ES2308981T3 - Metodo para la estabilizacion de las inmunoglobulinas hibridas o fragmentos de inmunoglobulina y fragmentos anti-egp-2-scfv estabilizado. - Google Patents

Metodo para la estabilizacion de las inmunoglobulinas hibridas o fragmentos de inmunoglobulina y fragmentos anti-egp-2-scfv estabilizado. Download PDF

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Andreas Pluckthun
Annemarie Honegger
Jorg Willuda
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Universitaet Zuerich
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Abstract

Una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina enlazada al antígeno que es el fragmento scFv 4D5MOC- B anti-EGP-2 (SEQ-ID No.3).

Description

Método para la estabilización de las inmunoglobulinas híbridas o fragmentos de inmunoglobulina y fragmento anti-EGP-2-scFv estabilizado.
La presente invención se refiere a un método para estabilizar inmunoglobulinas híbridas o fragmentos de inmunoglobulinas. Además, la invención también proporciona un fragmento estabilizado anti-EGP-2 scFv.
Pequeños fragmentos de anticuerpo son realmente prometedores en cuanto a su uso como agentes terapéuticos, reactivos diagnósticos y para la investigación bioquímica. Por consiguiente, se necesitan en grandes cantidades, y la expresión de los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fv, Fv de cadena única (scFv), o Fab en el periplasma de E. coli (Skerra & Plückthun 1988; Better y cols., 1988) se utiliza ahora de forma rutinaria en muchos laboratorios. Sin embargo, los valores de la expresión varían ampliamente, en especial en el caso de los scFvs. Mientras algunos fragmentos ceden hasta varios mg de proteína soluble funcional por litro y OD de caldo de cultivo en el cultivo en frasco agitado (Carter y cols., 1992, Plückthun y cols., 1996), otros fragmentos pueden llegar a ser casi exclusivamente material insoluble, a menudo hallado en los denominados cuerpos de inclusión. Se pueden obtener proteínas funcionales de estos últimos en valores modestos mediante un proceso laborioso y que requiere tiempo. Los factores que influyen en los niveles de expresión del anticuerpo todavía son difíciles de comprender. La eficacia en el plegado y la estabilidad de los fragmentos de anticuerpos, la labilidad de la proteasa y la toxicidad de las proteínas expresadas frente a las células huésped a menudo limita gravemente los niveles actuales de producción, y se han hecho varios intentos para incrementar los valores de expresión. Por ejemplo, Knappik & Plückthün han identificado residuos clave en la red de anticuerpos que influyen dramáticamente en los valores de la expresión. Del mismo modo, Ullrich y cols. (1995) descubrieron que las mutaciones puntuales en los CDRs pueden incrementar los valores en la expresión del fragmento periplásmico de los anticuerpos. Sin embargo, estas estrategias son solamente aplicables a unos pocos anticuerpos.
Las observaciones por parte de Knappik & Plückthun (1995) indican que optimizando esas partes del fragmento de anticuerpo que no están directamente implicadas en el reconocimiento del antígeno pueden mejorar de forma significativa las propiedades de plegado y los rendimientos de producción de los Fv y scFv recombinados. Las causas para un mejor comportamiento de la expresión residen en un modo reducido de agregarse de estas moléculas. Para otras moléculas, la estabilidad de los fragmentos y la resistencia de la proteasa también se pueden ver afectadas. La comprensión de cómo las modificaciones específicas de la secuencia cambian estas propiedades es todavía muy limitada y actualmente objeto de una activa investigación.
Los fragmentos de FV de única cadena (scFvs) son fragmentos de anticuerpo recombinado que consisten en dominios variables de la cadena ligera y pesada, conectados por un conector o enlace^{12, \ 13} peptídico flexible. Estos fragmentos conservan la afinidad del enlace monovalente y la especificidad del mAb original y pueden ser producidos eficazmente en las bacterias^{14}. Los ScFvs se pueden crear clonando los dominios variables de un mAb que presenta unas interesantes propiedades enlazantes de las células del hibridoma o bien por la selección directa de los fragmentos de scFv con la especificidad deseada de las colecciones de bacteriófagos inmunizados o indiferenciados^{15, \ 16}. Frecuentemente los scFvs clonados de los hibridomas presentan unos rendimientos de producción mínimos y una estabilidad termodinámica baja que limitan su utilidad para las aplicaciones in vivo 17, mientras que los scFvs seleccionados de las colecciones de bacteriófagos ya han sufrido una selección no solamente por el enlace del antígeno, sino que también por las propiedades de plegado y estabilidad en el formato del scFv^{18}.
Para las aplicaciones terapéuticas, se prefieren los anticuerpos humanos o los fragmentos de anticuerpos para evitar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, contra un fragmento de anticuerpo murino derivado de un anticuerpo monoclonal (respuesta HAMA). Para resolver dicho problema, se pueden obtener fragmentos de anticuerpos humanos por detección de colecciones de anticuerpos humanos (EP-A1 0859 841);Vaughab y cols., 1996). Otra solución consiste en trasplantar la especificidad de un anticuerpo monoclonal no humano mediante el injerto o transplante de las regiones CDR en una estructura humana (EP-B1 0 239400). Mejorando dicha técnica se pueden elaborar anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos con una actitud de enlace muy mejorada al incorporar los residuos adicionales derivados de dicho anticuerpo no humano (EP-B1 0 451 216). Además de conseguir la humanización, estas técnicas permiten "reparar" los fragmentos scFv con estabilidad subóptima y/o un rendimiento de plegado por el transplante de los CDRs de un fragmento de scFv con la afinidad de enlace deseada y la especificidad al esqueleto de una scFv diferente, de mejor comportamiento, tal como se demostraba por el fragmento 4-4-20 de anticuerpo de enlace a la fluoresceína cuyos CDRs se trasplantaban al esqueleto 4D5, lo que conducía a una mejoría clara tanto del valor de la expresión como de la estabilidad termodinámica^{18}. El esqueleto del 4D5 propiamente es un esqueleto artificial, que procede de la secuencia de consenso humana y se utilizaba para la humanización del anti-c-erbB2 (p185^{Her2}-ECD)4D5 mAb (Herceptin^{TM})^{19}. Estudios posteriores han demostrado la estabilidad termodinámica media del fragmento^{20} del anticuerpo 4D5 que se correlaciona con la estabilidad térmica de esta molécula (Wörn y Plückthun, 1999) y aparentemente es de importancia general para la aplicación in vivo de los scFvs.
El anticuerpo monoclonal murino (mAb) MOC31 reconoce la glucoproteína 2^{1}(EGP-2; también conocida por GA733-2,Ep-cAM o KSA) epitelial transmembrana 38 kDA. La EGP-2 es considerada como un antígeno de referencia adecuado para la ecografía del tumor y la terapia, ya que se encuentra expresada en exceso en una variedad de carcinomas humanos y no pasa a la circulación. Varios ensayos clínicos con anti-EGP-2 mAbs como el 17-1ª, KS1/4 y MOC31^{2, \ 3, \ 4} han demostrado el potencial de estos anticuerpos para la inmunoterapia activa y pasiva de los carcinomas humanos. La función exacta de la glucoproteína transmembrana EGP-2 se desconoce por el momento, aunque se ha propuesto un papel en la asociación célula-célula (Simon y cols., 1990). Informes recientes identifican la EGP-2 como una molécula de adhesión célula-célula homofílica^{5, \ 6}, y la EGP-2 se ha identificado como un modificador potencial de la reactividad química y del grado invasor^{7}. En un estudio que evalúa el potencial de los nuevos fármacos inmunoterapéuticos dirigidos a la EGP-2, la exotoxin-A(ETA) fusionada químicamente a mAb MOC31 retardaba el crecimiento de los grandes tumores^{8}.
Los antígenos asociados a los carcinomas como el c-erbB2 y el receptor del EGF, así como el EGP-2 han servido como de referencia para los anticuerpos radiomarcados para la ecografía del tumor y la terapia. Se han hecho esfuerzos para mejorar la eficacia del marcaje reduciendo el peso molecular e incrementando con ello la penetración tisular y el aclaramiento del suero de dichos anticuerpos. Los fragmentos Fab, (Fab)^{2}, dsFv y scFv, generados por la genotecnología tienen un gran potencial a este respecto^{9, \ 10}, aunque hasta ahora no se han determinado los formatos óptimos en lo que se refiere a estabilidad, peso molecular y afinidad y se tienen que ajustar para las diferentes proteínas de fusión del anticuerpo con un mecanismo efector dependiendo del sistema especial in vivo y del objetivo de aplicación^{11}.
Para el desarrollo del nuevo fragmento de anticuerpo a base de reactivos terapéuticos y de la imagen dirigidos al pancarcinoma asociado al antígeno epitelial glucoproteína-2 se clonaba el dominio variable del anti-EGP-2-hibridoma MOC31 murino en el formato del fragmento Fv de cadena única^{16}. Aunque el scFv resultante presentaba la afinidad de enlace esperada y la especificidad hacia el EGP-2, que también se mostraba en las secciones tisulares en los experimentos de histotinción inmunitaria por otros^{30}, se expresaba pobremente en el periplasma de las bacterias. Los experimentos de marcaje in vivo en los ratones desnudos que empleaban este fragmento scFv fallaban. El scFv no solo no se acumula en el tumor, sino que mostraba también unos índices de aclaramiento inferiores a los de un control irrelevante dirigido contra la fluoresceína. Se pudo demostrar que el MOC31 scFv formaba agregados de elevado peso molecular y perdía rápidamente su actividad cuando se incubaba en suero a una temperatura corporal (37ºC). Esto se debía principalmente a una estabilidad térmica insuficiente más que a una degradación proteolítica, puesto que también se podía observar una precipitación similar y una pérdida de actividad inmunitaria con la incubación de scFv altamente purificado en PBS a 37ºC.
Para obtener una molécula adecuada para la aplicación inmunoterapéutica a partir de este scFv inestable térmicamente y propenso a la agregación, se tenían que mejorar las propiedades biofísicas del anticuerpo. Básicamente, se abrían dos avenidas para lograr este objetivo: La evolución in vitro del MOC31 scFv hacia una mejor estabilidad térmica combinando la randomización con la selección para una mejor funcionalidad^{35} a una temperatura elevada o bien la transferencia de la especificidad de enlace del anti-EGP-2 scFv MOC31 a un esqueleto scFv con las anteriores propiedades biofísicas medias mediante el injerto CDR^{18}. Aunque la primera opción se ha utilizado con éxito para conseguir scFvs extremadamente estables^{35}, la segunda opción tenía la ventaja añadida de que al elegir una secuencia humana para el injerto, se podía conseguir una humanización al mismo tiempo, reduciendo así la inmunogenicidad potencial de futuros reactivos inmunoterapéuticos. Por lo tanto se decidía injertar la especificidad de enlace del anti-EGP-2 scFv MOC31 en el esqueleto de consenso humano artificial del scFv 4D5, que corresponde esencialmente a las secuencias germicidas IGVH 3-66 e IGVK 1-39(IMGT). Más de 100 veces se ha utilizado la técnica del injerto de regiones determinantes complementarias (CDRs) del mAbs para la humanización^{10} y actualmente se considera una tecnología estándar. El esqueleto 4D5 se ha utilizado con éxito varias veces como un aceptor del CDR^{21, \ 18, \ 36}.
Esta estrategia resultaba satisfactoria ya que la variante del injerto 4DSMOC-A presentaba unas características de enlace que no se distinguían de las del anticuerpo original y del scFv.
Sin embargo, la 4DSMOC-A presentaba únicamente un producto intermedio de estabilidad térmica entre el de las dos moléculas originales 4D5 y MOC31.
Los datos de biodistribución indicaban que el scFv MOC31 que perdía la mayor parte de su actividad en menos de una hora a 37ºC no se enriquecía en el tumor, y la variante 4D5MOC-A del injerto, estable durante pocas horas a 37ºC se enriquecía solo ligeramente.
Por consiguiente, el problema técnico que se plantea la presente invención consiste en lograr un método que permita la estabilización del fragmento scfv híbrido enlazado al anti-EGP-2 4D5MOC-A. La solución a los problemas técnicos anteriores se consigue mediante las configuraciones caracterizadas en las reclamaciones. De acuerdo con ello, la presente invención permite identificar y modificar los residuos de las inmunoglobulinas híbridas o de los fragmentos de inmunoglobulina que conducen a una estabilidad elevada. La propuesta técnica de la presente invención, es decir, la identificación y el intercambio de residuos aminoácidos en las regiones que rodean el dominio VH para estabilizar las inmunoglobulinas híbridas o los fragmentos de inmunoglobulinas formados por el injerto mediante CDR no ha sido sugerido ni previsto en la versión anterior.
En el contexto de la presente solicitud, se utilizan las siguientes abreviaciones:
"Quimera" se utiliza en lugar de la expresión "inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina híbrida", "donante" en lugar de "inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina donante", y "receptor" en lugar de "inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina receptora". EL término "quimérico o híbrido" en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula compuesta de partes de dos moléculas diferentes.
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Los fragmentos de inmunoglobulina pueden ser Fv, scFv, Fv enlazado al disulfuro (Glockshuber y cols., 1992; Brinkmann y cols., 1993), fragmentos de Fab, (Fab')_{2} u otros fragmentos bien conocidos por el experto, que comprenden el dominio variable de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina.
Se prefiere en particular el formato del fragmento scFv.
El término "asas de unión al antígeno" se refiere a aquellas partes del dominio variable de las inmunoglobulinas o de los fragmentos de inmunoglobulina que son esencialmente responsables de la fijación o unión del antígeno. Rabat y cols. (1979) definían las regiones que determinan la el carácter complementario (cDRS) como responsables de la fijación del antígeno en base al grado de variabilidad hallado en las secuencias de anticuerpos. Posteriormente, Chothia y sus colaboradores definían las asas de fijación del antígeno en base a consideraciones estructurales. Allazikani y cols. (1997) revisan y comparan las definiciones conforme a Rabat y Chothia. El término "residuos adicionales de dicho donante si se precisan" se refiere a la situación de que los residuos adicionales fuera de las asas que se unen al antígeno son injertados en el receptor. EP-B1 0 451 216 revela métodos que permiten identificar dichos residuos.
El análisis implica el análisis de los contactos entre los residuos del esqueleto y la identificación de las diferencias en los modelos de enlace del hidrógeno, ángulos de torsión de las cadenas laterales, cambios de la conformación de la cadena principal de polipéptidos y de la estructura terciaria. Especialmente preferido es el análisis de los residuos en el esqueleto 1 del dominio VH, y más preferido es el análisis de las diferencias ocasionadas por los diferentes residuos en las posiciones H6 a H10, y las consecuencias de dichas diferencias en todo el dominio de VH por las interacciones con adicionales residuos del dominio VH y la secuencia correlacionada y las diferencias conformacionales^{31}. Las diferencias en las posiciones H6 a H10 pueden ser utilizadas para definir subgrupos de diferente estructura de referencia.
En el contexto de la presente invención, se utiliza un esquema a base de números de acuerdo con Kabat y cols. (1979). Por consiguiente, el número no corresponde necesariamente a la posición actual en el orden secuencial de los residuos en una cadena VH o VL, sino que indica una posición relativa que corresponde a las secuencias en la base de datos Rabat de las secuencias de anticuerpos. "H" se refiere a las posiciones en VH, "L" a las posiciones en VL. Por tanto, H6 es el número del residuo 6 según Kabat en VH.
Los datos sobre las estructuras del dominio VH se pueden obtener en los estudios de RMN, o preferiblemente a partir de las estructuras de rayos X de las inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina. Los modelos de homología pueden ser generados usando diferentes paquetes de software de modelo molecular disponibles y bien conocidos por el experto. Preferiblemente, se utiliza el software Insight97 (Biosym/MSI, módulos Homology, Biopolymer y Discover).
Preferiblemente, la identidad de secuencia de los dominios VH utilizados para el análisis de estructuras y/o el modelado de estructuras muestra un elevado grado de identidad de secuencia respecto al correspondiente dominio VH de dicho donante o receptor. Preferiblemente, dicha identidad de secuencia es superior al 75%, y más preferiblemente mayor del 80%.
Una o más de dichas posiciones de estructura pueden comprender H6 ó H9.
La presente invención se refiere a un método en el que dicho receptor es el fragmento humano scFv 4D5 anti-c-ErbB2 (SEQ-ID No.1).
Antes ya se ha descrito el fragmento scFv 4D5 anti-c-ErbB2.
Dicho donante es el fragmento scFv anti-EGP-2 scfv obtenido del hibridoma murino MOC31 (SEQ-ID No.2). El hibridoma murino MOC31 y el fragmento scFv anti-EGP-2 obtenido del mismo se ha descrito aquí con anterioridad y en el ejemplo.
Las posiciones de referencia en VH son H6, H9, H18, H20, H38, H63, H82 y H109 (numeradas de acuerdo con Kabat y cols. (1979), ver antes).
La presente invención se refiere a un método, en el que dicha inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina fijada al antígeno, estabilizada, es el fragmento scFv 4D5MOC-B (SEQ-ID No.3) anti-EGP-2.
En otra configuración, la presente invención hace referencia a una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina que se fija al antígeno, estabilizada de acuerdo con un método de la presente invención, en la que dicha inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina fijada al antígeno es el fragmento scFv 4DSMOC-B anti-EGP-2 (SEQ-ID No.3).
Se revela una inmunoglobulina, fijada al antígeno, modificada o una inmunoglobulina que comprende el dominio variable de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina fijada al antígeno, estabilizada conforme a un método de la presente invención, de manera que dicha modificación sea
a)
la conversión a un fragmento diferente de inmunoglobulina o a la inmunoglobulina completa, y/o
b)
la fijación de mitades adicionales, como las etiquetas de detección o purificación, las moléculas indicadoras, las moléculas efector, los dominios de asociación o combinaciones de los mismos.
Dichos fragmentos de inmunoglobulina modificados pueden ser un Fv, scFv, Fv enlazado a disulfuros, Fab, fragmentos de (Fab')_{2} o bien otro fragmento, o una inmunoglobulina completa como la IgG, IgA, IgM, bien conocidas por el experto, que comprenden el dominio variable de dicha inmunoglobulina estabilizada o del fragmento de inmunoglobulina y que es diferente del formato de inmunoglobulina o del fragmento de inmunoglobulina de dicha inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina estabilizado.
Se prefieren especialmente las mitades que tienen una función terapéutica útil. Por ejemplo, la mitad adicional puede ser una molécula de toxina capaz de matar células (Vitetta y cols., 1993). Existen numerosos ejemplos de dichas toxinas, bien conocidas por los expertos, como las toxinas bacterianas, la Pseudomonas exotoxin A, y la toxina difteria, así como las toxinas de plantas, ricina, abrina, modeocina, saponina y gelonina. Fundiendo dicha toxina para tener un fragmento de inmunoglobulina o una inmunoglobulina conforme a la presente invención, la toxina puede ser dirigida hacia, por ejemplo, células enfermas y con ello tener un efecto terapéutico beneficioso. Alternativamente, la mitad adicional puede ser una citoquinina, como la IL-2 (Rosenberg & Lotze, 1986), que tenga un efecto especial (en este caso un efecto proliferativo de la célula T) en una familia de células. En otra configuración preferida, la mitad adicional es al menos parte de una proteína superficial que puede dirigir la proteína de fusión hacia la superficie de un organismo, por ejemplo, una célula o un bacteriófago, y con ello exterioriza la inmunoglobulina o el fragmento de inmunoglobulina. Preferiblemente, la mitad adicional es al menos parte de una proteína revestida de bacteriófagos filamentosos, más preferiblemente de la proteína génica. En otra configuración, la mitad adicional puede aportar a su inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina un medio de detección y/o de purificación. Por ejemplo, la proteína de fusión podría comprender la inmunoglobulina modificada o el fragmento de inmunoglobulina y un enzima frecuentemente utilizado para fines de detección, como la fosfatasa alcalina (Blake y cols., 1984). Existen otras mitades que se pueden utilizar como etiquetas de detección o purificación, y que son bien conocidas por el experto en la materia. La invención también ha aportado mitades adicionales como las etiquetas FLAG y c-myc utilizadas frecuentemente (Hopp y cols., 1988; Knappik & Plückthun, 1994).
Mediante la genomanipulación de uno o más dominios adicionales, la inmunoglobulina o el fragmento de inmunoglobulina se pueden acoplar a moléculas más grandes. Hasta el punto de que las propiedades físicas de la inmunoglobulina o del fragmento de inmunoglobulina determinen las características del montaje, la presente invención proporciona un medio para incrementar la estabilidad de esas moléculas más grandes. Por ejemplo, los mini-anticuerpos (Pack, 1994) son dímeros que comprenden dos fragmentos scFv, cada uno de ellos unido a un dominio de dimerización asociado. Los dominios de dimerización especialmente preferidos incluyen los derivados de una cremallera de leucina (Pack-Plückthun, 1992) o bien un motivo hélice-giro-hélice (Pack y cols., 1993).
Dicha modificación puede ser la fijación de una cola de penta- o hexahistidina.
Los péptidos que comprenden al menos cinco residuos de histidina (Hochuli y cols., 1988) son capaces de enlazarse a los iones metálicos y por lo tanto pueden ser utilizados para la purificación de la proteína a la que se unen por fusión (Lindner y cols., 1992). Los vectores como el pIG-6 (ver ejemplo) que codifican una cola de pentahistidina se pueden utilizar para fabricar dichas inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina modificados. Además, el pIG-6 proporciona una cola N-terminal FLAG y una cola C-terminal c-myc para fines de detección.
Se prefiere además un fragmento modificado en el que dicha cola de penta- o hexahistidina forme un complejo con una mitad 99m Tc-tricarbonilo.
Se ha descrito el método de marcaje del 99mTc específico cola his (Alberto y cols., 1988). El trihidrato 99mTc-tricarbonilo froma complejos muy estables con la cola de penta- o hexahistidina. Los fragmentos modificados que contienen una mitad 99mTC-tricarbonilo pueden ser utilizados para métodos de radioterapia o radiografía.
Se prefieren además una secuencia de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico que codifiquen una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina conforme a la presente invención. Dependiendo del tipo de fragmento de inmunoglobulina se requiere una secuencia de ácido nucleico aislada, por ejemplo, para codificar un fragmento de scFv, o bien dos, por ejemplo, para codificar un fragmento de Fab, o más secuencias de ácido nucleico. Preferiblemente dichas secuencias se componen de un vector, preferiblemente un vector adecuado para la secuencia y/o expresión. Dicho vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico puede encontrarse en una célula huésped.
En otra configuración preferida, la presente invención hace referencia a un método para la producción de un fragmento estabilizado de inmunoglobulina o bien una inmunoglobulina ligada al antígeno conforme a la presente invención, que comprenda la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico conforme a la invención que codifique dicha inmunoglobulina ligada al antígeno o el fragmento de inmunoglobulina en un sistema de expresión adecuado.
El sistema de expresión puede ser la expresión en un huésped o anfitrión adecuado. El huésped al que aquí hace referencia puede ser cualquiera de los frecuentemente utilizados en la producción de proteínas heterológicas, que incluye pero no se limita a las bacterias, como la E. coli (Ge y cols,1995) o el Bacillus subtilis (Wu y cols., 1993), hongos, como levaduras (Horwitz y cols., 1988; Ridder y cols., 1995) o bien hongos filamentosos (Nyyssönen y cols., 1993), células vegetales (Hiatt, 1990, Hiatt & Ma, 1993; Whitelam y cols., 1994), células de insectos (Potter y cols., 1993; Ward y cols., 1995), o células mamíferas (Trill y cols., 1995).
El sistema de expresión puede ser la expresión en un sistema de traslación libre de células, preferiblemente en un sistema de transcripción/traslación in vitro acoplado. Preferiblemente, dicha traslación se realiza en un sistema de traslación procariótico. Se prefiere especialmente en un sistema de traslación basado en E. coli como el sistema de traslación S-30. Alternativamente, la traslación puede ser llevada a cabo en un sistema de traslación eucariótico.
En otra configuración más preferida, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina enlazada al antígeno conforme a la presente invención y, opcionalmente, un soporte y/o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
En otra configuración todavía más preferida, la presente invención se refiere al uso de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina estabilizada conforme a la presente invención, o bien de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina modificada conforme a la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de los carcinomas humanos.
Además es preferible el uso del fragmento anti-EGP-2 scFv 4DSMOC-8 conforme a la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de carcinomas humanos.
En otra configuración incluso más preferida, la invención se refiere a una composición diagnóstica que contiene una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina enlazada al antígeno conforme a la presente invención.
En otra configuración más preferida, la presente invención se refiere a un equipo para el diagnóstico que contiene una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina enlazada al antígeno conforme a la presente invención.
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Leyendas de las figuras
Figura 1
La alineación de la secuencia de los dominios VL y VH de scFv MOC31, 4DSMOC-A, 4DSMOC-B y 4D5: (A) Mediante unas letras negras sobre un fondo gris se indican las posiciones del convenio de secuencia entre MOC31 y 4D5 pero son diferentes con MOC31 por las letras negras sobre un fondo blando y los residuos que coinciden con MOC31 pero no con 4D5 vienen indicados por letras blancas sobre un fondo negro. Las etiquetas de los residuos y las definiciones CDR están de acuerdo con Kabat (1987). (B) indica residuos sepultados en el centro del dominio o en la interfaz, (b) residuos semienterrados, (*) y (*) indican potenciales residuos de contacto con el antígeno, detectados por una gran pérdida (*>40%) o pequeña pérdida (*>1%) de superficie accesible al disolvente de cadena lateral en la formación de complejos, promediada para esta posición sobre todos los complejos diferentes de proteína-anticuerpo en la base de datos PDB. Modelo del fragmento scFv 4DSMOC-B: (B) Estructura cuaternaria del fragmento anti-EGP-2 scFv 4D5MOC-B, compuesto de VL (gris) y VH (blanco) con residuos del contacto con el antígeno de MOC31 (negro). Destacan los ocho residuos murinos transferidos adicionales en el núcleo de VH. Un modelo de relleno del espacio muestra el 4DSMOC-B en la vista superior(C) y en la vista inferior (D). Las bolas negras son de murino y las blancas de origen 4D5, mientras que las bolas grises son las mismas en 4D5 y MOC31.
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Figura 2
Resultado de la purificación de scFv 4DSMOC-A y 4D5MOC-B. SDS-Page en condiciones reductoras presenta el resultado de la purificación de scFc 4D5MOC-A y 4D5MOC-B tras IMAC y tras la realización del intercambio iónico. (MW estándar:fosforilasa b(97,4 kDa); albúmina de suero bovino (66 kDa); anhidrasa carbónica (29 kDa), inhibidor de tripsina (21,5 kDa); lisozima (14,3 kDa).
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Figura 3
Experimentos de enlace con 99mTc-etiquetado 4D5MOC-A y -B(RIA)
(A)
Radioinmunoanálisis (RIA) de competencia del 4D5MOC-A y 4D5MOC-B marcados con Tc en las células cancerígenas de pulmón SW2 con MOC31. 50 ng de fragmento scFv radiomarcado se incubaban con o sin MOC31 (10 \mug) o con la misma cantidad de un anticuerpo monoclonal anti c-erbB2 como inhibidor irrelevante.
(B)
Especificidad de enlace del 4D5MOC-A y del 4D5MOC-B marcados con 99mTc en diferentes antígenos (500 ng/pocillo).
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Figura 4
Verificación de la estabilidad térmica y del suero
La filtración en gel en una columna superdex 75 antes y después de una incubación durante la noche (20 h) a 37ºC de 4DSMOC-A(A) y 4D5MOC-B(B). Determinación de la inmunoactividad restante de los fragmentos de scFv anti-EGP-2 marcados con ^{99m}Tc antes (C) y después de un periodo de incubación (D) nocturno en el suero humano a 37ºC por incubación mediante el ensayo Lindmo^{29}.
El ejemplo ilustra la invención.
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Ejemplo
(Willuda y cols., 1999)
Material y métodos Estirpe celular mamífera
La estirpe celular del carcinoma pulmonar humano de célula pequeña SW2, amablemente suministrada por el Dr. S.D.Bernal (Dana Farber Cancer Institute, Boston, Mass., USA) y la estirpe celular de cáncer de mama SK-BR-3 (#HTB 30, American type culture collection, Rockville, MD) se mantenían en RPMI 1640 (Hyclone, Europe Ltd) como medio al que se añadía un 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY) y se dejaba que creciera a 37ºC bajo una atmósfera de un 5% de CO_{2}. La estirpe celular de cáncer de mama SK-OV-3 (#HTB 77, American type culture collection, Rockville, MD) se cultivaba en RPMI 1640, al que se añadía EGF (10 ng/ml) e insulina
(5 ng/ml).
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Fragmentos de Fv de cadena única y de glucoproteína -2 (EGP-2) epitelial
La glucoproteína-2 epitelial humana se producía como una proteína soluble recombinante (M1-F259) con una cola C-terminal de seis histidinas utilizando el vector de expresión pBB4(GA-733-2 en el sistema de expresión del báculovirus (Invitrogen). El fragmento scFv anti-EGP-2 (scFv MOC31) se recogía del ARNm aislado de la estirpe celular de hibridoma murino MOC31^{1} usando un sistema de visualización del bacteriófago genomanipulado descrito antes^{16}. El fragmento Fv de cadena única del anticuerpo 4D5 humano anti-c-erbB2 se ha construido a partir del fragmento Fab (Carter y cols.) y se había utilizado en varios estudios antes^{21, \ 20}.
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Modelado molecular/Construcción del injerto
Un modelo de homología del fragmento scFv anti-EGP-2 se generaba utilizando el software de modelado molecular Insight97 (Biosym/MSI, módulos Homology, Biopolymer y Discover). El modelo de dominio V_{L} se basaba en las estructuras de rayos x del fragmento Fab de ratón. JEL 103(^{22}, Brookhaven Database entradas 1mrc, 1mrd, 1mre y 1mrf, resolución del 2,3%-2,4%, identidad de secuencia del 76% respecto al MOC31), el modelo del dominio V_{H} se basaba en la estructura de una antineuraminidasa Fab (^{23, \ 24}, entradas pdb 1nca, 1ncb, 1ncc y 1ncd, resolución del 2,5%, identidad del 85%) y la conformación de CDR H3 del Fab TE33 anticleratoxina (^{25,} pdb entrada 1tet, 2,3% resolución, identidad del 82%). Los modelos del dominio MOC31 se superponían en la estructura de cristal del Fv de la versión 8 humanizada 4D5 (^{26}, pdb entrada 1fvc, resolución del 2,2%, V_{L}: identidad del 55%, V_{H}: identidad del 50% respecto a MOC31). Los contactos potenciales del antígeno se identificaban comparando la superficie accesible de solvente de cadena lateral de complejos conocidos anticuerpo-proteína en presencia y ausencia del ligando usando el programa naccess (S.Hubbard y J. Thomton, 1992, http://sjh.bi.umist.ac.uk/naccess.html). Se comprobaban los posibles conflictos estéricos de los modelos, los contactos potenciales con antígenos y los residuos que podrían tener una influencia directa en las conformaciones CDR, dando lugar al scFv híbrido 4D5MOC-A. En una segunda construcción génica, el scFv 4D5MOC-B, 8 residuos clave en el núcleo del V_{H} eran retenidos de la secuencia MOC31 en lugar de cambiarlos a la secuencia 4D5 con el fin de preservar el subtipo estructural del esqueleto MOC31 V_{H}.
Las secuencias designadas para ambas variantes eran trasladadas de vuelta (paquete GCG) y los fragmentos se construían mediante síntesis genética 27 de ocho oligonucleótidos superpuestos para V_{L} y diez para las dos variantes distintas de V_{H}, en la orientación V_{L}-enlazador-V_{H}. La longitud de los oligonucleótidos usados se situaba entre 40 bp y 78 bp. Cada dominio se fabricaba por separado y se clonaba con un extremo curvado en el vector pBluescript (Stratagene) y posteriormente se secuenciaba. Los dominios V_{L} y V_{H} se clonaban luego en el vector de expresión pIG6 (Ge y cols., 1995). Un enlazador no repetitivo TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS^{28} se introducía luego por mutagénesis por inserción de un casete vía los puntos de restricción AfIII y BamHI.
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Expresión y purificación de fragmentos Fv de cadena única
Para la expresión periplásmica del fragmento scFv enlazado al c-erbB2 4D5 y de los fragmentos scFv enlazados al EGP-2 4D5MOC-A y 4DSMOC-B, se utilizaba el vector pIG6, mientras que el vector pAK400^{16} se utilizaba para la expresión del scFvMOC31. Para una producción a gran escala, se utilizaba la cepa E. coli SB536 (Bass y cols. 1996). Un litro de dYT que contiene un 1% de glu y ampicilina (30 \mug/ml) se inducía en un frasco de agitación de 5 litros con una concentración final de 1mM de isopropil-D-galactopiranosida (IPTG;Boehringer Mannheim) durante tres a cuatro horas a 24ºC. El OD final era de cinco-seis para 4D5, 4D5MOC-A 4D5MOC-B y cuatro para scFv MOC31). Los gránulos recogidos se almacenaban a -80ºC.
Para la purificación se volvía a suspender el gránulo de un cultivo de 1 litro en Hepes 20 mM a pH 7,0. Se añadía NaCl 0,30 mM y se sometía a una lisis con dos ciclos en una prensa French Pressure Cell (SLS instruments Inc., Urbana Illinois, USA). El lisado aclarado se centrifugaba en un rotor SS-34 a 48246 g a 4ºC y se esterilizaba el filtro. Todos los fragmentos Fv de cadena única se purificaban en una columna Ni^{+}-IDA y en una columna de intercambio iónico HS/M-4,6/100, se acoplaban en línea a un sistema BIOCAD (Perseptive BioSystem. Inc.) tal como se ha descrito previamente (Plückthun 1996, capítulo del libro). Tras cargar el lisado en la columna Ni^{+}-IDA la columna se lavaba con Hepes 20 mM pH 7,0, NaCl 500 mM y en una segunda etapa con Hepes 20 mM pH 7,0, imidazol 0,40 mM antes de que la proteína unida se eluyera con imidazol 200 mM, pH 7,0. El eluido se cargaba directamente a la columna de intercambio iónico HS/M-4,6/100, y la proteína específicamente enlazada se eluía con un gradiente salino de 0 a 500 mM de NaCl en Hepes 20 mM pH 7,0. La fracción que contiene el fragmento de anticuerpo se dializaba frente a un exceso de PBS y se concentraba hasta 1 mg/ml usando un filtro 10 kDa (enlace proteínico mínimo Ultrafree-MC, Millipore) por centrifugación a 4000 g a 4ºC. Para el fragmento scFv anti-EGP-2 MOC31 era necesario realizar una filtración en gel preparatoria sobre una columna de Superdex 75 (Pharmacia) como la tercera etapa de purificación que disminuyera la producción final unas diez veces. El resultado de la purificación se verificaba en una SDS-PAGE del 12,5% en condiciones reductoras. Los pesos moleculares de todos los scFvs purificados se comprobaban mediante espectrometría de masa.
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Marcaje con ^{99m}technetium específico His de fragmentos Fv de una sola cadena
El ^{99m}Tc-tricarboniltrihidrato (Alberto y cols., 1998) forma complejos muy estables con la cola de penta o hexahistidina, por lo que se hace un uso doble de la cola His que está presente para la purificación de la cromatografía de afinidad del metal inmovilizado (IMAC). Los fragmentos scFv (1 mg/ml) se mezclaban con una tercera parte del volumen de ^{99m}Tc-tricarboniltrihidrato (30 mCi/ml) en tampón y una tercera parte del volumen de MES 0,5M pH 6,2 y se incubaban durante treinta minutos a 37ºC. El ScFv MOC31 se etiquetaba durante 30 minutos a 30ºC a una concentración proteínica de 400 \mug/ml para evitar la precipitación. La mezcla de reacción se desalaba en una columna desaladora rápida (Pharmacia) equilibrada con PVS. Las partes alícuotas de las fracciones recogidas se medían en un contador de escintilación para identificar las fracciones con la proteína marcada.
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Filtración en gel analítica
La filtración en gel analítica se realizaba con el sistema Smart (Pharmacia), usando una columna Superdex 75. Todas las mediciones se realizaban en un tampón PBS que contiene un 0,005% de Tween-20. Los fragmentos scFv se inyectaban en una concentración de 1 mg/ml en un volumen de 15 \mul antes y después de un periodo de incubación nocturno de 20 h a 37ºC. La columna se calibraba en el mismo tampón con alcohol deshidrogenasa (150 kDa), albúmina de suero bovino (66 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa) y citocromo c (12,4 kDa) como estándares de masa molecular.
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Especificidad del enlace
La especificidad del enlace de los diferentes fragmentos scFv se verificaba por competencia con el anticuerpo monoclonal MOC31. 50 ng de scFv 4D5MOC-A o 4D5MOC-B radiomarcado se incubaban con 0,5 x 10*6* células SW2 en 200 \mul de PBS/1% BSA después de la preincubación con o sin el mAb MOC31 (10 \mug) o con la misma cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-c-erb82 como un competidor irrelevante para 30 min a 4ºC. En las tres etapas de lavado las células se centrifugaban a 1000g durante 5 min a 4ºC, se descartaba el sobrenadante y las células se volvían a suspender en PBS/1% BSA. La radiactividad restante se medía luego en un contador de escintilación. En un experimento adicional de enlace ambos fragmentos scFV (50 ng) se incubaban con diferentes antígenos, se revestían (500 ng/pocillo) en una placa de microvaloración de 96 pocillos, para comprobar la reactividad de cruce. Los pocillos se lavaban tres veces con PBS/1% BSA y se determinaba la radiactividad.
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Determinación de K_{D} por RIA y resonancia de plasmones superficiales (BIAcore)
La afinidad de enlace de los fragmentos Fv de cadena única etiquetados con ^{99m}Tc se determinaba en las células SW2 en un ensayo de radioinmunoafinidad (RIA). Las células SW2 (0,5x10^{6}) se incubaban con cantidades crecientes de fragmento Fv de cadena única (100 pM-30 nM) durante 1 hora a 4ºC. Para la estimación del control del enlace no específico, muestras de células se incubaban previamente con un exceso de 100 veces el fragmento Fv de única cadena no etiquetado durante 1 hora a 4ºC. La fracción enlazada de fragmento Fv de una sola cadena se determinaba en un contador de escintilación. Cada valor obtenido representa la media de dos muestras. Los recuentos por minutos (cpm) se representaban gráficamente frente a la concentración nanomolar del fragmento Fv de cadena única y se ajustaban con la función de regresión no lineal.
Las constantes de la velocidad cinética se determinaban mediante la resonancia del plasmón superficial (SPR) con un instrumento BIAcore. El antígeno EGP-2 soluble recombinante se acoplaba mediante un enlace covalente a un chip del sensor CM-5 a través de grupos amina libres, lo que daba lugar a un recubrimiento superficial de 350 unidades de resonancia. Los fragmentos Fv de cadena única se inyectaban en concentraciones crecientes (0,1 nM - 4 \muM) a una velocidad de flujo de 30 \mul/min de PBS/0,005% Tween 20 desgasificado. Las constantes de asociación y velocidad de disociación se calculaban a partir del sensorgrama mediante un ajuste global de la curva usando el software 3.0 de evaluación BIA (Pharmacia).
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Estabilidad en suero del sdFv radiomarcado a 37ºC
La fracción de fragmentos de Fv de cadena única todavía inmunoactiva después del marcaje radiactivo se determinaba tal como se ha descrito. Las muestras que contienen diferentes números de células (0,625x10^{6}-10x10^{6}) se incubaban en 100 \mul con 50 ng de fragmentos de scFv radiomarcados durante 1 h a 4ºC en un agitador. El enlace no específico se determinaba en muestras de control de células previamente incubadas con un exceso de 100 veces fragmentos scFv no marcados en PBS/1% BSA. Después de tres etapas de lavado, la cantidad de fragmentos scFv enlazados se determinaba luego en un contador de escintilación. Cada valor anotado representa la media del resultado de dos muestras. Para el cálculo de la inmunoactividad se dividían los recuentos totales por minuto (cpm) por el valor de cpm medido por proteína enlazada y luego se representaban contra el número de células inversas y se ajustaba por regresión lineal. El y-intercepto inverso en tanto por ciento indica el porcentaje de fragmentos Fv bioactivos de una sola cadena. Para calcular la estabilidad de los diferentes fragmentos Fv radiomarcados de cadena única en suero, se incubaban las moléculas durante la noche (20 h) en suero humano a 37ºC, en una concentración final de 17 \mug/ml y la inmunoactividad restante se determinaba en el ensayo Lindmo.
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Caracterización in vivo - aclaramiento y biodistribución
Los estudios de aclaramiento de la sangre se llevaban a cabo con ratones desnudos CD1 hembras libres de tumores de ocho semanas de edad. Cada ratón recibía por vía intravenosa 300 \muCi de scFv 4D5MOC-B marcado con ^{99m}Tc. Después de 7,5, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos posteriores a la inyección, se extraían las muestras de sangre y se calculaba el valor t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta a partir de la radiactividad medida. El estudio de biodistribución del fragmento scFv 4D5MOC-B marcado con ^{99m}Tc se realizaba en ratones desnudos CD1 de seis semanas de vida que llevaban xerografías SW2 de 13 días (40-80 mg). Cada ratón de los tres grupos de cuatro ratones recibía 30 \mug de scFv radiomarcado (300 \muCi). El análisis de biodistribución del scFv 4D5MOC-B marcado con ^{99m}Tc se llevaba a cabo en ratones negros de siete semanas de vida que llevaban xerografías SW2 de diez días (10-40 mg). Cada ratón de los tres grupos de tres ratones recibía 5 \mug de scFv marcado con ^{99m}Tc tecnetium MOC31(85 \muCi). El scFv FITC-E2 enlazado a la antifluoresceina se utilizaba como un anticuerpo de control no específico. Los ratones se sacrificaban a las 1, 4, 24 horas de la inyección. El tejido y los órganos se extraían y evaluaban usando un contador gamma. EL análisis de biodistribución con scFv 4D5 marcado con ^{99m}Tc se ha descrito recientemente (Walbel y cols., 1999).
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Resultados Modelado molecular-construcción del injerto
Hemos construido el fragmento scFv de MOC31 usando una metodología de visualización del bacteriófago
estándar^{16}, hemos determinado su funcionalidad y demostrado una afinidad bastante elevada respecto a su antígeno EGP-1 (tabla 1), que concuerda en secuencia y propiedades con un scFv MOC31^{30} construido independientemente. Sorprendentemente, la localización in vivo de este scFv era difícil de distinguir de un scFv de control sin la especificidad del EGP-2 y esencialmente el scFv MOC31 no se localizaba para un tumor xerografiado (tabla 2). Por lo tanto llegamos a la hipótesis de que esta proteína no es suficientemente estable y diseñamos dos variantes más estables, en primer lugar, injertando las asas a un esqueleto estable bien caracterizado y en segundo lugar, cambiando adicionalmente varios residuos en el interior de uno de los dominios variables. Como el esqueleto receptor, elegimos la versión humanizada de 4D5^{19}, propiamente un producto de un ejercicio de injerto. Este esqueleto consiste esencialmente en un dominio variable de cadena pesada procedente de la estirpe IGVH 3-66 (IMGT), VH 3-18 (Vbase), Locus DP 3-66(DP-86) y un dominio variable derivada de la línea IGVK 1-39(IMGT), VK 1-1(Vbase), locus DP O12.
Un modelo de homología de MOC31 se construía y se comparaba con la estructura de rayos X del fragmento Fv versión 8 4D5 humano (pdb entry Ifvc). Los residuos de contacto con el antígeno se identificaban por un análisis de los complejos de antígeno anticuerpo-proteína en el Brookhaven Protein Database (Fig. 1A). En base a esta información, mas que a las definiciones de Rabat, se decidía que residuos se extraían del esqueleto 4D5 y los que se cogían de la secuencia MOC31. El injerto resultantes no seguía pues estrictamente la definición CDR según Kabat y cols (1970) o Chotia (ver Allazikani y cols. 1997), pero incluye dos residuos (L64 y L66) que determinan la conformación del "asa externa" de V_{L} (residuos L66-L71). Se demostraba que la punta de esta asa contactaba con el antígeno en algunos complejos, y no se podía excluir una influencia de esta asa en la conformación de CDR L1. El residuo L66 generalmente es Gly en cadenas de luz kappa y asume un ángulo positivo \Phi. Si este residuo es sustituido por un residuo sin Gly (Arg en 4D5), el asa externa asume una conformación diferente, alejándose del dominio. En V_{H}, además de CDR H1, se incluían los residuos H27 a H30, mientras que algunos residuos en la base del CDR2 se omitían (H62 y H63), a pesar de ser parte del CDR H2 según las definiciones del CDR (Kabat y cols. 1979); Allazikani y cols. 1997) y varios residuos en el asa externa del V_{H}, a veces conocidos como CDR4, se incluían (residuos H69, H71, H75-77), lo que daba lugar a 4D5MOC-A (fig. 1A).
El análisis de las conformaciones de los esqueletos de dominio V_{H} revelaba que estos se pueden clasificar conforme a su conformación estructural en 4 subgrupos distintos. Las diferencias conformacionales son más vistosas en el esqueleto 1 (FR1), en particular en las posiciones H7-H10, aunque la secuencia correlacionada y las diferencias conformacionales se hallan en todas las moléculas, que implican varios residuos centrales^{31}. Estos cambios conformacionales son causados probablemente por los modelos de enlace de hidrógeno diferentes que el íntegramente sepultado Glu H6 (como en 4D5) o el Gln H6 (como en LOC31) establece en el núcleo del dominio y además se ven influenciados por la naturaleza del residuo H9 (Pro, Gly u otros residuos)^{32}. Saul y Poljak (1993) informaron de cambios estructurales correlacionados que afectaban a los residuos H9, H18, H82, H67 y H63, que deben los efectos de los cambios en la conformación FR1 a través del núcleo del dominio a la base de CDR2, permitiéndoles influir potencialmente en el enlace del antígeno.
De acuerdo con esta clasificación, MOC31 pertenece a una subclase diferente que la 4D5. Puesto que no sabíamos hasta que punto estas clases de esqueleto afectan a la funcionalidad de un injerto de asa, decidimos verificar este aspecto de modo experimental. Mientras que en 4D5MOC-A el esqueleto del dominio V_{H} se modificaba al subtipo 4D5, el 4DSMOC-B mantiene íntegramente el envase del núcleo MOC31 así como los residuos críticos de la conformidad H6 y H9. Para lograrlo, ocho residuos adicionales de la secuencia del fragmento Fv de cadena única anti-EGP-2 (H6, H9, H18, H20, H38, H63, H82 y H109) tenían que retener la secuencia MOC31. Todos estos cambios se localizan en la mitad inferior del scFv(fig. y con la excepción de la sustitución de Gly por Pro en la posición H9, están sepultados en el núcleo del dominio. Por lo tanto no se espera que influya en la inmunogenicidad del esqueleto.
Para la introducción de la restricción Afill era necesario modificar la secuencia C-terminal del dominio V_{L} en todos los elementos desde ELKRA hasta ELKRA, lo que no afectaría a la estructura del dominio.
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Expresión y purificación de los fragmentos scFv
Para el scFv 4D5 se podían purificar generalmente 1-2 mg a partir de un litro de cultivo, mientras que para el scFv MOC31 el rendimiento era muy inferior. Tras dos etapas de purificación el scFv MOC31 daba solamente 200 \mug con una pureza del 70%. La coexpresión del skp33 aumentaba el rendimiento a 600 \mug, pero todavía existía un producto de degradación 20 kDa presente. La variante del injerto scFv 4D5MOC-A se podía purificar hasta un rendimiento de 400 \mug y la 4D5MOC-B hasta de 1 mg con una pureza del 95%. Ambos fragmentos Fv de cadena única se podían concentrar en 1mg/ml y se analizaban en una SDS-PAGE reductora (fig.2). La espectrometría de masa de ambas moléculas mostraba el peso molecular esperado de 29,855 Da para scFv 4D5MOC-A y de 29,897 Da para scFv 4D5MOC-B.
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Especificidad del enlace
La transferencia de la especificidad del enlace al anti-EGP-2 del scFv MOC31 en el esqueleto del scFv4D5 resultaba tener éxito para ambas variantes, la 4D5MOC-A y la 4D5MOC-B, por competencia ligante de las variantes del injerto radiomarcadas frente a las células SW2 de sobreexpresión de EGP-2. Solamente el anticuerpo monoclonal MOC31 podía inhibir el enlace de las variantes del injerto, mientras que un anticuerpo de control irrelevante no cometía (fig. 3A). No se observaba reactividad cruzada de las moléculas injertadas cuando se incubaban en el receptor EGF o c-erbB2 (dominio extracelular) (Fig.3B).
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Determinación de K_{D}
El enlace de elevada afinidad con tiempo residual largo en el antígeno específico de referencia es considerado como una de las características más importantes de los anticuerpos para el marcaje de tumores. Para garantizar que la afinidad del enlace se conservaba en las constantes de disociación del experimento del injerto del fragmento Fv de cadena única radiomarcado, se determinaban en las células en un ensayo de radioinmunoanálisis (RIA). Las variantes del injerto presentaban un comportamiento en el enlace similar y específico comparable al del fragmento Fv de cadena única anti-EGP-2 original en la escala nanomolar (tabla 1).
La cinética de enlace de los fragmentos de scFv no marcados respecto al EGP-2 inmovilizado también se analizaban por resonancia del plasmón superficial (tabla 1) en el instrumento BIAcore (Pharmacia). Para minimizar los efectos del re-enlace que podrían conducir a una subestimación de las constantes de disociación, utilizábamos revestimiento de baja densidad y elevada velocidad de flujo. El ScFv MOC31 presentaba un enlace estable en su referencia con una vida media de aproximadamente 38 min de acuerdo con una determinación independiente (vida media de 33 min) 30. Los valores K_{off} del scFv 4D5MOC-A y del 4D5MOC-B eran muy similares al scFv MOC31 original (tabla 1), lo que indica que la transferencia completa de las propiedades de enlace del scFv MOC31 en el esqueleto 4D5 era satisfactoria.
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Filtración en gel analítica y prueba de agregación térmica
Para muchas aplicaciones de los scFvs resulta crucial concentrar estas moléculas e incubarlas a elevadas temperaturas. El comportamiento biofísico de estas moléculas es a menudo el umbral de su aplicabilidad in vivo. Por lo tanto, nosotros analizabamos el comportamiento de agregación de los scFvs a concentraciones elevadas y altas temperaturas. Mientras que el 4D5, 4D5MOC-A y 4D5MOC-B se podían concentrar hasta 1 mg/ml por ultrafiltración, el MOC31 scFv se precipitaba a concentraciones superiores a 400 \mug/ml. A esta concentración, aproximadamente un 10% de la proteína total se eluía como agregados de elevado peso molecular con la filtración en gel analítica con el sistema de filtración en gel Smart (Pharmacia) en una columna Superdex 75. Casi el 90% de la proteína se eluía en un volumen de 1,27 ml tal como se esperaba para la especie monomérica. Sin embargo, ya a los 30 minutos a 37ºC, aproximadamente un 85% de la proteína se precipitaba. El 15% de proteína soluble restante te eluía como una especie monomérica (datos no mostrados).
Las dos variantes injertadas 4D5MOC-A y 4D5MOC-B se eluían en un volumen de 1,20 ml, lo que corresponde a un peso molecular de 30 kDa, lo que indica que ambos fragmentos Fv de cadena simple existen como monómeros en una concentración de 1 mg/ml. Aunque el 4D5MOC-A se precipitaba más lentamente que el MOC31, la incubación durante la noche en PBS a 37ºC durante 20 horas y la posterior filtración en gel indicaban que caso no existía proteína eluida (fig. 4A). Incubada en las mismas condiciones la 4D5MOC-B todavía se eluía como un pico simétrico en un volumen de 1,20 ml (fig. 4B), lo que indica una gran diferencia en la estabilidad intrínseca (térmica) de las dos variantes. Y lo que es más importante, la 4D5MOC-B mostraba tener las propiedades biofísicas requeridas para la aplicación in vivo.
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Etiquetado de ^{99m}technetium específico his
Los fragmentos Fv de cadena simple se etiquetaban con ^{99m}Tc usando un método nuevo en el cual el ^{99m}Tc-tricarbonil-trihidrato se une de forma estable a la cola de penta- o hexahistidina C-terminal de las proteínas recombinantes (Waibel y cols., 1993). Todos los fragmentos scFv a excepción del scFv MOC31 original, se podían marcar a 37ºC y a una concentración proteínica de 1 mg/ml, lo que resultaba en un 30-40% del ^{99m}Tc inicial incorporado, que daba una actividad específica final de 300-400 mCi/ml. Para el scFv MOC31 propenso a la agregación, la temperatura de incubación se tenía que reducir a 30ºC y la concentración máxima posible de proteína era de 400 \mug, lo que daba lugar a un rendimiento de incorporación reducido (25% del Tc total, 250 mCi/ml).
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Determinación de la inmunoactividad tras la incubación en suero a 37ºC
Nosotros determinamos la fracción de moléculas de scFv todavía activas después del etiquetado ^{99m}Tc (fig. 4C)^{29} y tras la incubación de los fragmentos etiquetados en suero humano durante 20 h a 37ºC (fig. 4D). Para el scFv MOC31, hallamos un 67%\pm 5,4 de la proteína todavía activa si la reacción de marcaje se realizaba a 30ºC. Los otros fragmentos mostraban un 47,25%\pm 4,9 de proteína activa para el scFv 4D5MOC-A, un 74,5 \pm8,3 para el scFv 4D5MOC-B y un 87,3%\pm 6,4 para el scFv 4D5, todos marcados a 37ºC. Para comprobar la estabilidad del suero, los fragmentos scFv (17 \mug/ml) se incubaban en suero humano a 37ºC durante 20 horas y se determinaba la inmunoactividad restante. El scFv MOC31 resultaba ser totalmente inactivo tras una incubación durante la noche, por lo que se medían tiempos más cercanos. Incluso al cabo de 1 hora, la actividad había caído al 6,32%\pm 0,17 (9,4% de la inmunoactividad inicial). Después de 4 horas, solamente el 1,95%\pm 0,175 (2,9%) se mantenía activo. En contraste con ello, la actividad del 4D5MOC-A caía del 47,25%\pm 4,9 al 8,1%\pm 4,7 (17,1% del valor inicial) en 20 h, mientras que la del scFv 4D5MOC-B pasaba del 74,5%\pm 8,3 al 36%\pm 1,6 (48,3%) y la del scFv 4D5 del 87,3%\pm 6,4 al 40,45%\pm 8,75 (46,3%), lo que confirmaba las diferentes estabilidades térmicas halladas en el análisis de filtración en gel.
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Caracterización in vivo - aclaramiento y biodistribución
Los estudios de biodistribución se realizaban luego para scFvs MOC31, 4D5, 4D5MOC-A, 4D5MOC-B marcados con ^{99m}Tc. Para el scFv MOC31 fuimos incapaces de obtener un porcentaje tumor frente a sangre superior al 0,92 después de 1 h, 4 h y 24 h (n=3, cada momento). Después de 24 h, la dosis total en el tumor era del 1,24% ID/g tejido, pero también 1,34% ID/g en la sangre, lo que era muy alto en comparación con los valores 3-5 veces inferiores habitualmente hallados en la sangre después de 24 h con el método de marcaje (tabla 2). En contraste con ello, la biodistribución del scFv 4D5 marcado con ^{99m}Tc daba una relación tumor-sangre de 8,3 después de 24 horas con una dosis total de 1,5 ID/g en células SK-OV (Waibel y cols. 1999). Resultados similares se observaban para el scFv c6.5^{34} anti-c-erbB2. Para el 4D5MOC-A nosotros hallamos después de 24 h un ligero enriquecimiento con una dosis total del 0,84% ID/g y un cociente tumor-sangre de 1,95 (tabla 3), mientras que en la aplicación in vivo de scFv 4D5MOC-B en los ratones que soportaban un tumor SW2, se obtenía una relación tumor sangre de 5,25 después de 24 h con una dosis total de 1,47% ID/g en el tumor. La dosis máxima en el tumor se medía después de 4 h con un 1,82% ID/g, que luego disminuía muy lentamente, lo que refleja un enlace rápido y estable del scFv 4D5MOC-B con el antígeno (tabla 3). para el control no específico de la anti-fluoresceína del scFv FITC-E2^{15} no se hallaba enriquecimiento en el lugar del tumor (tabla 4).
Los estudios de aclaramiento revelaban scFv 4D5MOC-B como una molécula de aclaramiento muy rápida con un t_{1/2}\alpha= 6 min y t_{1/2}\beta=228 min. La comparación con el scFv 4D5 con un valor medido de t_{1/2}\alpha= 7,5 min indica que el comportamiento excelente en el aclaramiento, que es un prerrequisito para conseguir un elevado cociente tumor-sangre no se pierde por el injerto de asa.
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Comentarios
Se ha informado de que el mAb MOC31 marcado con indio-DTPA se localizaba junto al tumor primario y a las metástasis en un ensayo clínico con pacientes con cáncer de pulmón en células pequeñas, pero no era superior a otros métodos de diagnóstico, por ejemplo, el barrido por tomografía computerizada^{4}. Una fusión química de mAb MOC31 con la exotoxina A (ETA) conducía a un retraso en el crecimiento para los tumores grandes (120 mm^{3}) en los ratones desnudos, y se proponía que la reducción del anticuerpo marcado en tamaño aumentaría la eficacia^{8}. Queda por comprobar si la penetración mayor del tejido y la velocidad de aclaramiento más rápida del fragmento scFv anti-EGP2 mucho más pequeño dará mejores resultados o bien si su abilidad elevada para acceder a los tejidos epiteliales que expresan el EGP-2, no accesible al mAbs debido a su peso molecular de 150 kDa^{1}, limitará la energía resolutoria del método. El scFv mejorado puede servir como bloque de construcción para otros formatos de molécula recombinante como el scFv dimerizado, multimerizado, Fab o (Fab)^{2}11 para optimizar los efectos de avidez y tamaño. También se pueden fundir a otros dominios efectores en la construcción de fármacos a base de fragmentos de anticuerpos. Una fusión scFv MOC31-ETA in vitro en las células SW2 era diez mil veces más tóxica que la fusión mab MOC31 con ETA (Zimmermann, resultados no publicados). El scFv MOC31 original no modificado se usaba también para la construcción de un diacuerpo con especificidad CD3 para el marcaje de células T. En este formato, el scFv MOC31 parecía estar algo estabilizado y se ha informado de una vida media de 12 h, pero el rendimiento era tan pobre como para el scFv MOC31^{37} solo y no se hablaba de ninguna aplicación in vivo.
Durante el modelado, nosotros observábamos que el dominio V_{H} del templado 4D5 pertenece a una subclase estructural diferente que el donante MOC31. Puesto que existen varios ejemplos en la literatura en los cuales un simple injerto de asa fallaba y las quimeras se tenían que rescatar mediante múltiples mutaciones adicionales^{36}, directamente diseñamos una segunda quimera en la cual la subclase estructural y el empaquetado del núcleo de MOC31 quedaban retenidos. Esto implicaba cambiar de ocho residuos adicionales, principalmente en el núcleo, a la secuencia murina, lo que corresponde esencialmente a una reestructuración del dominio MOC31 V_{H}. Estas mutaciones adicionales no tenían ningún efecto en la afinidad del antígeno pero tenían un efecto beneficioso en la estabilidad de la quimera. Las mutaciones adicionales en 4D5MOC-B daban una molécula que se comportaba de forma muy similar a la 4D5 scFv de muy buen comportamiento. Esto se debe destacar, pues la 4D5MOC-B se elimina luego en la secuencia de 4D5 y eso sugiere que puede ser crítico mantener una clase de estructura, tal como la definida por los residuos H6, H7 y H9 y no mezclar el esqueleto puesto que estos residuos se interrelacionan. Además, mientras que el 4D5MOC-B se parece más en secuencia al MOC31, esta última molécula es la menos estable de todas.
Recientemente se ha demostrado que el dominio V_{L} de 4D5 es excepcionalmente estable y la estabilidad termodinámica del scFv 4D5 está limitada por la estabilidad intrínseca de su dominio 20. El injerto de la superficie de interacción del antígeno de MOC31 en este fragmento daba lugar a una quimera de estabilidad intermedia. Esto podía se debido a las interacciones no favorables en las asas injertadas o entre los residuos injertados del núcleo y los residuos del núcleo incompatibles. Sin embargo, existen pocos contactos entre dichos residuos de la estructura en el núcleo inferior que difieren entre 4D5 y MOC31 y los residuos del núcleo de asas injertadas, estando ambos separados por una capa de residuos conservados (figura 1). El principal contacto directo entre los residuos variaba en el injerto de asa y el grupo de residuos adicionalmente modificado en 4D5MOC-B está entre MetH48(Val en 4D5) y Phe H63(Val en 4D5 y en 4D5MOC-A). Si hubiera habido un desacuerdo en el injerto original, habríamos esperado una peor situación por la sustitución del residuo de contacto por un residuo mayor. Es pues más probable que la influencia desestabilizante de las asas se haya visto compensada por una estabilización general del núcleo del dominio.
La estabilización adicional conseguida por las mutaciones del núcleo en 4D5MOC-B era de crucial importancia para el enriquecimiento eficaz de la zona del tumor. La construcción más estable, 4D5MOC-B, se enriquecía hasta un 1,47% de ID/g de tejido con un cociente tumor-sangre de 5,25. El MOC31 propenso a la agregación se eliminaba de la circulación mucho más lentamente que los anticuerpos de control y las quimeras más estables. Parece verse hasta que punto un incremento adicional en la estabilidad puede mejorar el enriquecimiento total de la dosis y los porcentajes tumor-sangre.
Nosotros demostramos en este estudio que la estrategia de ingeniería para el plegado y la estabilidad es una herramienta general para la mejora de los fragmentos interesantes de anticuerpos. Utilizamos como un ejemplo la conversión de un anti-EGP-2 scFv murino inestable que se expresa pobremente, que fallaba in vivo, en un fragmento de la misma especificidad de anticuerpo humanizado estable. También informamos del marcaje in vivo de xerografías que presentan EGP-2 en ratones CD1 por primera vez. El scFv 4D5MOC-B manipulado supera las limitaciones del scFv MOC31 y será un bloque de construcción importante para el desarrollo de reactivos a base de fragmentos de anticuerpos para la terapia y la imagen, dirigidos hacia los carcinomas que expresa EGP-2. Pensamos que además de utilizar grandes repertorios de bibliografía de los que se pueden seleccionar nuevos fragmentos de anticuerpos con propiedades importantes, la ingeniería del plegado y estabilidad de las moléculas recombinantes tiene una extraordinaria importancia para su uso futuro en todas las aplicaciones, y especialmente las correspondientes a la medicina del tumor. De nuevo se debe resaltar que las propiedades biofísicas influyen fuertemente en la habilidad de un fragmento scFv para dirigirse a una zona de tumor, incluso cuando las regiones complementarias y las constantes de enlace son idénticas. Esto indica que las propiedades biofísicas de un fragmento de anticuerpo tienen una importancia mayor para el funcionamiento biológico que lo que en general se ha apreciado hasta el momento.
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TABLA 1 Comparación de afinidades y constantes de velocidad cinética tal como se ha determinado por radioinmunoanálisis (RIA) en células SW2 y resonancia del plasmón superficial (BIAcore)
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Las mediciones se realizaba a 4ºC(*) y 20ºC(\Delta)
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TABLA 2 Biodistribución de scFvs marcados con 99mTc; en ratones desnudos Balb/C xenotrasplantados con tumores SW2
2 
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La biodistribución de scFv MOC31 marcado con 99mTc y FITC-E2 se estudiaba en ratones desnudos Balb/C hembras de ocho semanas de edad, que soportan tumores SW2 durante 17 días tras la inyección de los anticuerpos radiomarcados en los animales. Los números representan % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). Los resultados se expresan como la media.
TABLA 3 Biodistribución de scFvs marcados con ^{99m}technetium: en ratones desnudos CD1 xenotransplantados con tumores SW2
3 
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La biodistribución de scFv 4D5MOC-A y 4D5MOC-B marcados con 99mTc y FITC-E2 se estudiaba en ratones desnudos CD1 hembras de ocho semanas de edad, que soportan tumores SW2 durante 13 días tras la inyección de los anticuerpos radiomarcados en los animales. Los números representan % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). Los resultados se expresan como la media.
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MRC Centre for Protein Engineering, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, U.K.
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IMGT: http://www.ebi.ac.uklimgt/
Esta visualización puede ser copiada y redistribuida libremente, sin permiso por adelantado, siempre que se refiera a IMGT, y citada como:
"IMGT, the international ImMunoGeneTics database http://imgt.cnusc.fr:8104 (Coordinator: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France lefranc@ligm.igh.cnrs.fr). For reference: Nucleic Acids Research, 25, 206-211 (1997)".
SEQ-ID No. 1: fragmento humano 4D5 anti-c-Erb82:
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SEQ-ID No. 2: fragmento scFv anti-EGP-2 obtenido del hibridoma murino MNOC31
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SEQ-ID No. 3: fragmento scFv 4D5MOC-B anti-EGP-2
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Claims (8)

1. Una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina enlazada al antígeno que es el fragmento scFv 4D5MOC-B anti-EGP-2 (SEQ-ID No.3).
2. Una secuencia de ácido nucleico o secuencias de ácidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina enlazada al antígeno o el fragmento de inmunoglobulina de la reivindicación 1.
3. Un método para la producción del fragmento de inmunoglobulina enlazado al antígeno de la reivindicación 1, que comprende la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico conforme a la reivindicación 2 que codifican dicho fragmento de inmunoglobulina de enlace al antígeno en un sistema de expresión adecuado.
4. Una composición farmacéutica que contiene el fragmento de inmunoglobulina enlazado al antígeno de la reivindicación 1 y opcionalmente un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico y/o un diluyente.
5. El uso del fragmento scFv 4D5MOC-B anti-EGP-2 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de carcinomas humanos.
6. Un fragmento scFv 4D5MOC-B anti-EGP-2 de la reivindicación 1 para el tratamiento de carcinomas humanos.
7. Una composición diagnóstica que contiene el fragmento de inmunoglobulina enlazado al antígeno conforme a la reivindicación 1.
8. Un equipo de diagnóstico que contiene el fragmento de inmunoglobulina enlazado al antígeno conforme a la reivindicación 1.
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