ES2311529T3 - Procedimiento para la identificacion de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarizacion. - Google Patents
Procedimiento para la identificacion de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarizacion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2311529T3 ES2311529T3 ES01951152T ES01951152T ES2311529T3 ES 2311529 T3 ES2311529 T3 ES 2311529T3 ES 01951152 T ES01951152 T ES 01951152T ES 01951152 T ES01951152 T ES 01951152T ES 2311529 T3 ES2311529 T3 ES 2311529T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- hyperpolarization
- baselineskip
- activated
- procedure according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos activados por hiperpolarización, en el que a) se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización; b) las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio; y c) se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia a estudiar.
Description
Procedimiento para la identificación de
sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados
por hiperpolarización.
Es un objeto de la presente invención, un
procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad
de canales catiónicos activados por hiperpolarización y el uso de
este procedimiento.
Algunos de los genes de los canales catiónicos
activados por hiperpolarización de múridos y de humanos ya se
conocen, por ejemplo, muHCN2(muHAC1) (Ludwig y col. (1998)),
huHCN4 (Ludwig y col. (1999)), huHCN2 (Vaccari, T. y col. (1999)
Biochim. Biophys. Acta 1446(3): 419-425),
documentos de patente WO 99/32615 y WO 99/42574.
Ludwig y col. (1998) mostraban que muHCN2 se
puede transfectar de forma transitoria en células HEK293 y que el
canal correspondiente en las células transfectadas se puede examinar
fácilmente mediante métodos electrofisiológicos (estudios con una
abrazadera puntual, del inglés "Patch-Clamp").
Las propiedades electrofisiológicas del canal clonado se
corresponden con la corriente I_{f} o I_{h}, descrita en las
células de marcapasos que, hasta la fecha, no se conocían a nivel
molecular (Ludwig y col. (1998), Biel y col. (1999)). El canal se
activa cuando el potencial de retención cambia hacia
hiperpolarización (potencial de aproximadamente -100 hasta -160
mV). Sin embargo, la técnica de "Patch-Clamp"
no se puede automatizar y no es adecuada para un escrutinio de alto
rendimiento HTS (del inglés, "High Throughput Screening").
Empleando colorantes adecuados, se pueden medir
las corrientes iónicas en un FLIPR (lector de placas con formación
de imágenes fluorescentes, del inglés "Fluorescence Imaging Plate
Reader"; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El flujo de
entrada o de salida de los iones conduce a cambios en el potencial
de membrana, los cuales se pueden medir con un FLIPR en un
escrutinio de alto rendimiento, empleando colorantes fluorescentes
adecuados. Sin embargo, en contraposición con el método de
Patch-Clamp, en el FLIPR no se pueden generar
cambios del voltaje. Los cambios de voltaje son, sin embargo, un
prerrequisito esencial para la activación de los canales catiónicos
activados por hiperpolarización. Para poder analizar el mayor número
posible de sustancias, se desarrolló un procedimiento que hace
posible un escrutinio de alto rendimiento para los moduladores de un
canal catiónico activado por hiperpolarización.
En este contexto, un objeto de la presente
invención era encontrar una vía para hiperpolarizar las células que
expresan el canal catiónico activado por hiperpolarización (es
decir, activar el canal catiónico activado por hiperpolarización) y
mantener esta hiperpolarización de la célula. Bajo condiciones
fisiológicas, una hiperpolarización de la célula que sea suficiente
para activar un canal catiónico activado por hiperpolarización, se
anula de nuevo por la actividad de ese canal. Sólo cuando se puede
mantener la hiperpolarización, se podrá medir, por ejemplo con un
FLIPR, la despolarización de la célula causada, bajo condiciones
adecuadas, por una sustancia que modula la actividad del canal
catiónico activado por hiperpolarización.
Es un objeto de la presente invención un
procedimiento para examinar canales catiónicos activados por
hiperpolarización, en donde células que expresan los canales
catiónicos activados por hiperpolarización, se hiperpolarizan, es
decir, el canal catiónico activado por hiperpolarización se activa,
y esta hiperpolarización de las células, que se anula bajo
condiciones fisiológicas por la actividad del canal catiónico
activado por hiperpolarización, se mantiene. Añadiendo iones de
sodio extracelulares, el canal HCN activado en el FLIPR, tiene la
posibilidad de transportar iones sodio a las células y, de este
modo, despolarizar las células. Si se añaden de forma simultánea o
antes de aportar las sustancias con iones de sodio, que modulan la
actividad de los canales catiónicos activados por
hiperpolarización, se potencia la despolarización comparando con
cuando únicamente se añaden iones sodio en el caso de activadores
de HCN (por ejemplo, forskolina) y se reduce en el caso de
inhibidores de HCN (por ejemplo, zatebradina =
3-[3-[[2-(3,4-dimetoxifenil)-etil]-metilamino]-propil]-1,3,4,5-tetrahidro-7,8-dimetoxi-2H-3-benzazepin-2-ona,
de Reiffen y col. (1990)).
Al medir la despolarización de las células o los
cambios de su potencial de membrana, es posible identificar
sustancias que modulan la actividad del canal catiónico activado por
hiperpolarización.
Es un objeto de la presente invención un
procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad
de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, en
donde
- a)
- se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio; y
- c)
- se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia que se va a examinar.
Es un objeto de la presente invención un
procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad
de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, en
donde
- a)
- se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio;
- c)
- las células se incuban con una sustancia que se va a examinar; y
- d)
- el cambio en el potencial de membrana de las células se registra después de añadir iones sodio.
Para la función de los canales catiónicos
activados por hiperpolarización, por ejemplo, los canales HCN (HAC),
es importante la presencia de iones potasio extracelulares, es
decir, el tampón exento de iones sodio, iso-osmolar,
contiene iones potasio (K^{+}) - p. ej., en forma de cloruro
potásico - preferentemente al menos aproximadamente K^{+} 0,5 mM
o K^{+} 0,8 mM, preferentemente 2 mM, especialmente preferido
aproximadamente K^{+} 5 mM.
Preferentemente, el tampón exento de iones
sodio, iso-osmolar contiene otro catión que no es
capaz de atravesar la membrana, en cantidades que se corresponden
con la concentración normal de iones sodio extracelular, p. ej.,
colina^{+}, por ejemplo, en forma de cloruro de colina o NMDG
(N-metil-D-glucamina).
Preferentemente, el tampón
iso-osmolar, exento de iones sodio comprende un
colorante sensible al potencial, p. ej., una sustancia fluorescente
sensible al potencial, p. ej., derivados de oxonol, tal como
3-bis-ácido barbitúrico oxonol. Preferentemente, se
emplean colorantes fluorescentes sensibles al potencial que son
adecuados para examinar el potencial de membrana de células no
excitables, por ejemplo, colorantes sensibles al potencial, de
respuesta lenta, p. ej., bis-(1,3-ácido
dibutilbarbitúrico)-trimetina oxonol
[DiBAC_{4}(3)], bis-(1,3-ácido
dietiltiobarbitúrico)-trimetina oxonol
[DiSBAC_{2}(3)] o bis-(1,3-ácido
dibutilbarbitúrico)-pentametina oxonol
[DiBAC_{4}(5)]. Otros colorantes sensibles al potencial,
conocidos y adecuados, son los colorantes de respuesta rápida (la
mayoría de tipo estirilpiridinio), que se pueden utilizar
preferentemente con células excitables, tales como neuronas,
células cardiacas, etc. Estos colorantes sensibles al potencial
reaccionan en un intervalo de milisegundos y no son muy sensibles
(2-10% de cambio de la fluorescencia por 100 mV de
cambio de potencial). Por otro lado, se pueden emplear colorantes
lentos, como p. ej., del tipo de la carbocianina, p. ej.,
DiOC5(3) yoduro de
3,3'dipentiloxacarbo-cianina, DiOC6(3) yoduro
de 3,3'-dihexiloxacarbocianina, etc.),
JC-1 (yoduro de
5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina)
así como rodamina 123; estos colorantes lentos, sensibles al
potencial son adecuados principalmente para estudios del potencial
de la membrana de mitocondrias.
Una realización particular de la invención se
refiere al uso del colorante fluorescente procedente del "equipo
de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR"
(del inglés, "FLIPR Membrane Potential Assay Kit" (Molecular
Devices Sunnyvale, CA, EE.UU.). La fluorescencia de este colorante
se puede medir empleando un filtro de emisión convencional, que es
transparente entre 510 y 580 nm, pero preferentemente con un filtro
que es transparente por encima de 550 nm. No se conoce qué colorante
o qué combinación de colorantes subyacen tras este equipo de
reactivos. El fabricante ofrece para su equipo de reactivos diversas
ventajas frente a DiBAC_{4}(3):
- 1)
- La medición de potenciales de membrana con este equipo de reactivos no es termosensible, muy al contrario que con DiBAC_{4}(3), en el que la temperatura se tiene que equilibrar antes de la medición real en el FLIPR.
- 2)
- El volumen añadido en el FLIPR, puede ser superior al empleado en el caso de DiBAC_{4}(3), en donde generalmente todas las sustancias se tienen que añadir en forma diez veces concentrada.
- 3)
- Las mediciones se pueden realizar mucho más rápido, puesto que el equipo de reactivos requiere un tiempo mucho menor para alcanzar la situación de equilibrio que DiBAC_{4}(3), que requiere normalmente entre 10-30 minutos.
- 4)
- Para muchos protocolos de medición, una etapa de lavado antes de la adición del colorante, ya no es necesaria.
- 5)
- El colorante no tiene que estar presente en cada solución.
Entre estas ventajas, las dos primeras tienen
importancia para los canales catiónicos activados por
hiperpolarización, especialmente en FLIPR II, que permite la
medición en placas de 384 pocillos y que se prefiere para el
escrutinio de alto rendimiento, cuyo temple es complicado y
requiere mucho tiempo. En el caso de sustancias poco solubles, es
ventajoso además, si se pueden añadir a las células cinco, tres o
incluso dos veces concentradas, en lugar de diez veces
concentradas.
En el procedimiento se emplean preferentemente
células que tienen una concentración intracelular de AMPc elevada.
Esto se puede conseguir, p. ej., añadiendo derivados de AMPc que
sean capaces de atravesar la membrana, p. ej.,
dibutiril-AMPc y
8-bromo-AMPc. Otra posibilidad de
aumentar la concentración del AMPc intracelular, es añadir un
activador de la adenilatociclasa, p. ej., la forskolina,
preferentemente en concentraciones de 1 \muM-100
\muM o inferiores a 1 \muM de forskolina, se prefiere
especialmente la forskolina aproximadamente 10 \muM. En
principio, también es posible emplear todas las sustancias o
ligandos que activen la adenilatociclasa mediante la transducción
de una señal en la línea celular empleada (p. ej., ligandos para
receptores \beta-adrenérgicos, como p. ej., la
adrenalina, el isoproterenol, la noraderenalina, etc., si la célula
tiene receptores \beta-adrenérgicos
endógenos).
Para la despolarización del potencial de
membrana, en el FLIPR se añade Na^{+} (normalmente en forma de
NaCl) a las células que se han hiperpolarizado con el tampón exento
de iones sodio, preferentemente hasta obtener una concentración
final de Na^{+} de 20-100 mM, especialmente
preferida es una concentración final de Na^{+} de 50 mM. En caso
de emplear los equipos de reactivos para el ensayo del potencial de
membrana con FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.), la
concentración final de Na^{+} puede estar a su vez entre
20-100 mM, preferentemente entre 40 a 80 mM.
En particular, la invención se refiere a
procedimientos en los que el canal catiónico activable por
hiperpolarización, es un canal HCN1, HCN2, HCN3, HCN4 (siendo
HAC1=HCN2, HAC2=HCN1, HAC3=HCN3 y HAC4=HCN4) o un canal KAT1 (=AKT)
(canal de potasio activado por hiperpolarización procedente de
Arabidopsis thaliana) o un heteromultímero de estos canales (es
decir, un canal que se compone de subunidades de diferentes canales
catiónicos activados por hiperpolarización) o un canal catiónico
activado por hiperpolarización quimérico (es decir, un canal
sintético en el que las subunidades aisladas están compuestas por
partes de distintos canales o de canales catiónicos activados por
hiperpolarización). El canal catiónico activado por
hiperpolarización es preferentemente un canal catiónico humano
activado por hiperpolarización, p. ej., huHCN2 (SEQ ID NO. 1, SEQ ID
NO. 2) o huHCN4 (SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO.4) o un canal catiónico
activado por hiperpolarización de múrido muHCN2 (SEQ ID NO. 5, SEQ
ID NO. 6). A nivel de aminoácidos, la identidad entre muHCN2 y
huHCN2 es del 94,8%.
En principio, el procedimiento es adecuado para
todos los canales catiónicos que se activen por hiperpolarización,
es decir, p. ej., para HCN1-4 (o
HAC1-4; véase, Biel y col. 1999).
Las células son preferentemente células de
mamífero, por ejemplo, células CHO o HEK293. Preferentemente, se
emplea CHO u otra línea celular con un número de canales de potasio
endógenos que está comparablemente igual de reducido, ya que estos
canales de potasio endógenos, interfieren con las mediciones del
FLIPR. También se pueden emplear células cuyos canales de potasio
endógenos no se expresen funcionalmente (p. ej., las células con
los genes correspondientes desactivados).
Preferentemente, las células contienen un ADN
que codifica el canal catiónico activado por hiperpolarización,
preferentemente, el ADNc de un canal catiónico activado por
hiperpolarización en un plásmido adecuado. Preferentemente, las
células se preparan de modo que la línea celular de partida se
transfecta con un plásmido que contiene el ADNc del canal catiónico
activado por hiperpolarización.
En el caso de canales catiónicos activados por
hiperpolarización, se tienen que registrar los cambios en el
potencial de membrana de las células, que son el resultado de la
activación o de la inhibición de estos canales. Los tres ácidos
bis-barbitúricos oxonoles (información procedente
de: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^{a}
edición, Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU.), a los que se hace
referencia generalmente como colorantes DiBAC, forman una familia
de colorantes sensibles al potencial, con una excitación máxima a
490 nm (DiBAC_{4}(3)), 530 nm (DiSBAC_{2}(3)) y
590 nm (DiBAC_{4}(5)). Los colorantes entran en las
células despolarizadas, uniéndose a proteínas o a membranas
intracelulares, produciendo un incremento de la fluorescencia y un
desplazamiento al rojo. La hiperpolarización produce la expulsión de
los colorantes aniónicos y, de este modo, una disminución de la
fluorescencia. Esta disminución de la fluorescencia se puede medir,
p. ej., con el dispositivo de medición de FLIPR.
El FLIPR (del inglés: "Fluorescent Imaging
Plate Reader", lector de placas con formación de imagen
fluorescente; Fabricante: Molecular Devices, Sunnyvale CA, EE.UU.)
es un dispositivo de medición con el que se pueden medir
simultáneamente los cambios de la intensidad de la fluorescencia, en
todos los pocillos de una placa de microtitulación. La excitación
de los colorantes empleados tiene lugar a 488 nm con un láser de
argón integrado en el sistema. El filtro de emisión convencional
del sistema es transparente en el intervalo de 510 - 580 nm. La
fluorescencia emitida se registra empleando una cámara CCD y el
sistema permite el registro simultáneo, dentro de un intervalo
mínimo de aproximadamente un segundo, de la fluorescencia en todos
los pocillos de una placa de microtitulación con 96 o con 384
pocillos. Empleando un sistema de pipeteo incorporado en el mismo,
se puede determinar la fluorescencia incluso durante la adición de
la sustancia, lo que puede ser beneficioso, por ejemplo, en el caso
de procesos rápidos. Por medio de una óptica especial, se puede
registrar la fluorescencia en una capa aproximadamente de sólo 50
\mum, pero no en el pocillo completo. Esto es beneficioso para la
reducción del ruido de fondo en todas las mediciones en las que el
colorante fluorescente también está presente extracelularmente,
como p. ej., también en el caso de mediciones de cambios en el
potencial de la membrana empleando colorantes del tipo DiBAC.
Aplicaciones convencionales del sistema, son mediciones de la
concentración de calcio intracelular o del potencial de membrana de
las células.
Entre los colorantes mencionados anteriormente,
DiBAC_{4}(3) muestra la mayor sensibilidad hacia
diferencias del voltaje, debido a que su máximo de excitación es el
más adecuado para el láser de argón en el FLIPR.
Ya que la fluorescencia de DiBAC_{4}(3)
puede reaccionar de forma sensible a los cambios de temperatura, se
mide lo más rápido posible, preferentemente después de un tiempo de
incubación determinado a 37ºC, p. ej., después de 30 minutos, ya
que debido a un enfriamiento de la solución del colorante, se puede
alterar el resultado de la medición. Preferentemente, antes de
comenzar la medición se realiza una fase de incubación previa
durante cinco minutos, para equilibrar los cambios de temperatura
en la placa de microtitulación. La medición se realiza con los
parámetros de temperatura (aproximadamente 37ºC) predeterminados por
el fabricante del FLIPR, para la medición de potenciales de
membrana.
Preferentemente, el volumen de la solución de la
reacción en la que se realiza el proceso, se cambia lo menos
posible (en el FLIPR), ya que la capacidad para reproducir la señal
de DiBAC_{4}(3) es la mejor cuando en el FLIPR tienen
lugar cambios de volumen relativamente reducidos. Preferentemente,
las sustancias que se van a someter a ensayo se añaden por tanto
diez veces concentradas a las células teñidas con
DiBAC_{4}(3).
Ya que la medición de la fluorescencia con "el
equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con
FLIPR" no es sensible a la temperatura, se puede realizar
simplemente a temperatura ambiente, lo que es especialmente
ventajoso para el FLIPR II, con el que se pueden realizar mediciones
de placas de microtitulación con 384 pocillos.
Otra ventaja del "equipo de reactivos para el
ensayo del potencial de membrana con FLIPR" frente a
DiBAC_{4}(3) es que no se tienen que añadir las sustancias
diez veces concentradas.
Los canales de HCN se activan mediante
hiperpolarización (p. ej., HCN2 a -100 mV hasta 50%) y causan una
despolarización de las células. Incrementando la concentración
intracelular de AMPc (p. ej., con dibutiril-AMPc o
con forskolina) se puede desplazar el valor de la actividad
semi-máxima aproximadamente 10 mV, a potenciales más
positivos (Ludwig y col., 1998).
Electrofisiológicamente, los canales de HCN se
pueden estudiar fácilmente sobre células transfectadas de forma
estable, empleando el método de abrazadera puntual,
"Patch-Clamp".
Por el contrario, en el FLIPR no es posible
inducir cambios del voltaje y por ello, debido a la actividad de
HCN, una hiperpolarización de las células sólo sería transitoria. No
ha sido posible conseguir una hiperpolarización de las células
transfectadas, añadiendo un inhibidor de HCN2 (zatebradina), puesto
que el potencial de membrana de reposo de las células transfectadas
está demasiado alejado de los potenciales con los que HCN2 está
activado.
Por un lado, la hiperpolarización es necesaria
para la activación de HCN, pero por otro lado, bajo condiciones
fisiológicas, un HCN activado conduce inmediatamente a una
despolarización. Por tanto, en la presente invención se
proporcionan unas condiciones bajo las cuales se pueden activar los
canales de HCN mediante hiperpolarización, pero que bajo las cuales
es inicialmente imposible una despolarización mediante el canal de
HCN activado. Para ello, las células sembradas en las placas de
microtitulación se lavan en un tampón iso-osmolar en
el que el NaCl se reemplaza por cloruro de colina. Este tampón de
lavado contiene todavía KCl 5 mM, ya que el K^{+} extracelular es
necesario para la actividad de HCN (Biel y col. 1999). Este tampón
de lavado, que sirve para la hiperpolarización de las células HCN,
contiene a la vez DIBAC_{4}(3) 5 \muM, para medir los
cambios del potencial de membrana en el FLIPR. Al eliminar el
Na^{+} extracelular, las células se hiperpolarizan, es decir, el
HCN también se activa. Sin embargo, el HCN no puede provocar una
despolarización de las células, ya que faltan los gradientes de
concentración necesarios de los iones Na^{+} o K^{+}
transportados por HCN. Un HCN activado sólo podría ahora conducir a
una hiperpolarización más pronunciada. Esto se refleja en el hecho
de que la fluorescencia inicial medida para las células HCN en el
FLIPR, con forskolina 10 \muM, es menor que la que se obtiene sin
forskolina, mientras que en las células no transfectadas no hay
diferencia.
En el FLIPR se añade Na^{+} a las células, de
modo que el HCN activado (después de unos segundos en los que hay
unos efectos mezclados) provoca una despolarización de las células,
a partir de aproximadamente 15 segundos después de la adición de
Na^{+}, la cual se vuelve visible por un incremento de la
fluorescencia. La detección de moduladores de HCN depende de una
diferencia clara entre las células con un canal de HCN activo (sólo
adición de Na^{+}) y células con un canal de HCN bloqueado
(Na^{+} + CsCl 8 mM). Una activación del canal de HCN mediante
una incubación previa con forskolina 10 \muM, aumenta claramente
la diferencia entre el valor al 100% sin inhibición y el valor al
0% con inhibición (véase, la Figura 1).
Una realización especial de la invención se
refiere a la determinación comparativa del cambio en el potencial
de la membrana de al menos dos poblaciones celulares que se incuban
con concentraciones diferentes de una de las sustancias que se va a
examinar.
Las sustancias cuya actividad se va a examinar
que se denominan sustancias que se van a someter a ensayo, y que
son activas, es decir que modulan la actividad del canal catiónico
activado por hiperpolarización, pueden ser inhibidoras (inhiben el
canal y reducen la despolarización o la evitan totalmente) o ser
activadoras (activan el canal y producen una despolarización más
pronunciada o más rápida) del canal catiónico activado por
hiperpolarización.
El procedimiento se puede emplear en el
escrutinio de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores
y/o activadores de un canal catiónico activado por
hiperpolarización. Se pueden emplear sustancias identificadas de
este modo como compuestos farmacéuticamente activos, por ejemplo, en
una forma farmacéuticamente aceptable.
Un procedimiento para la preparación de un
medicamento comprende la identificación de una sustancia cuya
actividad inhibe o activa un canal catiónico activado por
hiperpolarización y finalmente la mezcla de la sustancia
identificada, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además,
un procedimiento para la preparación de un medicamento
comprende
- a)
- la identificación de una sustancia que modula la actividad de canales catiónicos activables por hiperpolarización;
- b)
- la preparación de la sustancia;
- c)
- la purificación de la sustancia; y
- d)
- la mezcla de la sustancia con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También es objeto de la invención un equipo de
reactivos para ensayos, para determinar si una sustancia modula la
actividad de un canal catiónico activable por hiperpolarización, que
comprende
- a)
- células que hiperexpresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- un tampón iso-osmolar exento de iones sodio, para la hiperpolarización de la célula y
- c)
- reactivos para la detección.
Como medida de la actividad de una sustancia, se
mide el cambio del potencial de membrana de la célula,
preferentemente con ayuda de un colorante fluorescente sensible al
potencial, p. ej., con un derivado de oxonol, preferentemente,
ácido 3-bis-barbitúrico oxonol.
Una realización especial de la invención se
refiere a la medición del potencial de membrana en un lector de
placas con formación de imágenes fluorescentes (FLIPR).
Fig. 1: La Figura muestra el curso del tiempo de
la fluorescencia medida como valor medio de cada uno de los 24
pocillos. Para poder distinguir claramente el curso del tiempo entre
60 y 290 segundos, la fluorescencia, medida en cada pocillo (la
suma de los grados de luminosidad en un número constante de píxel en
un pocillo concreto y en todos los pocillos) con ayuda del programa
del FLIPR, a los 60 segundos (se corresponde con 40 segundos
después de la adición de Na^{+}), se definió como "0". Las
curvas A y B se obtuvieron con células que durante la tinción
contenían forskolina 10 \muM en el medio de tinción; C y D son
curvas de células que no recibieron forskolina. En A y C se añadió
NaCl en el FLIPR, hasta tener una concentración final de 50 mM,
mientras que B y D recibieron adicionalmente CsCl 8 mM para inhibir
el canal HCN2. Con el programa del FLIPR, se definieron los valores
de la curva A (con forskolina; NaCl 50 mM + CsCl 8 mM) como testigos
negativos. Las curvas B, C y D representan los cambios de la
fluorescencia en relación con el curso de la curva A. En el caso de
la curva B (con forskolina; sin inhibición con CsCl) se observa en
contraposición con A, una clara despolarización. Las células que no
se habían incubado previamente con forskolina, pero que con la
adición de NaCl, recibieron simultáneamente CsCl 8 mM (curva C),
muestran, en comparación con la curva A, un curso descendente. Por
ello se puede reconocer que la forskolina en este ensayo también
influye sobre el potencial de membrana de las células,
independientemente del canal HCN2 expresado. En contraposición a la
curva C, la curva D (sin forskolina, sin inhibición con CsCl)
muestra también de nuevo una clara despolarización. Ya que la
distancia entre las curvas A y B, en el intervalo de tiempo a partir
de 60 segundos, es siempre mayor que la distancia entre las curvas
C y D, se puede observar que la forskolina activa el canal HCN2
expresado.
Fig. 2: La Figura muestra el efecto de la
zatebradina sobre el curso de la fluorescencia. En esta Figura,
todas las células recibieron forskolina 10 \muM durante la
tinción. La curva A muestra el curso sin inhibición (sólo NaCl 50
mM), la curva E el curso inhibido con CsCl (NaCl 50 mM + CsCl 8 mM),
las curvas B-D la influencia de zatebradina: B:
12,5 \muM, C: 25 \muM y D: 50 \muM. Las curvas A y E
representan cada valor medio de los valores medidos en 12 pocillos,
las curvas B, C y D en 6 pocillos. Los valores medidos con la
adición de CsCl 8 mM (curva E) se definieron como testigos
negativos, de modo que las curvas A-D reflejan el
cambio relativo en relación con la curva E. Se observa claramente
que la despolarización que aparece después de añadir NaCl,
disminuye con una concentración creciente de zatebradina. A partir
de los valores de la fluorescencia medida en el FLIPR, se pudo
calcular el valor CI_{50} para la zatebradina (26 \muM), después
de exportar a Excel.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El plásmido pcDNA3-muHCN2
contiene ADNc de HCN2 (muHCN2) de múrido (nº de entrada en Genbank:
AJ225122) desde la posición 22-2812 (secuencia
codificadora: pos. 36-2627), clonado dentro de los
sitios de corte de EcoRI y Notl de pcDNA3, y se obtuvo gracias a M.
Biel, TU Munich (Ludwig y col., 1998). En cada caso, se emplearon 6
\mug de este ADN plasmídico para transfectar las células CHO o
HEK293. Para transfectar las células CHO o HEK, se empleó el
reactivo LipofectAmine^{R} de la Firma LifeTechnologies
(Gaithersburg, MD, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las
células se transfirieron desde las placas de cultivo a frascos para
cultivos celulares de 75 cm^{2}. Setenta y dos horas después de
la transfección, las células se sometieron a selección con 400
\mug/ml del antibiótico G418 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania).
Después de seleccionar durante dos semanas, las células
supervivientes se desprendieron de los frascos, empleando
tripsina-EDTA, se contaron en un contador de células
Coulter Z1 y se sembraron en placas de microtitulación de 96
pocillos de modo que estadísticamente tenía que estar presente 1
célula por pocillo. Las placas de microtitulación se controlaron
regularmente con microscopio y únicamente se continuaron cultivando
las células que procedían de pocillos en los que sólo crecía una
colonia.
A partir de esas células, se aisló el ARN total
con ayuda de los equipos de reactivos QlAshredder y RNeasy de la
Firma Qiagen (Hilden, Alemania). Este ARN total se examinó con
RT-PCR en busca de expresión de muHCN2 (cebador 1):
5'- GCCAATACCAGGAGAAG -3' [SEQ ID NO. 7], se corresponde con la pos.
1354-1370 en AJ225122, y el cebador 2:
5'-TGAGTAGAGGCGACAGTAG -3' [SEQ ID NO. 8], se
corresponde con la pos. 1829-1811 en AJ225122;
banda esperada con RT-PCR: 476 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el método de Patch-Clamp se
examinaron electrofisiológicamente las células con expresión de ARNm
detectable, en la configuración de célula completa, para estudiar
la expresión funcional de muHCN2. Este método ha sido descrito
detalladamente por Hamill y col. (1981). Las células se fijaron a un
potencial de retención de -40 mV. Partiendo de este potencial de
retención, se activaron los canales iónicos mediante un cambio del
voltaje a -140 mV, durante un segundo. La amplitud de la corriente
se determinó al final de este impulso. Entre las células HEK
transfectadas, se encontraron algunas que tenían corrientes de
aproximadamente 1 nA, pero debido a las corrientes endógenas que
interferían, no fue posible construir un ensayo para estas células
en el FLIPR.
Sin embargo, en las células HEK, se encontró
claramente que un canal HCN2 funcionalmente activo sólo era
detectable en células que tenían una expresión pronunciada del
ARNm. En las células CHO, la correlación entre la expresión del
ARNm y la función se confirmó. En general, la expresión del ARNm en
las células HEK era aproximadamente tres veces mejor que en las
células CHO. En los estudios de Patch-Clamp fue
posible mostrar una corriente débil en algunas células de una de
las líneas celulares de CHO con expresión más pronunciada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Ya que la expresión funcional parecía estar
fuertemente correlacionada con la expresión del ARNm, realizamos
una segunda transfección con el ADNc de muHCN2 que se había
insertado previamente por clonación, en el sitio de EcoRI y Notl
del vector pcDNA3.1 (+)zeo. Después de seleccionar durante dos
semanas con G418 y zeocina (Invitrogen, Groningen, NL), se aislaron
los clones de células aisladas, tal y como se ha descrito en el
Ejemplo 1. Después de aislar el ARN total a partir de estas
células, se realizó en primer lugar una RT-PCR con
los cebadores mencionados en el Ejemplo 1 y a continuación una
RT-PCR con los siguientes cebadores que comprenden
una región que contiene el extremo 3' de la secuencia codificadora
de muHAC1 (cebador 3: 5'- AGTGGCCTCGACCCACTGGACTCT -3' [SEQ ID NO.
9], se corresponde con la pos. 2553-2576 en
AJ225122, y el cebador 4: 5'- CCGCCTCCTAAGCTACCTACGTCCC -3' [SEQ ID
NO. 10], se corresponde con la pos. 2725-2701 en
AJ225122;
Algunas de estas células transfectadas
doblemente mostraban una expresión considerablemente más pronunciada
en la RT-PCR y en el análisis
"Patch-Clamp", que las células que se habían
transfectado sólo una vez. Electrofisiológicamente se midieron
corrientes de hasta 11 nA. Estas células se emplearon para construir
un ensayo con FLIPR para HCN2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las células sembradas en las placas de
microtitulación se lavaron en un tampón iso-osmolar
en el que se había sustituido el NaCl por cloruro de colina. Este
tampón de lavado contiene todavía KCl 5 mM, ya que el K^{+}
extracelular es necesario para la actividad de HCN (Biel y col.
1999). Este tampón de lavado, que sirve para la hiperpolarización
de las células HCN, contiene a la vez DIBAC_{4}(3) 5 \muM
para medir los cambios del potencial de membrana en el FLIPR. Al
eliminar el Na^{+} extracelular, las células se hiperpolarizan,
es decir el canal HCN también se activa. Sin embargo, el HCN no
puede provocar una despolarización de las células, ya que faltan
los gradientes de concentración necesarios de los iones Na^{+} o
K^{+} transportados por los canales HCN. Un HAC activado podría
dar ahora como resultado a lo sumo una hiperpolarización más
pronunciada. Esto se refleja de nuevo en el hecho de que la
fluorescencia inicial medida en las células HAC en el FLIPR con
forskolina 10 \muM, es menor que la que se obtiene sin forskolina,
mientras que en las células no transfectadas no hay diferencia.
Puesto que la fluorescencia de
DiBAC_{4}(3) puede ser sensible a las variaciones de
temperatura, la medición se realiza lo más rápido posible después
de una incubación a 37ºC durante 30 minutos; un enfriamiento de la
solución de tinción puede afectar a los resultados de la medición.
Preferentemente, antes de la medición, la muestra se somete a una
fase de cinco minutos de regulación de la temperatura en el
FLIPR.
Las sustancias que se van a someter a ensayo se
añaden preferentemente en una forma 10 veces concentrada, a las
células que se han teñido con DiBAC_{4}(3).
En el FLIPR se añade Na^{+} a las células de
modo que el HCN activado (después de unos segundos en los que hay
unos efectos mezclados) provoca una despolarización de las células,
a partir de aproximadamente 15 segundos después de la adición de
Na^{+}, las cuales se vuelven visibles por un incremento de la
fluorescencia. La detección de moduladores de HCN depende de una
diferencia clara entre las células con un canal de HCN activo (sólo
adición de Na^{+}) y células con un canal de HCN bloqueado
(Na^{+} + CsCl 8 mM). Una activación del canal de HCN mediante
una incubación previa con forskolina 10 \muM, aumenta claramente
la diferencia entre el valor al 100% sin inhibición y el valor al
0% con inhibición (véase, la Figura 1). En comparación con los
valores testigos, se puede detectar si una sustancia que se va a
someter a ensayo es un activador (despolarización más rápida o más
pronunciada) o un inhibidor (despolarización más lenta o inhibida,
véase la Fig. 2: efecto de la zatebradina).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Empleando las células HCN transfectadas, se
examinó el efecto de diversas concentraciones de la sustancia
zatebradina, que se conoce como bloqueadora de l_{f} (véase la
Fig. 2). La inhibición con zatebradina se calculó por el cambio
relativo de la fluorescencia a partir de 60 segundos. Para cada
concentración del inhibidor, se determinó el valor promedio en cada
uno de los 6 pocillos de la placa de microtitulación. A partir de
esos valores, se calculó el valor CI50 de la zatebradina de 26
\muM, un valor que se corresponde bien con el valor 31 \muM
determinado electrofisiológicamente en las mismas células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las células sembradas el día anterior, se
lavaron como anteriormente, tres veces en cada caso con 400 \mul
de tampón de lavado por pocillo. Sin embargo, esta vez, el volumen
que permanece por encima de las células, después de la última etapa
de lavado, se escoge dependiendo de las concentraciones deseadas de
Na^{+} y Cs^{+}. El colorante se añade al tampón de lavado y
las células se incuban con el colorante durante 30 minutos a
temperatura ambiente o a 37ºC, pero preferentemente a temperatura
ambiente.
En el FLIPR, la despolarización se induce a
continuación por adición de Na^{+} y en algunos pocillos testigos
se inhibe de nuevo mediante la adición simultánea de Cs^{+}.
Puesto que en el colorante de Molecular Devices,
un incremento de la fuerza iónica puede conducir a cambios en la
fluorescencia, se tiene que asegurar que la fuerza iónica varíe en
todos los pocillos de una placa de microtitulación del mismo modo.
Permitiendo las concentraciones finales de iones sodio o cesio, se
intenta no variar la osmolaridad. Para ajustar las concentraciones
deseadas de Na+ y Cs+, se emplean otros dos tampones además del
tampón de lavado que en lugar de cloruro de colina 140 mM, contienen
NaCl 140 mM (tampón fosfato) o CsCl 140 mM CsCl (tampón de
cesio).
Para las mediciones con el "equipo de
reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR",
Molecular Devices proporciona el siguiente protocolo estándar para
placas de microtitulación de 96 pocillos (384 pocillos entre
paréntesis): un día antes de la medición, las células se siembran en
100 \mul (25 \mul) de medio. Después de añadir 100 \mul (25
\mul) de colorante y 30 minutos de incubación a temperatura
ambiente o a 37ºC; se añaden en el FLIPR 50 \mul (25 \mul) de
la sustancia que se va a someter a ensayo en un tampón
adecuado.
Empleando los volúmenes indicados por Molecular
Devices, es posible sin cambiar la fuerza iónica, conseguir una
concentración máxima de 28 mM para Na^{+} + Cs^{+} en placas de
96 pocillos y de 46,7 mM en placas de 384 poci-
llos.
llos.
Puesto que esta concentración, en particular en
placas de 96 pocillos, es demasiado baja para obtener una actividad
óptima de los canales catiónicos activados por hiperpolarización,
diferentes volúmenes se sometieron a ensayo para las etapas
individuales.
Se ha observado que las concentraciones de
colorante se pueden reducir a la mitad de las que se indican en el
protocolo de Molecular Devices.
En las placas de 96 pocillos, se obtuvieron
buenos resultados incluso con los siguientes volúmenes: 45 \mul
de material sobrenadante del tampón de lavado sobre las células, 60
\mul de colorante en el tampón de lavado, 195 \mul de volumen
de adición en el FLIPR.
Un volumen de adición tan elevado, permite una
concentración máxima de Na^{+} + Cs^{+} de 91 mM, es decir, con
CsCl 8-10 mM, la concentración final de NaCl puede
ser 81-83 mM. Para Na^{+} 80 mM y Cs^{+} 8 mM se
requieren 6,43 \mul de tampón de lavado, 171,43 \mul de tampón
de sodio y 17,14 \mul de tampón de cesio, basándose en un volumen
de adición de 195 \mul.
- A:
- DiBAC_{4}(3) bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-trimetina oxonol
- \quad
- Firma Molecular Probes, nº de cat. B-438, PM: 516,64 g/mol
- \quad
- Se prepara una solución base 10 mM de DIBAC_{4}(3) en DMSO (25 mg de DIBAC_{4}(3)/4,838 ml de DMSO). Se almacenan partes alícuotas de esta solución base a -20ºC. Concentración final durante la tinción y la adición: 5 \muM
- B:
- Forskolina, PM: 410,5 g/mol. Concentración final durante la tinción: 10 \muM.
- \quad
- Se almacenan partes alícuotas de una solución base 10 mM en DMSO a -20ºC
- C:
- Tampón de lavado: (cloruro de colina 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M KOH ajustado a pH 7,4).
- D:
- Solución de pre-impregnación para saturar las puntas de las pipetas: como el tampón de lavado + DIBAC_{4}(3) 10 \muM
- \quad
- ¡Esta solución sólo se emplea para la placa de pre-impregnación!
- E:
- Solución de la tinción: concentrada doblemente, es decir, tampón de lavado + DIBAC_{4}(3) 10 \muM + forskolina 20 \muM.
- F:
- solución 10 veces concentrada para la placa de adición: NaCl 500 mM en H_{2}O + DIBAC 5 \muM
- \quad
- Todas las sustancias se añaden a esta solución 10 veces concentradas.
- \quad
- Testigo positivo (concentración final): NaCl 50 mM
- \quad
- Testigo negativo (concentración final): NaCl 50 mM + CsCl 8 mM
- A:
- "Equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR",
- \quad
- Firma Molecular Probes, nº de cat. R8034
- B:
- Tampón de lavado: (cloruro de colina 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)
- C:
- Tampón de la coloración: (contenido de una de las "ampollas de reactivo" del " equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" en 10 ml de tampón de lavado)
- D:
- Tampón de sodio: (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)
- E:
- Tampón de cesio: (CsCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)
Las células CHO transfectadas con muHCN2 se
sembraron un día antes de la medición, con una densidad de 35.000
células/pocillo, en cada caso en 200 \mul de medio completo, en
placas de microtitulación de 96 pocillos negras. Las células se
incubaron durante una noche a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Antes de la tinción, las células se lavaron tres
veces con 400 \mul de tampón de lavado. Después de la última
etapa de lavado permanece un volumen residual sobre las células de
90 \mul de tampón de lavado/pocillo.
Las células lavadas (con 90 \mul de tampón de
lavado/pocillo) se incuban en cada caso con 90 \mul de solución
de tinción/pocillo durante 30 minutos a 37ºC, en una incubadora con
CO_{2}. Después de este tiempo de incubación, las placas
celulares se miden en el FLIPR a aproximadamente 37ºC (ajuste de la
temperatura determinada por el fabricante de FLIPR, para las
mediciones del potencial de membrana con DiBAC_{4}(3)),
inmediatamente después o después de una fase de templado de cinco
minutos.
La imagen instantánea (fluorescencia inicial
antes del inicio de la medición), debe tener un valor promedio de
aproximadamente 35.000 unidades. El FLIPR se puede determinar como
máximo hasta aproximadamente 65.000 unidades.
Cuando el programa comienza, las puntas de las
pipetas se saturan inicialmente mediante inmersión en una solución
de preimpregnación con DiBAC_{4}(3). Después de esta etapa,
comienza la medición real con la primera medición (t = 0 segundos).
Puesto que DiBAC_{4}(3) es un colorante que reacciona
lentamente, es suficiente determinar la fluorescencia en los
pocillos de la placa de microtitulación cada 5 segundos. Después de
20 segundos, las sustancias que están presentes en la placa de
adición en forma 10 veces concentrada, se añaden simultáneamente a
la placa de microtitulación empleando un sistema de pipeteo. Ya que
el volumen después de la tinción es de 180 \mul, se añaden 20
\mul a cada pocillo. La medición de la fluorescencia se puede
terminar después de aproximadamente 5 minutos. Para la evaluación,
se examina el cambio en la fluorescencia en el intervalo en el que
es lineal y en el que las células transfectadas con
HCN-2 sin inhibir difieren significativamente de
las células inhibidas.
Después de añadir la solución de la tinción (el
volumen depende de las concentraciones finales deseadas), las
muestras se incuban a temperatura ambiente (preferida) o a 37ºC,
durante 30 minutos en un incubador con CO_{2}. Después de este
tiempo de incubación, la placa celular se mide a temperatura
ambiente en el FLIPR.
La imagen instantánea (la fluorescencia inicial
antes del comienzo de la medición) puede ser en el caso del
"equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con
FLIPR" menor que durante la medición con DiBAC_{4}(3),
ya que el equipo de reactivos para el ensayo es más sensible a los
cambios en el potencial de membrana que DiBAC_{4}(3).
Debido a la alta sensibilidad que se puede conseguir, la medición
debería realizarse, siempre que sea posible (FLIPRII), empleando un
filtro de emisión que sea transparente a la luz por encima de 550
nm. Sin embargo, también es posible realizar las mediciones
empleando el filtro convencional que es transparente entre 510 y
580 nm.
Cuando se inicia el programa (t=0), el FLIPR
determina inicialmente la fluorescencia de todos los pocillos de la
placa, un número de veces, antes de que comience la despolarización,
después de aproximadamente 20 segundos, mediante la adición de
iones sodio. En cada caso, la solución de adición se mezcla a partir
de los tres tampones (tampón de lavado, tampón de sodio o tampón de
cesio), de modo que la adición dé como resultado que no haya ningún
cambio de la osmolaridad o que haya un cambio que sea idéntico en
todos los pocillos. La medición de la fluorescencia se puede
terminar después de aproximadamente 5 minutos. Como testigo
negativo, sirven los pocillos en los que además de Na^{+} se
añadió Cs^{+} 8 mM para bloquear completamente el canal HCN. Si
se abstraen estos valores de los otros, se obtiene una buena medida
de la actividad del canal HCN bajo la influencia de la sustancia
que se va a examinar. Para la evaluación, se examina el cambio de la
fluorescencia en el intervalo en el que es lineal y en el que las
células transfectadas con HCN-2 sin inhibición
difieren significativamente de las células inhibidas.
Biel M., Ludwig A., Zong
X., Hofmann R. (1999)
Hyperpolarization-activated cation channels: A
multigene family. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 136:
165-181.
Hamill O.P., Marty A.,
Neher E., Sakmann B., Sigworth F.J.
(1981) Improved patch-clamp techniques for
high-resolution current recording from cells and
cell-free membrane patches. Pflügers Arch.
391: 85-100.
Ludwig A., Zong X.,
Jeglitsch M., Hofmann F., Biel M. (1998)
A family of hyperpolarization-activated mammalian
cation channels. Nature 393: 587-591.
Ludwig A., Zong X., Stieber
J., Hullin R., Hofmann R., Biel M.
(1999) Two pacemaker channels from heart with profoundly
different activation kinetics. EMBO J. 18:
2323-2329.
Reiffen A., Eberlein W.,
Müller P., Psiorz M., Noll K., Heider
J., Lillie C., Kobinger W., Luger P.
(1990) Specific bradycardiac agents. 1. Chemistry,
pharmacology, and structure-activity relationships
of substituted benzazepinones, a new class of compounds exerting
antiischemic properties. J. Med. Chem. 33:
1496-1504.
Número de entrada: AAC28444
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Número de entrada: AF065164
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Número de entrada: HSA132429
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Número de entrada: HSA132429
\newpage
Número de entrada: CAA12406
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Número de entrada: MMJ225122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- AKT
- (Transporte de K+ en Arabidopsis thaliana)
- AMPc
- Monofosfato de adenosina cíclico (cyclic adenosine monophosphate)
- CHO
- (chinese hamster ovary); línea celular procedente de ovarios de hámster chino
- EDTA
- (ethylenediamine tetraacetic acid) Ácido etilendiamino tetraacético
- FLIPR
- (fluorescence imaging plate reader) lector de placas con formación de imagen fluorescente
- HAC
- (hyperpolarization-activated cation channel) canal catiónico activado por hiperpolarización; este nombre ha sido utilizado por diferentes grupos de trabajo
- HCN
- (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel); esta es la nueva definición, aceptada en general
- HEK
- (human embryonic kidney); línea celular procedente de células renales embrionarias y humanas
- HEPES
- Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanosulfónico
- HTS
- (high throughput screening) escrutinio de alto rendimiento
- KAT
- (canal de K+ de Arabidopsis thaliana)
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la identificación
de sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos
activados por hiperpolarización
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AVE D-2000/A006
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 10006309.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-02-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 889
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5065
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
Claims (30)
1. Procedimiento para identificar sustancias que
modulan la actividad de canales catiónicos activados por
hiperpolarización, en el que
- a)
- se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio; y
- c)
- se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia a estudiar.
2. Procedimiento para identificar sustancias que
modulan la actividad de los canales catiónicos activados por
hiperpolarización, en el que
- a)
- se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio;
- c)
- las células se incuban con una sustancia que se va a examinar; y
- d)
- el cambio en el potencial de membrana de las células se registra después de añadir iones sodio.
3 Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que el tampón
iso-osmolar exento de iones sodio, contiene una sal
de potasio.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón
iso-osmolar exento de iones sodio contiene al menos
K^{+} 0,8 mM.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el tampón
iso-osmolar exento de iones sodio contiene al menos
K^{+} 5 mM.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el tampón
iso-osmolar exento de iones sodio, contiene cloruro
de colina o
N-metil-D-glucamina.
7. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el tampón
iso-osmolar exento de iones sodio, contiene un
colorante sensible al potencial.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el colorante sensible al potencial es un colorante
fluorescente.
9. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 7 y 8, en el que el colorante sensible al potencial
es un derivado del oxonol.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el derivado del oxonol es un 3-bis-ácido
barbitúrico oxonol.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el 3-bis-ácido barbitúrico oxonol es
bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-trimetina
oxonol, bis-(1,3-ácido
dietiltiobarbitúrico)-trimetina oxonol y/o
bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-pentametina
oxonol.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que se emplean células en las que la
concentración intracelular de AMPc está incrementada.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el contenido intracelular de AMPc está incrementada por la
adición de dibutiril-AMPc o
8-bromo-AMPc.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por
la adición de un activador de la adenilato ciclasa.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por
la adición de forskolina.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la concentración intracelular de AMPc está incrementada por
la adición de forskolina desde 1 \muM hasta 100 \muM.
\newpage
17. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por
la adición de ligandos o de receptores.
18. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que el canal catiónico activado por
hiperpolarización es un canal HCN1, HCN2, HCN3, HCN4, KAT1 o un
heteromultímero de estos canales.
19. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que el canal catiónico activado por
hiperpolarización es un canal catiónico humano, activable por
hiperpolarización.
20. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que las células son células de
mamífero.
21. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que las células son células CHO o
HEK.
22. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que las células se transfectan con
un plásmido que contiene el ADNc de un canal catiónico activado por
hiperpolarización.
23. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con
un segundo plásmido que contiene el ADNc del mismo canal catiónico
activado por hiperpolarización.
24. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con
un segundo plásmido que contiene el ADNc de otro canal catiónico
activado por hiperpolarización, de modo que se pueden formar
canales HCN heteromultímeros.
25. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con
un plásmido que contiene un ADNc sintético en el que se reúnen las
subunidades que proceden de partes de canales diferentes o de los
canales HCN.
26. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 25, en el que la variación del potencial de
membrana se mide con ayuda de un colorante fluorescente sensible al
potencial.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
el que el colorante fluorescente sensible al potencial es un
derivado del oxonol, preferentemente el 3-bis-ácido
barbitúrico oxonol.
28. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 27, en el que se efectúa la medición en un
lector de placas con formación de imágenes fluorescentes,
"Fluorescent Imaging Plate Reader".
29. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 28, en el que se determina por comparación la
variación del potencial de membrana de al menos dos células.
30. Uso de un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 29, en el escrutinio de alto rendimiento para
identificar inhibidores y/o activadores de un canal catiónico
activado por hiperpolarización.
31. Equipo de reactivos para ensayos, para
determinar si una sustancia modula la actividad de una canal
catiónico activado por hiperpolarización, que contiene
- a)
- células que hiperexpresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;
- b)
- un tampón iso-osmolar exento de iones sodio, para la hiperpolarización de la célula y
- c)
- reactivos para la detección.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10006309 | 2000-02-12 | ||
| DE10006309A DE10006309A1 (de) | 2000-02-12 | 2000-02-12 | Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivität von hyperpolarisationsaktivierten Kationen-kanälen modulieren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2311529T3 true ES2311529T3 (es) | 2009-02-16 |
Family
ID=7630723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01951152T Expired - Lifetime ES2311529T3 (es) | 2000-02-12 | 2001-01-24 | Procedimiento para la identificacion de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarizacion. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6979532B2 (es) |
| EP (1) | EP1257819B1 (es) |
| JP (1) | JP4782967B2 (es) |
| AT (1) | ATE403864T1 (es) |
| AU (1) | AU2001228488A1 (es) |
| DE (2) | DE10006309A1 (es) |
| DK (1) | DK1257819T3 (es) |
| ES (1) | ES2311529T3 (es) |
| WO (1) | WO2001059153A2 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002098287A2 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A high throughput biological heart rate monitor that is molecularly determined |
| US7794702B2 (en) * | 2003-01-15 | 2010-09-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Mesenchymal stem cells as a vehicle for ion channel transfer in syncytial structures |
| US20050002914A1 (en) * | 2003-01-15 | 2005-01-06 | Rosen Michael R. | Mesenchymal stem cells as a vehicle for ion channel transfer in syncytial structures |
| GB0303506D0 (en) * | 2003-02-14 | 2003-03-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US8859273B2 (en) * | 2003-12-24 | 2014-10-14 | Medtronic, Inc. | Methods of using HCN genes to treat cardiac arrhythmias |
| US20090029366A1 (en) * | 2007-03-28 | 2009-01-29 | Wyeth | Methods of identifying modulators of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (hcn) channels |
| KR101802541B1 (ko) | 2010-02-23 | 2017-11-30 | 크리스토퍼 고든 앳우드 | 생물학적 관련 분자 및 이들의 상호작용 특징을 검출하는 방법 |
| US20110301568A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Medtronic, Inc. | Systems and Methods to Treat Cardiac Pacing Conditions |
| US8814072B2 (en) | 2011-11-30 | 2014-08-26 | Whirlpool Corporation | User-controlled adjustment mechanism for a food processing device |
| US8899504B2 (en) | 2011-11-30 | 2014-12-02 | Whirlpool Corporation | Externally-operated adjustment mechanism for a food processing device |
| US8905342B2 (en) | 2011-11-30 | 2014-12-09 | Whirlpool Corporation | Food processing device with lid mounted adjustment mechanism |
| US8833683B2 (en) | 2012-03-08 | 2014-09-16 | Whirlpool Corporation | Food processor with external control for operating an adjustable cutting tool |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994019464A2 (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-01 | The Upjohn Company | Human dna sequence encoding a kidney atp-dependent potassium channel |
| DE19621312A1 (de) * | 1996-05-28 | 1997-12-04 | Bayer Ag | Maskierung der Hintergrundfluoreszenz und Signalverstärkung bei der optischen Analyse biologisch medizinischer Assays |
| GB9718365D0 (en) * | 1997-08-29 | 1997-11-05 | Univ London | Ion channel proteins |
| US6703485B2 (en) | 1997-12-23 | 2004-03-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Brain and heart cyclic nucleotide gated ion channel compounds and uses thereof |
| DE19806581A1 (de) | 1998-02-17 | 1999-10-21 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Sequenzen eines Ih-Ionenkanals und deren Verwendung |
| CA2368590A1 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Icagen, Inc. | Human hac3 |
| JP2003501022A (ja) * | 1999-05-27 | 2003-01-14 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | イオンチャネルコンダクタンスを測定するための方法およびその組成物 |
| US20090029366A1 (en) * | 2007-03-28 | 2009-01-29 | Wyeth | Methods of identifying modulators of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (hcn) channels |
-
2000
- 2000-02-12 DE DE10006309A patent/DE10006309A1/de not_active Ceased
-
2001
- 2001-01-24 JP JP2001558489A patent/JP4782967B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-24 DE DE50114193T patent/DE50114193D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-24 WO PCT/EP2001/000755 patent/WO2001059153A2/de active IP Right Grant
- 2001-01-24 DK DK01951152T patent/DK1257819T3/da active
- 2001-01-24 EP EP01951152A patent/EP1257819B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-24 AT AT01951152T patent/ATE403864T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-01-24 AU AU2001228488A patent/AU2001228488A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-24 ES ES01951152T patent/ES2311529T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-02-07 US US10/067,457 patent/US6979532B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-03-24 US US11/088,356 patent/US7550257B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1257819A2 (de) | 2002-11-20 |
| DE50114193D1 (de) | 2008-09-18 |
| JP2003522533A (ja) | 2003-07-29 |
| DK1257819T3 (da) | 2009-01-19 |
| WO2001059153A3 (de) | 2002-04-11 |
| WO2001059153A2 (de) | 2001-08-16 |
| JP4782967B2 (ja) | 2011-09-28 |
| DE10006309A1 (de) | 2001-08-23 |
| US20030082513A1 (en) | 2003-05-01 |
| US20070231849A1 (en) | 2007-10-04 |
| US7550257B2 (en) | 2009-06-23 |
| EP1257819B1 (de) | 2008-08-06 |
| AU2001228488A1 (en) | 2001-08-20 |
| ATE403864T1 (de) | 2008-08-15 |
| US6979532B2 (en) | 2005-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2311529T3 (es) | Procedimiento para la identificacion de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarizacion. | |
| Levesque et al. | Release of calcium from guinea pig cardiac sarcoplasmic reticulum induced by sodium-calcium exchange | |
| Dai et al. | A high-throughput assay for evaluating state dependence and subtype selectivity of Cav2 calcium channel inhibitors | |
| Yamada et al. | Usefulness and limitation of DiBAC4 (3), a voltage-sensitive fluorescent dye, for the measurement of membrane potentials regulated by recombinant large conductance Ca2+-activated K+ channels in HEK293 cells | |
| Angers et al. | Biochemical and biophysical demonstration of GPCR oligomerization in mammalian cells | |
| Huang et al. | Mechanosensitive store‐operated calcium entry regulates the formation of cell polarity | |
| AU2003301688A1 (en) | METHODS OF SCREENING FOR TRPM4b MODULATORS | |
| Carmosino et al. | High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells | |
| Morad et al. | Calcium channel inactivation: possible role in signal transduction and Ca2+ signaling | |
| Sistemich et al. | The molecular mechanism of polymer formation of farnesylated human guanylate-binding protein 1 | |
| He et al. | Molecular determinants of cAMP‐mediated regulation of the Na+–Ca2+ exchanger expressed in human cell lines | |
| ES2431523T3 (es) | Método de ensayo de una sustancia capaz de cambiar el potencial de membrana mitocondrial | |
| Le et al. | Distinct shear-induced Ca2+ signaling in the left and right atrial myocytes: Role of P2 receptor context | |
| Betzenhauser et al. | Studying isoform-specific inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor function and regulation | |
| Zhang et al. | The gating effect of calmodulin and calcium on the connexin50 hemichannel | |
| CA2384170C (en) | Cgmp-visualizing probe and method of detecting and quantifying cgmp by using the same | |
| Fang et al. | High affinity binding of 9-[3H] methyl-7-bromoeudistomin D to the caffeine-binding site of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. | |
| CA2652960C (en) | Methods of screening for trpm4 modulators of insulin secretion | |
| ES2250369T3 (es) | Receptor acoplado a la proteina g. | |
| Sarker et al. | mOrange2, a genetically encoded, pH sensitive fluorescent protein, is an alternative to BCECF-AM to measure intracellular pH to determine NHE3 and DRA activity | |
| König et al. | Fluorescence lifetime imaging: association of cortical actin with a PIP3-rich membrane compartment | |
| Prasad et al. | Methods to detect cell surface expression and constitutive activity of GPR6 | |
| Laughery | Cellular localization and assembly of the Na, K-ATPase | |
| Simpson et al. | Native and Recombinant Human Edg4 Receptor-Mediated Ca2+ Signalling | |
| Szakadáti | THE FATE OF TYPE I ANGIOTENSIN II RECEPTOR AFTER BIASED ACTIVATION |