ES2308145T3 - Ensayo de diagnostico in vitro de infecciones enterovirales. - Google Patents
Ensayo de diagnostico in vitro de infecciones enterovirales. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2308145T3 ES2308145T3 ES04709254T ES04709254T ES2308145T3 ES 2308145 T3 ES2308145 T3 ES 2308145T3 ES 04709254 T ES04709254 T ES 04709254T ES 04709254 T ES04709254 T ES 04709254T ES 2308145 T3 ES2308145 T3 ES 2308145T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibodies
- diagnostic test
- test according
- protein
- facilitating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 14
- 206010070971 Enteroviral infections Diseases 0.000 title claims description 7
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims abstract description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 8
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 206010014909 Enterovirus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 76
- 241000709675 Coxsackievirus B3 Species 0.000 description 47
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 37
- 241000709673 Coxsackievirus B4 Species 0.000 description 30
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241000988559 Enterovirus A Species 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 3
- 241000709677 Coxsackievirus B1 Species 0.000 description 3
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000002077 Coxsackievirus Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000709716 Human enterovirus 70 Species 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101800003658 Protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709710 Swine vesicular disease virus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000021185 dessert Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000709700 Coxsackievirus A9 Species 0.000 description 1
- 241001635223 Coxsackievirus B2 Species 0.000 description 1
- 241000709711 Coxsackievirus B5 Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000032163 Emerging Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010014978 Epidemic pleurodynia Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 201000006219 Herpangina Diseases 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 1
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010068647 P2 peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035623 Pleuritic pain Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010366 Postpoliomyelitis syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 206010037898 Rash vesicular Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 206010041415 Spastic paralysis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000025222 central nervous system infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000005567 fecaloral disease transmission Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910003480 inorganic solid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 208000012965 maculopapular rash Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 201000005737 orchitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 208000012327 purpuric rash Diseases 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Substances [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000006531 swine vesicular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 241000292502 unclassified Enterovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Ensayo de diagnóstico in vitro de enterovirus basado en la revelación de una reacción inmunológica de tipo reconocimiento antígeno-anticuerpo caracterizado porque - el antígeno aplicado o epítopes del mismo, son los que no inducen anticuerpos antivirales neutralizantes sino que inducen anticuerpos "facilitantes" que aumentan la infección viral, y - dicho antígeno que induce anticuerpos antivirales "facilitantes" es la proteína viral interna estructural VP4 o un fragmento de la misma.
Description
Ensayo de diagnóstico in vitro de
infecciones enterovirales.
La invención se refiere a un ensayo de
diagnóstico in vitro de enterovirus basado en la revelación
de una reacción inmunológica de tipo reconocimiento de
antígeno-anticuerpo.
Los enterovirus forman en género Enterovirus en
el seno de la familia de los Picornaviridae. Se trata de
virus de 25 a 30 nm de diámetro, no recubiertos, de simetría
icosaédrica y de ARN (ácido ribonucléico) monocatenario lineal no
fragmentado y positivo.
Su ausencia de envoltura les confiere una
resistencia a los agentes fisicoquímicos y una estabilidad entre pH
3 y 10. Por el contrario, los enterovirus se inactivan por el calor
por encima de 45ºC (e incluso 50ºC en presencia de cationes
divalentes) y por los desinfectantes y antisépticos mayores
(povidona yodada, hipoclorito de sodio, aldehídos).
Existen 64 serotipos de enterovirus: 3
poliovirus, 23 coxsackievirus A (CVA), 6 coxsackievirus B (CVB), 28
ecoviru (EV) y 4 enterovirus no clasificados.
Más del 80% del genoma de los enterovirus de
aproximadamente 7.500 nucleótidos está constituido por un marco de
lectura único flanqueado por dos regiones no codificantes en 5' y
3'. La voluminosa proteína codificada por este marco de lectura se
escinde en 4 proteínas maduras estructurales VP1, VP2, VP3 y VP4 (VP
= viralprotein) y en proteínas no estructurales como proteasas y la
ARN polimerasa viral. Se han secuenciado pocos genomas de
enterovirus animales. Sin embargo, los que lo han sido han mostrado
una homología muy elevada con los enterovirus humanos.
Los enterovirus son objeto de una gran
variabilidad genética debida a los errores de transcripción de la
ARN polimerasa viral, a las fuentes de mutaciones puntuales y a las
recombinaciones entre diferentes genomas de virus. Esta
variabilidad contribuye a la diversidad de los tropismos tisulares y
de los espectros patológicos de los enterovirus.
Los enterovirus tienen un modo de transmisión
fecal-oral por contactos entre dos individuos de la
misma especie o mediante aguas o alimentos contaminados. Algunos
serotipos tienen una transmisión respiratoria o
cutáneo-mucosa. Los enterovirus que penetran por
vía digestiva se multiplican en primer lugar en el intestino (de ahí
el término enterovirus), antes de difundirse, por vía
hematógena, hacia órganos diana (sistema nervioso central, músculos
estriados, piel...) Las infecciones inaparentes constituyen la gran
mayoría de las enterovirosis. Entre las formas sintomáticas, se
distinguen las infecciones agudas y las infecciones
persistentes.
Las infecciones agudas en el hombre son muy
polimórficas. Los enterovirus son los agentes infecciosos más
frecuentes responsables de infecciones del sistema nervioso central
(meningitis linfocitarias, meningoencefalitis, parálisis de tipo
poliomielitis). Participan en otras numerosas patologías:
infecciones respiratorias (rinitis, bronquitis, bronquiolitos,
neumonías), infecciones cardiacas (pericarditis, miocarditis),
miositis, erupciones maculopapulosas o purpúricas, síndromes
febriles y, más raramente, hepatitis, nefritis, orquitis o artritis.
Algunas manifestaciones clínicas son muy específicas de los
enterovirus e incluso de algunos serotipos: pleurodinia o
enfermedad de Bornholm (CVB) que corresponde a una especie de gripe
hiperálgica, eruptiones vesiculosas de tipo herpangina o síndrome
pie-mano-boca (CVA, CVB, enterovirus
70), conjuntivitis hemorrágica (CVA-24, enterovirus
70).
En los animales, los enterovirus afectan a los
bovinos, los porcinos y las aves. La mayoría de estas infecciones
enterovirales son inaparentes y sólo los enterovirus porcinos y
aviares causan enfermedades con una cierta importancia económica.
Algunas cepas de enterovirus porcinos son responsables de la
polioencefalomielitis porcina. El SVDV (swine vesicular disease
virus) causa una enfermedad vesicular de los porcinos. en general,
la enfermedad en si misma no es severa y la mayoría de los animales
se libran de ella.
Las patologías humanas clásicas asociadas a los
enterovirus son al menos cuatro: meningoencefalitis crónicas,
síndrome postpoliomielítico, afecciones cardiacas y diabetes
insulinodependiente. En efecto, existen fuertes argumentos a favor
de la implicación de los coxsackievirus B en la diabetes mellitus
insulinodependiente (DID) o diabetes tipo 1. Diversos autores han
detectado la presencia de ARN enteroviral de fuerte homología con
CVB en la sangre periférica de pacientes DID al inicio de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad (Clements et al.,
1995; Andreoletti et al., 1997; Nairn et al., 1999;
Lonnrot et al., 2000). Recientemente elsolicitante a
mostrado que tasas elevadas en el plasma de interferón \alpha
(IFN\alpha) se correlacionan en el 50% de los casos con la
presencia de secuencias enterovirales, en particular CVB3 y CVB4, en
la sangre en circulación de adultos y de niños afectados de
diabetes tipo 1 (Chehadeh et al., 2000).El solicitante ha
demostrado igualmente que CVB4, por interacciones con anticuerpos
IgG circulantes o asociados a células, puede inducir en gran medida
la producción de IFN\alpha por células mononucleadas de la sangre
periférica (PBMC) de pacientes DID (Hober et al., J. Gen.
Virol., vol. 83, nº 9, septiembre 2002). La producción de interferón
\alpha es un marcador de la infección viral. CVB4 induce poco
esta producción salvo cuando se pone en presencia de anticuerpos
denominados "facilitantes" que facilitan la infección viral.
CVB4 puede por lo tanto infectar monocitos, en su mayoría CD14+,
por un mecanismo anticuerpo dependiente por interacciones entre el
virus, anticuerpos antivirales y receptores específicos en la
superficie de las células (CAR, Fcy RII, Fcy RIII) que dan como
resultado la producción de IFN\alpha. Esta síntesis de
IFN\alpha inducida por IgG anti-CVB4 refleja la
entrada de CVB4 en los monocitos pero no la replicación viral y
requiere la presencia de ARN de CVB4 en las células. Si se bloquea
la producción de IFN\alpha por estos IgG
anti-CVB4, se pueden detectar partículas virales
producidas por las PBMC (Chehadeh et al., J. Gen. Virol.,
vol. 82, nº 8, agosto 2001). Además, la actividad inductora de
IFN\alpha de plasma de pacientes IDDM preincubado con CVB4 antes
de ser traído por PBMC aisladas de sujetos sanos es elevada si se
compara con la de plasma de sujetos sanos (Hober et al., J.
Gen. Virol., vol. 83, nº9, septiembre 2002). Los pacientes IDDM
tienen una prevalencia más elevada de estos anticuerpos
anti-CVB denominados "facilitantes" que
aumentan la síntesis de IFN\alpha inducida por CVB respecto de los
controles. Los pacientes afectados por infecciones enterovirales
llevan por lo tanto en su plasma, además de los anticuerpos
neutralizantes conocidos hasta ahora que "inmovilizan" el virus
y que en la mayoría de los casos dirigidos contra epítopes de la
proteína estructura de superficie VP1, anticuerpos
"facilitantes" que favorecen la infección viral.
Las herramientas diagnósticas utilizadas hasta
ahora en el diagnóstico de las enterovirosis son medios directos:
cultivo celular, inoculación a ratoncillos recién nacidos,
ampliación genómica utilizando cebos en la región 5' no codificante
del genoma y medios indirectos: seroneutralización y técnicas
inmunoenzimáticas.
El cultivo celular y la seroneutralización no se
pueden aplicar a todos los coxsackievirus A, los serotipos A1, A19
y A22 no se pueden cultivar. En la práctica, la mayoría de los CVA
no son fácilmente cultivables salvo CVA9.
La inoculación a los ratoncillos recién nacidos
es una técnica pesada y larga que permite diagnosticar una
infección por coxsackievirus y permite diferenciar los CVA
(parálisis flácidas) de los CVB (parálisis espásticas).
Las técnicas de biología molecular como la
ampliación genómica por PCR (Polymerase chain Reaction) han
permitido detectar los enterovirus en baja cantidad eligiendo cebos
en las regiones muy conservadas. Sin embargo, no permiten detectar
todas las infecciones enterovirales, en particular si la infección
está localizada y la tasa de replicación del virus es baja, ni
diferenciar tal o tal serotipo. Igualmente, las técnicas
inmunoenzimáticas diferencian como máximo los grupos y éstas,
basadas en la detección de los anticuerpos neutralizantes se topan
con la ausencia de un antígeno común entre los enterovirus.
La solicitud de patente europea EP 0434992 (Max
Planck Gesellschaft) describe un ensayo de diagnóstico in
vitro de los enterovirus, basado en la revelación de una
reacción inmunológica de tipo reconocimiento
antígeno-anticuerpo entre la proteína VP1 del
coxsackievirus B3 o la proteína de fusión VP4/2/3 de las proteínas
VP4, VP2 y VP3 del coxsackievirus B3, y los anticuerpos dirigidos
contra estas proteínas. el ensayo diagnóstico divulgado en EP
0434992 permite diagnosticar la presencia de un Enterovirus sin
permitir, sin embargo, la identificación del serotipo.
Kubo et al. (Emerging Infectious Disease,
vol. 8, no 3, marzo 2002, páginas 293-304) divulga
que un análisis filogenético basado en la comparación de las
secuencias nucleotídicas de la proteína VP4 se revela más efectiva
para realizar el serotipado de enterovirus, que los ensayos clásicos
de neutralización que residen en antisueros que poseen una
especificidad para algunos serotipos de enterovirus.
No existe por lo tanto entre estos ensayos un
procedimiento de detección muy fina a la escala del serotipo o
variantes (diferenciación entre cepas salvajes y vacunales) ni
procedimientos de cuantificación de la carga viral en individuos
infectados.
Para colmar esta carencia, el solicitante ha
desarrollado un ensayo de diagnóstico in vitro de los
enterovirus específico y cuantitativo. Este ensayo se basa en la
existencia de antígenos que inducen anticuerpos "que
facilitan" la infección viral y no anticuerpos
neutralizantes.
\vskip1.000000\baselineskip
En efecto, el solicitante ha identificado la
proteína viral que presenta el o los epítopes reconocidos por los
anticuerpos "facilitantes" en el caso de una infección por
coxsackievirus B3 y B4. Esta proteína es la proteína estructural
interna VP4 y se ha llevado a cabo la demostración como sigue:
- a)
- en primer lugar, se han cultivado y purificado los virus CVB3 y CVB3
- b)
- a continuación, se han asilado y purificado las proteínas VP4 por una parte y por otra parte el antígeno H (también denominado AEC por "artificial empty capsids") a partir de los virus CVB3 y CVB4 disociados
- c)
- finalmente, se ha demostrado que la proteína VP4 inhibe el aumento de la producción de IFN\alpha inducida por el par CVB/plasma. En efecto, cuando VP4 se preincuba con plasma antes de añadir CVB, VP4 fija los anticuerpos antiVP4 y quedan menos anticuerpos antiVP4 para fijar CVB y facilitar la infección de PBMC in vitro y el aumento de la producción de INF\alpha por las mismas. Esto prueba que los anticuerpos "facilitantes" son los anticuerpos anti-VP4.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, no hay reacción cruzada entre los
anticuerpos antiVP4_{CVB3} y antiVP4_{CVB4}. cuando VP4_{CVB4}
se ha preincubado con plasma antes de añadir CVB3, el nivel de
IFN\alpha inducido por CVB3 en los cultivos de PBMC permanece sin
cambios. Igualmente, la proteína VP4 disociada de CVB3 no afecta el
nivel de IFN\alpha inducido por CVB4. Los epítopes presentados
por las proteínas VP4 de estos dos serotipos son por lo tanto
suficientemente diferentes para que los anticuerpos
"facilitantes" sean específicos de tal o tal serotipo.
Este resultado se ha verificado con los otros
serotipos de CVB, CVB1 a CVB5. Los anticuerpos antiVP4_{CVB4E2}
no reconocen los virus CVB de otro serotipo (Ejemplo 3).
Se denominan "anticuerpos facilitantes" a
anticuerpos no neutralizantes, que facilitan la infección viral y
que son específicos del serotipo del virus del cual se deriva su
antígeno.
El solicitante a sacado partido de esta
demostración para poner a punto un ensayo de diagnóstico in
vitro de enterovirus basado en la revelación de una reacción
inmunológica de tipo reconocimiento
antígeno-anticuerpo caracterizado porque aplica
antígenos o epítopes de los mismos que no inducen anticuerpos
antivirales neutralizantes sino que inducen anticuerpos
"facilitantes" que aumentan la infección viral.
La presente invención tiene por objeto un ensayo
de diagnóstico in vitro de enterovirus basado e la revelación
de una reacción inmunológica de tipo reconocimiento
antígeno-anticuerpo caracterizado porque:
- -
- el antígeno aplicado o epítopes del mismo, son los que no inducen anticuerpos antivirales neutralizantes sino que inducen anticuerpos "facilitantes" que aumentan la infección viral, y
- -
- dicho antígeno que induce anticuerpos antivirales "facilitantes" es la proteína viral interna estructural VP4 o un fragmento de la misma.
En una realización particular, la presente
invención tiene por objeto un ensayo de diagnóstico de enterovirus
caracterizado porque bien el antígeno aplicado o epítopes del mismo
se fijan a un soporte para la detección de los anticuerpos
"facilitantes" correspondientes, bien los anticuerpos
"facilitantes" se fijan a un soporte para la detección del
antígeno aplicado o epítopes del mismo correspondientes. Este
soporte es de tipo plano con múltiples pocillos para
microvaloración o "chip" o cualquier otro soporte. Se entiende
por "chip" un soporte miniaturizado plano, en un material
sólido orgánico o inorgánico, de tipo vidrio, silicio o polímeros
sintéticos, sobre el cual se enlazan de manera covalente o no
polipéptidos.
Cuando el ensayo según la invención cosiste en
la detección de los anticuerpos "facilitantes" por el antígeno
aplicado o epítopes del mismo correspondientes fijados a un soporte,
se revela la reacción por un anticuerpo antiviral marcado o por un
anticuerpo antiviral (por ejemplo humano) y a continuación un
anticuerpo secundario antiespecie marcado (por ejemplo
antihumano).
El marcador de los anticuerpos secundarios es
preferiblemente una enzima como la HRP ("horseradish
peroxidase") que muestra una reacción coloreada o luminiscente
con su sustrato, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un
compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente o un
quelato de metales
El antígeno que induce anticuerpos antivirales
"facilitantes" es la proteína viral interna VP4, de longitud
plena o un fragmento de la misma. Esta proteína se puede purificar a
partir del virus, puede ser una proteína recombinante que presenta
las mismas propiedades inmunógenas o se puede sintetizar
químicamente y presentar las mismas propiedades inmunógenas.
De manera particularmente preferida, el antígeno
que induce anticuerpos antivirales "facilitantes" utilizado en
el ensayo de diagnóstico según la invención es un fragmento
peptídico de la proteína VP4 elegido entre los péptidos de
secuencia SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3, SEQ ID Nº4, SEQ ID
Nº5, preferiblemente el péptido de secuencia SEQ ID Nº2.
Este ensayo permite en particular diagnosticar
una infección por los coxsackievirus de tipo A o B.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo comprende las siguientes etapas:
- a-
- inmovilización de los anticuerpos "facilitantes" o de la proteína viral que induce anticuerpos "facilitantes" o de un fragmento de la misma sobre un soporte
- b-
- inmovilización de anticuerpos control, de proteínas control o de un fragmento de las mismas sobre un soporte
- c-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- d-
- saturación de la superficie de soporte no recubierta por una solución tamponada de proteínas irrelevantes
- e-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- f-
- aplicación de las muestras a estudiar a diferentes diluciones en tampón de saturación
- g-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- h-
- ampliación de la respuesta por aplicación de anticuerpos marcados
- i-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- j-
- lectura de la intensidad del marcado.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de la invención se puede aplicar en
particular con la ayuda de un estuche o kit que comprende:
- -
- la proteína viral interna estructural VP4 o un fragmento de la misma o los anticuerpos "facilitantes" correspondientes,
- -
- los reactivos para la constitución del medio propicio para la realización de la reacción antígeno-anticuerpo,
- -
- los reactivos que permiten la detección del complejo formado.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, el ensayo se puede aplicar
especialmente al diagnóstico de una infección por CVB3 o CVB4 o
cualquier otro CVB por detección y dosificación de los anticuerpos
anti-VP4 atrapándolos mediante la proteína
purificada VP4 fijada a un soporte. En efecto, se ha puesto de
manifiesto la existencia de una relación
dosis-respuesta entre la cantidad de proteína VP4
preincubada con el plasma y el nivel de producción de INF\alpha.
De este modo, la proteína VP4 preincubada con el plasma atrapa los
anticuerpos anti-VP4 del plasma. Cuanto más se
aumenta la cantidad de proteína VP4 en este ensayo, más disminuye la
cantidad de anticuerpos anti-VP4 "facilitantes"
libres para reconocer CVB, y más baja es la producción de
IFN\alpha. Se ha puesto de manifiesto, además, la existencia de
una correlación dosis dependiente entre la cantidad de anticuerpos
anti-VP4 preincubados con CVB3 o CVB4 antes de ser
añadidos a PBMC y el nivel de producción de IFN\alpha. No se ha
detectado ninguna producción de IFN\alpha. en presencia de plasma
empobrecido en anticuerpos anti-VP4 o de anticuerpos
irrelevantes.
El ensayo objeto de la invención, al permitir
dosificar los anticuerpos "facilitantes" o la proteína viral
que lleva el o los epítopes reconocidos por estos anticuerpos,
permite medir la respuesta de las células a la infección viral,
como por ejemplo la producción de IFN\alpha.
El ensayo descrito anteriormente se puede
realizar con otras proteínas VP4 diferentes de enterovirus para
efectuar un cribado de la infección por diferentes virus.
Este ensayo se puede aplicar en el caso de
enfermedad crónica asociada a una infección por un enterovirus para
establecer el valor predictivo del desencadenamiento de la
enfermedad. En particular, este ensayo se puede utilizar para
predecir el desencadenamiento en paciente prediabéticos de una
diabetes de tipo 1 asociada a una infección por CVB.
Este ensayo también se puede utilizar para
correlacionar la cantidad de anticuerpos facilitantes detectados y
el estadio de la enfermedad. En particular, este ensayo puede
permitir la evaluación del estadio de una diabetes de tipo 1
asociada a una infección por CVB.
Se puede utilizar el ensayo de diagnóstico según
la invención para determinar el serotipo del enterovirus
responsable de una infección aguda humana o animal. En efecto, los
anticuerpos "facilitantes" y su antígeno son específicos de un
serotipo enteroviral dado y se puede multiplicar el ensayo según la
invención por el mismo número de serotipos. Para esto, se pueden
utilizar tantos soportes como serotipos o fijar a un soporte
miniaturizado de tipo "chip", para cada serotipo, anticuerpos
"facilitantes" o el antígeno correspondiente.
De este modo, Se puede igualmente, utilizar el
ensayo de diagnóstico según la invención para determinar la
distribución por serotipo de las infecciones enterovirales en una
población dada humana o animal.
En una realización adicional de la invención, se
puede utilizar el ensayo de diagnóstico según la invención para
determinar la diana viral de un agente antiviral. en efecto, se
puede detectar y dosificar el antígeno que induce anticuerpos
"facilitantes", para cada serotipo viral, con la ayuda del
ensayo de diagnóstico según la invención, fijando sobre uno o más
soportes los anticuerpos "facilitantes" correspondientes. Por
lo tanto, se puede medir la infecciosidad de células in
vitro de un virus estudiado cultivable en ausencia o en
presencia de concentraciones más o menos importantes de agente
antiviral. Se puede hacer lo mismo para diversos serotipos y
determinar la diana del agente antiviral. En esta realización, el
ensayo de diagnóstico según la invención permite sustituir
mediciones largas y pesadas de muerte celular in vitro en
función del valor viral y de la concentración en agente viral.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
limitar, sin embargo, el alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: efecto de la proteína VP4 o del
antígeno H sobre la producción de IFN\alpha. inducida por
CVB/plasma de 5 sujetos sanos.
Figura 1a: disminución dosisdependiente de la
producción de IFN\alpha. inducida por CVB3/plasma en presencia de
la proteína VP4_{CVB3}.
Figura 1b: aumento dosisdependiente de la
producción de IFN\alpha. inducida por CVB3/plasma en presencia
del antígeno H.
Figura 1c: disminución dosisdependiente de la
producción de IFN\alpha. inducida por CVB4/plasma en presencia de
la proteína VP4_{CVB4}.
Figura 1d: aumento dosisdependiente de la
producción de IFN\alpha. inducida por CVB4/plasma en presencia
del antígeno H.
Figura 2: comparación de la media de los valores
índice de anticuerpos anti-VP4 de los pacientes DID
respecto de la de los sujetos sanos.
Figura 3: Media de producción de IFN\alpha.
por los PBMC después de incubación de los diferentes serotipos de
CVB con el plasma de donantes sanos.
Figura 4: evaluación de la especificidad de los
anticuerpos activadores midiendo por procedimientos DELFIA la
producción de IFN\alpha. en el momento de la infección de los PBMC
con los diferentes serotipos del virus en presencia de plasma
procedente de donante sano (negro), o en presencia de plasma
preincubado con VP4 de CVB4E3 (sombreado con trazos).
Figura 5: Producción de IFN\alpha. en el
momento de la infección de los PBMC por CVB4E2 o CVB3 en presencia
de VP4 de CVB4E2 o de VP4 de CVB3.
Figura 6: Plásmido pMAL-c2.
Figura 7: Producción de IFN\alpha. en el
momento de la infección de los PBMC por CVB4E2 o CVB3 previamente
incubado en presencia de plasma de sujetos sanos y eventualmente de
VP4 recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Medio RPMI
- 2.
- Plasma
- 3.
- CVB4E2
- 4.
- VP4 1 \mug/ml
- 5.
- Plasma + VP4
- 6.
- Plasma + CVB4E2
- 7.
- Plasma + VP4 0,01 \mug/ml + CVB4E2
- 8.
- Plasma + VP4 0,1 \mug/ml + CVB4E2
- 9.
- Plasma + VP4 1 \mug/ml + CVB4E2
- 10.
- Plasma + VP4 10 \mug/ml + CVB4E2
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8: Ensayo ELISA comparativo entre VP4 y
los péptidos VP4-P1, VP4-P2,
VP4-P3, VP4-P5,
VP4-P6.
Figura 9: Ensayo ELISA comparativo entre VP4 y
el péptido VP4-P'' (paciente = media de 40 sueros de
pacientes diabéticos, control = media de 40 sueros de pacientes no
diabéticos).
Figura 10: Ensayo ELISA comparativo entre VP4,
VP4 recombinante y el péptido VP4-P2 (paciente =
media de 40 sueros de pacientes diabéticos, control = media de 40
sueros de pacientes no diabéticos).
Figura 11: Producción de IFN\alpha en el
momento de la infección de los PBMC por CVB4E2 previamente incubado
en presencia de plasma de sujetos sanos y eventualmente de VP4.
\newpage
- 1.
- Medio RPMI
- 2.
- P2 (1 \mug/ml)
- 3.
- Plasma 1/100e
- 4.
- CVB4E2
- 5.
- CVB4E2 + plasma 1/100e + medio
- 6.
- CVB4E2 + plasma 1/100e + VP4 (1 \mug/ml)
- 7.
- CVB4E2 + plasma 1/100e + VP4-P2 (1 mg/ml)
- 8.
- CVB4E2 + plasma 1/100e + VP4-P2 (0,1 mg/ml)
- 9.
- CVB4E2 + plasma 1/100e + VP4-P2 (0,01 mg/ml)
CVB3 (American Type Culture Collection,
Manassas, EE.UU) y CVB4 E2 diabetógeno (proporcionado por
Ji-Won Yoon, Julia McFarlane Diabetes Research
Center, Calgary, Alberta, Canada) se han cultivado en las células
Hep-2 (Biowhittaker, Verviers, Bégica) en medio
esencial mínimo de Eagle Gibco BRL, Eragny, Francia) adicionada del
10% de suero de ternera fetal inactivado por el calor (Gibco BRL) y
el 1% de L-glutamina (Eurobio, Francia). Después de
una incubación de 24 horas a 37ºC, el 5% de CO_{2}, la suspensión
celular se congeló y descongeló tres veces y se centrifugó a 2.000
x g durante 10 minutos. el virus procedente del sobrenadante se ha
sedimentado por centrifugación a 500.000 x g durante 3 horas a 4ºC
en un rotor Beckman TLA-100.4. El residuo se volvió
a suspender en 3 ml de Tris-HCl 0,01 M pH 7,2, que
contenía el 0,5% (vol/vol) de Nonidet P40, incubado a 4ºC durante
20 horas, se homogeneizó a 4.000 x g para quitar los restos
insolubles. A continuación se dispuso 0,5 ml de la suspensión viral
clarificada en capas sobre 0,5 ml de sacarosa (30% en peso/volumen)
y 3 ml de CsCl (40% en peso/vol). Después de la centrifugación a
348.000 x g a 4ºC en un rotor Beckman TLA-100.4
durante 4 horas, se recuperaron las fracciones del gradiente y se
determinaron los valores de las fracciones del gradiente por el
ensayo de la dosis infecciosa del 50% del cultivo tisular
(TCID_{50}) sobre un cultivo confluente de células
Hep-2. Las fracciones que contienen los valores a su
pico de infecciosidad se han agrupado, dializado y equilibrado con
Tris-HCl 0,01 M pH 7,2 por centrifugación a 4.000 x
g sobre membrana Macrosep^{TM} (Pall Filtron Corporation, Saint
Germain en Laye, Francia) con la exclusión del peso molecular (MWCO)
de 300 K. Se almacenaron alícuotas congeladas a -80ºC. Se
obtuvieron preparaciones de control por el mismo protocolo salvo
que las células Hep-2 estaban infectadas únicamente
por el disolvente del virus.
La proteína VP4 y el antígeno H se han disociado
de los virus completos CVB3 y CVB4 como se ha descrito anteriormente
en la bibliografía para el poliovirus (Maizel et al., 1967).
En resumen, las partículas virales CVB purificadas y concentradas
(\sim1 mg) se incubaron a 56ºC durante 5 minutos en 0,5 ml de
tampón salino (NaCl 0,1 M, citrato de sodio 0,005 M, pH 7,0). Este
tratamiento da como resultado la disociación del virus en ARN viral,
VP4 y el antígeno H. A continuación la proteína VP4 se separó de la
mezcla por centrifugación a 4000 x g sobre membrana Macrosep^{TM}
a MWCO de 100 Kd. El antígeno H y el ARN fueron retenidos por la
membrana, y VP4 pasó a través de la membrana. El ARN se degradó por
adición de 0,05 mg de ribonucleasa A bovina pancreática (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) y incubación a 37ºC
durante 10 minutos. el antígeno H y VP4 se dializaron y
equilibraron con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2, por
centrifugación a 4000 x g sobre membrana Macrosep^{TM} a 100 Kd y
3 Kd respectivamente. El antígeno H y VP4 se concentraron utilizando
un Concendrador Savant Speed Vac SVC 100H (Global Medical
Instrumentation, Minnesota, EE.UU). La disociación control se operó
igualmente con el sobrenadante de células Hep-2 no
infectadas purificado tal como se ha descrito anteriormente y se
proporcionó proteínas control para lo que sigue. La concentración
proteica se calculó a partir de la absorbencia a 280 nm con un
coeficiente de extinción de 1 mg/ml.
Se incubaron VP4, el antígeno H o proteínas
control durante 1 hora a 37ºC a diferentes concentraciones con
plasma de 5 sujetos sanos diluidos a una dilución óptima (1/10 o
1/100). Se añadió entonces CVB3 o CVB4 durante 1 horas antes de la
incubación con PBMC. se observa en la figura 1, una disminución
dosidependiente de la producción de IFN\alpha inducida por
CVB3/plasma en presencia de la proteína VP4_{CVB3} mientras que en
presencia del antígeno H no se observa disminución dosisdependiente
de la producción de IFN\alpha (figura 1a y 1b)- Se obtuvieron
resultados similares con la proteína VP4_{CVB4} en el sistema
CVB4/plasma (figura 1c y 1d). Por el contrario, las proteínas
control aisladas a partir de células Hep-2 no
infectadas no tuvieron ningún efecto sobre la producción de
IFN\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar los anticuerpos antiVP5 en el
plasma de un donante, se incubaron placas de microvaloración de 96
pocillos durante una noche a temperatura ambiente con la proteína
VP4 disociada a partir de CVB3 o CVB4 a 5 \mug/ml en PBS, pH 7,4.
Del mismo modo, se incubaron placas de microvaloración con proteínas
control. Los pocillos se lavaron a continuación tres veces con una
solución de lavado (PBS, pH 7,4, Tween al 0,05%), saturados durante
1 hora a 37ºC con tampón de saturación (PBS, pH 7,4, leche desnatada
al 2,5%, Tween 20 al 0,5%), y se lavaron de nuevo 4 veces. A
continuación, se añadió 0,1 ml de las muestras, diluido en tampón
de saturación a una dilución óptima (1/50) a los micropocillos.
Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los
pocillos se lavaron 4 veces y se añadió 0,1 ml de la mezcla de
anticuerpos IgA, G, N anti-humanos marcados a la
HPR ("horseradish peroxydase") diluido a 1/10.000 y se incubó
durante 1 hora. Después de 4 ciclos de lavado, se añadió 0,1 ml de
la solución sustrato (0,4 mg/ml de
o-fenilenodiamina, 0,012% de H_{2}O_{2} en
tampón fosfato citrato 0,05 M, pH 5,0) durante 30 minutos. La
reacción se detuvo por adición de 25 \mul de ácido sulfúrico 2N.
Las mediciones de la absorbencia se efectuaron a 490 nm en un lector
de microplacas Dynex MRX® (Thermo Life Science,
Cergy-Pontoise, Francia). El valor límite del ensayo
inmunológico se determinó adicionando la absorbencia de la muestra
sobre las placas control a la del blanco sobre las placas VP4. Las
muestras del ensayo con un índice (relación muestra/valor límite)
superior a 1,0 se consideraron como positivas para la presencia de
anticuerpos anti-VP4.
Este ensayo se utilizó para detectar y dosificar
los anticuerpos anti-VP4 en el plasma de sujetos
sanos y de pacientes IDDM. 14 de los 40 sujetos sanos (35%) y 25 de
los 40 pacientes IDDM (62,5%) eran positivos para los anticuerpos
Anti-VP4_{CVB3}. 6 de los 40 sujetos sanos (15%) y
32 de los 40 pacientes IDDM (80%) eran positivos para los
anticuerpos anti-VP4_{CVB4}. La media de los
índices obtenida en el grupo de los pacientes IDDM era
considerablemente más elevada que la obtenida en el grupo de los
sujetos sanos (Figura 2).
El ensayo desarrollado en este ejemplo muestra
que la detección y la dosificación de los anticuerpos
anti-VP4 se pueden utilizar en el diagnóstico de
una patología asociada a una infección por coxsackievirus. En
efecto, los pacientes IDDM presentan una fuerte prevalencia de
anticuerpos anti-VP4 y una mayor cantidad de estos
anticuerpos que los sujetos sanos.
Algunos pacientes presentan una tasa de
anticuerpos anti-VP4 por encima del umbral de
detección del ensayo del ejemplo pero esto se puede explicar por el
hecho de que su enfermedad se asocia a otros virus distintos de
CVB3 o CVB4 como CVB2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PBMC separadas de la sangre total heparinada
se distribuyen en micropocillos (placa de 96 pocillos), a razón de
5 a 8.10^{5} células en 100 \mul de medio RPMI suplementado por
pocillo. La infección de las PBMC se lleva a cabo con un volumen
final de 100 \mul de la preparación en cada pocillo. Después de
una incubación de 48 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al
5% y al 90% de humedad, el sobrenadante se recoge y se utiliza
inmediatamente para la dosificación de IFN\alpha, o se clarificar
mediante 10 minutos de centrifugación a 180 x g y se guarda a -80ºC
hasta la dosificación del IFN\alpha producido.
La concentración de IFN\alpha producida se
determina por una técnica sensible y específica, el procedimiento
DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthaniode FluoroImmunoAssay)
Rönnblom et al., 1997)
La dosificación del IFN\alpha se realiza según
el principio DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthaniode
FluoroImmunoAssay), basado en un procedimiento de
inmunofluorescencia en pase retardada con la ayuda de anticuerpos
que ligan el IFN\alpha, uno de los cuales está marcado con
Europium. La utilización de una solución de activación va a liberar
el Europium conjugado al anticuerpo y va a emitir una fluorescencia
proporcional a la cantidad de IFN\alpha producida y medida con el
fluorómetro (fluorometer LKB Wallac 1230 ARCUS®; Turku,
Finlandia).
Los anticuerpos monoclonales LT 273 (5,4 mg/ml)
y LT 293 (4,8 mg/ml) anti- IFN\alpha, proporcionados por el Dr.
Gunar Alm (Uppala, Suecia) se fijan al fondo de los pocillos después
de una incubación de 12 horas a temperatura ambiente. Estas placas
se pueden conservar en un tampón a 4ºC o utilizarse inmediatamente.
Las muestras estándar de IFN\alpha humano se preparan con un
anticuerpo monoclonal IgG1 "irrelevante" de ratón para
establecer la curva de referencia (10 mediciones). Las otras
muestras a analizar se depositan en cada pocillo (100 \mul) con
el tampón de dilución y el anticuerpo "irrelevante" y se
incuban 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Los
pocillos se lavan 3 veces con la solución de lavado. El anticuerpo
conjugado con Europium (200 \mul) se deposita en cada pocillo
dejando incubar 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
La placa se lava 6 veces con la solución de lavado. La solución de
activación (200 \mul) añadida inmediatamente después del lavado y
dejada 20 a 30 minutos en incubación en los pocillos provoca la
escisión del Europium ligado al anticuerpo fijado sobre el
IFN\alpha, emitiendo una fluorescencia medida por el lector de
fluorescencia (LKB Wallac 1230 ARCUS®). La concentración de
IFN\alpha se calculará a partir de los valores de fluorescencia
medidos gracias al software Graphpad (San Diego, EEUU). El umbral de
detección de IFN\alpha es de 0,5 U/ml.
Los plasmas de donantes (dilución óptima al 1/10
o 1/100) se preincuban 1 hora a 37ºC con los diferentes serotipos
del coxsackie virus B, CVB1 a CVB6 diluidos al 1/10. A continuación
se efectúa la infección de las células mononucleadas de la sangre
periférica (PBMC). La revelación de la producción de IFN\alpha
obtenida se efectúa por procedimiento inmunofluorométrico DELFIA
después de 48 horas de infección de los PBMC. Se utilizan los
mismos plasmas a diluciones idénticas para estudiar la producción de
IFN\alpha por serotipo. La cantidad de PBMC varía de 5.10^{5} a
7.10^{5}/pocillos. Se utilizaron los plasmas de cuatro donantes
sanos diferentes.
Cada serotipo de CVB conlleva una producción de
interferón alfa en presencia de plasma (véase figura 3). No se
obtiene ninguna producción de IFN\alpha en ausencia de plasma con
ocasión de estos experimentos. La dilución del plasma al 1/10 estén
el origen de una producción de IFN\alpha de media más importante
que la dilución al 1/100 (salvo para CVB6). En presencia de plasma
el virus CVB1 siguen siendo, sin embargo, un inductor bajo de
IFN\alpha.
Cada serotipo de CVB se incubó una hora bien con
sólo plasma diluido al 1/10, bien con plasma diluido al 1/10
previamente incubado una hora con la proteína VP4 recombinante (Cf.
Ejemplo 4) de CVB 4E2 diluida al 1/10, bien con MEM.
Los resultados muestran como anteriormente una
producción de IFN\alpha en el momento de la infección de las PBMC
en presencia de plasma. Preincubando el plasma con la proteína VP4
de CVB4E2 esta producción de IFN\alpha permanece elevada y
estable respecto de los resultados anteriores, salvo en presencia de
CVB4E2 donde la producción de IFN\alpha se ha hundido. Los
anticuerpos que facilitan la inducción de IFN\alpha por CVB4E2
parecen por lo tanto estar específicamente dirigidos contra la
proteína VP4 de CVB4E2 (véase la figura 4).
El plasma de un donante sano (dilución al 1/10 o
1/100) se preincuba 1 hora a 37ºC con la proteína recombinante VP4
de CVB4E2 (concentración óptima a 1 \mug/ml). El conjunto se
incuba de nuevo una hora a 37ºC en presencia del virus CVB4E2
(diluciones a 1/10 y 1/100: valor viral a 10^{13} TCID_{50}/ml)
y a continuación se deposita en las PBMC, (5.10^{5}/pocillo) para
una incubación de 48 horas. La producción de IFN\alpha por las
PBMC se revela mediante el procedimiento fluorométrico DELFIA
después de las 48 horas de incubación.
El mismo experimento se efectúa con el mismo
lote de plasma (dilución óptima), la proteína natural VP4 de CVB3
(dilución 1/10) y el virus CVB3 (diluciones a 1/10 y 1/100; valor
viral a 10^{13} TCID_{50}/ml). La determinación de la cantidad
de IFN\alpha producida por las PBMC también se lleva a cabo a las
48 horas por procedimiento DELFIA.
Se efectúan reacciones cruzadas sobre el mismo
principio para evaluar la especificidad de los anticuerpos que
facilitan la infección. La mezcla de plasma y P4 de CVB4E2
preincubada durante 1 hora se incuba a continuación con CVB3 antes
de ser depositada sobre la PBMC durante 48 horas.
Del mismo modo, la preparación preincubada 1
hora de plasma y VP4 de CVB3 se incuba 1 hora con CVB4E2 antes de
infectar las PBMC durante 48 horas y revelar la cantidad de
IFN\alpha producida.
Las PBMC infectadas por los virus CVB4E2 o CVB3)
en presencia de plasma constituyen los testigos positivos de esta
experimentación. Los testigos negativos se obtienen con un pocillo
de PBMC solas, un pocillo del virus CVB4E2 solo y un pocillo de
CVB3 solo.
La infección de las PBMC por el virus CVB3
incubado una hora con plasma de donante sano conlleva una producción
de IFN\alpha de 323 U/ml (testigo positivo). Cuando el mismo
plasma de donante sano se preincubó una hora con la proteína VP4 de
CVB4E2 antes de ponerlos en presencia del virus CVB3 durante una
hora no se encuentra diferencia de producción de IFN\alpha (308
U/ml). Sin embargo, cuando el mismo plasma se preincuba inicialmente
una hora con la proteína VP4 específica de CVB3, antes de ser
añadido a CVB3, la producción de IFN\alpha cae a 6,4 U/ml, es
decir, al 2% de su valor inicial (véase la figura 5).
La infección de las PBMC por el virus CVB4E2
incubado una hora con plasma de donante sano conlleva una producción
de IFN\alpha de 148 U/ml (testigo positivo). Cuando el mismo
plasma de donante sano se preincubó una hora con la proteína VP4 de
CVB3 antes de ponerlos en presencia del virus CVB4E2 se encuentra
una producción elevada de IFN\alpha (87 U/ml). Sin embargo,
cuando el mismo plasma se preincuba inicialmente una hora con la
proteína VP4 específica de CVB4E2, antes de añadir CVB4E2, la
producción de IFN\alpha por la PBMC es baja a 8,5 U/ml.
Los testigos virus solos (CVB4E2 o CVB3),
proteínas VP4 de CVB3 o de CVB4E2 solas, MEM o plasma solos no
conllevan producción de IFN\alpha por las PBMC.
Se utilizan bacterias Escherichia coli
competentes JM 109 (Promega, Madison, Estados Unidos).
El plásmido utilizado para transformar las
bacterias competentes es pMAL-c2
(Valera-Calvino y al., 2000) proporcionado por el
Dr. Ruben Valera Calvino, plásmido que codifica una
beta-lactamasa, de ahí la selección de las bacterias
que han recibido el plásmido en un medio que contiene ampicilina, y
que codifica la proteína MBP, a la cual se ha fusionado la proteína
VP4 bajo el control de un promotor inducible a la IPTG (Promega,
Madison, Estados Unidos). (véase la figura 6).
Este medio comprende, para un litro, 20 g de
Bacto^{TM} triptona (DIFCO-BECTON DICKINSON,
Estados Unidos), 5 g de extracto de levadura (DIFCO, Detroit,
Estados Unidos), 10 ml de NaCl 1M, 2,5 ml de KCl 1M, 10 ml de
MgCl_{2} 1M/MgSO_{4} 1M y 10 ml de glucosa 2M, el pH se ajusta a
7.
Este medio comprende, para un litro, 10 g de
triptona (DIFCO-BECTON DICKINSON, Estados Unidos), 5
g de extracto de levadura (DIFCO, Detroit, Estados Unidos), 5 l de
NaCl 1M, su pH es de 7,2. Para las cajas de medio LB, este medio
comprende también 15 g de agar que contiene ampicilina (Invitrogen,
Cergy Pontoise, Francia): El medio LB utilizado para la producción
de proteínas recombinantes se enriquece, por adición de 2 g de
glucosa por litro y contiene 100 \mug de ampicilina por
litro.
Esta solución comprende, para un litro: 20 ml de
tris-HCl (Q.BIOgene, Estados Unidos) 1 M, pH 7,4,
11,7 g de NaCl, 2 ml de EDTA 0,5 M (Sigma-Aldrich,
Estados Unidos). Para la elución de la proteína
MBP-VP4, se añaden 3,6 g de maltosa
(Sigma-Aldrich, Estados Unidos) (10 mM) en el tampón
de columna entonces denominado tampón de elución.
Esta solución comprende, para un litro: 3,2 g de
tris-HCl (Q.BIOgene) (0,2 M), 5,84 g de NaCl (100
mM) y 0,22 g de CaCl_{2}, el pH se ajusta a 8.
Una alicuota de bacterias competentes se
descongela en el hielo, y a continuación 1 a 2 \mul del plásmido
se añaden, y se incuban con las bacterias 30 minutos en el hielo.
Las bacterias experimentan entonces un choque térmico: se ponen 30
segundos a 42ºC, antes de volver 1 a 2 minutos al hielo. se añaden
250 \mul de medio SOC llevado a la temperatura de la pieza, el
tubo se incuba 1 hora a 37ºC con agitación. Se extienden 20 a 100
\mul de la suspensión de bacterias en una caja de medio que
contiene ampicilina, para seleccionar las bacterias transformadas,
la caja se incuba una noche a 37ºC.
Se extienden volúmenes diferentes de la
suspensión de bacterias en diferentes cajas, para obtener al menos
una caja en la que se aíslan las colonias. Las cajas con las
colonias se almacenan a 4ºC.
Se inoculan 10 ml de medio LB con una colonia de
bacterias transformadas en un tubo Falcon® 15 ml, que se incuba una
noche a 37ºC. El día siguiente en un matraz de 2,5 ml litros, se
inocula 1 litro de medio LB rico con estos 10 ml, y a continuación
se incuba a 37ºC con agitación, hasta que su D.O (densidad óptica)
alcance un valor comprendido entre 0,5 y 0,6. Entonces, la
producción de MBP-VP4 se induce por adición de 3 ml
de IPTG (isopropiltiogalactosido) en el matraz, que se incuba al
menos 3 horas a 37ºC con agitación.
El cultivo de bacterias se centrifuga 20 minutos
a 4000 x g a 4ºC. El sobrenadante se elimina entonces y se retoma
el residuo de bacterias en 50 ml de tampón de columna y se congela
por la noche a -20ºC, antes de descongelarse en agua fría y se
coloca en el hielo el día siguiente por la mañana. Las bacterias se
lisan por 8 sonicaciones sucesivas de 15 segundos. El lisado
bacteriano se clarifica por una centrifugación de 30 minutos a 9000
x g, a 4ºC, recuperándose el sobrenadante. En paralelo, se colocan
5 ml de resina de amilosa (NEW ENGLAND BioLabs, Estados Unidos) en
la columna de cromatografía, y a continuación se lavan con 40 ml de
tampón de columna. El extracto celular que contiene la proteína de
fusión MBP-VP4 se inyecta en la columna con un
caudal de 25,6 ml por hora. La resina se lava con 60 ml de tampón
de columna. La proteína MBP-VP4 se eluye con el
tampón de elución, las fracciones se recuperan a razón de 1 ml por
fracción. Las fracciones que tienen una D.O. a 280 nm máxima se
agrupan. La proteína se desala contra PBS, por diálisis y se
concentra sobre una membrana de filtro MacrosepTM a 10 kd (PALL,
Life Sciences, Estados Unidos) por centrifugación a 5000 x g, a 4ºC,
al menos 30 minutos.
La proteína MBP-VP4 obtenida se
escinde con el factor Xa (NEW ENGLAND BioLabs, Estados Unidos), cuya
concentración óptima es del 2% de la de la proteína de fusión
(determinada por espectrometría U.V. con la absorbencia a 280 nm)
en tampón de elución o tampón de digestión.
La proteína MBP, la MBP-VP4 no
escindida y el factor Xa se eliminan por centrifugación sobre una
membrana de filtro Macrosep^{TM} a 10 Kp permeable solamente a la
proteína VP4. El filtrado se recupera y se concentra por
centrifugación sobre una membrana de filtro Macrosep^{TM} a 3 Kp
(PALL, Life Sciences, Estados Unidos). L proteína VP4 concentrada
se almacena a -80ºC.
Se mide la producción de IFN\alpha inducida en
cultivos de PBMC por CVB4E2 previamente incubado en presencia de
plasma de sujetos sanos. Este nivel de producción de IFN\alpha se
mide por el procedimientos DELFIA en los sobrenadantes de cultivo
recuperados al cabo de 48 horas. Cada condición de cultiva necesita
2.10^{5} células por pocillos y una m.o.i de 1 para CVB4E2. Las
muestras de plasma se diluyen a 1/10 en medio RPMI y se incuban 1
hora con CVB4E2 a 37ºC. La proteína VP4 recombinante se pone en
presencia de plasma durante una hora a 37ºC antes de la incubación
con CVB4E2. Los resultados presentan las medias y los desvíos tipos
de tres experimentos independientes realizados con tres donantes
diferentes. (véase la figura 7).
La proteína VP4 recombinante, incubada con el
plasma a tasas variables (10, 1, 0,01 \mug(ml) permite
constatar un efecto dosis-respuesta de la proteína
VP4 recombinante sobre el efecto procurado sobre la incubación con
CVB4E2 de las PBMC por la preincubación del plasma con el virus. Se
obtiene de este modo con la proteína a una tasa de 0,01 \mug una
producción de IFN\alpha de 189,5 \pm 21,6 U/ml, con una tasa de
0,1 \mug/ml 104,7 \pm 4,5 U/ml, con una tasa de 1 \mug/ml
44,1 \pm 24,3 U/ml de IFN\alpha y con una tasa de 10 \mug/ml
15,3 \pm 7,9 U/ml. De este modo cuanto más importante es la dosis
de VP4 recombinante incubada con el plasma, más bajos son los
valores de IFN\alpha (véase la figura 7).
Se han ensayado 40 plasmas de pacientes no
diabéticos y 40 plasmas p sueros de pacientes diabéticos.
Los 5 péptidos VP4 utilizados fueron
sintetizados por la sociedad EPYTOPE (Nimes) sobre la base de la
secuencia de la proteína VP4 del virus CVB4E2 repertoriada en el
banco de datos NCBI (Nº de adhesión de la secuencia: Q86887). Si
posición sobre la secuencia de la proteína VP4 del virus
CVB4-E2 y su secuencia se presentan en la siguiente
Tabla 1. son imbricantes y cubren la totalidad de la secuencia de la
VP4.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón PBS: (para un litro)
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}
- NaCl 8,0 g
- \text{*}
- KCl 0,2 g
- \text{*}
- KH2PO4 0,2 g
- \text{*}
- 2HPO4/2H2O 1,44 g
Ajustar el pH a 7,4
\vskip1.000000\baselineskip
- Solución de lavado
\vskip1.000000\baselineskip
PBS pH=7,4 que contiene tween 20 al 0,05%.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de saturación y de dilución:
\vskip1.000000\baselineskip
Solución diluyen de leche /de bloque concentrada
(KPL diluida a 1/20 en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
- ``Tampón postrecubrimiento:
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón fosfato de sodio 50 mM pH=4,5 que
contiene
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}
- D-Sorbitol 6%
- \text{*}
- NaCl 0,9%
- \text{*}
- BSA 0,1%
- \text{*}
- CAC12/2 H2O 0,1 mM
- \text{*}
- EDTA 4 PM
- \text{*}
- NaN3 0,005%
\vskip1.000000\baselineskip
Ajustar el pH a 4,8
\vskip1.000000\baselineskip
- Solución de anticuerpo secundario
Anticuerpo Anti-IgG.A.M (H+L)
humano acoplado a la peroxidasa (Bio-Rad) diluido a
1/10.000 en el tampón de dilución.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de revelación:
Disolver una cápsula de tampón citrato de
fosfato (Sigma) en 00 ml de agua destilada (Cf. 0,05 M, pH 5,0).
Tomar 25 ml de este tampón y disponerlos en un frasco de 50 ml
rodeado de aluminio. Tomar una pastilla de OPD a 10 mg (Sigma) y
disolverla en estos 25 ml (Df = 0,4 mg(ml). Mezclar con la
ayuda de un remolino. Justo antes de su utilización añadir 10
\mul de H_{2}O_{2} al 30%.
La proteína VP4 o los 5 péptidos VP4, diluidos a
5 \mug/ml en tampón PBS pH = 7,4, se depositan en los pocillos de
una microplaca de 96 pocillos (FluoroNunc, MaxiSorp surface, NUNC,
Dinamarca) a razón de 100 \mul/pocillo. Las placas se incuban a
continuación 1 hora a 37ºC bajo atmósfera húmeda, y a continuación
se dejan 24 horas a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con
el tampón PBS, los pocillos se saturan con 300 \mul de tampón de
saturación durante 1 hora a 37ºC bajo atmósfera húmeda. antes de
lavarse 3 veces con el tampón de lavado. Se depositan a
continuación 250 \mul de tampón de postrecubrimiento en cada uno
de los pocillos y las placas se incuban durante 24 horas a
temperatura ambiente y a continuación se conservan a 4ºC hasta su
utilización.
Los pocillos recubiertos con la proteína VP4 o
los diferentes péptidos VP4 se lavan 3 veces con el tampón de
lavado para eliminar la solución de postrecubrimiento. A
continuación se depositan 100 \mul de los plasmas o sueros
diluidos al 1/50 en el tampón de dilución en los diferentes pocillos
y las placas se incuban 1 hora a 37ºC bajo atmósfera húmeda. Un
pocillo testigo negativo que contiene 100 \mul de tampón de
dilución se realiza en paralelo. Los pocillos se lavan a
continuación 3 veces con la solución de lavado y se añaden 100
\mul de solución de anticuerpo secundario en cada uno de los
pocillos. Después de la incubación de 1 hora a 37ºC en atmósfera
húmeda, los pocillos se lavan 6 veces con la solución de lavado y se
añaden 100 \mul de solución de sustrato encada uno de los
pocillos. Las placas se incuban a continuación 30 minutos a
temperatura ambiente y en la oscuridad. La reacción coloreada se
detiene añadiendo 25 \mul de H_{2}O_{4} 2N (1M) por pocillos
y se leen las placas con la ayuda de un lector de placas con
longitud de onda de 490 nm.
Las D.O. obtenidas para cada uno de los sueros
con la proteína VP4 y los diferentes péptidos VP4 se dividieron por
la D.O. obtenida con el testigo negativo. Las siguientes tablas
presentan la media \pm desvío tipo de las relaciones de D.O.
obtenidas con las dos series de sueros ensayados (Paciente =
paciente diabéticos, Control = no diabéticos), (véase figuras 8 a
10).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 8 a 10 representan esquemáticamente
los resultados de los ensayos ELISA.
Los péptidos VP4-P1 (SEQ ID Nº1)
y VP4-P2 (SEQ ID Nº2) muestran una D.O. comparable a
la proteína VP4 en el ensayo ELISA con 40 sueros de pacientes
(Véase figura 8).
En particular, el péptido VP4-P2
(SEQ ID Nº2) tiene el mismo comportamiento que VP4 en el ensayo
ELISA comparando la media de las D.O. de 40 sueros de pacientes y
de 40 sueros de no diabéticos. (Véase figuras 9 y 10). El péptido
VP4-P2 (SEQ ID Nº2), como VP4, reconoce por lo tanto
más anticuerpos en los diabéticos que en los no diabéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
El material y procedimientos para la producción
de IFN\alpha por PBMC en cultivo y para la revelación del
IFN\alpha producida por el procedimiento DELFIA es el mismo que el
del ejemplo 3.
El péptido VP4-P2 (SEQ ID Nº2)
muestra una disminución dosisdependiente de la producción de
IFN\alpha con ocasión de la infección de las PBMC en presencia de
plasma (Véase figura 11, pistas 7 a 9).
El péptido VP4-P2 imita por lo
tanto la proteína VP4 en este ensayo biológico.
Estos resultados, corroborados en los ensayos
ELISA (punto B) sugieren que el péptido VP4-P2 (SEQ
ID Nº2) lleva uno o más epítopes reconocidos por los anticuerpos
"facilitantes" anti-VP4.
<110> CENTRO HOSPITALARIO REGIONAL
UNIVERSITARIO DE LILLE UNIVERSIDAD DE LILLE 2 DERECHO Y SALUD
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ensayo de diagnóstico in
vitro de infecciones enterovirales
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10476/5PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR0301454
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-02-07
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coxsackievirus B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coxsackievirus B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> coxsackievirus B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coxsackievirus B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coxsackievirus B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (18)
1. Ensayo de diagnóstico in vitro de
enterovirus basado en la revelación de una reacción inmunológica de
tipo reconocimiento antígeno-anticuerpo
caracterizado porque
- -
- el antígeno aplicado o epítopes del mismo, son los que no inducen anticuerpos antivirales neutralizantes sino que inducen anticuerpos "facilitantes" que aumentan la infección viral, y
- -
- dicho antígeno que induce anticuerpos antivirales "facilitantes" es la proteína viral interna estructural VP4 o un fragmento de la misma.
2. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación
1 caracterizado porque la reacción inmunológica de tipo
reconocimiento antígeno-anticuerpo se revela bien
por un anticuerpo antiespecie marcado cuando el ensayo según la
invención consiste en la detección de los anticuerpos
"facilitantes" por los antígenos correspondientes fijados
sobre un soporte, bien por un anticuerpo antiviral marcado o por un
anticuerpo antiviral y a continuación un anticuerpo secundario
antiespecie marcado cuando el ensayo según la invención consiste en
la detección de los antígenos por los anticuerpos
"facilitantes" correspondientes fijados sobre un soporte.
3. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación
2, caracterizado porque el anticuerpo marcado lleva un
marcador de tipo enzima, radioisótopo, compuesto fluorescente,
compuesto quimioluminiscente, compuesto bioluminiscente o quelato
de metales.
4. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque la proteína viral interna o un
fragmento de la misma se obtiene bien por purificación a partir del
virus, bien es una proteína recombinante que presenta las mismas
propiedades inmunógenas, bien se sintetiza químicamente y presenta
las mismas propiedades inmunógenas.
5. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación
4, caracterizado porque el fragmento de la proteína
estructural VP4 es elegido entre los péptidos de secuencia SEQ ID
Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5.
6. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación
4 caracterizado porque el fragmento de la proteína
estructural VP4 es el péptido de secuencia SEQ ID Nº 2.
7. Ensayo de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque los
enterovirus diagnosticados son los coxsackievirus de tipo A o
B.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Ensayo de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque su aplicación
comprende la sucesión de las siguientes etapas:
- a-
- inmovilización de los anticuerpo "facilitantes" o de la proteína viral que induce anticuerpos "facilitantes" o de un fragmento de la misma sobre un soporte
- b-
- inmovilización de anticuerpos control, de proteínas control o de un fragmento de las mismas sobre un soporte
- c-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- d-
- saturación de la superficie de soporte no recubierta por una solución tamponada de proteínas irrelevantes
- e-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- f-
- aplicación de las muestras a estudiar a diferentes diluciones en tampón de saturación
- g-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- h-
- ampliación de la respuesta por aplicación de anticuerpos marcados
- i-
- lavados con una solución salina tamponada adicionada o no de un detergente de baja concentración
- j-
- lectura de la intensidad del marcado.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Ensayo de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque los antígenos
o los anticuerpos "facilitantes" correspondientes se fijan
sobre un soporte de tipo placa de múltiples pocillos para
microvaloración.
10. Ensayo de diagnóstico según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque los
antígenos o los anticuerpos "facilitantes" correspondientes se
fijan sobre un soporte de tipo chip.
11. Estuche o kit para la puesta en práctica de
un ensayo de diagnóstico in vitro de enterovirus según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
- -
- la proteína viral interna estructural VP4 o un fragmento de la misma o los anticuerpos "facilitantes" correspondientes,
- -
- los reactivos para la constitución del medio propicio para la realización de la reacción antígeno-anticuerpo,
- -
- los reactivos que permiten la detección del complejo formado.
12. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para predecir el
desencadenamiento de una patología crónica humana o animal asociada
a una infección por un enterovirus.
13. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para predecir el
desencadenamiento de una diabetes de tipo 1 en un paciente
prediabético.
14. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para definir el estadio
de una patología crónica humana o animal asociada a una infección
por un enterovirus.
15. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para definir el estadio
de una diabetes de tipo 1 asociada a una infección por CVB.
16. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para determinar el
serotipo del enterovirus responsable de una infección aguda humana o
animal.
17. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para determinar la
distribución por serotipo de las infecciones enterovirales en una
población dada humana o animal.
18. Uso del ensayo de diagnóstico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para determinar in
vitro la diana viral de un agente antiviral.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0301454 | 2003-02-07 | ||
| FR0301454A FR2851046B1 (fr) | 2003-02-07 | 2003-02-07 | Test de diagnostic in vitro d'infections enterovirales |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308145T3 true ES2308145T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=32731863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04709254T Expired - Lifetime ES2308145T3 (es) | 2003-02-07 | 2004-02-09 | Ensayo de diagnostico in vitro de infecciones enterovirales. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7534558B2 (es) |
| EP (1) | EP1590670B1 (es) |
| JP (1) | JP2006518844A (es) |
| AT (1) | ATE396402T1 (es) |
| CA (1) | CA2515178A1 (es) |
| DE (1) | DE602004013925D1 (es) |
| ES (1) | ES2308145T3 (es) |
| FR (1) | FR2851046B1 (es) |
| NO (1) | NO20054142L (es) |
| WO (1) | WO2004072644A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2560848A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-10-06 | The Regents Of The University Of California | Method and materials for use in diagnosing viral myocarditis |
| CN116478283A (zh) * | 2020-04-26 | 2023-07-25 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 抗柯萨奇a6型病毒的单克隆抗体及其应用 |
| CN113549146B (zh) * | 2020-04-26 | 2023-07-14 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 针对柯萨奇病毒b1型的单克隆抗体及其用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3939200A1 (de) * | 1989-11-27 | 1991-05-29 | Max Planck Gesellschaft | Enterovirale polypeptide und gruppenspezifischer nachweis von enterovirusinfektionen |
| DE19846271A1 (de) * | 1998-10-08 | 2000-04-13 | Viragen Virus Antigene Gmbh | Verfahren zum Nachweis enteroviraler Antigene und Testkit |
-
2003
- 2003-02-07 FR FR0301454A patent/FR2851046B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-09 ES ES04709254T patent/ES2308145T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 EP EP04709254A patent/EP1590670B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 DE DE602004013925T patent/DE602004013925D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 AT AT04709254T patent/ATE396402T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-02-09 JP JP2006502137A patent/JP2006518844A/ja active Pending
- 2004-02-09 CA CA002515178A patent/CA2515178A1/fr not_active Abandoned
- 2004-02-09 US US10/544,547 patent/US7534558B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-09 WO PCT/FR2004/000287 patent/WO2004072644A1/fr active IP Right Grant
-
2005
- 2005-09-06 NO NO20054142A patent/NO20054142L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2851046B1 (fr) | 2007-07-20 |
| WO2004072644A1 (fr) | 2004-08-26 |
| ATE396402T1 (de) | 2008-06-15 |
| DE602004013925D1 (de) | 2008-07-03 |
| EP1590670B1 (fr) | 2008-05-21 |
| FR2851046A1 (fr) | 2004-08-13 |
| CA2515178A1 (fr) | 2004-08-26 |
| NO20054142D0 (no) | 2005-09-06 |
| JP2006518844A (ja) | 2006-08-17 |
| US7534558B2 (en) | 2009-05-19 |
| NO20054142L (no) | 2005-11-07 |
| US20060246420A1 (en) | 2006-11-02 |
| EP1590670A1 (fr) | 2005-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Graham et al. | Neutralization potency of monoclonal antibodies recognizing dominant and subdominant epitopes on SARS-CoV-2 Spike is impacted by the B. 1.1. 7 variant | |
| Capucci et al. | A further step in the evolution of rabbit hemorrhagic disease virus: the appearance of the first consistent antigenic variant | |
| ES2286852T3 (es) | Metodos para detectar o analizar virus. | |
| Lee et al. | Chikungunya virus neutralization antigens and direct cell-to-cell transmission are revealed by human antibody-escape mutants | |
| ES2226894T3 (es) | Deteccion precoz de los flavivirus utilizando la glicoproteina ns1. | |
| ES2764481T3 (es) | Procedimiento y kit de detección inmunológica de Mycoplasma pneumoniae | |
| KR100847586B1 (ko) | Ｃ형 간염 바이러스의 측정방법 | |
| Abdullahi et al. | Exploring the genetics, ecology of SARS-COV-2 and climatic factors as possible control strategies against COVID-19 | |
| Deregt et al. | Mapping of a type 1-specific and a type-common epitope on the E2 (gp53) protein of bovine viral diarrhea virus with neutralization escape mutants | |
| Graham et al. | Impact of the B. 1.1. 7 variant on neutralizing monoclonal antibodies recognizing diverse epitopes on SARS-CoV-2 Spike | |
| ES2232815T3 (es) | Procedimientos para el tipaje de virus de la hepatitis c y reactivos para su uso en los mismos. | |
| Okumura et al. | Development of serological assays for Thottapalayam virus, an insectivore-borne Hantavirus | |
| Sjölander et al. | Serological divergence of Dobrava and Saaremaa hantaviruses: evidence for two distinct serotypes | |
| Fukumoto et al. | Seroprevalence of trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus in Japan | |
| CN109265542A (zh) | 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| ES2898068T3 (es) | Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pIII de Adenovirus humano (ADV), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por ADV | |
| Makdasi et al. | The neutralization potency of anti-SARS-CoV-2 therapeutic human monoclonal antibodies is retained against viral variants | |
| Tsai et al. | Characterization of monoclonal antibodies to the Zta and DNase proteins of Epstein-Barr virus | |
| ES2308145T3 (es) | Ensayo de diagnostico in vitro de infecciones enterovirales. | |
| Burioni et al. | Cross-reactive pseudovirus-neutralizing anti-envelope antibodies coexist with antibodies devoid of such activity in persistent hepatitis C virus infection | |
| Nedeljkovic et al. | Maturation of IgG avidity to individual rubella virus structural proteins | |
| Deregt et al. | Mapping of two antigenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus | |
| CN112904021A (zh) | 一种双线检测新冠病毒疫苗接种后抗体的试纸条 | |
| Zhang et al. | Recombinant DENV 2 NS5: an effective antigen for diagnosis of DENV infection | |
| CN105137076B (zh) | 小片段gG抗原及其在检测伪狂犬病毒gG抗体中的应用 |