ES2309555T3 - Compuestos aromaticos como inhibidores de las aldolasas. - Google Patents
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Abstract
Compuesto aromático que comprende un grupo aldehído, un grupo fenol y un grupo fosfato o un grupo mimético del grupo fosfato, caracterizado: - porque su núcleo aromático comprende dos anillos aromáticos de tipo bencénico, - y porque responde a la fórmula general siguiente: (Ver fórmula) en la cual: * el grupo aldehído (-CHO) y el grupo fenol (-OH) están fijados a dos átomos de carbono adyacentes de un mismo anillo aromático llamado primer anillo aromático , * y está fijado a un átomo de carbono de un segundo anillo aromático llamado segundo anillo aromático, R un grupo fosfato o un grupo mimético del grupo fosfato de fórmula general; (Ver fórmula) en el cual: - X es elegido de entre el grupo formado de un átomo de oxígeno de -CH2-, -CHF- y -CF2-, - R'' es elegido de entre el grupo formado del átomo de hidrógeno y de los sustituyentes (IV), (V), (VII), (VIII), (IX), (X) y (XII). (Ver fórmulas)
Description
Compuestos aromáticos como inhibidores de las
aldolasas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se refiere a nuevos compuestos
inhibidores de la glicólisis cuya acción se manifiesta en forma de
una inhibición de las aldolasas. La invención se refiere también a
su procedimiento de síntesis y a sus aplicaciones en particular en
la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer.
La glicólisis representa un mecanismo complejo
que hace que intervenga una cascada de diez enzimas distintas para
asegurar la degradación anaeróbica de la glucosa con liberación de
energía almacenada en forma de ATP
(adenosina-5'-trifosfato).
De entre las diez enzimas que toman parte en la
glicólisis, las aldolasas
(fructosa-1,6-bifosfato aldolasas),
que son enzimas homotetraméricas, intervienen en una etapa
importante: la fragmentación de la
fructosa-1,6-bifosfato
(Fru(1,6)P_{2}) en dos triosas fosfatos, que son el
dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y el
gliceraldehído-3-fosfato (GAP). La
fragmentación de la Fru(1,6)P_{2} por las aldolasas
se efectúa según un mecanismo multietapas que define una pluralidad
de intermedios reaccionales bien identificados.
Las aldolasas son esenciales en la vía de la
glicólisis, y son en consecuencia preciosas para la síntesis del
piruvato y de la ATP.
Las aldolasas se dividen en dos clases (Ruther
et al., 1964, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol.,
23:1248-1257). Las aldolasas de una clase se
distinguen de las de la otra clase en particular en sus orígenes,
pero también en su modo de funcionamiento. Las aldolasas de clase
I, que están presentes en la especie animal, las plantas superiores
y ciertos parásitos, fijan la Fru(1,6)P_{2} formando
una imina protonada (o base de Schiff) entre un residuo de lisina
(lys-229) del sitio activo y el sustrato. En cuanto
a las aldolasas de clase II, las mismas son específicas de los
organismos procariotas. Éstas requieren la presencia, al nivel de su
sitio catalítico, de un ion metálico bivalente para fijar y
estabilizar el sustrato en forma de enolato, antes de la
fragmentación.
De entre los inhibidores de las aldolasas de
clase I que son actualmente conocidos pueden citarse inhibidores
competitivos, y en particular los descritos en Blonski C. et
al., 1997 (Biochem. J., 323:71-77): derivados
fosfatos de la hidroquinona (HQN-P_{2}) y del resorcinol
(RSN-P_{2}) y el
benzaldehído-4-fosfato
(HBA-P). Sometidos a ensayo con la aldolasa de músculo de
conejo, estos inhibidores presentan respectivamente una constante
de disociación (o constante de inhibición) K_{i} del orden
de 135, 400 y 500 \muM. Se conocen también compuestos fosfatados
de constante de inhibición K_{i} del orden de
30-40 \muM (Hartman et al., 1965,
Biochemistry, 4:1068-1075).
Puede también citarse el
2-hidroxibenzaldehído-4-fosfato
(Blonski C. et al., 1997, Biochem. J.,
323:71-77), que es un inhibidor reversible
dependiente del tiempo de constante de inhibición global
K_{i}* de 35 \pm 5 \muM, que es capaz de reducir en un
80% la actividad de las aldolasas para una concentración de
inhibidor del orden de 200 \muM.
A semejanza de estos compuestos, los otros
inhibidores de las aldolasas que son actualmente conocidos
(Gefflaut T. et al., 1995, Prog. Biophys. Mol. Biol.,
63(3):301-340) y los inhibidores de la
glicólisis en general presentan una débil actividad inhibitoria, a
menos que se les utilice a muy alta concentración, lo cual limita
considerablemente su campo de aplicación. Asimismo es difícilmente
contemplable su aplicación a baja concentración, como por ejemplo a
concentraciones compatibles con dosis terapéuticas.
Ahora bien, en muchas aplicaciones, y en
particular en el dominio médico, se persigue una significativa
inhibición de la glicólisis, y ello para concentraciones de
inhibidor lo suficientemente bajas como para evitar todo efecto
nocivo para el paciente. A título de ello es conocido un enfoque que
es el llamado enfoque GRH ("Glycerol rescued hypoglycemia"),
imaginado para el tratamiento de ciertos cánceres y ciertos tumores
sólidos (Mc Carty M.F., 2001, Med. Hypothèses,
56:286-289). Su fundamento se basa en particular en
dos constataciones.
En primer lugar, se ha demostrado que los
tumores sólidos y los cánceres letales que se desarrollan en
tejidos en los que reina una débil concentración de oxígeno
(condiciones de hipoxia) poseen un fenotipo que hace que la
glicólisis intervenga como única vía de producción de energía. Se ha
demostrado asimismo que las células de este tipo se caracterizan
también por una ausencia de actividad de la glicerol cinasa, que es
una enzima particular que permite a las células sanas utilizar el
glicerol en sustitución de la glucosa.
Así pues, el enfoque GRH propone inhibir la vía
de la glicólisis en todas las células del paciente, dispensándole
al mismo tiempo una dosis suficiente de glicerol a guisa de única
fuente de energía. Las células cancerosas para las cuales la
glicólisis representa la vía primordial de síntesis de ATP se
encuentran así "hambreadas", no pudiendo utilizar ni la
glucosa ni el glicerol como fuente de energía alternativa a la
glucosa. En cuanto a las células sanas, gracias a la actividad de
la glicerol cinasa y de otras enzimas de la parte inferior de la
glicólisis (la de las triosas), las mismas pueden utilizar el
glicerol para la síntesis del piruvato. Así pues, se hambrean las
células cancerosas, asegurándoles a los tejidos sanos un conveniente
aporte energético.
Sin embargo, a día de hoy no ha podido aún ser
aplicado tratamiento anticanceroso alguno que se sirva del enfoque
GRH debido a la ausencia de inhibidores suficientemente eficaces de
la glicólisis, y más en particular, de inhibidores de una de las
enzimas de la parte superior de la glicólisis (la de las
hexosas).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Asimismo, al representar la glicólisis la única
vía de síntesis energética para numerosos parásitos, el bloqueo de
la glicólisis puede ser igualmente un enfoque muy prometedor para el
tratamiento de numerosas patologías de origen parasitario.
Así, existe actualmente una real necesidad de
poder disponer de al menos un inhibidor eficaz de la glicólisis, en
particular con la perspectiva de superar el cáncer así como ciertas
enfermedades parasitarias, o dentro del marco de erradicar todo
organismo para el cual la glicólisis represente una principal o
esencial vía de síntesis de energía.
La presente invención pretende paliar las
lagunas anteriormente señaladas proponiendo nuevos compuestos
químicos que tengan la capacidad de inhibir la glicólisis y en
particular la actividad de las aldolasas de clase I.
La invención persigue más en particular proponer
compuestos que por su eficacia de inhibición de las aldolasas
puedan ser utilizados como medicamentos, es decir eficazmente y a
dosis terapéuticas -en particular dentro del marco de los
tratamientos del cáncer-.
La invención tiene igualmente como objetivo el
proponer aplicaciones de estos compuestos en calidad de agentes
inhibidores de la glicólisis, exceptuando las aplicaciones
terapéuticas. Por extensión, la invención tiende a proponer nuevos
medicamentos, en particular para el tratamiento del cáncer y/o de
las enfermedades parasitarias.
La invención tiene por último el objetivo de
proponer un procedimiento de síntesis de los compuestos según la
invención, de aplicación a la vez sencilla, cuantitativa y poco
costosa, o en otros términos, un procedimiento compatible con las
exigencias económicas de una producción a escala industrial.
En todo el texto se adopta la terminología
siguiente:
- anillo aromático: ciclo conjugado de un núcleo
aromático en el cual los electrones libres pueden desplazarse de un
átomo de carbono a otro sin ligarse a ninguno a ellos
(deslocalización de los electrones por efecto de resonancia) y de
un átomo de carbono de un anillo a un átomo de carbono de otro
anillo; los núcleos aromáticos de tipo naftaleno que se aplican en
la invención presentan así una alternancia de enlaces sencillos
(enlaces \sigma) y dobles (enlaces \pi), conduciendo a un
sistema de electrones \pi fuertemente deslocalizados entre los
dos anillos aromáticos que forman estos núcleos,
- mimético del grupo fosfato: sustituyente de un
compuesto químico, distinto de un grupo fosfato, adaptado para
mejorar la biodisponibilidad del compuesto químico a nivel de su
blanco proteico (la aldolasa) dentro del marco de la invención; los
miméticos del grupo fosfato pueden ser de dos tipos: grupos
protectores enzimolábiles o análogos estables del fosfato,
- grupo protector enzimolábil: mimético del
grupo fosfato adaptado para permitir la difusión pasiva del
compuesto a través de los sistemas membranosos celulares o
parasitarios, según un método de enmascaramiento de cargas, para
después experimentar, en el interior de la célula o del parásito,
una transformación (o desprotección) enzimática para así poder
generar un grupo fosfato o un análogo estable del fosfato,
- análogo estable del fosfato: mimético del
grupo fosfato que en comparación con un grupo fosfato presenta una
estabilidad mejorada frente a las condiciones fisiológicas -en
particular frente al pH y/o al entorno enzimático-.
La invención se refiere a un compuesto aromático
según la reivindicación 1.
Aunque los mecanismos reales de la inhibición de
las aldolasas de clase I no hayan sido definitivamente elucidados
específicamente para cada uno de los compuestos de la invención, los
trabajos de los inventores con ciertos compuestos de éstos, así
como los trabajos de modelización del sitio activo de distintas
aldolasas de clase I, permiten pensar en una inhibición eficaz de
estas aldolasas gracias a compuestos que responden a la definición
precedente.
La invención ha permitido así demostrar que la
presencia simultánea de un grupo fosfato, de un grupo hidroxilo y
de un grupo aldehído, incorporados a una estructura química de
geometría plana tal como un núcleo aromático de tipo naftaleno, es
necesaria para generar un buen reconocimiento y una apreciable
afinidad con el sitio activo de las aldolasas.
El grupo fosfato es esencial para el
reconocimiento del inhibidor por parte de la aldolasa. El grupo
fosfato se inserta en el interior del bolsillo de reconocimiento de
la enzima y permite al compuesto aromático adoptar una buena
orientación en el interior del sitio activo. El compuesto aromático
expone entonces los grupos aldehído y fenol a buena distancia de al
menos de uno de los tres residuos de lisina
(Lys-107, Lys-146,
Lys-229) del sitio activo, formando así con éste,
con pH fisiológico, un enlace estable de tipo imina protonada o
base de Schiff. La exigencia de la disposición del grupo fosfato en
un anillo aromático distinto del ocupado por el aldehído y el
hidroxilo, tiene así gran importancia. En efecto, un núcleo
aromático de tipo naftaleno permite posicionar el hidroxilo y el
aldehído a una distancia del grupo fosfato particularmente apropiada
para una buena afinidad del compuesto frente a las aldolasas; la
distancia que separa al grupo fosfato del aldehído y del hidroxilo
conduce a un reconocimiento del grupo fosfato por parte de las
aldolasas y a la estabilización del compuesto en el sitio activo,
en virtud del sesgo de uno de los tres residuos de lisina, siendo el
compuesto sometido a una muy débil tensión, y siendo por
consiguiente escaso el gasto de energía.
Por otra parte, las respectivas posiciones del
aldehído y del hidroxilo con respecto al fosfato desempeñan un
papel importante en la selectividad de una aldolasa en particular
para con un compuesto bien definido según la invención.
Por último, la presencia de los grupos hidroxilo
y aldehído sobre dos átomos de carbono adyacentes de un mismo
anillo aromático es primordial y gobierna la formación de este
enlace particular al nivel del sitio activo de las aldolasas de
clase I. El grupo hidroxilo desempeña probablemente un papel de
catalizador ácido en la deshidratación de la carbinolamina
intermedia e interviene a continuación probablemente en la
estabilización de la base de Schiff protonada, generando así una
eficaz inhibición cuasi-irreversible, o incluso
irreversible.
Un núcleo aromático de tipo naftaleno al cual
están incorporados los grupos fosfato, aldehído y fenol en
posiciones particulares permite igualmente y de manera ventajosa
definir un compuesto de geometría plana de conformación más forzada
que los sustratos de la aldolasas (Fru(1,6)P_{2},
GAP, DHAP) y de dimensiones adaptadas, respetando a la vez las
coerciones de accesibilidad del compuesto al sitio activo de las
aldolasas y de obstrucción estérica a este nivel.
Tales compuestos aromáticos son, pues,
susceptibles de ocupar el sitio activo de las aldolasas de clase I
de forma tal que pueden ser impedidas la fijación y la fragmentación
de la Fructosa-1,6-bifosfato, y,
in fine, de forma tal que producen el bloqueo de la
glicólisis. Tales compuestos aromáticos son así susceptibles de
inhibir de manera eficaz las aldolasas de células eucariotas y/o de
parásitos, y por ende de bloquear la glicólisis de las células
eucariotas y/o parasitarias.
Sin embargo, cuando se desea una inhibición
intracelular y/o intraparasitaria, el estado de ionización del
grupo fosfato, necesario para el reconocimiento y el anclaje de un
compuesto según la invención en el sitio activo de las aldolasas,
engendra un problema para el paso de estos inhibidores a través de
la membrana celular, lo que se traduce en una mala
biodisponibilidad de estos compuestos, y por ende en una escasa
actividad global.
Un primer enfoque que permite mejorar la
biodisponibilidad de un compuesto fosfato consiste en proteger los
grupos fosfatos de forma tal que se enmascaran temporalmente estas
cargas -en particular por medio de grupos protectores
enzimolábiles- y se permite así su paso de manera pasiva a través de
las membranas celulares.
Por otro lado, el pH, en particular en los
tejidos vivos, en las células y en los parásitos, puede estar en el
origen de una disociación espontánea del grupo fosfato. Asimismo,
numerosas enzimas -en particular las fosfatasas- son capaces de
cortar el enlace ciclo aromático-fosfato. Además,
para las aplicaciones en tejidos, células y parásitos vivientes, es
preferible sustituir estos grupos fosfatos por miméticos, y en
particular por análogos estables del fosfato.
Ventajosamente, un mimético del grupo fosfato es
elegido de entre:
- un grupo protector enzimolábil adaptado para
permitir a dicho compuesto aromático un paso pasivo a través de los
sistemas membranosos celulares y/o parasitarios y para poder
generar, una vez en el interior de una célula o de un parásito, la
formación de un grupo fosfato o de un análogo estable del grupo
fosfato,
- un análogo estable del fosfato adaptado para
preservar al compuesto aromático de una desfosforilación espontánea
y/o enzimática
- en particular por las fosfatasas celulares y/o
parasitarias.
A título de ejemplos no limitativos de
compuestos según la invención susceptibles de inhibir a las
aldolasas, pueden citarse compuestos que, según la nomenclatura
oficial, pueden ser designados de la manera siguiente: el
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato,
el
6-formil-5-hidroxi-2-naftilfosfato,
el
4-formil-5-hidroxi-1-naftilfosfato,
el
5-formil-4-hidroxi-1-naftilfosfato,
el
4-formil-3-hidroxi-2-naftilfosfato,
el
3-formil-4-hidroxi-2-naftilfosfato,
el
3-formil-2-hidroxi-1-naftilfosfato
y el
2-formil-3-hidroxi-1-naftilfosfato,
o un derivado de éstos últimos obtenido mediante la sustitución del
grupo fosfato por un mimético del grupo fosfato según la
invención.
Ventajosamente, un compuesto aromático según la
invención tiene por fórmula general la siguiente:
donde R_{1} es un grupo fosfato o
un mimético del grupo
fosfato.
Cuando R_{1} es un grupo fosfato, el compuesto
aromático según la fórmula general (II) es entonces designado,
según la nomenclatura oficial, como
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato
(designado de aquí en adelante como FHN-P). Asimismo, un
compuesto según la invención y de fórmula general (II) puede ser el
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato
o un derivado de éste último, obtenido mediante una sustitución del
grupo fosfato por un mimético según la invención.
Han sido realizados por espectroscopia
diferencial UV/visible y por espectrometría de masas por
electrospray estudios de interacción del FHN-P con las
aldolasas de clase I, y en más en particular con la aldolasa de
músculo de conejo. Estos estudios han sido a la vez completados con
análisis de cinéticas enzimáticas y experiencias utilizando
aldolasas mutadas.
Con la aldolasa de músculo de conejo, la
invención ha permitido poner en evidencia la formación de una base
de Schiff entre el grupo aldehído del compuesto aromático según la
invención y la enzima. Dichos experimentos han permitido asimismo
demostrar la implicación del residuo Lys-107 en la
formación de esta base de Schiff. Por último, la inhibición de la
aldolasa de músculo de conejo por parte del FHN-P ha sido
definida como una inhibición reversible dependiente del tiempo
("slow - binding inhibition"). Aparte del hecho de presentar
un alto grado de selectividad, este tipo de inhibición se
caracteriza por una fijación lenta del inhibidor a la enzima, que
puede ser tan eficaz como una inhibición realizada por un inhibidor
de tipo irreversible químicamente reactivo (Morrison et Walsch,
1988, Adv. Enzymol. Relat. Aeras Mol. Biol.,
61:201-301). La inhibición de la aldolasa de
músculo de conejo por parte del FHN-P se caracteriza por una
constante global de inhibición K_{i}* del orden de 25nM.
Así, este compuesto representa en la actualidad el inhibidor
reversible dependiente del tiempo que es el más potente frente a
las aldolasas de clase I. Y lo que es más, como toda inhibición que
implica la formación de una base de Schiff entre el inhibidor y un
residuo de lisina, esta inhibición puede hacerse irreversible
mediante un tratamiento al borohidruro de sodio del complejo
inhibidor-enzima.
Hay que señalar que un compuesto tal como el
dihidrogenofosfato de
2-(4-formil-3-hidroxifenil)-1-etileno
puede ser considerado en la inhibición de las aldolasas como un
equivalente del FHN-P. En efecto, este compuesto responde de
manera muy equiparable al FHN-P a las condiciones que son
necesarias para la inhibición de las aldolasas, las cuales han sido
expuestas anteriormente. La presencia del grupo fosfato de este
compuesto permite de entrada un reconocimiento por parte de las
aldolasas. Igual como el FHN-P, este compuesto se orienta
entonces en el interior del sitio activo y, teniendo en cuenta la
distancia que separa el grupo fosfato de los grupos aldehído y
fenol, que es muy sensiblemente idéntica a la de los grupos de
FHN-P, expone en las inmediaciones de uno de los residuos de
lisina sus grupos aldehído y fenol.
Ventajosamente, un grupo protector enzimolábil
según la invención es un grupo de naturaleza tal que es
desprotegido por una (de las) esterasa(s)
intracelular(es).
Ventajosamente y según la invención, este grupo
protector enzimolábil presenta la fórmula general siguiente:
donde R' puede ser elegido de entre
los grupos
siguientes:
Un compuesto aromático según la invención
presenta así un grupo protector enzimolábil, llamado de tipo
oximetiléster. Los mecanismos de desprotección de un grupo
enzimolábil de este tipo han sido en particular descritos por
Farquhar et al., 1983 (J. Pharm. Sci.,
72:324-325) y por Srivastva et al., 1984
(Bioorg. Chem., 12:118-124).
Ventajosamente, según otra variante, un grupo
protector enzimolábil según la invención, de naturaleza tal que es
desprotegido por estearasas intracelulares, presenta la fórmula
general siguiente:
donde R'' puede ser elegido de
entre los grupos
siguientes:
Si bien los grupos protectores enzimolábiles de
tipo tioéster hacen que para su desprotección intervengan las
mismas enzimas que para los grupos protectores enzimolábiles de tipo
oximetiléster, el mecanismo reaccional es sin embargo bien distinto
y ha sido en particular descrito por Lefebvre et al., 1995
(J. Med. Chem., 38:3941-3950).
Según una variante de realización en materia de
enmascaramiento temporal de carga, un grupo protector enzimolábil
según la invención es susceptible de ser desprotegido por una (de
las) reductasa(s) intracelular(es).
Ventajosamente, según esta variante de
realización, un grupo protector enzimolábil responde a la fórmula
general siguiente:
donde R''' puede ser elegido de
entre los grupos
siguientes:
Los mecanismos de desprotección de un grupo
protector enzimolábil de este tipo han sido descritos por Puech
et al., 1993 (Antiviral Res.,
22:155-174).
Se entiende que es posible paliar el estado
ionizado del grupo fosfato de ciertos compuestos aromáticos según
la invención mediante técnicas distintas del enmascaramiento de
cargas mediante grupos protectores enzimolábiles. Según la
aplicación contemplada (sobre aldolasas extraídas o no de células),
podrá preferirse recurrir a una encapsulación particular (forma
galénica) o a una técnica de administración particular (métodos de
inyección) como complemento o en sustitución de los grupos
protectores enzimolábiles, y en particular de los anteriormente
citados.
Ventajosamente, un análogo estable del fosfato
según la invención puede ser elegido de entre los grupos
siguientes:
- el fosfonato de metileno,
- el fosfonato de difluorometileno,
- el fosfonato de monoflurometileno,
descritos en particular en Nieschalk J. et
al., 1996 (Tetrahedron Lett.,
52(1):165-176).
Ventajosamente y según la invención, un átomo de
hidrógeno de al menos uno de los átomos de carbono de al menos uno
de los anillos aromáticos es sustituido por un sustituyente llamado
sustituyente hidrofóbico adaptado para mejorar la hidrofobicidad
global del compuesto. La presencia de un grupo de este tipo facilita
el acceso de un compuesto aromático según la invención al sitio
activo, relativamente hidrofóbico, de las aldolasas. Conviene
además elegir un grupo compatible con la síntesis del compuesto
según la invención y tener en cuenta las coerciones de obstrucción
estérica al nivel del sitio activo de las aldolasas.
Ventajosamente, cada uno de los sustituyentes
hidrofóbicos según la invención es un grupo alquilo de cadena
principal que comprende como máximo tres átomos de carbono.
La invención se refiere además a un compuesto
aromático según la invención para sus usos como agente inhibidor de
la actividad de las aldolasas de clase I, y por extrapolación, como
agente inhibidor de la glicólisis, en los organismos eucariotas.
Ventajosamente, el uso de un compuesto aromático se hace dentro de
un marco no terapéutico.
Ventajosamente y según la invención, un
compuesto aromático usado con esta finalidad es susceptible de
presentar una constante de inhibición K_{i} de las
aldolasas inferior a 25 \muM, en particular inferior a 50 nM
-típicamente del orden de 25 nM-.
Ventajosamente y según la invención, un
compuesto aromático usado con esta finalidad es susceptible de
inhibir al menos una aldolasa de manera irreversible o cuasi
irreversible.
La invención se extiende a un procedimiento de
inhibición de aldolasas extracelulares o intracelulares,
ventajosamente con excepción de las aldolasas intracelulares de
células vivientes no aisladas de un cuerpo humano o de un cuerpo
animal o de un embrión humano, en el cual se pone a estas aldolasas
en contacto con al menos un compuesto aromático según la invención,
al menos en cantidad suficiente para inducir un efecto notable en
la actividad de las aldolasas.
Ventajosamente, un procedimiento según la
invención se aplica a la inhibición de la glicólisis celular.
Ventajosamente, un procedimiento según la
invención puede ser aplicado para cortar el desarrollo de una
célula cancerosa.
La invención se extiende también a un
medicamento que comprende un compuesto aromático según la
invención.
En la lucha contra el cáncer han sido imaginados
distintos enfoques terapéuticos (quimioterapia, radioterapia,
cirugía, ...) y se utilizan hoy en día numerosos tratamientos. Sin
embargo, en la actualidad no existe tratamiento alguno que sea
totalmente eficaz contra los cánceres. La elección de los
tratamientos actuales se hace generalmente en función del tipo de
tejido y de los órganos atacados, así como del grado de difusión y
de la malignidad. Sin embargo, muchos tratamientos son mal
soportados a más o menos largo plazo por los pacientes. Debido a
ello, generalmente se prescribe un abordaje multiterapéutico, de lo
cual se deriva la necesidad de poder disponer de distintos
tratamientos para poder tratar un mismo tipo de cáncer, que podrán
ser prescritos alternativamente para un paciente. La posibilidad de
poder aplicar el enfoque GRH daría lugar a nuevos tratamientos y por
ende a un gran progreso en la lucha contra el cáncer. Un compuesto
aromático según la invención permite aplicar muy favorablemente el
enfoque
GRH.
GRH.
La invención se extiende así igualmente al uso
de un compuesto aromático según la invención para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento del cáncer -en particular para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer que se
efectúa según el enfoque GRH-.
La invención se extiende también a un
procedimiento de síntesis de un compuesto aromático según la
invención.
Según un primer aspecto de la invención, el
procedimiento permite la síntesis de un
1-hidroxi-2-naftaldehído
fosforilado sobre un átomo de carbono del segundo anillo
aromático.
Ventajosamente, un procedimiento de síntesis
según la invención comprende una etapa de fosforilación de un
compuesto 2-naftaldehído dihidroxilado, hidroxilado
sobre el átomo de carbono 1 del primer anillo aromático y sobre uno
de los átomos de carbono del segundo anillo aromático,
correspondiendo dicha fosforilación a una sustitución del grupo
hidroxilo del segundo anillo aromático por un grupo fosfato.
Ventajosamente y según la invención, la etapa de
fosforilación es iniciada por la técnica del fosfito de trietilo,
piridina y yodo, en una solución de CH_{2}Cl_{2}/THF (Stowel
J.K. et al., 1995, Tetrahedron Lett.,
36:182-185; Ladame S. et al., 2001,
Phosphorus, Sulfur and Silicon, 174:37-47).
Ventajosamente y según la invención, la
fosforilación se efectúa sobre el
1,6-dihidroxi-2-naftaldehído
para llegar, tras desprotección (Page P. et al., 1999,
Bioor. Med. Chem., 7:1403-1412), al
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato
(FHN-P).
La invención se refiere también a un compuesto
aromático inhibidor de aldolasa, un procedimiento de inhibición de
las aldolasas y de la glicólisis y un medicamento, caracterizados en
combinación por la totalidad o parte de las características que se
mencionan en lo expuesto anteriormente o de aquí en adelante.
Otros objetivos, características y ventajas de
la invención quedarán de manifiesto al proceder a la lectura de los
ejemplos siguientes. Las figuras 1 a 5 ilustran los resultados
obtenidos en estos ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las reacciones sensibles a la humedad han
sido realizadas bajo atmósfera de argón en condiciones
anhidras.
El tetrahidrofurano (THF) y el éter etílico son
destilados sobre sodio/benzofenona. El diclorometano es destilado
sobre P_{2}O_{5}. La piridina y la trietilamina son destiladas
sobre potasa. El metanol es destilado en presencia de una pequeña
cantidad de sodio. Los disolventes para las cromatografías de
líquidos a alta presión (HPLC) son utilizados sin otras
purificaciones.
La evolución de las reacciones se ha seguido por
cromatografía en capa fina (CCM) sobre placa de sílice (Merck
60-F254) utilizando sistemas de eluyentes
apropiados. Los productos han sido revelados por irradiación UV
(\lambda = 254 nm y 366 nm) o mediante utilización de vapor de
yodo o de revelador específico como el zinzade (molibdato de
amonio) para los productos fosforilados, o del revelador de Pancaldi
que contiene un 5% de sulfato de cerio (IV), una solución acuosa de
ácido sulfúrico al 6% y un 8% de molibdato de amonio.
Los productos han sido purificados por
cromatografía flash en gel de sílice (Merck-60,
tamaño de tamiz 230-400) o bien por cromatografía
de líquidos a alta presión (HPLC) preparativa en columna de fase
inversa C18 (Macherey-Nagel polygoprep C18,
12-25 \mum, 60A) con sistemas de eluyentes
apropiados.
Los espectros RMN ^{1}H, ^{13}C y ^{31}P
han sido registrados en espectrómetros Bruker AC 200 ó AC 250. Los
desplazamientos químicos (\delta) están expresados en ppm, a
partir de tetrametilsilano para los núcleos ^{1}H y ^{13}C, y a
partir de ácido fosfórico para el núcleo ^{31}P. Los valores de
las constantes de acoplamiento están expresados en Hz. Se han
utilizado las abreviaturas siguientes: s, singulete; se, singulete
ampliado; d, doblete; t, triplete; q, cuadruplete y m,
multiplete.
Los espectros de masa (DCI) se realizan en un
espectrómetro cuadripolar Nermag R10-10.
- Los análisis elementales han sido efectuados
en un aparato Eager 200.
El
1,6-dihidroxi-2-naftaldehído
(0,21 g; 1,1 mmoles), previamente sintetizado (Jonhson W.S.J. et
Shelberg W.E., 1945, J. Am. Chem. Soc.,
67:1745-1753; Jonhson W.S.J. et al., 1944, J.
Am. Chem. Soc., 66:218-222; Bilger C. et
al., 1987, Eur. J. Med. Chem., 22:363-365), es
puesto en solución en CH_{2}Cl_{2} (34 ml). Se añade piridina
anhidra (0,1 ml; 1,24 mmoles) mantenida a 0ºC. Se añade entonces una
mezcla de yodo (0,1 g; 1,2 mmoles) y de fosfito de trietilo (0,23
ml; 1,32 mmoles) disueltos en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). Se mantiene
el conjunto en agitación a 0ºC durante 1 hora, y después se le deja
en reposo a temperatura ambiente. Se añade agua (20 ml). La fase
orgánica es lavada con salmuera (solución de agua saturada con
NaCl), y luego es secada con MgSO_{4}. Se elimina el disolvente a
presión reducida. Tras cromatografía flash (CH_{2}Cl_{2}), se
obtiene un aceite de color amarillo (0,11 g; 31%): el
1-hidroxi-2-naftaldehído-6-dietilfosfato.
Bromotrimetilsilano (0,15 ml; 1,1 mmoles) es
añadido lentamente bajo agitación a la solución de
1-hidroxi-2-naftaldehído-6-dietilfosfato
(0,054 g; 0,17 mmoles) anteriormente obtenida, en solución en
CH_{2}Cl_{2} anhidro (200 \mul) bajo atmósfera de nitrógeno.
La mezcla obtenida es agitada durante 3 horas a temperatura
ambiente. Se añade entonces Et_{2}O/H_{2}O (10:1), y la fase
orgánica obtenida es lavada con agua. El pH de la fase acuosa se
ajusta a 7,6 con sosa 1M. La solución es liofilizada para así
obtener un polvo blanco (0,050 g; 96%) de
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato
(FHN-P) en forma de sal de sodio.
^{1}H NMR (250 MHz, D_{2}O): \delta7,11
(d, ^{3}J_{H3-H4} = 8,50 Hz, 1H, H3);
7,34 (d, ^{3}J_{H7-H8} = 8,00 Hz, 1H,
H7); 7,41 (se, 1H, H5); 8,24 (d,
^{3}J_{H4-H3} = 8,50 Hz, 1H, H4); 9,84
(d, ^{3}J_{HS-H7} = 8,00 Hz, 1H, H8);
9,91 (s, 1H, CHO).
^{13}C NMR (50 MHz, D_{2}O): \delta114,73
(C2); 116,93-(C10): 118,32 (d,
^{3}J_{C-P} = 3,57 Hz, C5); 120,13 (C8);
123,36(d, ^{3}J_{C-P} = 5,00 Hz,
C7); 123,42 (C9): 126,72 (C3); 128,31 (C4); 142,35 (C1);
158,49(d, ^{2}J_{C-P} = 6,00 Hz,
C6); 1-98,32 (CHO), ^{31}P NMR (81 MHz, D_{2}O);
\delta0,56:
Espectrometría de masas (FAB): 267,
\lambda_{max}^{H}_{2}^{O} (pH 7,6): 392 nm
(\varepsilon5100 M^{-1}\cdotcm^{-1}), 277 nm
(\varepsilon4650 M^{-1}\cdotcm^{-1}).
La actividad de aldolasa ha sido medida por
medio de un sistema de ensayos enzimáticos acoplados: el sistema
triosafosfato isomerasa y
gicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(TIM/GDH) siguiendo la oxidación del NADH
(Boehringer-Mannheim, Francia), a 340 nm, por medio
de un espectrofotómetro SAFAS ajustado termostáticamente a 25ºC.
Los ensayos han sido iniciados por adición del sustrato (el
Fru(1,6)P_{2}; a una concentración final de 1 mM),
para completar una solución de aldolasa realizada en un tampón de
trietanolamina (tampón TEA) (HCl/TEA 100 mM; NaCl 50 mM; EDTA 1 mM,
pH 7,6; de fuerza iónica 0,15), NADH 0,42 mM, y que contiene los dos
sistemas enzimáticos (10 \mug/ml de GDH y 1 \mug/ml de TIM)
para un volumen final de 1 ml. La construcción, la sobreexpresión y
la purificación de la aldolasa recombinante han sido realizadas
según Morris A. J. et al., 1993, (J. Biol. Chem.,
265:1095-1100) y Berthiaume L. et al., 1993
(J. Biol. Chem., 268:10826-10835).
El grado de disociación del sustrato se
determina midiendo la disminución de la absorbancia/minuto a 340
nm. La aldolasa es dializada durante toda la noche a 4ºC contra un
tampón TEA antes de su utilización. La concentración de proteína se
determina por espectrofotometría utilizando como coeficiente de
extinción \varepsilon_{280} = 0,91 ml.mg^{-1}.cm^{-1}. La
concentración de subunidades se determina tomando como base un peso
molecular de 159.000 para un tetrámero de aldolasa.
En el caso presente, la inhibición reversible
dependiente del tiempo ("slow binding inhibition") implica la
formación rápida de un equilibrio entre la enzima E y el inhibidor
I, seguida por un complejo inicial EI que experimenta una
isomerización lenta y reversible hacia un complejo EI* cinéticamente
más estable, como se muestra en el esquema de reacción y en las
ecuaciones reaccionales que están presentes en la Figura 1, donde
K_{i}* representa la constante global de inhibición,
K_{i} la constante de disociación del complejo de
Michaelis EI, rápidamente formado, y K_{d} la constante de
disociación del complejo EI*.
En ausencia del sustrato la constante de
velocidad aparente de orden 1 (k_{app}) que describe la
formación del complejo EI* está definida por la ecuación eqn. (1)
(Figura 1) (Morrison et Walsh, 1988, Adv. Enzymol. Relat. Aeras
Mol. Biol, 61:201-300).
El valor de k_{app} refleja la cinética
de saturación cuando aumenta la concentración de inhibidor [I], y
varía entre límites inferior y superior, respectivamente, de
k_{2} y k_{2}+k_{-2}.
En equilibrio, cuando [EI*]>[EI], se utiliza
la ecuación eqn.(2) (Figura 1), donde [E]_{t} e
[I]_{t} representan las concentraciones iniciales,
respectivamente, de la enzima y del inhibidor; y K_{d} es
la constante de disociación del complejo EI* (Segal I.H., 1975,
Enzyme kinetics: Behavior and Analysis of
Steady-State and Rapid Equilibrium Enzyme Systems,
Willey-Interscience, New York).
En la situación extrema, en la que
k_{-2} tiende a cero, un inhibidor reversible dependiente
del tiempo puede parecerse a un inhibidor irreversible dirigido
contra el sitio activo. En esta situación se utiliza la ecuación
eqn.(3) para este tipo de inhibición (Meloche H.P., 1967,
Biochemistry, 6:2273-2280). El tiempo de
semiinactivación de la enzima (t_{1/2}) se define como una función
de la concentración del inhibidor recíproco y está representado
gráficamente por una recta que corta el eje de ordenadas en
ln(2/k_{2}) y corta al eje de abscisas en
-1/K_{i}.
La aldolasa nativa (subunidades 5 \muM) es
incubada en presencia de FHN-P (0,05-1 mM) en
el tampón TEA. La actividad enzimática es analizada en función del
tiempo con partes alícuotas de 10 \mul.
La cinética de inactivación sigue una cinética
de pseudoprimer orden, y los parámetros cinéticos K_{i} y
k_{2} se determinan utilizando la ecuación eqn.(3). Para
determinar el grado de reactivación, la aldolasa (subunidades 25
\muM en tampón TEA) es incubada con FHN-P 500 \muM hasta
obtener un 90% de inactivación. El exceso de inhibidor es retirado
por ultrafiltración utilizando una membrana (Millipore)
PM-30. El complejo enzima-inhibidor
es incubado en el tampón TEA (subunidades en una concentración final
15 \muM) que contiene hexitol-P_{2} (10 mM). Se toman
partes alícuotas (de 10 \mul) en distintos tiempos para medir la
actividad de aldolasa.
Los controles consisten en repetir el protocolo
sin FHN-P. El proceso de reactivación se analiza como si
fuese una reacción de orden 1.
Los espectros de absorción se miden utilizando
un espectrofotómetro Cary 1E Varian ajustado termostáticamente a
25ºC. El mismo tampón TEA se utiliza para las titraciones y los
análisis de actividad. Los espectros de absorción se miden por dos
métodos distintos que están en particular descritos en Gefflaut T.
et al., 1986 (Bioorg. Med. Chem.,
4:2043-2054) y en Blonski C. et al., 1997
(Biochem. J., 323:71-77).
Para el método A, los espectros de absorción son
registrados en función del tiempo, ya sea entre 250 y 500 nm, o
bien a longitudes de onda correspondientes a la absorción máxima o
mínima. Las mediciones son iniciadas mediante adición de
FHN-P a distintas concentraciones finales
(0,1-1 mM) en el tampón TEA que contiene una
concentración fija de aldolasa (subunidades 10 \muM). Los
espectros de absorción medidos del complejo enzimático son
corregidos con la absorbancia del tampón, de FHN-P y de la
enzima (medidas por separado). Los espectros de absorción
diferencial así obtenidos son utilizados para determinar el valor de
las constantes que definen la formación del complejo
aldolasa-inhibidor.
El método B es utilizado para la titración del
FHN-P mediante el ácido aminocaproico. Para cada análisis en
el tampón TEA que contiene una concentración fija de FHN-P
(10 \muM), se añade el ácido aminocaproico para obtener distintas
concentraciones finales (0,01-0,2M). Los espectros
de absorción diferencial, que corresponden a la formación de una
base de Schiff, son registrados en distintos intervalos de tiempo y
son después corregidos con la absorbancia del tampón, del ácido
aminocaproico y de FHN-P (medidas por separado).
La constante de velocidad aparente de orden 1
(k_{app}) y las variaciones de absorción máximas límites
(\DeltaA_{max}) son obtenidas para cada ensayo aplicando los
datos de absorción dependientes del tiempo a la ecuación cinética
de orden 1 (o al conjunto de los dos mecanismos cinéticos de orden
1). La constante de disociación (K_{d}) de la base de
Schiff formada entre el FHN-P y el ácido aminocaproico es
obtenida a partir de las diferencias de absorción determinadas en
el equilibrio utilizando la ecuación eqn.(2). El valor de la
constante de disociación (K_{i}) del complejo EI formado
rápidamente y el de la constante k_{2} que corresponde a
la formación lenta del complejo EI* provienen del análisis de los
valores de las constantes de orden 1 según las ecuaciones eqn.(1) o
eqn.(3).
Todos los ensayos de espectroscopia diferencial
UV/visible utilizando aldolasas mutantes (subunidades 10 \muM)
son llevados a cabo utilizando el método A.
Los espectros de masas por electrospray son
obtenidos en modo positivo en un cuadrípolo Finnigan Mat TSQ 700.
Las aldolasas (subunidades 50 \muM en tampón TEA) son incubadas
con FHN-P 50 \muM hasta alcanzar un 60\pm5% de
inactivación. El exceso de inhibidor es suprimido por
ultrafiltración en tampón de acetato amónico (10 mM, pH 5,5). Las
muestras se preparan a razón de aproximadamente 10 pmoles/\mul en
H_{2}O/metanol (1:1, v/v) con una concentración final 1 mM para
el acetato amónico y de un 0,5% para el ácido acético. Las muestras
son inyectadas al interior de la fuente del espectrómetro con un
caudal continuo de 4 \mul/min.
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación de la aldolasa de músculo de
conejo con el FHN-P conduce a una pérdida de la actividad
enzimática según una cinética de orden 1.
El sustrato Fru(1,6)P_{2} y el
sustrato análogo hexitol-P_{2}, que es un potente inhibidor
competitivo de las aldolasas, presentan una protección de la enzima
contra la inactivación por el FNH-P (Tabla 1) que
corresponde a una inhibición que se produce a nivel del sitio activo
de la enzima.
Las condiciones experimentales y las mediciones
efectuadas, que están indicadas en la siguiente Tabla 1, son las
siguientes: la aldolasa nativa de músculo de conejo (RM) (0,2 mg/ml)
es incubada en presencia de una concentración fija de FHN-P
(250 \muM) en el tampón TEA (volumen final de 1 ml; pH 7,6) con o
sin Fru(1,6)P_{2} o hexitol-P_{2} (1 mM);
y la actividad enzimática de las partes alícuotas es analizada tras
80 minutos de incubación.
Comparativamente, en las mismas condiciones
experimentales (descritas en la Tabla 1), el análogo no fosforilado
del FHN-P
(1,6-dihidroxi-2-naftaldehido
o DHNA, a 250 \muM) es totalmente inactivo, lo cual sugiere en
gran medida la implicación funcional del grupo fosfato en la
fijación de FHN-P al sitio activo de la enzima. Los
parámetros cinéticos se derivan de las constantes aparentes de orden
1 (k_{app}) medidas para distintas concentraciones de
inhibidor (0,01-1,5 mM) según la ecuación eqn.(3) y
están recogidos en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad enzimática es recuperada en parte
incubando las enzimas inactivadas en una solución que está exenta
de FHN-P y contiene una concentración saturante de
hexitol-P_{2} (10 mM). El valor de la constante de orden 1
(k_{-2} = 1,3\pm7,10^{-5}min^{-1}) que refleja la
recuperación de la actividad enzimática es de aproximadamente
cuatro órdenes inferiores a la constante de inactivación
k_{2}.
Así pues, el FHN-P se comporta como un
inhibidor reversible dependiente del tiempo. Según los valores que
se indican en la Tabla 2, la constante global de disociación
K_{i}* puede estimarse como de 40\pm20 nM. Por otro
lado, la actividad enzimática no puede ser restablecida tras un
tratamiento del complejo enzima-inhibidor con
borohidruro de sodio, lo cual sugiere que el mecanismo de inhibición
por FHN-P engendra la formación de una base de Schiff con un
residuo de lisina del sitio activo.
El FHN-P y el grupo
\varepsilon-amino de los residuos de lisina de la
aldolasa han sido tomados como modelo para la formación de la base
de Schiff; habiendo sido la reacción de FHN-P (10 \muM) con
el ácido aminocaproico (0,1-1 mM) como referencia
seguida por espectroscopia diferencial UV/visible. La reacción
modelo, que está representada en la Figura 3 (parte superior), se
caracteriza por cambios de absorbancia diferencial en luz
UV/visible que corresponden a dos máximos a 425 nm
(\Delta\varepsilon 3730 \pm 200 M^{-1}.cm^{-1}) y a 291
nm (\Delta\varepsilon 13080 \pm 700 M^{-1}.cm^{-1}), lo
cual puede ser atribuido a la formación de una base de Schiff. Esta
reacción modelo se caracteriza asimismo por dos mínimos a 367 nm
(\Delta\varepsilon-740 \pm 50
M^{-1}.cm^{-1}) y a 267 nm
(\Delta\varepsilon-5650 \pm 300
M^{-1}.cm^{-1}) que resultan de la pérdida de FHN-P en
el interior del complejo covalente. La presencia de puntos
isosbésticos a 388, 343 y 276 nm indica que los intermedios no se
acumulan y que ya no hay reacción secundaria. Las variaciones de
absorbancia diferencial en equilibrio devienen saturantes cuando se
aumentan las concentraciones de ácido aminocaproico (Figura 2), y
la cinética de reacción para cada una de estas concentraciones se
asemeja a la de un mecanismo reaccional de pseudoprimer orden y
corresponde a una constante de orden 2, k_{2nd} de 0,12
\pm 0,01M^{-1}.min^{-1} a 25ºC. El valor de la constante de
disociación K_{d} del complejo FHN-P-ácido
aminocaproico es de 16 \pm 3 mM (Figura 2).
Cuando el FHN-P (a una concentración
final 0,1-1 mM) es añadido a una solución que
contiene aldolasa nativa (subunidades 10 \muM), el espectro
diferencial UV/visible resultante presenta máximos a 431 y 293 nm,
mínimos a 376 y 268 nm y puntos isosbésticos a 401 y 279 nm (Figura
3, parte inferior). Las ligeras diferencias en las posiciones de
las bandas con la reacción modelo pueden ser atribuidas a
diferencias del entorno proteico de FHN-P con respecto al
sistema modelo. La evolución de los espectros diferenciales de
absorbancia coincide con dos mecanismos de orden 1 distintos. La
fase de cinética rápida se manifiesta en forma de una más importante
variación de la absorbancia y de un comportamiento saturante a
elevada concentración de inhibidor, en correlación con una pérdida
total de actividad de la enzima. Se observa asimismo una fase de
cinética lenta cuando los análisis son realizados a concentraciones
saturantes de hexitol-P_{2} (10 mM). Esta fase de cinética
lenta, que corresponde a una constante treinta veces más débil y que
contribuye a un cuarto de la variación final de absorbancia no está
ligada a la inhibición que se observa. A concentraciones saturantes,
los coeficientes de absorción molar relativos al FHN-P
ligado son calculados suponiendo que están ocupados los cuatro
sitios activos de las aldolasas: \Delta\varepsilon_{431} =
3600 \pm 200 M^{-1}.cm^{-1}; \Delta\varepsilon_{376} =
2140 \pm 110 M^{-1}.cm^{-1}; \Delta\varepsilon_{293} =
12480 \pm 650 M^{-1}.cm^{-1} y \Delta\varepsilon_{268}
= 5080 \pm 250 M^{-1}.cm^{-1}.
La estequiometría de la unión de FHN-P a
la aldolasa para una inhibición máxima es coherente con las
absorbancias moleculares diferenciales que provienen del complejo
ácido aminocaproico-FHN-P, que predice al
complejo EI* que tiene 3,9-4,2 moles de FHN-P
enlazados por mol de aldolasa tetramérica.
Los parámetros cinéticos K_{i} y
k_{2} que caracterizan la formación del complejo EI* se
determinan a partir de los datos que se exponen en la Figura 4 según
las ecuaciones eqn.(1) o eqn.(3) y conducen a los valores de
K_{i} = 125 \pm 25 \muM, k_{2} = 0,067 \pm
0,004 min^{-1} y t1/2 \sim6 min.
La constante global de inhibición
K_{i}* calculada a partir de estos últimos resultados
corresponde a 25 \pm 15 nM.
El análisis por espectrometría de masas por
electrospray de un complejo aldolasa-FHN-P ha
conducido a masas moleculares que corresponden a: un monómero de
aldolasa (39212 Da); un complejo binario entre una subunidad de
aldolasa y el FHN-P (39460 Da), en forma de base de Schiff, y
trazas de complejo terciario entre una subunidad de aldolasa y 2
moléculas de FHN-P (39712 Da) (Figura 5).
Los residuos de lisina 107, 146 y 229 están
localizados al nivel de los sitios activos de la aldolasa y son así
candidatos a realizar la inactivación por medio de la formación de
una base de Schiff con el FHN-P. Para identificar cuál
lisina es responsable de las absorbancias diferenciales en presencia
de FHN-P, han sido realizadas y denominadas mutaciones
puntuales de estos residuos de lisina: K107M (Research Collaboratory
for Structural Bioinformatics Protein Databank), K146M (Blonski C.
et al., 1997, Biochem. J. 323:71-77) y K229M
(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein
Databank). La comparación de las coordenadas atómicas de K107M, de
K229M y de la enzima nativa pone de manifiesto que estos mutantes
estructurales son isomorfos con respecto a la enzima salvaje (las
desviaciones estándar ("desviaciones rms") de las coordenadas
atómicas con respecto a la aldolasa nativa son de 0,41 \ring{A} y
de 0,48 \ring{A} respectivamente para las estructuras K107M y
K229M). Se ha utilizado la espectroscopia diferencial UV/visible
(método A) para examinar la formación del complejo enzimático para
cada mutación puntual en presencia de una concentración fija de
FHN-P (300 \muM). Se recoge en la Tabla 3 el análisis de
los datos obtenidos a 431 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los espectros diferenciales observados para el
mutante K229M son idénticos a los observados con la aldolasa
salvaje. La evolución de la reacción puede ser justificada por dos
mecanismos de orden 1 distintos. Los parámetros cinéticos y el
nivel de complejo EI* formado son idénticos a los obtenidos con la
enzima salvaje, y excluyen a la Lys-229 como
residuo de lisina directamente responsable de la formación de la
base de Schiff.
Comparativamente, los espectros diferenciales
del mutante K107M y de FHN-P presentan una fase de cinética
lenta cuya constante y cuya absorbancia máxima son idénticas a los
valores de la fase lenta observada para la enzima salvaje. La
ausencia de fase rápida añadida a la ausencia de inhibición de la
enzima demuestra la implicación de la Lys-107 en el
fenómeno de inhibición reversible dependiente del tiempo.
La reacción del mutante K146M con FHN-P
tiene como resultado un cambio global de absorbancia en equilibrio
que es comparable con la que se observa para la aldolasa salvaje
(Tabla 3). La fase de la cinética asociada a la inhibición
enzimática, si bien corresponde a un mecanismo de orden 1, se
diferencia de lo que se observa en el caso de la aldolasa salvaje
en una formación muy lenta de la base de Schiff. Así pues, la
sustitución de la Lys-147 por una metionina engendra
un significativo descenso de la proporción de complejos EI*
formados, pero no varía la capacidad del mutante para formar el
complejo. Así, la Lys-146 no es requerida para la
formación de la base de Schiff, pero la facilita
considerablemente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (16)
1. Compuesto aromático que comprende un grupo
aldehído, un grupo fenol y un grupo fosfato o un grupo mimético del
grupo fosfato, caracterizado:
- porque su núcleo aromático comprende dos
anillos aromáticos de tipo bencénico,
- y porque responde a la fórmula general
siguiente:
en la
cual:
\bullet el grupo aldehído (-CHO) y el grupo
fenol (-OH) están fijados a dos átomos de carbono adyacentes de un
mismo anillo aromático llamado primer anillo aromático,
\bullet y está fijado a un átomo de carbono de
un segundo anillo aromático llamado segundo anillo aromático, R un
grupo fosfato o un grupo mimético del grupo fosfato de fórmula
general;
\vskip1.000000\baselineskip
en el
cual:
- X es elegido de entre el grupo formado de un
átomo de oxígeno de
-CH_{2}-, -CHF- y -CF_{2}-,
- R' es elegido de entre el grupo formado del
átomo de hidrógeno y de los sustituyentes (IV), (V), (VII), (VIII),
(IX), (X) y (XII).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto aromático según la reivindicación
1, caracterizado porque tiene como fórmula general;
\bullet donde R_{1} es un grupo
de fórmula
general;
en la
cual:
- X es elegido de entre el grupo formado de un
átomo de oxígeno,
-CH_{2}-, -CHF- y -CF_{2}-,
- R'' es elegido de entre el grupo formado del
átomo de hidrógeno y los sustituyentes (IV), (V), (VII), (VIII),
(IX), (X) y (XII).
3. Compuesto aromático según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque un átomo de
hidrógeno de al menos uno de los átomos de carbono de al menos uno
de los anillos aromáticos está sustituido por un sustituyente
llamado sustituyente hidrofóbico, que está adaptado para mejorar la
hidrofobicidad global del compuesto aromático.
4. Compuesto aromático según la reivindicación
3, caracterizado porque el (los) sustituyente(s)
hidrofóbico(s) es (son) un grupo (grupos) alquilo de cadena
principal que comprende como máximo tres átomos de carbono.
5. Compuesto aromático según una de las
reivindicaciones 1 a 4, para su uso no terapéutico como agente
inhibidor de la actividad de las aldolasas de clase I.
6. Compuesto aromático según la reivindicación
5, caracterizado porque presenta una constante de inhibición
K_{i} inferior a 25 \muM, en particular inferior a 50 nM,
y típicamente del orden de 25 nM.
7. Compuesto aromático según la reivindicación
5, caracterizado porque es susceptible de inhibir al menos
una aldolasa de manera irreversible o cuasi irreversible.
8. Procedimiento de inhibición de aldolasas
extracelulares o intracelulares, con la excepción de las aldolasas
intracelulares de células vivientes no aisladas de un cuerpo humano
o animal o de un embrión humano, caracterizado porque se
pone dichas aldolasas en contacto con al menos un compuesto
aromático según una de las reivindicaciones 1 a 7, al menos en
cantidad suficiente para inducir un efecto notable.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
aplicado a la inhibición de la glicólisis celular.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó
9, aplicado para cortar el desarrollo de una célula cancerosa.
11. Medicamento que comprende un compuesto
aromático según una de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Uso de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento del cáncer.
13. Uso según la reivindicación 12 para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer que se
efectúa según el enfoque GRH.
14. Procedimiento de síntesis de un compuesto
1-hidroxi-2-naftaldehído
fosforilado sobre un átomo de carbono del segundo anillo aromático,
según la reivindicación 1, en el cual se realiza una etapa de
fosforilación de un compuesto 2-naftaldehído
dihidroxilado, hidroxilado sobre el átomo de carbono 1 del primer
anillo aromático y sobre uno de los átomos de carbono del segundo
anillo aromático, correspondiendo dicha fosforilación a una
sustitución del grupo hidroxilo del segundo anillo aromático por un
grupo fosfato.
15. Procedimiento de síntesis según la
reivindicación 14, caracterizado porque la fosforilación es
iniciada mediante la técnica del fosfito de trietilo, piridina y
yodo en una solución de CH_{2}Cl_{2}/THF.
16. Procedimiento de síntesis según las
reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque se efectúa
sobre el
1,6-dihidroxi-2-naftaldehído
para conducir a la obtención del
5-formil-6-hidroxi-2-naftilfosfato.
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