞类型中表达。在一个优选例中，蛋白质在大肠杆菌中表达。
本发明还涉及上述DNA编码的分离和纯化的人尿皮质素相关肽蛋白。优选纯化的人尿皮质素相关肽具有对应于SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
本发明还针对人尿皮质素相关肽蛋白的抗体。该抗体优选是单克隆抗体。
另外，本发明针对含有人尿皮质素相关肽蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。可用这种药物组合物降低体温、抑制食欲、治疗或预防充血性心力衰竭，治疗紧张和焦虑，和改变ACTH分泌的不良低水平。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽，突变为含有一个酪氨酸残基，它用于蛋白质的放射性碘化。一个特定的修饰是在尿皮质素II或人尿皮质素相关肽的N末端加入含有Tyr-Gly的序列。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽的缺失突变体。特别有用的缺失是蛋白质的N末端1-5个氨基酸的缺失。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽蛋白，其中标准的“L-型”异构体氨基酸被“D-型”异构氨基酸取代。在人尿皮质素相关蛋白中，特别有用的是SEQ ID NO：3的9位所对应的异亮氨酸残基被D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和D-亮氨酸或其它D-型氨基酸取代。其它有用的取代是SEQ ID NO：3或11中17位的谷氨酸残基被D-谷氨酸取代。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽，其中各种氨基酸被非标准氨基酸取代。Cα-甲基化亮氨酸、Cα-甲基化丙氨酸、N-im-苄基组氨酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸是非标准氨基酸的例子。
本发明还针对具有酰基化N-末端的尿皮质素II或人尿皮质素相关肽蛋白。该蛋白质的酰化可用于将脂肪酸等分子与蛋白质的N-末端连接，保护Ucn II或URP免受酶降解或改变蛋白质的各种性质，例如其亲水性/疏水性。这些修饰可用于改变体内蛋白质的持续时间或生物利用率。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽蛋白，它们经修饰含有荧光标记，用于显象或生物测定。
本发明还针对尿皮质素II或人尿皮质素相关肽蛋白，它们与放射性核素的络合剂偶联。与放射性核素络合的Ucn II可用于闪烁照相法或各种测定。
本发明还针对与毒素偶联的尿皮质素II或人尿皮质素相关肽。得到的毒素偶联物可用于靶向破坏携带CRF受体的细胞。
给出下列例子是为了说明本发明的各个实施例，而不是为了以任何形式限制本发明。
实施例1
人尿皮质素-相关蛋白的鉴定
在致力于鉴定新的CRF-R配体中，用HMMER软件包(Sean Eddy，Department ofGenetics，Washington University，St.Louis，MO；见参考文献19)从已知CRF家族蛋白的成簇W排列构建隐藏Markov模型(HMM)，这些蛋白包括大鼠/人CRF、大鼠Ucn、人Ucn、蛙皮降压肽和白短鮣硬骨鱼紧张肽I。该HMM用于检索公用人类基因组数据库，鉴定出衍生自染色体3p21.3-4的BAC(Genbank登录号AC005903)，它含有109bp的区域，显示显著的序列同源性，但不是先前鉴定的基因的一部分。该区域延伸到621个bp，鉴定出一个人EST克隆与该序列重叠(Genbank登录号VE622276)。然而该人序列缺少肽的C-末端加工的共有蛋白酶解切割位点。因此，该蛋白被命名为人尿皮质素相关肽(hURP)序列。图1显示了人URP蛋白预测的开放阅读框的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。该基因编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的肽。
为了确认人尿皮质素相关肽基因的存在和序列，用与从基因组克隆扩增人尿皮质素相关肽序列类似的寡核苷酸引物，通过PCR从人胰岛cDNA文库分离部分cDNA片段。该片段也被亚克隆入pGEM载体并测序。该cDNA序列对应于一部分基因组序列。部分的cDNA序列对应于图2中的下划线序列。图1和2中所示的序列编码人尿皮质素相关肽的多肽前体。人尿皮质素相关肽的前19个核苷酸编码信号肽，它在蛋白质的翻译后修饰过程中被切开，得到成熟人尿皮质素相关肽，它具有下列氨基酸序列：
IVLSLDVPIGLLQILLEQARARAAREQAT
TNARILARVGHC-NH2(SEQ ID NO.3)
图3显示人尿皮质素相关肽的氨基酸72-109与人尿皮质素、人硬骨鱼紧张肽I、人促肾上腺皮质素释放因子(CRF)、蛙皮降压肽和角鲨CRF/Uro的等价节段之间的同源性比较的结果。该区域中的同源性范围是26-42％。
实施例2
小鼠尿皮质素II的鉴定
基于人基因序列的片段化cDNA探针与大鼠组织(大脑)特异性交叉杂交，提示两个物种之间有合理程度的同源性。基于该人序列设计引物，通过cDNA末端快速扩增(RACE)法鉴定同源小鼠基因。从小鼠全脑poly(A+)RNA用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)制备易于RACE的cDNA。在低严格条件(低Tm)下进行PCR反应，试用最大异源引发。第一轮扩增用着地(touchdown)法(94℃30秒；70℃-55℃30秒；72℃3分钟)，然后第二轮扩增用多组嵌套引物(94℃20秒；55℃20秒；72℃3分钟)。将候选PCR产物克隆入pCRII-TOPO(Invitrogen)对两条链进行测序。根据其预测大小(从人序列推断)鉴定候选5’和3’反应产物，克隆并测序。
图4A列出了小鼠Ucn II的预测氨基酸序列。基因编码112氨基酸前体，C-末端包括推测的38个氨基酸成熟肽的编码区域，用加框的区域表示(图4A)。编码序列的C-末端部分后面是一个甘氨酸和成对的碱性残基(R-R)，推测分别与酰胺化和从前体切割有关。
存在两种其它推定的或已知的尿皮质素相关肽：人，其肽序列推导自出版的人EST，和近来克隆的(20)河豚URP(来自Takifugu rubripes)。排列人和鱼尿皮质素相关肽、大鼠Ucn和大鼠/人CRF如图4B所示。在氨基酸水平，小鼠Ucn II编码区与人和鱼尿皮质素相关肽分别显示77％和45％的同源性。小鼠Ucn II与该肽家族的已知成员相当密切，与大鼠CRF和大鼠UCN分别具有36％和44％的氨基酸同一性。保守取代使得相关性增加到62％(与CRF)和59％(Ucn)。
实施例3
肽合成
用固相法，甲基二苯甲基胺树脂和Boc-策略(21)手工合成小鼠Ucn II和人Ucn相关肽。用三氟乙酸、60％二氯甲烷除去Boc基团。用二异丙基碳二亚胺介导主链装配。切割肽，在氢氟酸中去保护，并用RP-HPLC和三种溶剂系统(磷酸三乙铵，pH2.25和6.5和/或0.1％TFA)纯化(22)。用独立的HPLC和CZE标准纯化肽大于95％。用质谱确定制备物的组成。
实施例4
Ucn II受体活化
用放射性受体分析评估了Ucn II与CRF-R1和CRF-R2受体的亲和力。从稳定表达克隆的CRF-R1或CRF-R2β的CHO细胞制备粗膜组分。测试的肽和放射性配体，125I-[Tyr0、Glu1、Nle17]-蛙皮降压肽稀释在试验缓冲液(20mM HEPES，2mM EGTA，0.1％BSA，10％蔗糖，pH7.6)中，并与在预包涂0.1％聚乙烯亚胺的MAGV微量滴定板(Millipore)中的受体膜制备物混合。反应混合物在室温温育90分钟，然后用试验缓冲液迅速洗涤两次，并过滤。用γ辐射计数定量放射性配体复合物。用Prism软件确定抑制结合常数。结果总结于表2。
                                         表2
                            选择CRF受体配体的结合性质和功能活性
    肽     CRF-R1     CRF-R2
    平均Ki(nM)(结合)     平均EC50(nM)(cAMP)     平均Ki(nM)(结合)     平均EC50(nM)(cAMP)
    尿皮质素II(小鼠)     ＞100     ＞100     0.66(0.13-3.3)     0.14(0.03-0.52)
    URP(人)     ＞100     ＞100     0.50(0.22-1.16)     0.42(0.16-1.1)
    尿皮质素(大鼠)     0.32(0.14-0.77)     0.29(0.12-0.70)     0.62(0.14-2.8)     0.17(0.043-0.68)
    蛙皮降压肽(蛙)     0.94(0.49-1.8)     N/A     1.7(0.77-3.9)     N/A
从3-6个独立实验，对于每种测试肽使用稳定转染的CHO细胞或其膜测定的值。用Prism软件确定Ec50和Ki值。它们的log10值取平均数(γ)。平均EC50或Ki表示成10γ。计算log10值的标准偏差(σ)。所取范围为[(10γ)10°或10γ/10°]。
与尿皮质素比较，Ucn II在竞争与标记的蛙皮降压肽结合的能力上比CRF-R1至少差1000倍，但它与Ucn在竞争与CRF-R2的结合上几乎等效。在通过胞内cAMP聚集测定的受体活化中也见到了该2型受体的显著选择性。稳定转染的CHO细胞(在DMEM/10％ FBS中培养)铺在48孔组织培养皿(Costar)中，恢复24小时。在处理前至少2小时将培养基改成DMEM/0.1％FBS。细胞预先用0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤培养30分钟，然后在37℃接触肽20分钟。提取胞内cAMP并一式两份用RIA试剂盒(Biomedical Technologies)测定一式三份的孔。在cAMP实验中，Ucn II显示CRF-R2的相当效力，与Ucn一样(表2)。Ucn II对CRF-R1的极低亲和力排除了它对于该受体的效力测定。
实施例5
在96孔0.2微米Durapore平板上，用真空过滤多筛选试验系统(Millipore)进行结合。各孔的总体积为200微升，含有50微升结合缓冲液(10％蔗糖、0.1％BSA、2mM EGTA、20mM HEPES缓冲液，pH7.5)；50微升未标记的竞争剂(尿皮质素或人尿皮质素相关肽)，在结合缓冲液中以不同稀释度存在；50微升125I-蛙皮降压肽，浓度为150,000cpm/孔；和50微升细胞膜。平板在室温温育1小时，真空过滤，用结合缓冲液洗涤两次，使其干燥。切下各滤膜用γ计数器计数。
图5显示了人尿皮质素相关肽介导的125I-蛙皮降压肽与CHO细胞中稳定表达的CRFR1和CRFR2β结合的置换。从该数据，发现尿皮质素相关肽对于CRF-R1具有解离常数(Ki)78nM，CRF-R2β具有0.23nM。在另一方面，Ucn对于CRF-R1具有0.13nM，对于CRF-R2β具有0.15nM的解离常数。因此，人尿皮质素相关肽对于促肾上腺皮质素释放因子II型受体比尿皮质素更有特异性。
实施例6
Ucn II mRNA表达
进行杂交组织化学分析小鼠和大鼠大脑中Ucn II mRNA表达的模式。用水合氯醛深度麻醉动物(350mg/kg，腹膜内)，通过上行主动脉灌注盐水，然后灌注冰冷4％多聚甲醛的0.1％硼酸盐缓冲液，pH9.5。大脑随后固定16小时，在10％蔗糖的0.1M磷酸缓冲液中低温保护过夜。用滑动切片机切出4只(小鼠)或6只(大鼠)系列的30微米厚冷冻切片，收集在基于冷乙二醇的冷冻保护剂中，储藏在-20℃直到组织化学加工。
用35S-标记的反义和有义(对照)cRNA探针进行原位杂交(23)，这些探针是通过首先使含有小鼠cDNA的TOPO-II质粒线性化构建的。将探针标记到1-3×109dpm/μg的比活力，以约107cpm/ml的浓度涂到载玻片上，在高严格度下(50％甲酰胺)杂交过夜。在15mM NaCl/1.5mM柠檬酸钠中，65-68℃进行最终洗涤。然后使载玻片脱水并接触x光胶片(β-Max；Kodak)16小时，然后用Kodak NTB-2液体乳液包涂，并在4℃暴露21-28天。
杂交组织化学揭示了小鼠和大鼠大脑中Ucn II mRNA表达的稳定和有限模式。标记到相似的比活力的有义链失控作为反义探针不能得到高于背景的杂交信号。Ucn II mRNA观察到的分布看来主要在皮质下，表达的主要位点包括应激相关细胞群，例如下丘脑室旁核、视上核和弓状核和脑桥嘴兰斑(图6)。脑干的运动核(三叉、面部、舌下)和脊髓腹侧角也被鉴定为Ucn II mRNA表达的位点。在非神经元元件中，在脑膜上稳定地观察到阳性杂交信号，但在脉络丛或室管膜中未观察到。没有清楚的提示神经胶质元件的Ucn II mRNA表达是明显的。
实施例7
灵长类大脑中尿皮质素相关肽的表达
用原位杂交检测了灵长类大脑中人尿皮质素相关肽的表达。原位杂交在猕猴(Macaca fascicularis)的大脑组织切片上用对应于人尿皮质素相关肽的约400bp的35S-标记的反义cRNA探针进行。探针以107cpm/ml的浓度涂到载玻片上，杂交进行过夜。杂交后，用20微克/毫升核糖核酸酶A 37℃处理30分钟，用15nMNaCl/1.5mM柠檬酸钠/50％甲酰胺在70℃洗涤。载玻片脱水并接触X光胶片(BetaMax；Kodak)24小时。图7显示了样品自显影图。在灵长类下丘脑的室旁核(PVH)和视上核中观察到URP的阳性信号。
实施例8
Ucn II-诱导的Fos表达
为了鉴定对中枢Ucn II施用有反应性的细胞群，和评估这些符合CRF-R2表达位点的程度，监测了立即早期基因产物Fos响应icv肽施用的诱导表达。在饲养室中以12∶12亮：暗循环饲养成年雄性Sprague-Dawley大鼠(实验开始时250-300g)和C57 BL/6小鼠(25-40g)，在实验前任其自由摄取水和食物。对于脑室内(icv)注射，用氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪麻醉大鼠，用26ga导管立体定位植入，终止于侧脑室。对于肽的静脉内(iv)给药，将颈内静脉导管装在动物上。接受icv注射的大鼠还在腹内植入发送器，以遥感监测总活动水平和体温(Mini-Mitter)。手术后，动物恢复7天，然后进行实验，期间每天对其进行处理。所有的步骤由学会动物护理(Institutional Animal care)和索克研究所应用委员会(UseCommittee of Salk Institute)认可。
为了监测Fos表达的诱导模式，在每天上午10点用合成的Ucn II(1，5或10微克/动物的2微升盐水溶液icv注射，或200微升iv给药)，或仅用载体注射大鼠，并在2小时后输液。为了监测肽施用对于食物摄取的影响，在关灯前30分钟动物icv注射合成的小鼠Ucn II、大鼠Ucn或大鼠/人CRF。用变量重复测量分析(ANOVA)分析数据，用多次比较的Bonferoni校正作为保证。
对于免疫组织化学，用0.3％过氧化氢和1％氢硼化钠顺序地预处理组织。然后用PBS/0.2％triton X-100透化，与原代抗血清在PBS/2％封闭血清一起温育48小时。用家兔中针对人Fos蛋白的N-末端合成片段产生的多克隆抗血清(SantaCruz Biotechnology，1∶5K)定位Fos免疫反应性。用镍增强的常规链霉亲和素-生物素免疫过氧化物酶法，如所述进行定位(24)。
注射1微克合成的Ucn II产生活化反应，在与中枢自主控制有关的一群互连的结构中最显著(25，26)。这些包括终纹床核、扁桃体中央核、下丘脑室旁核(PVH)、臂旁核和孤束核(NTS；图8)。其中仅NTS被描述为CRf-R2表达的位点(27)。其它CRF-R2表达的主要位点，包括外侧隔、中脑中缝核和下丘脑腹内侧核中(27，28)的Fos诱导与盐水注射的对照中所见的没有区别。较高剂量的肽(5或10微克)引起了类似分布的更强的活化反应。
为了控制icv注射的可能全身效应，对各组大鼠静脉内施用类似范围的Ucn II剂量。仅最高剂量(10微克)引起明显高于对照水平的Fos诱导。虽然模式与中枢注射的反应所观察到的类似，但标记的细胞数及其染色强度都未达到icv注射1微克Ucn II后可见的程度。
实施例9
大脑中尿皮质素相关肽刺激的FOS表达
通过在注射人尿皮质素相关肽后细胞中Fos基因产物的检测，检测人尿皮质素相关肽对中枢应激相关细胞的活化。在实验前7天，在大鼠外侧脑室中植入导管。在测试日，用5微克合成的人尿皮质素相关肽的5微升无菌盐水注射大鼠。2小时后杀死大鼠，制备各种大脑切片的载玻片。用在兔子中针对人Fos蛋白残基3-16产生的多克隆血清通过免疫过氧化物酶定位Fos-免疫反应性染色载玻片。
如图9所示，在终纹床核(BST)、下丘脑室旁核(PVH)、扁桃体中央核(CeA)、臂旁外侧核(PBI)、蓝斑(LC)和孤束核(NTS)中检测Fos-免疫反应性。这些位点分别具有先前被认为是CRF-相关肽活性的位点。
实施例10
Ucn II的行为作用
与CRF和Ucn一样，Ucn II也能够作用于中枢以抑制食物摄取(图10A)。在白昼-黑夜循环的夜间期开始用这些肽(1微克，icv)注射各组大鼠获得的测量值体现了治疗和时间点之间的重要相互作用[F(18，95)＝4.22，p＜0.0001]，两种主要作用也达到可靠程度。所有这三种肽明显减少了12小时间隔的食物摄取，其抑制程度为30％(CRF)-35％(Ucn II)-70％(Ucn)。这些作用随时间分布不同，Ucn和CRF处理的动物在测试期(4-5小时)比盐水注射的对照进食显著少，比Ucn-II处理的大鼠早(6小时)。
在这些相同的受试者中，遥感监测总活动能力和体温(图10B)。活动数据的分析揭示药物和时间点之间的显著相互作用[F(33，110)＝1.94，p＜0.006]，两种主要作用也达到显著。hoc后比较指示接受CRF的动物明显比用载体处理的大鼠在注射后2-6小时的间隔内更活跃(p＜0.001)。在该测试中Ucn和Ucn II处理在任何注射后的时间点都没有引起可靠的改变。还记录了核心体温，各肽引起相对轻微(0.5-1℃)和瞬间(2小时)的低温反应(数据未显示)。
实施例11
大鼠垂体前叶细胞对hURP-介导的作用的体外生物测定
对于垂体作用，在大鼠垂体前叶细胞的原代培养物中，如所述(30)测定了对人尿皮质素相关肽的ACTH分泌反应。用来自Nichols Institute Diagnostics的ACTH免疫测定试剂盒测定ACTH水平。用大鼠尿皮质素或人尿皮质素相关肽处理大鼠垂体前叶细胞，用试剂盒(Nichols Institute Diagnostics)测定分泌的ACTH水平。图11显示了尿皮质素和人尿皮质素相关肽对ACTH分泌的作用。发现垂体前叶细胞中ACTH分泌的刺激对于人尿皮质素相关肽比对于尿皮质素不敏感。
实施例12
hURP对A7R5细胞作用的体外生物测定
检测了在表达天然CRF-R2β的A7R5细胞中hURP对cAMP水平的作用。A7R5细胞系维持在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100微克/毫升链霉素的DMEM中。细胞以10,000细胞/cm2接种并培养6天。血清饥饿的细胞在0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤在测定培养基中预培养20分钟，用指定浓度的肽处理30分钟。用RIA(Biochemical Technologies)测定cAMP水平，如图12所示。人尿皮质素-相关肽对cAMP生产具有尿皮质素的相似作用。
实施例13
人尿皮质素相关肽对于总活性的作用
为了确定人尿皮质素-相关肽是否在应激反应的产生中起作用，检测了人尿皮质素相关肽对于大鼠总运动功能的作用。通过手术将导管插入右侧脑室，在腹内移植遥测计以连续监测总运动功能。动物在手术后恢复7天。在此时，动物每天处理使其适应注射过程。在注射日，记录4小时的基线活性。在下午6点(关灯的开始)，动物接受5微升盐水或含总共5微克人尿皮质素相关肽的盐水注射。总共进行4小时的活性计数。结果总结于图13。注射人尿皮质素相关肽的动物与对照动物比较，在总运动功能上没有观察到显著的区别。
实施例14
人尿皮质素相关肽对体温的影响
检测了人尿皮质素相关肽对于大鼠体温的影响。将用于人尿皮质素相关肽注射的导管通过手术插入右侧脑室。在腹内移植连续非强迫体温分析用遥测计。动物在手术后恢复7天。在此时，动物每天处理使其适应注射过程。在注射日，记录3小时的基线体温。在下午6点(关灯的开始)，动物接受5微升盐水或含总共5微克人尿皮质素相关肽的盐水注射。在12小时内每5分钟监测体温。如图14所示，注射人尿皮质素相关肽的动物在注射后立即和7小时具有较低的体温。
实施例15
人尿皮质素相关肽对食欲的作用
还在大鼠中检测了人尿皮质素相关肽对食欲的作用。将用于人尿皮质素相关肽注射的导管通过手术插入右侧脑室，动物在手术后恢复7天。在此时，动物每天处理使其适应注射过程。在注射日，动物接受5微升盐水或含总共5微克人尿皮质素相关肽的盐水注射。在6小时内每小时和第14小时记录各动物吃掉的食物量。
图15A显示了实验过程中各时间期的总消耗食物。注射人尿皮质素相关肽的动物显著比对照动物吃得少。图15B总结了在各时间期内消耗的食物量。hURP处理的动物在注射后第1和第3个小时内和实验最后8个小时内吃得尤其少。
实施例16
有用的尿皮质素II和人尿皮质素相关肽修饰和衍生物
本文公开的尿皮质素II或人尿皮质素相关肽通常以这些蛋白的激素原形式存在。考虑到激素的活化将涉及蛋白酶解加工和对蛋白的其它修饰类型，例如得到蛋白质非酰胺化形式的修饰。
先前对于其它CRF受体的配体的研究显示，可对这些配体进行许多氨基酸取代，而不丧失配体生物活性中与受体结合的能力。许多先前对于尿皮质素的研究显示容易忍受一个、两个或甚至三个取代。在一些对尿皮质素修饰的例子中导致具有更理想的药理学性质的蛋白质。由于尿皮质素II和人尿皮质素相关肽是小蛋白质，这种修饰可以是方便地通过本领域技术人员熟知的肽合成法掺入。这些包括固相技术、部分固相、片段缩合和经典溶液添加。如果非标准氨基酸掺入尿皮质素II或人尿皮质素相关肽，这些方法尤其是优选的。另外，如果修饰包括整个天然氨基酸，可用重组DNA技术诱变，随后表达修饰的尿皮质素II和人尿皮质素相关肽。
人尿皮质素相关肽缺乏一个酪氨酸残基。由于赖氨酸残基用于蛋白质的放射性碘化，对于人尿皮质素相关肽的一个可能的修饰是用酪氨酸取代蛋白质中的另一个氨基酸。先前，描述了在尿皮质素的N-末端加上由Tyr-Gly组成的序列。得到的蛋白质保留CRF受体结合和生物活性，但大概在蛋白质的放射性碘化中是有用的。还可以构建本发明蛋白质的其它N-末端延伸，用于标记和其它目的。
发现尿皮质素的开始7-10个残基的缺失导致形成有效的尿皮质素拮抗剂。这些蛋白质能与CRF受体结合，但不显著刺激或激活受体。预计尿皮质素II或人尿皮质素相关肽缺失达5个氨基酸也能得到有效的拮抗剂。还可能从其它尿皮质素II和人尿皮质素相关肽片段产生拮抗剂。这些拮抗剂能有效提高通常由CRF-结合蛋白质清除的内源肽的水平。通过与CRF结合蛋白质结合并封闭CRF，尿皮质素、尿皮质素II和人尿皮质素相关肽与相同蛋白质结合，提高内源CRF、Ucn和Ucn II的有效的体内浓度。这些拮抗剂可与其它CRF、Ucn、Ucn II或URP的激动剂或拮抗剂一起施用，以增强其效果。
其它CRF受体结合蛋白的延伸分析显示，用D-异构体氨基酸或环化氨基酸取代正常氨基酸导致CRF受体的亲和力提高。特别是，尤其有用的取代是用“D-型”异构氨基酸，优选D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和D-亮氨酸替换对应于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11第9位的异亮氨酸残基。类似的，可用D-谷氨酸替换对应于SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：11第17位的谷氨酸残基。环化氨基酸可通过两个或多个残基的侧链之间的化学键形成。例如邻近的谷氨酸和赖氨酸残基可反应形成酰胺键，产生内酰胺环。用非标准氨基酸，例如Cα-甲基化亮氨酸、Cα-甲基化丙氨酸、N-im-苄基组氨酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸取代也可以形成人尿皮质素相关肽的激动剂或拮抗剂。
本文公开的尿皮质素II和人尿皮质素相关肽的修饰是为了说明可以进行的可能修饰，而不是为了以任何方式限制发明。
讨论
用全基因组的同源性检索鉴定神经肽的CRF家族的新成员。新配体之一，UcnII与CRF-R2选择性结合，在大鼠CNS的分散区域内表达，并激活与内脏感觉信息加工和调节自主流出物有关的中枢神经元。另外，Ucn II抑制食物摄取，而对总运动功能没有任何作用。
除了显示CRF家族成员预计的结构、结合、活性和表达特征的鼠肽以外，鉴定出人URP(基于公众可得的EST序列)，其与小鼠序列在核苷酸水平有80％相同。然而人肽中重要的区别在于不存在任何明显的蛋白酶解切割位点，该位点或许提供人同系物的C-末端加工。仍然要确定从该蛋白是否产生，如何产生任何同源人肽。另外，Ucn以高亲和力与CRF-R1和CRf-R2结合，并通过它们传递强信号(14-16)。小鼠Ucn II和人URP在这些测量中显示高程度的CRF-R2选择性，但毫无疑问的对于这两种受体介导的解离功能有价值。图16显示了尿皮质素II如何作用于CRF-R1和CRF-R2的模型。Ucn II以高亲和力与CRT-R2结合，但不与CRF-R1结合。尿皮质素与二种受体结合，而CRF以高亲和力与CRF-R1结合，但不与CRF-R2结合。
Ucn II mRNA在啮齿类大脑中显示有限的皮层下分布，该分布是独特的，部分与CRF(脑室旁核；例如文献31)和Ucn(脑干和脊运动神经元；例如文献18)的mRNA表面上重叠。特别感兴趣的是转录物在涉及压力相关生理和行为功能的细胞群中表达(见文献13)。这包括蓝斑，它广泛分布在大脑皮质的突起中，与产生唤醒和焦虑水平有关(例如32)；室旁核，它含有多种相关神经分泌性神经元群体，在CNS中突起，调节中枢自主回路中的感觉和运动信号(例如33)；和弓形核，它被认为是延伸系统的中枢成分，辅助食物摄取和能量平衡的调节(例如34)。虽然尚缺乏在这些情况下确定新肽位置的解剖学和功能性数据，但中枢Ucn II系统有可能参与应激相关功能，该功能长期以来被认为与更广泛的中枢CRF网络有关。这与Ucn相反，它的细胞表达的主要位置在大脑中，Edinger-Westphal核，显示在该方面能力非常有限，大部分是由于缺乏文献记载的前脑的突起(16，18)。
根据其结合特征和活性，出乎意料的发现中枢Ucn II所引起的细胞活化模式并不密切的模拟CRF-R2分布。一项比较icv CRF或UCN诱导的FOS表达的研究记录了活化模式与这些肽对于两种已知基因编码的CRF-R的结合亲和力粗略一致(35)。即与本文使用的剂量类似的CRF高度优选的活化CRF-R1表达位点，而UCN引起的Fos诱导主要在表达各受体的细胞亚组中。另外，这两种肽引起同一组中枢自主结构，该结构是大鼠大脑中Ucn II诱导的活化反应的主要部位。该重要性在于中枢自主系统的元件是CRF-样肽能引起应激相关自主和行为反应所记载的最佳位点之一。这些发现提示2型和1型受体活化能结合该系统，虽然基础并不清楚。在中枢自主网络的节点中，仅臂旁核(R1)和NTS(R2)被认为是CRF-R表达的位点(27，28.35)，仍然要确定这些之一或两者的受体介导的活化是否都足够支持整个系统。重要的是注意合成的Ucn II的全身性注射在用于icv注射研究的相同剂量范围内，不能在中枢自主细胞群中引起较强的活化反应。这是重要的对照，因为周围CRF-R2的活化可使得血压显著和持续下降(16，17)，显著的低血压攻击能与响应中枢Ucn II施用一样，活化非常相同的中枢自主结构(36，37)。
icv Ucn II对于食物摄取和功能的作用的最初表征补充了近来将各CRF-R在应激相关行为中的作用分开的尝试。例如，虽然具有无受体突变的小鼠显示正常的基础食物摄取，CRF-R1缺陷型动物显示，在注射后随即的一段时间内，而不是在较后的时间点对于UCN的厌食作用难以治疗，而对于CRF-R2突变型小鼠，逆转是真实的(11，38，39)。这用于提示Ucn介导的喂食抑制的早期和晚期可以分别是CRF-R1和CRF-R2介导的事件。用不同范例(夜间自由进食而不是缺乏诱导的重新进食)提供了数据支持该分析，因为R2特异性配体不能可靠抑制早时间点的食物摄取，而能在注射6小时后抑制。
运动功能的测定也支持了该参数中的CRF-R无关。在近来敲除小鼠的证据系列中，提示了运动活化是CRF-R1介导的事件(40)，发现R1选择性激动剂CRF显著提高总运动功能，而UCN II给药则不能。有趣的是，用以高亲和力与两种受体结合的UCN处理，导致向功能增加有非显著的趋势，其值低于对CRF反应中可见的数据。这大致上与一增加的证据体系一致，这些证据支持两种已知受体类型之间的功能拮抗。虽然CRF-R1缺陷型小鼠显示内分泌下降和对应激的焦虑样反应(41)，CRF-R2突变体品系显示这些参数上升(11，39，42)，提示CRF-R2的基础活化可能在对抗CRF-R1驱动的应激反应中起作用。
内源CRF-R2-选择性配体的鉴定将能更详细的分析各CRF-相关信号分子在应激相关生理和行为功能中的作用。Ucn II mRNA的中枢表达鉴定对肽的中枢给药有反应的细胞群，并确定与先前假设的CRF-R2活化的后果一致的行为反应。进一步深入观察该肽在应激生物学中的地位需要描绘含Ucn II细胞的中枢突起，并鉴定调节基因表达和肽释放的因子和环境。
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本说明书中提到的任何专利或出版物表明了本发明涉及领域的技术人员水平。这些专利和出版物在此以相同程度引入以供参考，如同各出版物专门和分别指明引入以供参考。
本领域技术人员不难理解本发明非常适合实现其目的并获得所提到的和其中固有的结果和优点。本文所述的实施例和方法、步骤、处理、分子和特定化合物代表了优选例，是示范性的，不是要限制本发明的范围。对于本领域技术人员其中存在改变和其它用途，它们包括在权利要求所限定的本发明的精神中。
序列表<110>W.W.韦尔(Vale，Wylie Walker Jr.)
 K.A.刘易斯(Lewis，Kathy Ann)
 T.M.雷耶斯(Reyes，Teresa Marie)
 J.B.赫格埃施(Hogenesch，John Beren)
 P.F.索切纳科(Sawchenko，Paul Emil)
 J.M.沃恩(Vaughan，Joan Maureen)
 J.E.里弗(Rivier，Jean Edouard Frederic)
 M.H.佩林(Perrn，Marilyn Heller)<120>尿皮质素蛋白及其用途<130>D6334PCT<141>2001-08-04<150>US 60/273,969<151>2001-03-07<160>13<210>1<211>399<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>7..345<223>编码人尿皮质素相关肽(hURP)的DNA序列<400>1ctcacgatga ccaggtgtgc tctgctgttg ctgatggtcc tgatgttggg  50cagagtcctg gttgtcccag tgacccctat cccaaccttc cagctccgcc  100ctcagaattc tccccagacc actccccgac ctgcggcctc agagagcccc  150tcagctgctc ccacatggcc gtgggctgcc cagagccact gcagccccac  200ccgccaccct ggctcgcgca ttgtcctatc gctggatgtc cccatcggcc  250tcttgcagat cttactggag caagcccggg ccagggctgc cagggagcag  300gccaccacca acgcccgcat cctggcccgt gtcggccact gctgagcctg  350agagaggggg tcacagtgat agggccaccc tggatgggaa gacctggag   399<210>2<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>人尿皮质素相关肽(hURP)前体肽<400>2Met Thr Arg Cys Ala Leu Leu Leu Leu Met Val Leu Met Leu Gly
              5                  10                  15Arg Val Leu Val Val Pro Val Thr Pro Ile Pro Thr Phe Gln Leu
             20                  25                  30Arg Pro Gln Asn Ser Pro Gln Thr Thr Pro Arg Pro Ala Ala Ser
             35                  40                  45Glu Ser Pro Ser Ala Ala Pro Thr Trp Pro Trp Ala Ala Gln Ser
             50                  55                  60His Cys Ser Pro Thr Arg His Pro Gly Ser Arg Ile Val Leu Ser
             65                  70                  75Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ala
             80                  85                  90Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala Arg Ile
             95                 100                 105Leu Ala Arg Val Gly His Cys
            110<210>3<211>41<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>人尿皮质素相关肽(hURP)<400>3Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu
              5                  10                  15Leu Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr
             20                  25                  30Asn Ala Arg Ile Leu Ala Arg Val Gly His Cys
             35                  40<210>4<211>38<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>人尿皮质素相关肽(hURP)的氨基酸1-38<400>4Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu
              5                  10                  15Leu Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr
             20                  25                  30Asn Ala Arg Ile Leu Ala Arg Val
             35<210>5<211>40<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>人尿皮质素(hUcn)<400>5Asp Asn Pro Ser Leu Ser Ile Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg
              5                  10                  15Thr Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala
             20                  25                  30Glu Gln Asn Arg Ile Ile Phe Asp Ser Val
             35                  40<210>6<211>41<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>人促肾上腺皮质素释放因子<400>6Ser Glu Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu
              5                  10                  15Arg Glu Val Leu Glu Met Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Gln Gln
             20                  25                  30Ala His Ser Asn Arg Lys Leu Met Glu Ile Ile
             35                  40<210>7<211>41<212>PRT<213>鲤属(Cyprinus carpio)<220><223>鲤鱼硬骨鱼紧张肽(cUro)<400>7Asn Asp Asp Pro Pro Ile Ser Ile Asp Leu Thr Phe His Leu Leu
              5                  10                  15Arg Asn Met Ile Glu Met Ala Arg Asn Glu Asn Gln Arg Glu Gln
             20                  25                  30Ala Gly Leu Asn Arg Lys Tyr Leu Asp Glu Val
             35                  40<210>8<211>40<212>PRT<213>未知<220><223>蛙皮降压肽(fSvg)<400>8Glu Gly Pro Pro Ile Ser Ile Asp Leu Ser Leu Glu Leu Leu Arg
              5                  10                  15Lys Met Ile Glu Ile Glu Lys Gln Glu Lys Glu Lys Gln Gln Ala
             20                  25                  30Ala Asn Asn Arg Leu Leu Leu Asp Thr Ile
             35                  40<210>9<211>41<212>PRT<213>未知<220><223>角鲨促肾上腺皮质素释放因子/硬骨鱼紧张肽(dCRF/Uro)<400>9Pro Ala Glu Thr Pro Asn Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu
              5                  10                  15Arg Glu Met Ile Glu Ile Ala Lys His Glu Asn Gln Gln Met Gln
             20                  25                  30Ala Asp Ser Asn Arg Arg Ile Met Asp Thr Ile
             35                  40<210>10<211>112<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220><223>小鼠尿皮质素II前体肽<400>10Met Thr Arg Trp Ala Leu Val Val Phe Val Val Leu Met Leu Asp
              5                  10                  15Arg Ile Leu Phe Val Pro Gly Thr Pro Ile Pro Thr Phe Gln Leu
             20                  25                  30Leu Pro Gln Asn Ser Leu Glu Thr Thr Pro Ser Ser Val Thr Ser
             35                  40                  45Glu Ser Ser Ser Gly Thr Thr Thr Gly Pro Ser Ala Ser Trp Ser
             50                  55                  60Asn Ser Lys Ala Ser Pro Tyr Leu Asp Thr Arg Val Ile Leu Ser
             65                  70                  75Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Arg Ile Leu Leu Glu Gln Ala
             80                  85                  90Arg Tyr Lys Ala Ala Arg Asn Gln Ala Ala Thr Asn Ala Gln Ile
             95                 100                 105Leu Ala His Val Gly Arg Arg
            110<210>11<211>38<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220><223>小鼠尿皮质素II<400>11Val Ile Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Arg Ile Leu
              5                  10                  15Leu Glu Gln Ala Arg Tyr Lys Ala Ala Arg Asn Gln Ala Ala Thr
             20                  25                  30Asn Ala Gln Ile Leu Ala His Val
             35<210>12<211>38<212>PRT<213>河豚(Takifugu rubripes)<220><223>河豚尿皮质素释放肽<400>12Leu Thr Leu Ser Leu Asp Val Pro Thr Asn Ile Met Asn Val Leu
              5                  10                  15Phe Asp Val Ala Lys Ala Lys Asn Leu Arg Ala Lys Ala Ala Glu
             20                  25                  30Asn Ala Arg Leu Leu Ala His Ile
             35<210>13<211>40<212>PRT<213>大鼠(Rattus norwegicus)<220><223>大鼠尿皮质素<400>13Asp Asp Pro Pro Leu Ser Ile Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg
              5                  10                  15Thr Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala
             20                  25                  30Glu Gln Asn Arg Ile Ile Phe Asp Ser Val
             35                  40

Claims (46)

1.编码尿皮质素II的DNA，其特征在于，该DNA选自：
(a)编码尿皮质素II蛋白的分离和纯化的DNA；
(b)分离和纯化的DNA，其在高严格条件下与(a)的分离的DNA的反义补体杂交，其中高严格条件是在功能上等价于0.1×SSC，65℃的高温和低盐浓度下洗涤膜，其中所述DNA编码尿皮质素II蛋白；和
(c)与(a)和(b)的分离的DNA编码序列由于基因编码的简并性不同的分离和纯化的DNA，其编码尿皮质素H蛋白。
2.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述DNA编码具有氨基酸序列SEQ IDNO：10的尿皮质素II蛋白前体肽。
3.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述DNA编码尿皮质素II蛋白，所述蛋白具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
4.一种能表达权利要求1所述的DNA的载体，其特征在于，所述载体含有所述DNA和在细胞中表达所述DNA必需的调控元件。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述DNA编码具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的尿皮质素II蛋白。
6.一种用权利要求4所述的载体转染的宿主细胞，其特征在于，所述载体表达尿皮质素II蛋白。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细菌细胞是大肠杆菌。
9.分离和纯化的尿皮质素II蛋白，其特征在于，该蛋白是由DNA编码的，所述DNA选自：
(a)编码尿皮质素II蛋白的分离和纯化的DNA；
(b)分离和纯化的DNA，其在高严格条件下与(a)的分离的DNA的反义补体杂交，其中高严格条件是在功能上等价于0.1×SSC，65℃的高温和低盐浓度下洗涤膜，其中所述DNA编码尿皮质素II蛋白；和
(c)与(a)和(b)的分离的DNA编码序列由于基因编码的简并性不同的分离和纯化的DNA，其编码尿皮质素II蛋白。
10.如权利要求9所述的分离和纯化的尿皮质素II蛋白，其特征在于，所述蛋白具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
11.一种抗体，其特征在于，该抗体针对权利要求9所述的尿皮质素II蛋白。
12.如权利要求11所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
13.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求9的尿皮质素II蛋白和药学上可接受的载体。
14.一种治疗病理性状态的方法，其特征在于，该方法包括步骤：对需要治疗的个体施用权利要求13所述的药物组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病理性状态选自高体温、食欲紊乱、充血性心力衰竭、紧张、焦虑和ACTH分泌的不良低水平。
16.编码人尿皮质素相关肽的DNA，其特征在于，该DNA选自：
(a)编码人尿皮质素相关肽蛋白的分离和纯化的DNA；
(b)分离和纯化的DNA，其在高严格条件下与(a)的分离的DNA的反义补体杂交，其中高严格条件是在功能上等价于0.1×SSC，65℃的高温和低盐浓度下洗涤膜，其中所述DNA编码人尿皮质素相关肽蛋白；和
(c)与(a)和(b)的分离的DNA编码序列由于基因编码的简并性不同的分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素相关肽蛋白。
17.如权利要求16所述的DNA，其特征在于，所述DNA具有SEQ ID NO：1的序列。
18.如权利要求16所述的DNA，其特征在于，所述DNA编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的人尿皮质素相关肽前体蛋白。
19.如权利要求16所述的DNA，其特征在于，所述DNA编码人尿皮质素相关肽蛋白，所述蛋白具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
20.一种能表达权利要求16所述的DNA的载体，其特征在于，所述载体含有所述DNA和在细胞中表达所述DNA必需的调控元件。
21.如权利要求20所述的载体，其特征在于，所述DNA编码具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的人尿皮质素相关肽蛋白。
22.一种用权利要求20所述的载体转染的宿主细胞，其特征在于，所述载体表达人尿皮质素相关肽蛋白。
23.如权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其特征在于，所述细菌细胞是大肠杆菌。
25.分离和纯化的人尿皮质素相关肽蛋白，其特征在于，该蛋白是由DNA编码的，所述DNA选自：
(a)编码人尿皮质素相关肽蛋白的分离和纯化的DNA；
(b)分离和纯化的DNA，其在高严格条件下与(a)的分离的DNA的反义补体杂交，其中高严格条件是在功能上等价于0.1×SSC，65℃的高温和低盐浓度下洗涤膜，其中所述DNA编码人尿皮质素相关肽蛋白；和
(c)与(a)和(b)的分离的DNA编码序列由于基因编码的简并性不同的分离和纯化的DNA，其编码人尿皮质素相关肽蛋白。
26.如权利要求25所述的分离和纯化的人尿皮质素相关肽蛋白，其特征在于，所述蛋白具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
27.一种抗体，其特征在于，该抗体针对权利要求25所述的人尿皮质素相关肽蛋白。
28.如权利要求27所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
29.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求25的人尿皮质素相关肽蛋白和药学上可接受的载体。
30.一种治疗病理性状态的方法，其特征在于，该方法包括步骤：对需要治疗的个体施用权利要求29所述的药物组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述病理性状态选自高体温、食欲紊乱、充血性心力衰竭、紧张、焦虑和ACTH分泌的不良低水平。
32.一种修饰的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自尿皮质素II和人尿皮质素相关肽。
33.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质经过突变，含有酪氨酸残基。
34.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，通过在所述蛋白质的N-末端加上由Tyr-Gly组成的序列修饰所述蛋白质。
35.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质通过N-末端缺失修饰，其中所述缺失包括选自第一个氨基酸，第一和第二个氨基酸，第一到第三个氨基酸，第一到第四个氨基酸，和第一到第五个氨基酸的氨基酸。
36.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自序列SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：11的蛋白质，其中对应于所述序列第9位的异亮氨酸残基被D-型异构氨基酸替换。
37.如权利要求36所述的蛋白质，其特征在于，所述D-型异构氨基酸选自D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸和D-亮氨酸。
38.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自序列SEQ IDNO：11的尿皮质素II和序列SEQ ID NO：11的人尿皮质素相关蛋白质，其中所述蛋白质第17位的谷氨酸残基被D-谷氨酸取代。
39.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，氨基酸被本领域已知的非标准氨基酸替换。
40.如权利要求39所述的蛋白质，其特征在于，所述非标准氨基酸选自Cα-甲基化亮氨酸、Cα-甲基化丙氨酸、N-im-苄基组氨酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸。
41.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质在所述蛋白质N-末端被酰化。
42.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质被脂肪酸酰化。
43.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质经过修饰，含有荧光标记。
44.一种偶联物，其特征在于，该偶联物是权利要求32所述的蛋白质和毒素连接的偶联物。
45.一种偶联物，其特征在于，该偶联物是权利要求32所述的蛋白质和放射性核素的络合剂的偶联物。
46.如权利要求45所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物与放射性核素络合。
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