ES2309158T3 - Planta, semillas y aceite con un contenido incrementado de triacilgliceroles saturados y aceite que tiene un elevado contenido de acido estearico. - Google Patents
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Abstract
Una planta de girasol productora de semillas de girasol, cuyas semillas comprenden un aceite que tiene un contenido de ácido esteárico de al menos 22% en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso del aceite, y en cuyo aceite entre 6% y 12,4% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMM, donde la fórmula da de izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M representa un ácido graso monoénico, obtenible proporcionando semillas de CAS-3 o CAS-4 o semillas similares con un rasgo de elevado contenido de ácido esteárico como al menos un ancestro, cruzando la planta desarrollada a partir de semejante semilla con otro material de girasol diferente, sometiendo a ensayo el TAG del aceite utilizando una Cromatografía Gas-Líquido y seleccionando el material que tiene un elevado contenido de ácido esteárico de al menos 22% en peso y el perfil de TAG deseado, donde al menos 6% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMM.
Description
Planta, semillas y aceite con un contenido
incrementado de triacilgliceroles saturados y aceite que tiene un
elevado contenido de ácido esteárico.
La presente invención se refiere a semillas de
girasol que comprenden un aceite que tiene cierto contenido de
triacilglicerol para SMS y SMM y un contenido incrementado de ácido
esteárico en comparación con las plantas de tipo salvaje entre 22% y
35% en peso con relación a la cantidad total de ácidos grasos del
aceite, estas especies de triacilglicerol tienen la fórmula general
que da de izquierda a derecha el primero, segundo y tercer ácidos
grasos del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y
M representa un ácido graso monoénico. La invención también hace
referencia a semillas de girasol que tienen un contenido de ácido
esteárico de hasta 54% en peso o más. La invención se refiere
adicionalmente a un aceite de girasol extraíble de las semillas de
la invención, a las plantas de girasol producidas a partir de las
semillas, a los métodos para preparar las semillas y el aceite, así
como al uso del aceite en diversos productos y a los productos que
comprenden el aceite.
El girasol se cultiva generalmente para obtener
aceite que tiene ácidos grasos saturados (palmítico y esteárico) y
ácidos grasos insaturados (oleico y linoleico). El contenido de
ácido esteárico es siempre menor de 10% (Gustone, F.D. et al.
"The lipid handbook", Chapman y Hall 1.986), normalmente
comprendido entre 3% y 7%. En relación con los ácidos grasos
insaturados existen dos clases diferentes de semillas de girasol: el
girasol normal que tiene un contenido de ácido linoleico entre 50% y
70% (Knowles, P.F. "Recent advances in oil crops breeding";
AOCS Proccedings 1988) y el girasol con alto contenido de ácido
oleico que tiene 2-10% de ácido linoleico y
75-90% de ácido oleico (Soldatov, K.I. "Chemical
mutagenesis in sunflower breeding", Int. Proc. 7ª Intern.
Sunflower Conference, 352-357, 1.976). También
existe una línea de girasol que tiene un elevado contenido de ácido
palmítico, entre 22% y 40% (R. Ivanov et al. "Sunflower
Breeding for High Palmitic Acid Content in the Oil"; Proc. of
the 12ª Intern. Sunflower Conference, Vol. II,
453-465, 1.988) y otra línea con un bajo contenido
de ácido graso saturado (6% o menos) (publicación
EP-A-496504).
La Tabla I muestra la composición de ácido graso
para algunas variedades de aceite de girasol conocidas.
El contenido de ácido graso de un aceite está
directamente relacionado con las características físicas y químicas
del mismo. En caso de que dicho contenido sea suficientemente alto,
el aceite puede ser sólido a la temperatura ambiente como algunas
grasas animales. El aceite de girasol normal siempre es líquido en
dichas condiciones.
En la industria alimentaria para la producción
de confitería o margarina, normalmente se utilizan grasas animales o
grasas vegetales hidrogenadas debido a que se requiere un producto
sólido o semisólido. Por medio de hidrogenación los ácidos grasos
insaturados se convierten en ácidos grasos saturados. Las grasas
animales así como las grasas hidrogenadas no son muy recomendables
desde el punto de vista nutricional (Chow, C.K. "Fatty acids in
food and their health implications", Dekker, N.Y., 1.992). Las
grasas animales tienen un contenido relativamente alto de
colesterol. Demasiado colesterol en la dieta puede ser perjudicial
para la salud. Por lo tanto las grasas animales se han sustituido en
los últimos años por grasas vegetales hidrogenadas que no contienen
colesterol.
Sin embargo, dichas grasas hidrogenadas
presentan otro problema derivado del procedimiento de hidrogenación.
En dicho procedimiento tienen lugar una isomerización posicional
(desplazamiento de los dobles enlaces) y transformaciones
estereoquímicas (formación de isómeros "trans"). Los isómeros
son producidos en una cantidad de hasta 30%-50% de la cantidad de
ácidos grasos totales. Estos isómeros no son muy saludables desde el
punto de vista nutricional (Wood, R., "Biological effects of
geometrical and positional isomers of monounsaturated fatty acids in
humans"; Dekker, N.Y. (1.990); Willet, W.C. & Ascherio, A.,
"Trans Fatty Acids: Are The Effects Only Marginal?", American
Journal of Public Health, Vol. 84, 5, (1.994)). Por lo tanto, el uso
de grasas hidrogenadas en la industria alimentaria debe ser
evitado.
El aceite de girasol tiene un contenido deseable
de ácidos grasos insaturados. Para su uso en la industria
alimentaria no obstante, el contenido de ácido esteárico del aceite
debe ser superior al del aceite de girasol normal (Norris, M.E.,
"Oil substitutions in food formulations", Inform. 1,
388-392 (1.990)) con el fin de obtener un producto
más sólido.
En la publicación WO 95/20313 se describe un
aceite de girasol que tiene un contenido de ácido esteárico
incrementado entre 18,1 y 35% en peso. Este aceite es líquido a la
temperatura ambiente.
De este modo un objeto de la invención es
proporcionar un nuevo aceite vegetal natural extraído de semillas
mutadas, teniendo el aceite un contenido de ácido esteárico mayor en
comparación con el aceite obtenido de las semillas de tipo salvaje y
ciertos contenidos de las especies de triacilglicerol que tienen la
fórmula general SMS y SMM donde SMS es sólido (no líquido) a la
temperatura ambiente (20ºC) y SMM líquido.
La presente invención se describe ampliamente
como una planta de girasol que tiene material genético capaz de
elaborar semillas que comprenden aceite, comprendiendo dicho aceite
un contenido de ácido graso esteárico incrementado de al menos 22%
en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso en el aceite
cuando se compara con el aceite de girasol extraído de plantas de
girasol de tipo salvaje y con al menos 6% de especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0%
de especies de triacilglicerol SMM donde la fórmula da, de izquierda
a derecha, el primer, segundo y tercer ácido graso del
triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M
representa un ácido graso monoénico.
El incremento de ácido graso esteárico en
algunas realizaciones es de al menos 22% de ácido graso esteárico en
peso con respecto a la cantidad total de ácido graso del aceite. Y
en otras realizaciones, el incremento de ácido esteárico es de al
menos 26% e incluso en otras realizaciones preferidas es de al menos
28% de ácido graso esteárico en peso con respecto a la cantidad
total de ácido graso del aceite. La planta de girasol que comprende
niveles de SMM y SMS por encima de los niveles incrementados de
ácido esteárico también puede comprender en su genoma al menos un
transgén.
Una realización de la invención comprende una
planta de girasol que forma semillas y el aceite de las mismas tiene
un incremento de ácido esteárico y no menos de 7,4% de las especies
de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS.
Adicionalmente, la presente invención puede ser
incorporada a una planta de girasol capaz de elaborar semillas que
en diversas realizaciones de la invención tienen un aceite extraíble
de la semilla que comprende un aceite con al menos 6% de las
especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no
más del 5,0% de especies de triacilglicerol que tienen la fórmula
general SMM con un incremento de ácido esteárico y al menos 22% de
las especies de triacilglicerol con la fórmula general SDS y en otra
realización al menos 25% de las especies de triacilglicerol con la
fórmula general SDS. En otra realización más, al menos 28% de las
especies de triacilglicerol con la fórmula general SDS también se
encuentra en el aceite donde la fórmula da de izquierda a derecha el
primer, segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol y S
representa un ácido graso saturado y D representa un ácido graso
di-insaturado.
La presente invención también describe un método
para desarrollar plantas de girasol híbridas y semillas, que
comprende las etapas de acceder al material del girasol con semillas
que tienen un alto contenido de ácido esteárico de al menos 22% en
peso con respecto a la cantidad total de ácido graso del aceite,
como al menos un ancestro y cruzarlo con otro material de girasol
diferente, donde se forma una semilla de girasol híbrida que cuando
se planta forma una planta de girasol híbrida capaz de formar
semillas con aceite que comprende niveles de ácido esteárico de al
menos 28% de ácido graso esteárico en peso con respecto a la
cantidad total del ácido graso del aceite y no más de 5,0% de
especies de triacilglicerol SMM donde la fórmula da de izquierda a
derecha el primer, segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol
y S representa un ácido graso saturado y M representa un ácido graso
monoénico.
El alcance del método de la presente invención
incluye el siguiente método de cruzamiento de girasoles que
comprende las etapas de acceder al material de girasol seleccionado
del grupo que consiste en semillas endogámicas que tienen un elevado
contenido de ácido esteárico de al menos 12% en peso con respecto a
la cantidad total de ácido graso del aceite, la planta de girasol
producida de la misma, o una planta de girasol que tiene la semilla
como ancestro, y reproducir tales líneas juntas o reproducir
semejante línea con otro material de girasol, donde se produce un
girasol diferente capaz de producir semillas con un aceite que
comprende al menos 22% de ácido graso esteárico en peso con respecto
a la cantidad total de ácido graso del aceite y con al menos 6% de
las especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y
no más de 5,0% de especies de triacilglicerol SMM donde la fórmula
da de izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido graso
del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M
representa un ácido graso monoénico. La presente invención también
puede ser incorporada a un aceite de una planta de girasol formada
mediante el método anterior donde menos de 6,0% de las especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general DDD están presentes en
el aceite.
La invención incluye el aceite extraído de
cualquiera de las semillas anteriores, que sin un tratamiento
adicional, tiene trazas de aceite de cualquiera de las realizaciones
de la presente invención.
La presente invención también puede incluir en
la siguiente realización una semilla de girasol híbrida formada
cruzando una planta de girasol con alto contenido de ácido esteárico
con un girasol con alto contenido de aceite palmítico en su semilla
donde dicha semilla de girasol híbrida tiene al menos 26% de
contenido de ácido esteárico y una especie de triacilglicerol que
tiene la fórmula general SMS de al menos 6% y no más de 5,0% de
especie de triacilglicerol SMM.
Una realización de la invención se describe como
un aceite extraído de material vegetal que comprende no más de 5,0%
de especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMM y
donde la fórmula general SMS comprende al menos 3,7% de las especies
de triacilglicerol que tienen la fórmula específica EOE, donde la
fórmula da de izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido
graso del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado, E
representa un ácido graso esteárico y M representa un ácido graso
monoénico, O representa un ácido graso oleico y el aceite contiene
al menos 28% de ácido graso esteárico en peso con respecto a la
cantidad total de ácido graso del aceite.
Otra realización más de la invención está
dirigida a un aceite extraído de material vegetal donde el aceite
comprende no menos de 21,5% de las especies de triacilglicerol que
tienen la fórmula general SDS y no más de 5,0% de especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general SMM donde la fórmula
da de izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido graso
del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M
representa un ácido graso monoénico, y el aceite contiene al menos
28% de ácido esteárico en peso con respecto a la cantidad total de
ácido graso del aceite.
Por lo tanto la invención proporciona semillas
de girasol, que comprenden un aceite de girasol que tiene un
contenido incrementado de ácido esteárico en comparación con las
semillas de tipo salvaje de no más de 5,0% de especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general SMM y donde la fórmula
general SMS comprende al menos 6%, obtenible tratando las semillas
parentales con un agente mutagénico durante un período de tiempo y
en una concentración suficiente para inducir una o más mutaciones en
el rasgo genético implicado en la biosíntesis de ácido esteárico
dando como resultado un aumento de la producción de ácido esteárico,
germinar las semillas tratadas y cultivar las plantas de su
progenie, recoger y analizar las semillas de la progenie,
seleccionar las semillas que han adquirido el rasgo genético
deseable y opcionalmente repetir el ciclo de germinación, cultivo y
recolección de las semillas.
Una semilla seleccionada de un grupo que
consiste en la progenie CAS-3 y
CAS-4 de líneas de cruzamiento que contiene al menos
12% de ácido graso esteárico en peso con respecto a la cantidad
total de ácido graso del aceite o una semilla con un incremento de
ácido esteárico similar que contiene al menos 12% de ácido graso
esteárico en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso
del aceite que comprende un aceite con al menos 6% de las especies
de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no más de 5%
de las especies de triacilglicerol SMM donde la fórmula da de
izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido graso del
triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M
representa un ácido graso monoénico. La presente invención abarca
adicionalmente el aceite extraído de dicha semilla. Adicionalmente
en otra realización más de la invención anterior el aceite extraído
de la semilla comprende un contenido de ácido graso esteárico en
peso que no es menor de 15% de la cantidad total de los ácidos
grasos del aceite. Adicionalmente en una realización de la invención
la semilla con no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol que
tienen la fórmula general SMM y donde la fórmula general SMS
comprende al menos 3,4% tiene adicionalmente un aceite donde menos
de 8,1% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general
DDD.
La presente invención comprende adicionalmente
el aceite extraído de las semillas que tienen CAS-3
o CAS-4 como ancestro que comprende especies de
triacilglicerol en las que al menos 12,0% de las especies de
triacilglicerol tienen la fórmula general SMS, y no más de 8,0% de
especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general DDD y el
contenido de ácido graso esteárico en peso no es menor de 22% de la
cantidad total de contenido de ácido graso del aceite. La presente
invención también abarca híbridos elaborados con material de alto
contenido de ácido esteárico por ejemplo la semilla de girasol
híbrida formada cruzando CAS-3 o
CAS-4 con un girasol con un elevado contenido de
aceite palmítico en su semilla donde dicha semilla de la progenie
tiene al menos 22% de contenido de ácido esteárico y una especie de
triacilglicerol que tiene la fórmula general SMS de al menos 12% y
no más de 5% de la especie de triacilglicerol SMM donde la fórmula
da de izquierda a derecha el primer, segundo y tercer ácido graso
del triacilglicerol y S representa un ácido graso saturado y M
representa un ácido graso monoénico. Específicamente semejante
híbrido se puede formar con el cruzamiento del depósito
IG-1297M presentado en la ATCC y
CAS-3 o CAS-4 o su progenie. Esta
semilla de girasol híbrida formada cruzando CAS-3
con CAS-4 o su progenie a menudo evidencia un
contenido de ácido esteárico de al menos 15% del contenido de ácido
graso total. La invención incluye un aceite extraído de material
vegetal con al menos 6% de las especies de triacilglicerol que
tienen la fórmula general SMS y no más de 5% de las especies de
triacilglicerol SMM donde la fórmula da de izquierda a derecha el
primer, segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol y S
representa un ácido graso saturado y M representa un ácido graso
monoénico, y el aceite contiene al menos 26% de ácido graso
esteárico en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso
del aceite.
Preferiblemente las semillas de girasol de
acuerdo con la invención comprenden un aceite que tiene un contenido
de ácido esteárico entre 22 y 35% en peso, con respecto a la
cantidad total de ácidos grasos del aceite, el contenido de ácido
esteárico de al menos 22% es útil, más preferiblemente es de al
menos 25%, siendo al menos 28% otra realización y al menos 6% de las
especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y
siendo no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol SMM y son
obtenibles tratando las semillas parentales durante 2 horas a la
temperatura ambiente con un agente alquilante tal como una solución
de metanosulfonato de etilo en agua 70 mM.
En otra realización de la invención las semillas
son obtenibles tratando las semillas parentales con una solución de
azida de sodio en agua 2 mM durante 2 horas a la temperatura
ambiente.
Otro método para producir la presente invención
consiste en cruzar semillas con incremento de ácido esteárico
denominadas CAS-3 o CAS-4, donde una
semilla representativa de las semillas CAS-3 ha sido
depositada con el número de acceso ATCC 75968 y una semilla
representativa de las semillas CAS-4 ha sido
depositada con el número de acceso ATCC 75969. Adicionalmente, la
invención abarca una planta de girasol o sus partes como sus
semillas, embriones, polen derivado de semejante semilla o de una
semilla similar con el rasgo de elevado contenido de ácido esteárico
y SMM y SMS. La presente invención incluye una semilla que tiene al
menos una de tales semillas de girasol como al menos una planta de
girasol ancestral. La invención abarca adicionalmente una planta de
girasol estéril masculina o sus partes como sus semillas derivadas
de semejante semilla y desarrollada con germoplasma que comprende un
componente citoplásmico de esterilidad masculina. O semejante planta
de girasol comprende un componente citoplásmico restaurador de la
esterilidad masculina.
También se describen ciertos métodos de
desarrollo de una planta de girasol híbrida, que comprenden las
etapas de acceder al material de girasol que tiene las semillas de
CAS-3 o CAS-4 o semillas similares
con el rasgo de elevado contenido de ácido esteárico como al menos
un ancestro y cruzarla con otro material de girasol diferente donde
se forma una planta de girasol híbrida que es capaz de elaborar un
aceite que comprende al menos 6% de las especies de triacilglicerol
que tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0% de especies de
triacilglicerol SMM. Asimismo se describe un método de producción de
girasoles que comprende las etapas de acceder al material de girasol
seleccionado del grupo que consiste en semillas endogámicas de
CAS-3 o CAS-4 o semillas similares
con el rasgo de elevado contenido de ácido esteárico, la planta de
girasol producida de las mismas, o una planta de girasol que tiene
semejantes semillas como ancestros, y reproducir otro material de
girasol con la planta o partes de la planta a la que se ha tenido
acceso, donde se produce un girasol diferente que es capaz de
elaborar un aceite que comprende al menos 6% de las especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0%
de especies de triacilglicerol SMM, que el del material de girasol
original.
Algunas semillas de girasol útiles para el
cruzamiento para formar la presente invención son identificadas como
"CAS-3" que tienen un contenido medio de ácido
esteárico de 25% en peso, con respecto a la cantidad total de ácidos
grasos del aceite, han sido depositadas el 14 de Diciembre de 1.994
en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 12301 Paklawn Drive,
Rockville, MD 20852, U.S.A. con el número de acceso del depósito
ATCC 75968. Las semillas de girasol identificadas como
"CAS-4" que tienen un contenido medio de ácido
esteárico de 15,4% en peso, con respecto a la cantidad total de
ácidos grasos en el aceite, han sido depositadas el mismo día en la
misma institución con el número de acceso del depósito ATCC
75969.
Las semillas que tienen un contenido de ácido
esteárico incluso mayor entre 29 y 54% en peso con respecto a la
cantidad total de ácidos grasos en el aceite, pueden ser obtenidas
cruzando girasoles que se originan a partir de semillas que tienen
un contenido de ácido esteárico entre 19,1 y 35% en peso con
girasoles que se originan a partir de semillas que tienen un
contenido de ácido esteárico entre 12% y 19% en peso, y recogiendo
las semillas.
La invención se refiere adicionalmente a un
aceite de girasol que comprende al menos 6% de las especies de
triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0%
de especies de triacilglicerol SMM y un contenido de ácido esteárico
entre 22% y 54% en peso, preferiblemente entre 22% y 35% en peso,
con respecto a la cantidad total de ácidos grasos del aceite, que
puede ser obtenido extrayendo las semillas de girasol de la
invención. Se puede obtener aceite de girasol que comprende al menos
6% de las especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general
SMS y no más de 5,0% de especies de triacilglicerol SMM y que tiene
un contenido de ácido esteárico de 22% en peso con respecto a la
cantidad total de ácidos grasos del aceite extrayendo las semillas
de girasol de cruces seleccionados formados con el número de acceso
de depósito ATCC 75969. El aceite de girasol que comprende al menos
6% de las especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general
SMS y no más de 5,0% de especies de triacilglicerol SMM y que tiene
un contenido de ácido esteárico de 25% en peso con respecto a la
cantidad total de ácidos grasos del aceite, es obtenible extrayendo
semillas de girasol que tienen como ancestro en un cruce
seleccionado del número de acceso de depósito ATCC 75968.
Preferiblemente el aceite de girasol de la
invención tiene incrementado el ácido esteárico y al menos 6% de las
especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no
más de 5,0% de especies de triacilglicerol SMM y un contenido de
ácido palmítico entre 3 y 40% en peso, un contenido de ácido oleico
entre 3 y 85% en peso y un contenido de ácido linoleico entre 2 y
84% en peso, todos con respecto a la cantidad total de ácidos grasos
del aceite. Tales tipos de aceites pueden ser obtenidos a partir de
semillas producidas cruzando las semillas con alto contenido de
ácido esteárico de la invención con semillas que tienen un contenido
deseable de uno o más ácidos grasos insaturados y/o saturados. De
este modo se pueden obtener semillas hechas a la medida y aceite
hecho a la medida producido a partir de ellas preparando mutantes de
acuerdo con la invención y utilizar éstas en la práctica de mejora
vegetal convencional adicional cruzándolas con otras plantas
mutantes o de tipo salvaje conocidas o todavía desconocidas.
También se describe un método para preparar
semillas de girasol que tienen un contenido de ácido esteárico
incrementado con comparación con las semillas de tipo salvaje,
tratando semillas parentales con un agente mutagénico durante un
período de tiempo y en una concentración suficiente para inducir una
o más mutaciones en el rasgo genético implicado en la biosíntesis de
ácido esteárico dando como resultado un incremento de la producción
de ácido esteárico, germinando las semillas tratadas y cultivando
las plantas progenie a partir de allí, recogiendo y analizando las
semillas progenie, seleccionado las semillas que comprenden al menos
6% de las especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general
SMS y no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol SMM y que
han adquirido el rasgo genético deseable y repitiendo opcionalmente
el ciclo de germinación, cultivo y recolección de las semillas.
En la práctica, el método comprende la
mutagénesis de semillas de girasol con un agente de mutagénesis
adecuado. La mutagénesis producirá cambios genéticos heredables en
el ADN de las semillas. Después de varios tratamientos diferentes
fue posible seleccionar algunos tratamientos que produjeron un
elevado número de modificaciones genéticas en los genes que
controlan la biosíntesis de ácidos grasos de la semilla. Estos
tratamientos comprenden el uso de azida de sodio o un agente
alquilante, como metanosulfonato de etilo. Por supuesto, también se
puede utilizar cualquier otro agente mutagénico que tenga los mismos
o similares efectos.
Después, se analizó la siguiente generación de
semillas con una nueva metodología descrita por Garcés, R. y Mancha,
M. "One-step lipid extraction and fatty acid
methyl esters preparation from fresh plant tissues". Analytical
Biochemistry, 211:139-143, 1.993. Esto permitió la
detección de semillas con modificaciones en la composición de
cualquier ácido graso. Las semillas seleccionadas que mostraron un
contenido de ácido esteárico deseablemente elevado se cultivaron
hasta la quinta generación mostrando que este nuevo rasgo genético
es heredable y estable e independiente de las condiciones de
crecimiento.
Las semillas parentales se tratan por ejemplo
durante 2 horas a la temperatura ambiente con una solución de
metanosulfonato de etilo en agua 70 mM, o durante 2 horas a la
temperatura ambiente con una solución de azida de sodio en agua 2
mM.
Se pueden seguir a mutación y las etapas de
selección mediante técnicas de mejora vegetal convencionales
conduciendo de este modo a semillas que tienen y al menos 6% de las
especies de triacilglicerol que tienen la fórmula general SMS y no
más de 5,0% de especies de triacilglicerol SMM y un contenido de
ácido esteárico incluso superior de hasta 54% en peso o más, o a
semillas que tienen un contenido deseable de uno o más ácidos grasos
distintos. Las semillas de la invención pueden ser sometidas a uno o
más tratamientos de mutación adicionales.
Se puede preparar aceite de girasol que tiene un
contenido de ácido esteárico entre 22 y 35% en peso, con respecto a
la cantidad total de ácidos grasos del aceite, mediante extracción
de semillas de girasol de la invención de cualquier manera conocida
por el experto en la técnica. Tales métodos de extracción son bien
conocidos y se describen por ejemplo en "Bailey's industrial oil
and fat products", Vol. 2, Capítulo 3; 4ª Edición, John Wiley and
Sons, Nueva York (1.982).
La invención se refiere adicionalmente a plantas
de girasol producidas a partir de semillas de acuerdo con la
invención. De este modo, se pueden utilizar las semillas para
producir líneas parentales que tienen los TAG deseadas y un elevado
contenido de ácido esteárico en su aceite. Esto también se aplica a
plantas que se originan a partir de semillas obtenidas después del
cruzamiento de los mutantes de la invención entre sí o con otras
semillas que tienen un fenotipo deseable. Las semillas pueden ser
cultivadas de la manera normal en tierra o cualquier otro sustrato.
La producción de las plantas modificadas no requiere ninguna medida
adicional en comparación con el desarrollo de semillas de girasol
normales.
Las plantas de girasol se pueden utilizar en
programas de reproducción para el desarrollo de líneas de girasol o
híbridos, cuyos programas están destinados a la producción de
variedades de polinización abierta o híbridos que satisfacen los
requerimientos de rendimiento referente a las técnicas agrícolas,
resistencia a enfermedades y otros rasgos agronómicamente
importantes en las principales zonas de crecimiento de girasol del
mundo. Las semillas resultantes de estos programas se pueden
utilizar en el crecimiento de cultivos de girasol comerciales.
El aceite de girasol de la invención se puede
utilizar en la industria alimentaria. El aceite vegetal natural que
ha sido extraído de semillas de girasol mutagenizadas tiene un
elevado contenido de ácido esteárico entre 22 y 35%, o en caso de
entrecruzamiento de las semillas, incluso hasta 54% o más. Esto
permite el uso de lo que es una grasa de tipo sólido, el aceite con
un contenido incrementado de ácido esteárico y los TAGS deseados de
estas clases de semillas como tales. Sin embargo, también son
posibles combinaciones del aceite de la invención con aceite de
semillas de girasol con alto contenido de ácido oleico o alto
contenido de ácido palmítico conocidas, en la producción de grasas
comestibles o mezclas de grasas, como margarinas, lácteos vegetales
o en la producción de confitería o repostería dependiendo de los
requerimientos de la aplicación. Adicionalmente, el aceite de la
presente invención puede ser utilizado como un aceite total o se
puede utilizar o separar componentes del aceite. Por ejemplo, se
puede separar un componente del aceite tal como los diinsaturados
antes de su uso en la producción de grasas comestibles o mezclas de
grasas, como la margarina, lácteos vegetales o en la producción de
confitería o repostería. La ventaja de estos aceites es que no
tienen isómeros de ácidos grasos artificiales, como los isómeros
"trans" encontrados en los aceites hidrogenados, y, por
supuesto, sin colesterol, como las grasas animales.
\newpage
Los productos elaborados utilizando aceite, son
por ejemplo margarina, lácteos vegetales, confitería o repostería.
El aceite puede remplazar simplemente los aceites o grasas
utilizados normalmente en este tipo de productos. Está dentro del
alcance del experto en la técnica determinar cómo utilizar el aceite
sin realizar ningún trabajo de la invención.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que se
proporcionan con fines ilustrativos solamente y en modo alguno están
destinados a limitar el alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron azida de sodio y metanosulfonato
de etilo como agentes mutagénicos en el Ejemplo 1 y 2,
respectivamente. Se han obtenido numerosas líneas de girasol con un
contenido de ácido esteárico entre 12 y 35%. En todos estos casos la
línea parental de girasol original fue
RDF-1-532 (Colección de Girasol del
Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, España) que
tiene de 4 a 7% de contenido de ácido esteárico en el aceite de la
semilla. La preparación de las líneas CAS-3 y
CAS-4, y de la línea CAS-3x4
obtenida después del cruzamiento de CAS-3 con
CAS-4, ha sido descrita en los siguientes
ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a mutagénesis las semillas con una
solución de 70 mM de metanosulfonato de etilo (EMS) en agua. El
tratamiento se realizó a la temperatura ambiente durante 2 horas
mientras se sacudía (60 rpm). Tras la mutagénesis se descartó la
solución de EMS y las semillas se lavaron durante 16 horas con agua
del grifo.
Las semillas tratadas se hicieron germinar en el
campo y las plantas se autopolinizaron. Las semillas recogidas de
estas plantas se utilizaron para seleccionar nuevas líneas de
girasol con modificaciones en la composición de ácidos grasos.
Utilizando el método de Garcés, R. y Mancha, M. supra se
determinó la composición de ácidos grasos de la semilla mediante
cromatografía gas líquido, después de convertir los ácidos grasos en
sus correspondientes ésteres metílicos.
Se seleccionó una primera planta con un
contenido de ácido esteárico en el aceite de 9 a 17%. La progenie se
cultivó durante cinco generaciones durante las cuales el contenido
de ácido esteárico aumentó y el nuevo rasgo genético se fijó
establemente en el material genético de la semilla. Esta línea se
denominó CAS-3. Una muestra seleccionada de esta
línea se analizó dando como resultado un contenido de ácido
esteárico de 26% (Tabla 2). El contenido mínimo y máximo de ácido
esteárico de la línea fueron 19 y 35% respectivamente. El contenido
de ácido esteárico del aceite extraído de las semillas de esta línea
celular puede encontrarse de este modo entre 19 y 35%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a mutagénesis semillas de girasol
con azida de sodio, a una concentración 2 mM en agua. El tratamiento
se realizó a la temperatura ambiente durante dos horas mientras se
sacudía (60 rpm). Después se descartó la solución de mutagénesis y
las semillas se lavaron durante 16 horas con agua del grifo.
Las semillas se plantaron en el campo y las
plantas se autopolinizaron. Las semillas de estas plantas se
recogieron, y se determinó la composición de ácidos grasos mediante
cromatografía gas líquido, después de convertir los ácidos grasos en
sus correspondientes ésteres metílicos utilizando el método descrito
en el Ejemplo 1.
Las semillas de una planta que tenía alrededor
de 12% de ácido esteárico en el aceite se seleccionaron y se
cultivaron durante cinco generaciones. Durante este procedimiento se
incrementó el contenido de ácido esteárico y se fijó el nuevo rasgo
genético. Esta línea se denominó CAS-4. Una muestra
seleccionada de esta línea se analizó dando como resultado un
contenido de ácido esteárico de 16,1%. Los valores mínimo y máximo
fueron 12 y 19% respectivamente (Tabla 2).
Se hicieron crecer plantas de girasol a partir
de semillas CAS-3 y CAS-4. Las
plantas obtenidas de este modo fueron polinizadas artificialmente
con el fin de asegurar que se produjeran cruzamientos solamente
entre CAS-3 y CAS-4, no la
polinización de las plantas mutantes entre ellas.
A partir de las semillas producidas de este modo
se desarrollaron plantas y se determinó el contenido de ácido
esteárico de la progenie como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2.
La progenie y las plantas incluirán células vegetales, protoplastos
vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los
cuales se pueden regenerar plantas, callos vegetales, agrupaciones
vegetales, ARN y ADN vegetales y células vegetales que están
intactas en plantas o partes de las plantas, tales como embriones,
polen, flores, semillas, estambres, pétalos, hojas, cascarillas,
tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, células y similares, y
este término también incluye cualquier ADN o (ARN) transgénico o
porción del mismo que haya sido introducida en la planta mediante
cualquier método. El híbrido CAS-3x4 tenía un
contenido de ácido esteárico de más de 35% en peso. A partir de esto
parece que el entrecruzamiento de mutantes producirá híbridos con un
contenido de ácido esteárico aún mayor.
Los aceites contenidos en las semillas de
CAS-3 y CAS-4 son triésteres de
glicerol con ácidos grasos y se denominan triglicéridos o
triacilgliceroles (también identificados aquí como "TAG"). Los
TAG de CAS-3 y CAS-4 se encuentran
en una huella que identificaba el aceite. Los tres ácidos grasos de
un triacilglicerol pueden ser iguales o diferentes y pueden ser
saturados o insaturados. Las propiedades físicas de un
triacilglicerol dependen de su composición de ácidos grasos. Existen
tres posiciones en el TAG, sn-1,
sn-2 y sn-3. Se ha
sugerido que la localización de los ácidos grasos saturados en la
posición sn-2 es responsable de los efectos
aterogénicos de estos ácidos. De este modo los TAG con SMS y SDS son
mejores, donde la fórmula da de izquierda a derecha el primer,
segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol y S representa un
ácido graso saturado y M representa un ácido graso monoenoico y D
representa un ácido graso diinsaturado.
La presente invención proporciona un aceite de
girasol, que puede ser extraído de semillas de girasol y en el que
al menos 3,4%, más preferiblemente más de 5% de las especies del
triacilglicerol que constituyen el aceite tienen una fórmula general
SMS y preferiblemente menos de 25% e incluso más preferiblemente
menos de 13,0% e incluso más preferido menos de 5,0% de las especies
de triacilglicerol tienen la fórmula general SMM.
En diversas realizaciones de esta invención el
contenido de tag SDS de semejante aceite es normalmente superior al
contenido de tag SDS del aceite de girasol normal. La presente
invención proporciona un aceite de girasol, que puede ser extraído
de semillas de girasol y en el que al menos 3%, más preferiblemente
al menos 8% e incluso más preferiblemente más de 20% de las especies
de triacilglicerol que constituyen el aceite tienen la fórmula
general SDS, donde la fórmula da de izquierda a derecha el primer,
segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol y S representa un
ácido graso saturado y M representa un ácido graso monoénico y D
representa un ácido graso diinsaturado.
El aceite de acuerdo con la invención puede ser
formado por las semillas mutantes depositadas en la ATCC de la
presente memoria.
El aceite de la invención es un aceite natural
que puede ser extraído de las semillas de girasol y utilizado
directamente sin métodos de modificación adicionales para cambiar el
contenido de TAG de la invención. Semejante método de modificación
es por ejemplo el denominado "endurecimiento" del aceite, que
representa la hidrogenación de ácidos grasos. El aceite de la
invención se obtiene sin realizar semejantes procedimientos de
modificación artificial.
El aceite de girasol preferido de la invención
tiene niveles de SMS de al menos 3,4%.
\newpage
Los ácidos grasos saturados observados
previamente son ácido graso esteárico, ácido palmítico, ácido
aráquico y ácido behénico. El aceite debe tener un contenido de
ácido esteárico relativamente elevado de manera que el aceite sea
preferiblemente semi-sólido a la temperatura
ambiente.
La composición de triacilglicerol del aceite de
girasol que se puede extraer de las semillas normales y de las
semillas CAS-3 y CAS-4 del depósito
está en la Tabla 1. Donde CAS-3 no tiene una
cantidad detectable de POP, 2% POE; EOE 4% (redondeando al número
entero más próximo), ELA = 1%; PLP = 1%; PLE = 7%; ELE = 12%; POO =
1%; EOO = 4%. Como se observa en la Tabla: P = palmítico; E =
esteárico; O = oleico; L = linoleico; A = aráquico y B =
behénico.
\vskip1.000000\baselineskip
P = Palmítico; E = Esteárico; O = Oleico; L =
Linoleico; A = Aráquico; B = Behénico.
S = saturado (P, E, A, y B); M = monoenos (O); D
= Dienos (L); donde P = Palmítico; E = Esteárico; O = Oleico; L =
Linoleico; A = Aráquico; B = Behénico.
Los TAG fueron analizados utilizando
"Cromatografía Gas Líquido" (GLC) de acuerdo con las técnicas
esbozadas en Carelli, A.A. y A. cert. Comparative Study of the
Determination of Triacylglycerol in Vegetable Oils using
Chromatographic Techniques, J. Chromatogr.,
630:213-222 (1.993).
Como se ha observado en el Ejemplo 3 se produjo
un híbrido de CAS-3 y CAS-4
(cualquiera puede ser la planta femenina), que tenía un elevado
nivel de ácido esteárico. La presente invención tiene
preferiblemente al menos más contenido de ácido esteárico que de
palmítico. Las semillas de girasol que producen aceites con niveles
de ácido esteárico de al menos alrededor de 22% y superiores
funcionan bien. Los niveles de 26% y superiores parecen mejores y el
nivel de ácido esteárico por encima de 28% con los TAG deseados
proporciona grasas de tipo bastante sólido a aproximadamente 22,22
grados centígrados (aproximadamente la temperatura ambiente). El
cruce de CAS-3 y CAS-4 dio como
resultado la selección de CAS-29 que tenía un TAG
seleccionado, la línea derivada indirectamente por medio de
reselección de CAS-3 dio como resultado una
composición TAG de CAS-30. CAS-3
cruzado con una línea con niveles elevados de aceite palmítico dio
como resultado CAS-31. Estos tipos de aceites que
comprenden los Tag mejorados que son incluso más útiles para
elaborar untables y margarina y productos que a la temperatura
ambiente no son totalmente líquidos debido a que el nivel de ácido
esteárico se encuentra en un intervalo de 30%. Estas plantas
mejoradas producidas por medio de las etapas de acceso al material
de girasol tienen la semilla de CAS-3 o
CAS-4 o una semilla similar con el rasgo de elevado
contenido de ácido esteárico como al menos un ancestro y cruzamiento
de la planta desarrollada a partir de tales semillas con otro
material de girasol diferente cuando se forma una planta de girasol
híbrida. Después el método puede incluir la etapa de someter a
ensayo el Tag o el aceite o alternativamente la primera etapa de
evaluación del contenido de ácido graso o una parte del contenido de
ácido graso del aceite. Después plantar las semillas seleccionadas
para formar nuevas líneas y cruzar esas líneas entre sí o
alternativamente retrocruzar con el parental o uno de su progenie.
Adicionalmente, se pueden emplear reservas de reproducción para
aumentar la variedad de rasgos. El material resultante se selecciona
para que tenga el elevado contenido de ácido esteárico y el perfil
de tag deseados.
Este perfil de tag utilizado para la selección
puede ser un número de tipos de Tag tal como SMS y SDS o puede ser
simplemente un tipo de Tag tal como SMS o DDD o similar. No
obstante, de acuerdo con la presente invención el TAG preferido para
la selección es SMS y SMM. Esto es particularmente cierto ya que
existen métodos de elaboración para la separación de los tipos de
Tag a menudo a un coste relativamente bajo. La separación permite
extraer una porción del aceite que se va extraer para su uso en un
producto untable como manteca de cacao y otra porción del aceite que
se va a emplear en un producto de tipo lubricante o un producto de
tipo no semi-sólido líquido tal como aceite para
cocinar. Posiblemente el ensayo adicional y la selección de plantas
por medio de generaciones adicionales podrían reducir los niveles de
SMM del TAG. Alternativamente, si el TAG SMS y SDS es la porción
útil, el TAG podría ser separado por medio de procedimientos con
calor o frío.
La Tabla 5 muestra CAS-30 y el
TAG mejorado de los híbridos elaborados con CAS-3.
Cada uno de estos muestra TAG de híbridos o líneas con elevado
contenido de ácido esteárico que tienen niveles de SMS y SMM dentro
del alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
P = Palmítico; E = Esteárico; O = Oleico; L =
Linoleico; A = Aráquico; B = Behénico.
Utilizando los símbolos de los TAG S = saturado
(P, E, A, y B); M = monoenos (O); D = Dienos (L); donde P =
Palmítico; E = Esteárico; O = Oleico; L = Linoleico; A = Aráquico; B
= Behénico.
No solamente los híbridos, las variedades y los
productos endogámicos elaborados a partir de ellos tienen mejores
perfiles Tag para los productos semi-sólidos
saludables elaborados con aceites; si no que también tienen más
ácido esteárico saludable en el contenido de aceite que
CAS-3 y CAS-4. La composición de
ácidos grasos mejorada de la progenie mejorada se muestra más abajo.
Estas mejoras deben hacer el producto incluso más útil como
semi-sólido sin requerir un tratamiento químico
mucho menos saludable antes de ser empleado en productos
alimenticios, o productos cosméticos o similares.
De este modo el TAG del aceite preferido tiene
niveles elevados de ácido graso esteárico y un TAG con un SMS
incrementado en comparación con el aceite de girasol normal de tipo
salvaje y un SMM preferiblemente por debajo de 25% y más
preferiblemente en o por debajo de 13% e incluso más preferido en o
por debajo del nivel de tipo salvaje (girasol normal).
La presente invención puede ser empleada para
desarrollar líneas, variedades de girasol de polinización abierta o
girasoles híbridos. Estas plantas de girasol se pueden utilizar para
producir nuevas líneas endogámicas mediante autopolinización
sucesiva y selección o mediante retrocruzamiento sucesivo. Una línea
convencional lleva preferiblemente tres o más generaciones de
autopolinización hasta que las líneas son fijadas o presentan una
reproducción verdadera.
Una vez que las líneas son líneas fijadas se
pueden emplear para formar híbridos. Los híbridos a menudo emplean
un sistema de esterilidad masculina citoplásmica (CMS). Una línea se
cruza muy a menudo con germoplasma CMS tal como CMS HA89
(Departamento de Agricultura de los Estados Unidos). El germoplasma
CMS se utiliza normalmente en un programa de reproducción con
retrocruzamientos recurrentes con la línea que tiene el porcentaje
de ácido esteárico deseado. La progenie CMS final es virtualmente
idéntica al parental con un elevado contenido de ácido esteárico
recurrente excepto que la progenie CMS es masculina estéril y
produce polen viable. Esta línea CMS se cruza después con el
parental masculino que porta el determinante genético que codifica
la fertilidad restauradora del citoplasma masculino estéril (la
línea restauradora (R)). Este cruce produce un polen fértil que
produce semillas de girasol híbridas. También se pueden emplear
otros métodos de esterilidad, tal como gametocidas químicos.
La semilla híbrida se utiliza después para
producir plantas que producen semillas que son "granos" y se
muele para su aceite o harina o se utiliza con fines de producción
adicionales.
De acuerdo con la invención se han obtenido
plantas de girasol y semillas de las cuales se puede extraer dicho
aceite por medio de un procedimiento biotecnológico. Este elevado
contenido de ácido esteárico es un rasgo heredable y es
independiente de las condiciones de crecimiento.
Claims (13)
1. Una planta de girasol productora de semillas
de girasol, cuyas semillas comprenden un aceite que tiene un
contenido de ácido esteárico de al menos 22% en peso con respecto a
la cantidad total de ácido graso del aceite, y en cuyo aceite entre
6% y 12,4% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula
general SMS y no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol
tienen la fórmula general SMM, donde la fórmula da de izquierda a
derecha el primer, segundo y tercer ácido graso del triacilglicerol
y S representa un ácido graso saturado y M representa un ácido graso
monoénico, obtenible proporcionando semillas de
CAS-3 o CAS-4 o semillas similares
con un rasgo de elevado contenido de ácido esteárico como al menos
un ancestro, cruzando la planta desarrollada a partir de semejante
semilla con otro material de girasol diferente, sometiendo a ensayo
el TAG del aceite utilizando una Cromatografía
Gas-Líquido y seleccionando el material que tiene un
elevado contenido de ácido esteárico de al menos 22% en peso y el
perfil de TAG deseado, donde al menos 6% de las especies de
triacilglicerol tienen la fórmula general SMS y no más de 5,0% de
las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMM.
2. Una planta de girasol reivindicada en la
reivindicación 1, donde el contenido de ácido esteárico es al menos
26% en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso del
aceite.
3. Una planta de girasol reivindicada en la
reivindicación 1 o 2, donde el contenido de ácido esteárico es al
menos 28% en peso con respecto a la cantidad total de ácido graso
del aceite.
4. Una planta de girasol reivindicada en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde entre
7,4% y 12,4% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula
general SMS.
5. Una planta de girasol reivindicada en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde entre
11,6% y 12,4% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula
general SMS.
6. Una planta de girasol reivindicada en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde 12,4%
de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general
SMS.
7. Una planta de girasol reivindicada en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde al
menos 22% de las especies de triacilglicerol de dicho aceite tienen
la fórmula general SDS, donde D representa un ácido graso
di-insaturado.
8. Una planta de girasol reivindicada en la
reivindicación 7, donde al menos 25% de las especies de
triacilglicerol de dicho aceite tienen la fórmula general SDS, donde
D representa un ácido graso di-insaturado.
9. Una planta de girasol reivindicada en la
reivindicación 7 u 8, donde al menos 26% de las especies de
triacilglicerol de dicho aceite tienen la fórmula general SDS, donde
D representa un ácido graso di-insaturado.
10. Una planta de girasol y sus partes
reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones
1-9, que contiene al menos un transgén.
11. Una semilla de girasol producida por una
planta de girasol reivindicada en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10.
12. Aceite de girasol que tiene un contenido de
ácido esteárico de al menos 22% en peso con respecto a la cantidad
total de ácido graso del aceite, y en cuyo aceite entre 6% y 12,4%
de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula general SMS y
no más de 5,0% de las especies de triacilglicerol tienen la fórmula
general SMM.
13. Un aceite de girasol reivindicado en la
reivindicación 12, que es extraído directamente sin tratamiento
adicional.
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