ES2309191T3 - Fijacion de nitrogeno endosimbiotica no nodular sistemica en plantas. - Google Patents
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Abstract
Una planta no leguminosa o leguminosa que contiene bacterias que fijan el nitrógeno, Acetobacter diazotrophicus (sin. Gluconacetobacter diazotrophicus), dichas bacterias estando localizadas intracelularmente en las células vivas de la planta y proporcionando nitrógeno fijado a dicha planta.
Description
Fijación de nitrógeno endosimbiótica no nodular
sistémica en plantas.
Esta invención se refiere a la fijación de
nitrógeno y en particular, pero no exclusivamente, a la fijación de
nitrógeno en plantas no leguminosas y leguminosas, y a un método de
establecimiento de la fijación de nitrógeno en plantas no
leguminosas y leguminosas.
Aunque el gas nitrógeno (N_{2}) constituye el
78% de la atmósfera, no está disponible para ser usado por las
plantas y la mayoría de los otros organismos porque hay un enlace
triple entre los dos átomos de nitrógeno, que hace la molécula casi
inerte. Para que el gas nitrógeno sea usado para el crecimiento
primero debe ser fijado (es decir, reducido por hidrógeno a
amoniaco) y estar disponible en la forma combinada de amonio
(NH_{4}^{+}) o nitrato (NO_{3}^{-}); ciertos tipos de
bacterias pueden realizar esta fijación biológica del nitrógeno
reduciendo el nitrógeno gaseoso a amoniaco (NH_{3}) utilizando
enzimáticamente la enzima nitrogenasa. La disponibilidad de
nitrógeno fijado es a menudo el factor limitante para el crecimiento
vegetal y la producción de biomasa en ambientes donde existe un
clima adecuado y disponibilidad de agua para soportar la vida.
Químicamente la mayoría del amoniaco es
producido de forma industrial mediante el proceso de
Haber-Bosch combinando catalíticamente el nitrógeno
atmosférico con hidrógeno para formar amoniaco, usando un
catalizador a base de hierro a alta temperatura y presión muy
elevada. Una cantidad relativamente muy pequeña de amoniaco es
producida como resultado de descargas eléctricas en la
atmósfera.
La demanda de mayor rendimiento de los cultivos
en el Siglo XX y en este siglo ha requerido que la fijación
biológica de nitrógeno por bacterias sea sustituida cada vez más por
el uso de nitrógeno fijado a partir de fertilizantes químicos.
La fijación biológica de nitrógeno puede ser
representada por la siguiente ecuación, en la cual dos moléculas de
amoniaco son producidas a partir de una molécula de gas nitrógeno, a
expensas de 16 moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) y un
suministro de electrones y protones (iones de hidrógeno):
N_{2} +
8H^{+} + 8e + 16ATP => 2NH_{3} + H_{2} + 16 ADP + 16
Pi
Esta reacción es realizada en bacterias, usando
un complejo de enzima llamada nitrogenasa. Esta enzima consiste en
dos proteínas - una proteína de hierro (Fe) y una proteína de
Molibdeno-Hierro (Mo-Fe).
La reacción ocurre mientras el N_{2} es
enlazado al complejo de la enzima nitrogenasa. La proteína de Fe es
reducida primero por electrones donados por la ferredoxina. Luego la
proteína de Fe reducida se enlaza al ATP y reduce la proteína
Mo-Fe, que dona electrones al N_{2}, produciendo
HN = NH. En dos ciclos más de este proceso (cada uno requi-
riendo electrones donados por la ferredoxina) HN = NH es reducido a H_{2}N-NH_{2} y este a su vez es reducido a 2NH_{3}.
riendo electrones donados por la ferredoxina) HN = NH es reducido a H_{2}N-NH_{2} y este a su vez es reducido a 2NH_{3}.
En dependencia del tipo de bacteria, la
ferredoxina reducida que suministra los electrones para este proceso
es generada mediante fotosíntesis, respiración o fermentación.
Los ejemplos más familiares de simbiosis de
fijación de nitrógeno entre plantas y bacterias rizobiales son los
nódulos de la raíz de las legumbres (guisantes, frijoles, trébol y
similares). En estas simbiosis los rizobios "invaden" la
planta a través de los pelos de la raíz o de sitios de entrada de
grieta (es decir, intercelularmente entre las células epidérmicas)
y provocan la formación de un nódulo que induce la proliferación
localizada de las células hospederas de la planta. Posteriormente,
los rizobios invaden las células del nódulo penetrando la pared
celular y siendo engullido por invaginaciones de la membrana
plasmática (endocitosis). Como consecuencia dentro de las células
del nódulo los rizobios son encerrados en vesículas (pequeñas
vacuolas) unidas a la membrana en las cuales fijan el nitrógeno,
utilizando productos de la fotosíntesis de la planta como carbono y
fuentes de energía, y suministran nitrógeno fijado biológicamente a
la planta para el crecimiento y desarrollo (endosimbiosis). El
microsimbión bacteriano es intracelular, pero es siempre
extra-citoplasmático debido a la integridad de la
membrana circundante.
Cultivos no legumbres, entre los que se incluyen
los principales cereales del mundo por ejemplo trigo, maíz y arroz,
no forman nódulos y son dependientes del nitrógeno fijado a partir
del suelo para su nutrición, o de fertilizantes
químicos/nitrogenados.
Sin embargo, los problemas energéticos y
ambientales surgidos por el uso excesivo de fertilizantes
nitrogenados han resaltado una necesidad de que los cultivos no
leguminosos obtengan más de su nitrógeno del aire mediante fijación
biológica de nitrógeno.
Es conocido que una interacción de fijación de
nitrógeno intercelular, sistémica, endofítica con Acetobacter
diazotrophicus y Herbaspirillum spp., sin la necesidad de
nodulación, ocurre de manera natural en variedades brasileñas de la
caña de azúcar. La caña de azúcar es un miembro de la familia
herbácea, Gramineae, que también incluye los cereales. Esta
relación de fijación de nitrógeno no nodular, intercelular,
endofítica también puede ser posible en arroz, trigo, maíz y en
otros cultivos no leguminosos.
También es conocido de varios trabajos
científicos publicados, evaluados por expertos, en el arte que no
existe evidencia de que la fijación endofítica de nitrógeno entre
las bacterias diazotróficas y la planta hospedera ocurre
intracelularmente en células vivas. Por ejemplo, en Biological
Nitrogen fixation for the 21st Century páginas
685-692 se declara que no existe evidencia de la
presencia de bacterias diazotróficas endofíticas dentro de las
células vivas. James en "Field Crops Research 2000 páginas
197-209" describe que "diazotróficas
endofíticas han sido observadas solo dentro de espacios
intercelulares, tejido vascular, aerenchyma y células
muertas de sus hospederas y no en células vivas". Egener y
otros., en "MPMI Vol. 12 (1999) páginas
813-819" también describen que no existe
evidencia de bacterias diazotróficas endofíticas dentro de las
células vivas de la planta.
La presente invención tiene como objetivo
proporcionar plantas no leguminosas y leguminosas, incluyendo
legumbres que no nodulan con rizobios, con bacterias que les
permiten fijar el nitrógeno endofíticamente, resolviendo así muchos
de los problemas asociados al uso de los fertilizantes
químicos/nitrogenados.
En correspondencia, la presente invención, en un
primer aspecto, proporciona una planta no leguminosa o leguminosa,
que contiene bacterias que fijan el nitrógeno, Acetobacter
diazotrophicus (sin, Gluconacetobacter diazotro-
phicus), dichas bacterias estando localizadas intracelularmente
en las células vivas de la planta y proporcionando el nitrógeno
fijado a dicha planta.
De acuerdo con el segundo aspecto, la presente
invención proporciona además un método para inocular a una planta
no leguminosa o leguminosa con bacterias que fijan el nitrógeno,
Acetobacter diazotrophicus (sin. Gluconacetobacter
diazotrophicus), situadas intracelularmente en las células
vivas de la planta y proporcionando el nitrógeno fijado a dicha
planta el cual comprende la inoculación de dicha planta con entre 1
y 100 de dichas bacterias por mililitro del inóculo cuando ocurre la
germinación de dicha planta o hasta siete días después de la
misma.
La planta no leguminosa es seleccionada
preferiblemente de la familia herbácea Gramineae (incluye arroz
[Oryza sativa], trigo [Triticum aestivum] y maíz
[Zea mays]). La planta no leguminosa también puede ser
seleccionada de familias tales como: Solanaceae (incluye tomate,
patata y tabaco), Brassicaceae/Cruciferae (incluye coles, nabos,
colza y la planta modelo Arabidopsis thaliana), Malvaceae
(incluye algodón), Compositae/Asteraceae (incluye girasol y
lechuga), Euphorbiaceae (incluye yuca), Chenopodiaceae (incluye
remolacha de azúcar). La planta leguminosa es seleccionada
preferiblemente de Leguminosae (incluye soja, trébol, alfalfa,
guisantes y otros frijoles).
La planta no leguminosa, o la planta leguminosa,
puede ser inoculada con entre 1 a 1x10^{7} bacterias por
mililitro de inóculo. La planta no leguminosa o la planta leguminosa
es inoculada preferiblemente con entre 1 a 100 bacterias por
mililitro de inóculo.
La planta no leguminosa, o la planta leguminosa,
es preferiblemente inoculada con 1-10 bacterias por
mililitro de inóculo. La planta no leguminosa, o leguminosa, es más
preferiblemente inoculada con 1-2 bacterias por
mililitro de inóculo. Idealmente la planta no leguminosa, o
leguminosa, es lo más preferiblemente inoculada con una bacteria
por mililitro de inóculo.
La planta no leguminosa, o leguminosa, es
inoculada preferiblemente cuando ocurre la germinación o hasta
alrededor de siete días después de la misma.
Hemos descubierto que usando una concentración
muy baja de bacterias en el inóculo podemos obtener plantas que son
más sanas que aquellas inoculadas con concentraciones más elevadas
de bacterias. También hemos descubierto que la Acetobacter
diazotrophicus secreta grandes cantidades de ácido indolacético
(IAA), una hormona de crecimiento vegetal. Es conocido que la
respuesta de varias especies de plantas al IAA externo (liberado de
forma microbiana) puede variar de efectos beneficiosos a nocivos,
dependiendo de la concentración de IAA en la raíz de la planta. En
general, cuando el IAA está presente en concentraciones más elevadas
que las que serían encontradas normalmente en una planta, la
concentración aumentada de IAA inhibe el crecimiento, y altera el
fenotipo de la planta. También, en concentraciones bajas el IAA (u
otras sustancias de crecimiento vegetal) secretado por bacterias
puede estar actuando como una molécula señalizadora bacteriana de la
planta (y otras sustancias de crecimiento vegetal) para el
establecimiento endofítico intracelular de Acetobacter
diazotrophicus.
Las bacterias que fijan el nitrógeno pueden
fijar nitrógeno en presencia de hasta 10% de oxígeno.
Preferiblemente las bacterias fijan nitrógeno en presencia de entre
2% y 7% de oxígeno.
Las bacterias que fijan el nitrógeno son
intracelulares. Las bacterias intracelulares que fijan el nitrógeno
están más preferiblemente presentes en vesículas unidas a la
membrana y vacuolas dentro del citoplasma de la célula de la
planta.
Las bacterias que fijan el nitrógeno son
encontradas preferiblemente en colonias en vesículas y vacuolas.
Las colonias están localizadas preferiblemente
en estructuras que tienen configuración poliédrica. Lo más
preferiblemente las estructuras son substancialmente
romboidales.
Estas estructuras son cápsulas de levana, un
polímero de oligo-fructosida de
\beta-D-fructosa secretado por
A. diazotrophicus.
Es un resultado sorpresivo e inesperado que la
presente invención proporcione una simbiosis intracelular sistémica,
no nodular, entre las bacterias que fijan el nitrógeno y una planta
no leguminosa, dichas bacterias estando localizadas dentro de las
células vivas de la planta. Esto no había sido observado antes. Como
fue mencionado previamente, es conocido que en otras simbiosis
entre las bacterias que fijan el nitrógeno y otras plantas no
leguminosas, por ejemplo, caña de azúcar, las bacterias existen en
los espacios intercelulares entre las células (el apoplasto) y
dentro de las células muertas de la xilema.
También es un resultado sorpresivo e inesperado
que la presente invención proporcione una simbiosis intracelular
sistémica, no nodular similar entre bacterias que fijan el nitrógeno
y una planta leguminosa, o no leguminosa, dichas bacterias estando
localizadas dentro de las células vivas de la planta. Esto no ha
sido observado antes.
Otro resultado sorpresivo e inesperado es que
las bacterias que fijan el nitrógeno, están situadas
intracelularmente en células vivas dentro de vesículas y vacuolas
en el citoplasma tanto en una planta no leguminosa como en una
planta leguminosa.
Las bacterias pueden propagarse de una célula de
la planta a otra célula de la planta mediante división de las
células de la planta en el meristemo y divisiones subsiguientes de
las mismas.
Las bacterias pueden convertirse en sistémicas
al moverse a través de la xilema. Alternativamente pueden
convertirse en sistémicas mediante división de las células de la
planta y divisiones subsiguientes de las mismas. Las bacterias
pueden convertirse en sistémicas mediante combinaciones de lo
anterior.
En correspondencia, la presente invención
proporciona además, en un tercer aspecto, un método para producir
una planta leguminosa o no leguminosa que contiene bacterias que
fijan el nitrógeno, en el cual dichas bacterias han sido
introducidas por inoculación de entre 1 y 100 bacterias por
mililitro de inóculo cuando ocurre la germinación de dicha planta o
hasta siete días después de la misma, y se han convertido en
sistémicas mediante división de las células de la planta y
divisiones subsiguientes de las mismas, dichas bacterias siendo
Acetobacter diazotrophicus (sin. Gluconacetobacter
diazotrophicus) y estando localizadas intracelularmente en
células vivas de la
planta.
planta.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención será descrita ahora,
simplemente a modo de ejemplo, haciendo referencia a las Figuras
acompañantes, de las cuales:
Las Figuras 1 a la 13 se refieren a la presente
invención en una planta no leguminosa de (Lycopersicon
esculentum; tomate).
- La Figura 1A y B muestran A. diazotrophicus UAP 5541/pRGS561 GUS invadiendo el meristemo y los pelos de la raíz (A) y las células del meristemo (B) de raíces laterales de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum (A) y 5 \mum (B).
- La Figura 1C y D muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGS561 GUS en vesículas y vacuolas en secciones finas de células del meristemo de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum (C y D).
- La Figura 2A muestra colonias de A. diazotrophicus UAP554l/pRGS561 GUS en la xilema de raíces laterales en una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 2B muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGS56l GUS en células de la corteza cerca de la xilema invadida en una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 2C muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGS56l GUS en la xilema de una raíz primaria en una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 3A muestra la invasión de A. diazotrophicus UAP5541/pRGS561 GUS de una raíz lateral secundaria emergente de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 3B muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGS561 GUS invadiendo una raíz lateral secundaria emergente a través de un sitio de entrada de grieta en una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum.
- La Figura 4A y B muestra la colonización de A. diazotrophicus UAP 5541/pRGS56l GUS de la corteza y la xilema en la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum (A y B).
- La Figura 4C muestra la colonización de A. diazotrophicus UAP5541/pRGS561 GUS desde la xilema hasta las células del floema y la corteza de una raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 4D muestra colonias de A. diazotrophicus UAP5541/pRGS561 GUS dentro de una célula de la corteza de una raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 5 muestra la colonización de A. diazotrophicus UAP5541/pRGS561 GUS propagándose de la xilema hasta el floema en el tallo de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 6 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la punta de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención (iluminación del campo oscuro) Bar = 50 \mum.
- La Figura 7 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) colonizando una raíz lateral secundaria emergente de una planta de acuerdo con la presente invención, (iluminación del campo oscuro) Bar = 50 \mum.
- La Figura 8A muestra colonias de A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el meristemo de una raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum.
- La Figura 8B muestra colonias de A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en las células del meristemo de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 9 muestra colonias uniformemente romboidales tipo cristalino de A. diazotrophicus UAP5541/ pRGH562 (NifH-GUSA) en las células de la corteza de la raíz en una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 10 muestra colonias de A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el sistema vascular de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. (Iluminación de la imagen oscura) Bar = 50 \mum.
- La Figura 11 muestra colonias de A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la xilema y la corteza de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 12 muestra la propagación de A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) desde la xilema hasta la región del floema en el tallo de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 13 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el cloroplasto que contiene células en el tallo de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 14 a 19 se refieren a la presente
invención en una planta leguminosa (Trifolium repens,
trébol
blanco).
blanco).
- La Figura 14 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el sistema vascular y en células de la corteza de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum.
- La Figura 15 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la xilema y la región del floema de la raíz de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 16 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el sistema vascular de la hoja de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 17 muestra A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la xilema de una vena de la hoja de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
- La Figura 18 muestra la propagación de A. diazotrophicus UAP 5541/pRGH562 (NifH-GUSA) desde la xilema hasta el mesofilo (cloroplasto que contiene células) de la hoja de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum.
- La Figura 19 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en el cloroplasto que contiene células del mesofilo de una hoja de una planta de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 20 a la 22 se refieren a la presente
invención en el trigo cereal (triticum aestivum).
- La Figura 20 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) invadiendo célulasde la corteza joven de la raíz de una raíz lateral de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
- La Figura 21 muestra con gran amplificación colonias de A. diazotrophicus, como en la Figura 20, en una célula cortical de la raíz lateral. Bar = 5 \mum
- La Figura 22 muestra una agrupación de colonias de A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la vacuola de una célula epidérmica de la hoja, después del tratamiento con etanol para quitar la clorofila de la hoja. Bar = 5 \mum
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 23 a 25 se refieren a la presente
invención en la colza (Brassica napus).
- La Figura 23 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la xilema del tallo de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
- La Figura 24 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en la xilema del tallo de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum
- La Figura 25 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en cloroplasto que contiene células del tallo de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 26 y 27 se refieren a la presente
invención en el arroz cereal (Oryza sativa).
- La Figura 26 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) invadiendo una célula de la corteza de la raíz del arroz varias células por debajo de la epidermis de la raíz joven de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
- La Figura 27 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) invadiendo células de la corteza de una raíz madura de arroz de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 28 y 29 se refieren a la presente
invención en Arabidopsis no legumbre (Arabidopsis
thaliana).
- La Figura 28 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) invadiendo las células del meristemo de una raíz lateral de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum
- La Figura 29 muestra A. diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) invadiendo células de una raíz lateral de una planta inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
- La Figura 30 muestra colonias de A. diazotrophicus dentro de la vacuola de una célula viva de la corteza de la raíz del trébol inoculada de acuerdo con la presente invención. Bar = 25 \mum
- La Figura 31.A muestra colonias de A. diazotrophicus con gran ampliación dentro de la vacuola de una célula viva de la corteza de la raíz del trébol. La inoculación fue de acuerdo con la presente invención. Bar = 5 \mum
- La Figura 31.B muestra otra región de la corteza de la raíz del trébol que muestra numerosas colonias de A. diazotrophicus dentro de la vacuola de una célula viva. Bar = 5 \mum
- La Figura 32 muestra un cristal grande (cristalizado a partir del agua) de Levana (Sigma L8674). Bar = 5 \mum
\vskip1.000000\baselineskip
Lycopersicon esculentum var. semillas de
Ailsa Craig, Trifolium repens var. semillas de Kent,
Triticum aestivum var. semillas de Hereford, Brassica
napus var. semillas de Express, Oryza sativa var.
semillas de Lemont y Arabidopsis thaliana var. semillas de
Col-O tipo ecológico fueron superficialmente
esterilizadas en una solución de hipoclorito 15% (v/v) (Domestos)
durante quince minutos.
La solución de hipoclorito fue drenada usando un
tamiz estéril y las semillas fueron enjuagadas a continuación seis
veces con agua desionizada estéril.
Las semillas fueron colocadas en un frasco
cónico estéril de 250 ml que contenía 15 ml de agua desionizada
estéril. Luego el frasco fue colocado en un agitador a
24-26ºC en la obscuridad y las semillas fueron
dejadas impregnar durante tres a cuatro días.
Luego las semillas fueron colocadas en la
superficie de agar estéril individualmente en jarras (175 ml de
capacidad conteniendo 50 ml de medio de Murashige y Skoog (Sigma
M5519) 0.8% p/v de agar y 3% p/v de sacarosa) usando fórceps
estériles.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Plántulas fueron cultivadas durante seis a siete
días en las siguientes condiciones:
Luz diurna artificial fue proporcionada mediante
tubos fluorescentes "daylight" 250 \muEm^{-2}S^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos cepas de Acetobacter diazotrophicus
fueron utilizadas:
- \quad
- A. diazotrophicus UAP 5541/p RGS561 (GUS)
- \quad
- A. diazotrophicus UAP 5541/p RGH562 (NifH-GUSA)
Acetobacter diazotrophicus fue rayada
sobre tres placas Petri de 9 cm de diámetro de medio ATGUS
conteniendo 45 \mug/ml de estreptomicina e incubada durante
cuatro a seis días a 28ºC.
Las bacterias fueron raspadas de la placa,
usando un bucle estéril y transferidas a frascos cónicos estériles
de 250 ml conteniendo 50 ml de agua desionizada estéril. Fue
preparada una suspensión bacteriana que tenía una densidad óptica
de 0.5-0.6 a una longitud de onda de 600 nm (5 x
10^{8} bacterias/ml). La suspensión fue diluida 10^{-9} (es
decir, aproximadamente 1 bacteria/ml).
1 ml de la suspensión bacteriana diluida
10^{-9} fue agregado a la base de cada planta, después de la
germinación de dicha planta después de seis a siete días de
crecimiento en jarras.
A la base de una planta de control, fue agregado
1 ml de agua desionizada estéril.
Todas las plantas fueron cultivadas durante doce
a veinte días más.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas fueron retiradas del agar. El exceso
de agar fue eliminado secando con toallas de papel. Luego las
plantas fueron coloreadas de manera histoquímica para la actividad
bacteriana de GUS; el gen GUS codifica la enzima
\beta-glucoronidasa, que hidroliza
X-gluc (sal de amonio de ciclohexil
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucoronida;
Gold Biotech, EE.UU.) para formar un compuesto de color azul
índigo.
Dos controles fueron establecidos para
garantizar que la reacción de coloración de GUS estaba funcionando,
el primero usando una muestra de bacterias tomadas del borde de una
placa de agar al 8% p/v Murashige y Skoog y el segundo fue una
muestra de bacterias cultivadas en medio de ATGUS.
\vskip1.000000\baselineskip
Plantas retiradas previamente del agar fueron
colocadas en un recipiente de manera que es necesaria una cantidad
mínima de solución colorante. La solución colorante que contiene
X-gluc fue agregada a dicho recipiente, sumergiendo
dichas plantas y almacenada en la obscuridad durante la noche a 37ºC
en condiciones de vacío.
Las plantas fueron lavadas tres veces con 0.1 ml
de solución tampón de fosfato de pH 7.0, y fijado con 2% (v/v)
glutaraldehído en 0.1 M de solución tampón de fosfato pH 7.0.
Posteriormente fue observada la coloración de las plantas mediante
examen microscópico con luz directa. Las plantas fueron
deshidratadas en una serie de etanol e incrustadas en LR White
Resin. Secciones de planta de 1 \mum fueron preparadas para la
observación.
Plantas inoculadas con Acetobacter
diazotrophicus UAP5541/pRGS561 (expresando constitutivamente
GUS) fueron evaluadas en cuanto a la colonización endofítica 12 a
20 días después de la inoculación. Plantas coloreadas
histoquímicamente fueron examinadas para detectar bacterias
Acetobacter diazotrophicus precipitadas coloreadas en azul
índigo mediante observación microscópica directa de plantas fijadas
con glutaraldehído. Para los propósitos de esta especificación las
bacterias coloreadas histoquímicamente son indicadas por puntos
negros.
\newpage
Fue demostrado por los resultados del análisis
microscópico que la Acetobacter diazotrophicus inoculada en
una concentración inicial de 1 bacteria/ml había invadido la región
meristémica de raíces laterales a través de la punta de la raíz
(Figura 1A + B) incluyendo las células meristémicas y convirtiéndose
en establecidas en vesículas (y luego en vacuolas grandes) en el
citoplasma de las células del meristemo, (Figura 1C + D). Las
bacterias son indicadas como puntos negros.
También fue observado que la Acetobacter
diazotrophicus había invadido la xilema (Figura 2A) de las
raíces laterales formando colonias (indicadas por puntos negros) y
también habían invadido las células de la corteza de la raíz cerca
de la xilema invadida (Figura 2B). La xilema de raíces primarias
también fue invadida por la Acetobacter diazotrophicus
(Figura 2C).
También fue observada la invasión de las raíces
laterales secundarias emergentes (Figura 3A) por la entrada de la
grieta (Fig. 3B) en la región de emergencia. También ocurrió
colonización extensa de células de la corteza (Figuras 4A y 4B).
Esto es probablemente por la propagación de las bacterias (que son
altamente movibles y conocidas por secretar enzimas que degradan la
pared celular de la planta, por ejemplo, celulasas y pectinasas) de
elementos de la xilema joven en células vecinas, incluyendo el
floema (Fig. 4C). La Figura 4D muestra una célula de corteza grande
de la raíz de la planta colonizada por la Acetobacter
diazotrophicus (mostrada como puntos negros).
Fue realizado otro análisis en plantas de tomate
inoculadas con Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) en el cual la expresión del gen
\beta-glucuronidasa (GUS) está bajo el control de
un promotor NifH. Por consiguiente, las bacterias solo
mancharán azul en el análisis histoquímico si están siendo
expresados genes de nitrogenasa. La coloración de Acetobacter
diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA)
mostrada en las Figuras 6 a 13, fue comparable con la coloración de
GUS expresada constitutivamente en Acetobacter diazotrophicus
UAP5541/pRGH561 (Figuras 1 a 5). Las bacterias en estas figuras
son indicadas por puntos negros.
La Figura 6 muestra una punta de raíz de la
planta inoculada en una concentración inicial de 1 bacteria/ml. La
bacteria puede ser vista como una mancha negra en la punta de la
raíz. Las bacterias también invadieron las raíces laterales
emergentes (Figura 7). La Figura 8A muestra bacterias colonizando
las células del meristemo de una raíz y la Fig. 8B es una imagen de
inmersión en aceite que muestra bacterias coloreadas en negro dentro
de las células del meristemo. La Figura 9 muestra, usando un lente
objetivo de inmersión en aceite, células de la corteza de una raíz
de la planta. Las bacterias (mostradas en negro) son vistas dentro
de células de la corteza de la raíz. Es interesante observar que
las bacterias forman colonias con forma romboidal uniforme. Estas
colonias son paquetes de bacterias probablemente impregnadas en el
polímero incoloro de oligofructosida, levana. Es conocido que la
Acetobacter diazotrophicus produce levana la cual podría
actuar para promover la agregación de bacterias dentro de estos
grupos tipo cristalinos y proporcionar así protección de oxígeno de
su nitrogenasa. La Figura 10 muestra las bacterias en el sistema
vascular de la raíz y la Fig. 11 muestra bacterias en la xilema y
células de la corteza de la raíz. Las bacterias también fueron
encontradas en el sistema vascular del tallo como es mostrado en la
Fig. 12 que también muestra la propagación de bacterias desde la
xilema hasta la región del floema en el tallo de la planta.
La Acetobacter diazotrophicus también fue
vista en el cloroplasto que contenía las células (Figura 13) en el
tallo de la planta.
Las Figuras 14 a 19 muestran análisis en las
plantas de trébol de legumbre inoculadas con Acetobacter
diazotro- phicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) en el cual la expresión del gen
\beta-glucoronidasa (GUS) está bajo el control de
un promotor NifH. Por lo tanto, las bacterias solo mancharán
de azul en el análisis histoquímico si están siendo expresados
genes de nitrogenasa. La invasión intracelular de células vivas, la
colonización sistémica de la planta y la coloración de
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) como es mostrado en las Figuras 14 a
la 19 fueron comparables a lo mostrado en las plantas de tomate, no
legumbres, Figura 6 a Figura 13, inoculadas de manera similar con
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) en una concentración inicial de 1
bacteria/ml. La invasión sistémica de las hojas fue muy evidente
(Figura 16 a Figura 19). Las bacterias en las figuras anteriores
son indicadas por puntos negros.
Las Figuras 20, 21 y 22 muestran el análisis de
las plantas de trigo cereal inoculadas con Acetobacter
dia-zotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) en el cual la expresión del gen
\beta-glucuronidasa (GUS) está bajo el
control de un promotor NifH. Por lo tanto, las bacterias
colorearán de azul en el análisis histoquímico solo si están siendo
expresados genes de nitrogenasa. La invasión intracelular de células
vivas, la colonización sistémica de la planta y la coloración de
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) como es mostrado en las Figuras 20 a
la 22 fueron comparables a lo mostrado en el tomate no legumbre
(Figuras 6 a 13) y las plantas de trébol legumbre (Figuras 14 a la
19) inoculadas de manera similar con Acetobacter
diazotrophicus
UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en una concentración inicial de 1 bacteria/ml. La invasión sistémica de las células epidérmicas de las hojas fue muy evidente (Fig. 22). Las bacterias en las figuras anteriores son indicadas por puntos
negros.
UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) en una concentración inicial de 1 bacteria/ml. La invasión sistémica de las células epidérmicas de las hojas fue muy evidente (Fig. 22). Las bacterias en las figuras anteriores son indicadas por puntos
negros.
Las Figuras 23, 24 y 25 muestran el análisis en
plantas de colza inoculadas de manera similar con Acetobacter
diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA). La
invasión intracelular de células vivas, la colonización sistémica
de la planta y la coloración de Acetobacter diazotrophicus
UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) fueron comparables
con lo observado en el tomate, trébol y trigo inoculados de manera
similar.
Las Figuras 26 y 27 muestran el análisis del
arroz cereal (Oryza sativa) inoculado de manera similar con
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA). La invasión intracelular de células
vivas, la colonización sistémica de la planta y la coloración de
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) fueron comparables a lo observado en
las plantas de tomate, trébol, trigo y colza inoculadas de manera
similar.
Las Figuras 28 y 29 muestran el análisis de la
planta modelo Arabidopsis thaliana inoculada con
Acetobacter diazotrophicus UAP5541/pRGH562
(NifH-GUSA) de acuerdo con la presente invención.
La invasión intracelular de la célula viva, la colonización
sistémica de la planta y la coloración de Acetobacter
diazotrophicus UAP5541/pRGH562 (NifH-GUSA) fueron
comparables con lo observado en las plantas de tomate, trébol,
trigo, colza y arroz cereal inoculados de manera similar.
\vskip1.000000\baselineskip
El Rojo Neutral (Índice Merck No. 6571) es un
color biológico que no es tóxico. Las células de la planta aún son
viables después de coloreadas con 0.01% P/V de Rojo Neutral en agua.
Plantas inoculadas con Acetobacter diazotrophicus de acuerdo
con la presente invención fueron colocadas en una solución de rojo
neutral (0.9% P/V en agua) durante 30 minutos. Luego las plantas
fueron lavadas y preparadas para observación microscópica.
Las Figuras 30, 31A y 31B muestran el análisis
de Acetobacter diazotrophicus en células vivas de trébol.
Este análisis fue realizado para garantizar que las bacterias de
Acetobacter diazotrophicus inoculadas al trébol de acuerdo con
la presente invención estaban realmente presentes intracelularmente
en las células vivas. Para este propósito fue utilizado rojo
neutral. A pH bajo (un pH menor de 7.0) los compartimientos
celulares que son ácidos se colorearon de rojo. A pH más alto (un pH
sobre 7.0) el rojo neutral es presentado como una mancha amarilla.
Las Figuras 30 y 31A muestran colonias (puntos negros) de
Acetobacter diazotrophicus dentro de una vacuola de una célula
viva de la corteza de la raíz de trébol inoculada de acuerdo con la
presente invención. La Figura 31B muestra otra región de la corteza
de la raíz de trébol con Acetobacter diazotrophicus (puntos
negros) presente en la vacuola de una célula viva.
La Acetobacter diazotrophicus está
presente en células vivas como colonias poliédricas. Estas
estructuras poliédricas son causadas por la secreción de un
polímero de \beta-D-fructosa
llamado Levana. Cristales de Levana aislados a partir de Erwinia
herbicola (sigma cat. No. L8647) semejan bien la forma de
colonias de Acetobacter diazotrophicus encontradas en las
plantas inoculadas de acuerdo con la presente invención (Figura
32).
Trigo (Triticum aestivum) y trébol
(Trifolium repens), inoculado con Acetobacter
diazotrophicus UAP5541/ pRGH562
(NifH-GUSA) de acuerdo con la presente invención,
fueron transferidos después de dos semanas de inoculación en jarras
(75 ml de capacidad conteniendo 50 ml de medio de Murashige y Skoog,
0.8% P/V de agar y 3% P/V de sacarosa), a (semilla y esqueje) abono
en potes durante cuatro semanas. Las plantas en potes fueron
incubadas en condiciones de cuarto de crecimiento limpio
(temperatura durante del día de 25ºC, temperatura durante la noche
de 16ºC, período de exposición a la luz de 250 \mum E
M^{-2}S^{-1} a de tubos fluorescentes "Daylight",
0600-2200) y regadas con agua estéril. Fue probada
la actividad de nitrogenasa de las plantas usando la prueba de
reducción de acetileno. Controles no inoculados también fueron
transferidos de manera similar de las jarras al abono y probados en
cuanto a la actividad de nitrogenasa usando la prueba de reducción
de acetileno.
\vskip1.000000\baselineskip
Nitrogenasa, la enzima responsable de la
reducción del nitrógeno gaseoso (N \equiv N) a amoniaco (NH_{3})
(fijación de nitrógeno), fue probada por cromatografía de gas. En
esta prueba, las plantas son incubadas con exceso de gas acetileno
(H-c \equiv CH) que es reducido por la nitrogenasa
que actúa en el enlace triple del acetileno para producir etileno
(H2-C = C-H_{2}). Las plantas
fueron enjuagadas en agua estéril y transferidas a tubos Pyrex de
75 ml los cuales fueron tapados después con gas comprimido
Subaseals^{TM}. 10% del volumen de aire fue retirado usando una
jeringuilla hipodérmica, y substituido por acetileno. Las muestras
fueron regresadas al cuarto de crecimiento e incubadas durante 24
horas en las mismas condiciones usadas para el crecimiento de las
plantas inoculadas con A. diazotrophicus (25ºC,
temperatura durante el día, 16ºC, temperatura durante la noche,
período de exposición a la luz de 250 \mum Em^{-2}S^{-1} de
tubos fluorescentes "Daylight", 0600-2200).
Muestras de los gases (0.5 ml) fueron retiradas en jeringuillas y
analizadas en cuanto a la producción de etileno con una
cromatografía de gas Pye Unicam PU 4500 con columna de cristal de
183 cm (diámetro interno de 2.0 mm) conteniendo "Propack N"
con un tamaño de malla de 80-100. El portador de la
fase móvil fue N_{2} con una tasa de flujo de 27 ml
minuto^{-1}. El horno que contenía la columna fue ajustado a 60ºC
y el detector de llama ajustado a 121ºC. El instrumento fue
calibrado (altura máxima: etileno (número de nanomoles) por 0.5 ml
de muestra) usando una curva estándar.
\newpage
TRIGO (nanomoles de etileno por
24
horas)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TRÉBOL (nanomoles de etileno por
24
horas)
Cuando el trébol fue inoculado con Rhizobium
leguminosarum biovariante Trifolii (RCR5), en estas
condiciones de cultivo, fueron producidas plantas noduladas y éstas
tenían una actividad media de nitrogenasa por planta de trébol de
60 nanomoles de etileno por 24 horas.
Claims (10)
1. Una planta no leguminosa o leguminosa que
contiene bacterias que fijan el nitrógeno, Acetobacter
diazotro- phicus (sin. Gluconacetobacter
diazotrophicus), dichas bacterias estando localizadas
intracelularmente en las células vivas de la planta y
proporcionando nitrógeno fijado a dicha planta.
2. Una planta de acuerdo con la reivindicación 1
obtenible mediante un método de inoculación de dicha planta con
entre 1 y 100 de dichas bacterias por mililitro de inóculo.
3. Una planta de acuerdo con la reivindicación
1 obtenible mediante un método para la inoculación de dicha planta
con entre 1 y 10 de dichas bacterias por mililitro de inóculo.
4. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en la cual las bacterias que fijan el
nitrógeno están presentes en vesículas y vacuolas unidas a la
membrana dentro del citoplasma de una célula de la planta.
5. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en la cual las bacterias se propagan de una
célula de la planta a otra célula de la planta mediante división de
las células de la planta en el meristemo y divisiones subsiguientes
de las mismas.
6. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en la cual las bacterias se convierten en
sistémicas moviéndose a través de la xilema.
7. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en la cual las bacterias se convierten en
sistémicas mediante divisiones de las células de la planta y
divisiones subsiguientes de las mismas.
8. Un método de inoculación de una planta no
leguminosa o leguminosa con bacterias que fijan el nitrógeno,
Acetobacter diazotrophicus (sin. Gluconacetobacter
diazotrophicus) localizadas intracelularmente en las células
vivas de la planta y proporcionando el nitrógeno fijado a dicha
planta, que comprende la inoculación de dicha planta con entre 1 y
100 de dichas bacterias por mililitro de inóculo cuando ocurre la
germinación de dicha planta o hasta siete días después de la
misma.
9. Un método acuerdo con la reivindicación 8 en
el cual la planta no leguminosa o leguminosa es inoculada con
1-10 bacterias por mililitro de inóculo.
10. Un método para la producción de una planta
leguminosa o no leguminosa de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual dichas bacterias son introducidas por inoculación de entre 1
y 100 bacterias por mililitro de inóculo cuando ocurre la
germinación de dicha planta o hasta siete días después de la misma,
y en el cual dichas bacterias se convierten en sistémicas mediante
división de las células de la planta y divisiones subsiguientes de
las mismas.
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