ES2307395B2

ES2307395B2 - QUICK METHOD OF DETECTION AND EVALUATION OF GENOTOXIC AGENTS.

Info

Publication number: ES2307395B2
Application number: ES200602309A
Authority: ES
Inventors: Juan Evaristo Suarez Fernandez; Nora Elsa Soberon Maltos
Original assignee: Universidad de Oviedo
Current assignee: Universidad de Oviedo
Priority date: 2006-09-04
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2026-09-04
Also published as: ES2307395A1

Abstract

Método rápido de detección y evaluación de agentes genotóxicos por RT-PCR basado en la inducción del ciclo lítico de bacteriófagos que detecta y cuantifica la capacidad que tienen ciertas condiciones físicas y compuestos químicos para inducir alteraciones en el material genético. La técnica se fundamenta en la detección de la liberación de profagos de bacterias lisogénicas mediante PCR o RT-PCR, usando como cebadores oligonucleótidos que flanquean la región attP del fago. El método utiliza bacterias Gram positivas o Gram negativas para aumentar el rango de agentes a probar. Está metodología es aplicable a la detección de genotoxicidad ambiental y a la de nuevos compuestos terapéuticos.Rapid method of detection and evaluation of genotoxic agents by RT-PCR based on the induction of the lymphatic cycle of bacteriophages that detects and quantifies the ability of certain physical conditions and chemical compounds to induce alterations in the genetic material. The technique is based on the detection of the release of lysogenic bacteria profages by PCR or RT-PCR, using oligonucleotide primers that flank the attP region of the phage. The method uses Gram positive or Gram negative bacteria to increase the range of agents to be tested. This methodology is applicable to the detection of environmental genotoxicity and that of new therapeutic compounds.

Description

Método rápido de detección y evaluación de agentes genotóxicos.Quick method of detection and evaluation of genotoxic agents

La presente invención se refiere al desarrollo de un método de detección y evaluación de agentes genotóxicos por PCR o RT-PCR basado en la inducción del ciclo lítico de bacteriófagos. Esta metodología detecta y cuantifica la capacidad que tienen ciertas condiciones físicas y compuestos químicos para inducir alteraciones en el material genético. La técnica se fundamenta en la detección de la liberación de profagos de bacterias lisogénicas mediante PCR o RT-PCR, usando como cebadores oligonucleótidos que flanquean la región attP del fago.The present invention relates to the development of a method of detection and evaluation of genotoxic agents by PCR or RT-PCR based on the induction of the lymphatic cycle of bacteriophages. This methodology detects and quantifies the ability of certain physical conditions and chemical compounds to induce alterations in the genetic material. The technique is based on the detection of the release of lysogenic bacteria profages by PCR or RT-PCR, using oligonucleotide primers that flank the attP region of the phage.

Prior art

Se denomina actividad genotóxica a la capacidad que tienen diversos compuestos químicos y agentes físicos para inducir, directa o indirectamente, alteraciones en el material genético que conducen al bloqueo de su replicación o a la aparición de mutaciones, las cuales pueden alterar las características de los organismos y/o inducir la aparición de una patología asociada.Capacity is called genotoxic activity which have various chemical compounds and physical agents to induce, directly or indirectly, alterations in the material genetic that lead to the blockage of their replication or the appearance of mutations, which can alter the characteristics of organisms and / or induce the appearance of an associated pathology.

En los últimos años, se ha generalizado el uso de metodologías de química combinatoria para generar familias de moléculas derivadas de un "compuesto líder", que posee actividad antibiótica y/o antitumoral (compuestotecas). Uno de los problemas asociados a esta práctica es el ensayo de la posible actividad biológica de las múltiples variantes sintetizadas.In recent years, the use has become widespread of combinatorial chemistry methodologies to generate families of molecules derived from a "leading compound", which has antibiotic and / or antitumor activity (compoteotheques). One of the problems associated with this practice is the trial of the possible Biological activity of the multiple synthesized variants.

Por otro lado, la contaminación del agua y el suelo por diversos compuestos resultantes de la actividad industrial, es una fuente de preocupación sanitaria importante, entre otras causas, porque dichos compuestos con potencial efecto mutagénico y xenobiótico pueden acceder a la cadena alimentaria a través del consumo de plantas, que los absorben, o de los animales herbívoros, que los acumulan en su organismo.On the other hand, water pollution and soil by various compounds resulting from the activity industrial, is an important source of health concern, among other causes, because said compounds with potential effect mutagenic and xenobiotic can access the food chain to through the consumption of plants, which absorb them, or animals herbivores, which accumulate them in your body.

En la actualidad, para la medida de la genotoxicidad de sustancias biológicamente activas y/o potencialmente nocivas para el medio ambiente se utilizan cultivos de microorganismos o de células animales. Estas últimas crecen muy despacio y precisan de instalaciones y procedimientos sofisticados, por lo que la obtención de resultados es lenta y costosa. Así pues, las ventajas principales de los tests basados en la actividad microbiana son la sencillez de manejo y la rapidez en la obtención de resultados, lo que los hace, comparativamente, baratos.Currently, for the measurement of genotoxicity of biologically active substances and / or potentially harmful to the environment crops are used of microorganisms or animal cells. The latter grow very slowly and require sophisticated facilities and procedures, So obtaining results is slow and expensive. So that, the main advantages of activity-based tests microbial are the simplicity of handling and the rapidity in obtaining of results, which makes them comparatively cheap.

Los ensayos microbianos de genotoxicidad se basan en dos principios:Microbial genotoxicity assays are They are based on two principles:

\ding{226}\ ding {226}: Detectan mutantes inducidos por el agente genotóxico capaces de desarrollarse en medios en los que el organismo parental no lo hace.They detect induced mutants by the genotoxic agent capable of developing in media in the that the parental organism does not.

\ding{226}\ ding {226}: Detectan la respuesta SOS, que se induce como consecuencia de situaciones de estrés, especialmente las derivadas del daño al material genético bacteriano.They detect the SOS response, which is induced as a result of stress situations, especially those derived from damage to genetic material bacterial.

Dentro de los primeros se engloban el test de Ames (Maron y Ames, "Revised methods for the Salmonella mutagenicity test". Mutat Res. 1983 May; 113(3-4):173-215) y el de resistencia a la arabinosa (Dorado y Pueyo, "L-arabinose resistance test with Salmonella typhimurium as a primary tool for carcinogen screening". Cancer Res. 1988 Feb 15; 48(4):907-12). En ambos se utilizan cepas de Salmonella typhimurium con mutaciones puntuales que les impiden, respectivamente, sintetizar histidina o crecer en presencia del monosacárido. Lo que se mide es la capacidad del agente genotóxico de revertir dichas mutaciones, dando lugar a bacterias que crecen en medios sin el aminoácido o en presencia de arabinosa. Estos tests presentan tres inconvenientes: a) se necesita una media de tres días para completarlos y requieren bastante material; b) si el compuesto que se analiza es tóxico, la bacteria morirá durante el tratamiento, por lo que no se podrá valorar la frecuencia de reversión de la mutación y c) se utilizan bacterias Gram negativas exclusivamente. Las bacterias de este grupo presentan una pared celular con una capa externa impermeable para multitud de compuestos, lo que restringe el universo de sustancias a probar. Este problema ha sido solventado, en parte, con el uso de mutantes que presentan alteraciones en su pared para hacerla más permeable, aunque esto provoca un menor vigor de las cepas y dificulta su utilización.Among the former are the Ames test (Maron and Ames, "Revised methods for the Salmonella mutagenicity test". Mutat Res. 1983 May; 113 (3-4): 173-215) and the arabinose resistance test ( Dorado and Pueyo, "L-arabinose resistance test with Salmonella typhimurium as a primary tool for carcinogen screening." Cancer Res. 1988 Feb 15; 48 (4): 907-12). In both, strains of Salmonella typhimurium are used with specific mutations that prevent them, respectively, from synthesizing histidine or growing in the presence of the monosaccharide. What is measured is the ability of the genotoxic agent to reverse these mutations, giving rise to bacteria that grow in media without the amino acid or in the presence of arabinose. These tests have three drawbacks: a) it takes an average of three days to complete them and they require a lot of material; b) if the compound analyzed is toxic, the bacteria will die during treatment, so the frequency of mutation reversion cannot be assessed and c) Gram-negative bacteria are used exclusively. The bacteria in this group have a cell wall with a waterproof outer layer for a multitude of compounds, which restricts the universe of substances to be tested. This problem has been solved, in part, with the use of mutants that have alterations in its wall to make it more permeable, although this causes a lower vigor of the strains and hinders their use.

La respuesta SOS es un mecanismo de emergencia que las bacterias activan especialmente cuando sufren alteraciones en su material genético que afectan a su replicación o a la fidelidad de la transcripción del mensaje. Consiste en la activación de una serie de genes cuyos productos están destinados a reparar el daño que actuó como inductor de la respuesta.The SOS response is an emergency mechanism that bacteria activate especially when they suffer alterations in their genetic material that affect their replication or the fidelity of the transcription of the message. Consists of the activation of a series of genes whose products are intended for repair the damage that acted as a response inducer.

Las metodologías que detectan la respuesta SOS se agrupan en dos categorías:The methodologies that detect the SOS response They are grouped into two categories:

a)to): Tests basados en la detección de la actividad de un promotor inducible por SOS.Tests based on the detection of the activity of an inducible promoter by SOS.

b)b): Tests que miden la inducción de profagos residentes en el genoma de la bacteria.Tests that measure the induction of profago residents in the genome of the bacterium.

En el primer grupo, el promotor activable por SOS provoca la expresión de un gen cuyo producto da lugar a un cambio en el cultivo que es mensurable. Los genes utilizados como reporteros son básicamente dos:In the first group, the promoter activatable by SOS causes the expression of a gene whose product results in a crop change that is measurable. The genes used as Reporters are basically two:

lacZ, que codifica para una \beta-galactosidasa (cromotest) (Quillardet et al. "SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity". Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Oct; 79(19):5971-5) y el complejo de la luciferasa (WO94113831, "A highly sensitive method for detecting environmental insults", 1994). En el primer caso, las células, una vez tratadas con el compuesto a probar, se rompen para liberar el enzima y el extracto se añade a un sustrato para dar lugar a un producto coloreado. En el segundo, se genera luz cuya intensidad puede ser medida. Una ventaja de estos métodos respecto a los anteriores es que se acorta el tiempo necesario para observar los resultados. La detección de la actividad \beta-galactosidasa presenta algunos inconvenientes respecto a la observación de la luminiscencia, como la necesidad de lisar las células y el gasto asociado a la detección de la actividad enzimática. Los inconvenientes de ambos procedimientos son que en ellos se utilizan organismos Gram negativos recombinantes, que aparte de poder presentar el problema de impermeabilidad indicado anteriormente, pueden plantear reservas respecto a su inocuidad medio ambiental. Por otro lado, se miden reacciones enzimáticas, de manera que si el agente a probar inhibe la producción del enzima se pueden obtener resultados negativos falsos. lacZ , which codes for a β-galactosidase (chromotest) (Quillardet et al . "SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity." Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Oct ; 79 (19): 5971-5) and the luciferase complex (WO94113831, "A highly sensitive method for detecting environmental insults", 1994). In the first case, the cells, once treated with the compound to be tested, are broken to release the enzyme and the extract is added to a substrate to give rise to a colored product. In the second, light is generated whose intensity can be measured. An advantage of these methods over the previous ones is that the time needed to observe the results is shortened. The detection of β-galactosidase activity has some drawbacks with regard to the observation of luminescence, such as the need to lyse the cells and the expense associated with the detection of enzymatic activity. The disadvantages of both procedures are that they use recombinant Gram-negative organisms, which apart from being able to present the impermeability problem indicated above, may raise reservations regarding their environmental safety. On the other hand, enzymatic reactions are measured, so that if the agent to be tested inhibits the production of the enzyme, false negative results can be obtained.

Los tests que miden la inducción de profagos se basan en la capacidad que tienen algunos virus bacterianos de integrar su ADN en puntos concretos del genoma de la célula que han infectado. Los virus que presentan esta propiedad se denominan atemperados y las células que los albergan se dice que son lisogénicas. La inducción de la respuesta SOS va a provocar la liberación del genoma viral y, en último término, la generación de una progenie viral y la lisis de la célula hospedadora (Walter G. C. "The SOS response of Escherichia coli". En: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (Ingraham, J. L., Low K. B., Magasanik, B., Schaechter M. and Umbarger, H. E., Eds.) 1987. pp. 1346-1357. A. S. M. Press. Washington D. C.; Janion "Some aspects of the SOS response system: a critical survey". Acta Biochim Pol. 2001 48(3):599-610). Así pues, en estos métodos, denominados de microescrutinio, se cuentan las placas de lisis que se originan en una cepa susceptible como consecuencia de la acción de un agente genotóxico sobre un cultivo lisogénico y, complementariamente, se mide la pérdida de turbidez de dicho cultivo. En la práctica se usan células lisogénicas de Escherichia coli que albergan al profago lambda (Rossman T.G., Molina M., and Meyer L.W. ``The genetic toxicology of metal compounds: I. Induction of lambda prophage in E. coli WP2s (lambda). Environ Mutagen. 1984 6(1):59-69.; DeMarini, D.M., Brooks, H.G. and Parkes, D.G. Jr. "Induction of prophage lambda by chlorophenols". 1990 Environ. Mol. Mutagen. 15: 1-9). Estos métodos son baratos, no hacen uso de organismos modificados genéticamente y el propio fago lisa a las células, por lo que no es necesario forzar la rotura de las mismas.Tests that measure the induction of profagos are based on the ability of some bacterial viruses to integrate their DNA into specific points in the genome of the cell they have infected. Viruses that exhibit this property are called tempered and the cells that harbor them are said to be lysogenic. The induction of the SOS response will cause the release of the viral genome and, ultimately, the generation of a viral progeny and the lysis of the host cell (Walter GC "The SOS response of Escherichia coli ". In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (Ingraham, JL, Low KB, Magasanik, B., Schaechter M. and Umbarger, HE, Eds.) 1987. pp. 1346-1357. ASM Press. Washington DC; Janion "Some aspects of the SOS response system: a critical survey ". Acta Biochim Pol. 2001 48 (3): 599-610). Thus, in these methods, called microscrutinium, lysis plates that originate from a susceptible strain are counted as a consequence of the action of a genotoxic agent on a lysogenic culture and, in addition, the turbidity loss of said culture is measured. . In practice, Escherichia coli lysogenic cells that house the profago lambda (Rossman TG, Molina M., and Meyer LW `` The genetic toxicology of metal compounds: I. Induction of lambda prophage in E. coli WP2s (lambda)) are used. Environ Mutagen. 1984 6 (1): 59-69 .; DeMarini, DM, Brooks, HG and Parkes, DG Jr. "Induction of prophage lambda by chlorophenols". 1990 Environ. Mol. Mutagen. 15: 1-9). These methods are cheap, do not make use of genetically modified organisms and the phage itself smooth to the cells, so it is not necessary to force them to break.

Sin embargo, estos métodos de microescrutinio tienen inconvenientes asociados a: a) el excesivo tiempo empleado para la obtención de resultados, dos días aproximadamente, b) la necesidad de trabajar con dos cepas, una lisogénica para el fago y la otra susceptible, c) lo laborioso de los métodos, d) la producción de nuevos virus es un proceso complejo con muchos estadios intermedios (replicación, síntesis de proteínas, ensamblaje, etc.) cada uno de los cuales puede ser inhibido por compuestos concretos, lo que podría impedir la generación de una progenie, dando lugar a un resultado negativo falso. Además, el empleo exclusivo de bacterias Gram negativa en estos ensayos puede producir resultados negativos falsos debido a que la pared de estas bacterias es impermeable al paso de ciertos agentes genotóxicos.However, these microscrutiny methods They have drawbacks associated with: a) excessive time spent to obtain results, approximately two days, b) the need to work with two strains, a lysogenic for the phage and the other susceptible, c) the laborious methods, d) the New virus production is a complex process with many intermediate stages (replication, protein synthesis, assembly, etc.) each of which can be inhibited by concrete compounds, which could prevent the generation of a progeny, resulting in a false negative result. In addition, the Exclusive use of Gram negative bacteria in these assays can produce false negative results because the wall of these bacteria is impervious to the passage of certain agents genotoxic

Definitions

Fago A2: Es un bacteriófago atemperado capaz de infectar a las especies Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei. El virión presenta cabezas isométricas y colas no contráctiles. Su genoma consiste en una doble hebra de ADN de unas 43.4 Kb. El fago presenta extremos cohesivos 3' sobresalientes que permiten la circularización del genoma cuando se introduce en una bacteria. Se espera que diferentes cadenas nucleotídicas aisladas de diferentes cepas del fago y correspondientes a una misma región tengan una homología de al menos el 90% debido a que dichas secuencias se encuentran conservadas por la evolución. Del mismo modo, también podrán encontrarse secuencias cuya homología sea superior al 95% o al 98%. Phage A2 : It is a tempered bacteriophage capable of infecting the Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei species. The virion has isometric heads and non-contractile tails. Its genome consists of a double strand of DNA of about 43.4 Kb. The phage has 3 'cohesive ends that allow the genome to circulate when introduced into a bacterium. It is expected that different nucleotide chains isolated from different strains of the phage and corresponding to the same region have a homology of at least 90% because these sequences are conserved by evolution. Similarly, sequences whose homology is greater than 95% or 98% may also be found.

Fago Lambda: es un virus atemperado cuyo genoma reside en una molécula de ADN en doble cadena de aproximadamente 48.5 Kb. con extremos cohesivos 5' sobresalientes. Infecta a diversas cepas de la especie E. coli. Se espera que diferentes cadenas polinucleotídicas aisladas de diferentes cepas del fago y correspondientes a una misma región tengan una homología de al menos el 90% debido a que dichas secuencias se encuentran conservadas por la evolución. Del mismo modo, también podrán encontrarse secuencias cuya homología sea superior al 95% o al 98%. Phage Lambda : It is a tempered virus whose genome resides in a double-stranded DNA molecule of approximately 48.5 Kb. With 5 'protruding cohesive ends. It infects various strains of the species E. coli . It is expected that different polynucleotide chains isolated from different strains of the phage and corresponding to the same region have a homology of at least 90% because these sequences are conserved by evolution. Similarly, sequences whose homology is greater than 95% or 98% may also be found.

Región o punto attP : El sitio attP es la región del genoma viral en el que ocurre una recombinación que conducirá a la integración/escisión de dicho genoma en el cromosoma bacteriano (Alvarez M.A., Herrero M., and Suárez J.E. "The site-specific recombination system of the Lactobacillus species bacteriophage A2 integrates in gram positive and gram negative bacteria" 1998 Virology. Oct 10; 250(1):185-93. (Campbell 2003. "Prophage insertion sites". Res. Microbiol. 154: 277-282). Region or attP point : The attP site is the region of the viral genome in which recombination occurs that will lead to the integration / excision of that genome in the bacterial chromosome (Alvarez MA, Herrero M., and Suárez JE "The site-specific recombination system of the Lactobacillus species bacteriophage A2 integrates in gram positive and gram negative bacteria "1998 Virology. Oct 10; 250 (1): 185-93. (Campbell 2003." Prophage insertion sites ". Res. Microbiol. 154: 277- 282).

Fragmentos polinucleotidicos: por este término se entenderán secuencias de polinucleótidos continuos de al menos 10 nucleótidos, preferentemente de al menos 20 nucleótidos y más preferentemente de al menos 25 nucleótidos que deriven de otros polinucleótidos mayores. Polynucleotide fragments : This term means continuous polynucleotide sequences of at least 10 nucleotides, preferably of at least 20 nucleotides and more preferably of at least 25 nucleotides derived from other major polynucleotides.

PCR a tiempo real: esta técnica, también conocida como PCR cuantitativa, posibilita la detección inmediata de la amplificación de secuencias de ADN o ARN de interés y proporciona un dato cuantitativo que es función de la concentración inicial de la molécula usada como molde. La medida se hace por fluorescencia, existiendo dos estrategias de detección: 1) uso de fluorocromos que sólo emiten fluorescencia cuando están intercalados con ADN en cadena doble (dsADN). De esta manera, cuanto más dsADN se genera, más fluorescencia se detecta. 2) utilización de cebadores con fluorescencia enmascarada. En este caso, la ADN polimerasa desplaza el agente que reprime la fluorescencia y así, la emisión de luz será proporcional a la concentración de ADN amplificado. Real-time PCR : This technique, also known as quantitative PCR, enables immediate detection of amplification of DNA or RNA sequences of interest and provides quantitative data that is a function of the initial concentration of the molecule used as a template. The measurement is done by fluorescence, there are two detection strategies: 1) use of fluorochromes that only emit fluorescence when intercalated with double stranded DNA (dsDNA). In this way, the more dsDNA is generated, the more fluorescence is detected. 2) use of primers with masked fluorescence. In this case, the DNA polymerase displaces the agent that represses the fluorescence and thus, the emission of light will be proportional to the concentration of amplified DNA.

Amplicón: se denomina así a cualquier fragmento de ADN que resulta de la polimerización repetida de un ácido nucleico molde (ADN o ARN) limitado por dos oligonucleótidos cebadores. Amplicon : Any DNA fragment that results from repeated polymerization of a template nucleic acid (DNA or RNA) limited by two oligonucleotide primers is named.

Cebador: polinucleótido de pequeño tamaño que se corresponde con una forma polimérica de nucleótidos de una longitud de al menos 10 nucleótidos, preferentemente entre 15 y 30 nucleótidos, compuesto por ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos, y que se une específicamente a ADN o ARN para su amplificación y actúa como punto de partida para la acción catalítica de una polimerasa. Primer : small polynucleotide that corresponds to a polymeric form of nucleotides of at least 10 nucleotides in length, preferably between 15 and 30 nucleotides, composed of ribonucleotides or deoxyribonucleotides, and that specifically binds to DNA or RNA for amplification and acts as a starting point for the catalytic action of a polymerase.

Kit de análisis: se entiende por kit cualquier soporte que permita la detección de secuencias polinucleotidicos. Dichas secuencias pueden haber sido amplificadas fuera del kit o dentro de éste mediante cebadores. Adicionalmente, el kit puede contener cualquier reactivo o compuesto necesario para su puesta a punto, además de medios de cultivo que posibiliten el crecimiento de aquellas bacterias de las que proceden las secuencias a analizar. Analysis kit : kit means any support that allows the detection of polynucleotide sequences. Said sequences may have been amplified outside the kit or within it by primers. Additionally, the kit can contain any reagent or compound necessary for its adjustment, in addition to culture media that allow the growth of those bacteria from which the sequences to be analyzed come.

Por otro lado, la detección de las secuencias en el kit puede ser realizada mediante sondas marcadas o no, PCR a tiempo real, u otras técnicas sobradamente conocidas en el estado de la técnica.On the other hand, the detection of sequences in The kit can be made using probes labeled or not, PCR a real time, or other techniques well known in the state of technique

Explanation of the invention.

Existe la necesidad de encontrar métodos que permitan detectar y evaluar de manera fiable la acción de los agentes genotóxicos sin las limitaciones que tienen las técnicas actualmente disponibles. El sistema que propone la presente invención pertenece a la categoría de los ensayos microbianos de genotoxicidad, que detectan la inducción de profagos residentes en genomas bacterianos ante la estimulación de la respuesta SOS.There is a need to find methods that allow to detect and evaluate reliably the action of genotoxic agents without the limitations that techniques have currently available. The system proposed by this invention belongs to the category of microbial assays of genotoxicity, which detect the induction of profagos resident in Bacterial genomes before stimulation of the SOS response.

Durante el proceso de integración del profago, tanto el ADN viral como el bacteriano se abren en puntos específicos, denominados respectivamente attP y attB, a partir de los cuales se produce la soldadura entre ambas moléculas de ADN, quedando el genoma viral integrado en el cromosoma bacteriano (Fig. 1).During the process of integration of the profago, both viral and bacterial DNA open at specific points, called respectively attP and attB , from which welding occurs between both DNA molecules, leaving the viral genome integrated in the chromosome bacterial (Fig. 1).

La liberación del ADN viral, consecuencia de la activación de la respuesta SOS, es el proceso inverso al expuesto en el párrafo anterior y que ocurre en los mismos puntos. De este modo, los segmentos de ADN viral que se encuentran a cada lado de attP y que, por lo tanto, están contiguos en el ADN del fago independiente, quedan separados por todo el ADN bacteriano después de la integración, y vuelven a quedar adyacentes una vez que se libera el profago (Fig. 1).The release of viral DNA, a consequence of the activation of the SOS response, is the inverse process to the one described in the previous paragraph and that occurs at the same points. Thus, the segments of viral DNA that are located on each side of attP and, therefore, are contiguous in the independent phage DNA, are separated by all bacterial DNA after integration, and become adjacent again. once the prophane is released (Fig. 1).

Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo procedimiento de análisis y evaluación de compuestos genotóxicos de elevada sensibilidad, amplio espectro de detección e interés potencial en sectores como el farmacéutico y el medioambiental, basado en la amplificación y detección de las regiones que flanquean al sitio attP de un fago atemperado de bacterias Gram positivas. Además, dicho procedimiento se combina con la detección de la inducción del ciclo lítico de fagos atemperados de bacterias Gram negativas. Más concretamente, los bacteriófagos y las especies bacterianas empleadas son respectivamente el fago A2/Lactobacillus casei (L. casei) y el fago lambda/Escherichia coli (E. coli). Esta combinación aumenta el universo potencial de compuestos que pueden ser evaluados, ya que la diferente estructura de la pared celular de las bacterias Gram positivas y de las Gram negativas facilita el paso a su través de moléculas con propiedades físico-químicas muy distintas, grandes (incluso macromoléculas) e hidrofílicas en el primer caso y pequeñas e hidrofóbicas en el segundo.The authors of the present invention have developed a new method of analysis and evaluation of genotoxic compounds of high sensitivity, broad detection spectrum and potential interest in sectors such as pharmaceutical and environmental, based on the amplification and detection of regions flanking the attP site of a tempered phage of Gram positive bacteria. Furthermore, said procedure is combined with the detection of the induction of the lithic cycle of tempered phages of Gram negative bacteria. More specifically, the bacteriophages and bacterial species used are respectively phage A2 / Lactobacillus casei (L. casei ) and phage lambda / Escherichia coli (E. coli ). This combination increases the potential universe of compounds that can be evaluated, since the different cell wall structure of Gram positive and Gram negative bacteria facilitates the passage through molecules with very different physicochemical properties, large ( including macromolecules) and hydrophilic in the first case and small and hydrophobic in the second.

Así, la eliminación del efecto barrera jugado por la membrana externa de las bacterias Gram negativas podría ser de gran utilidad para la detección de actividades antitumorales, ya que muchos agentes que se unen al ADN y que no son activos frente a éstas bacterias porque no acceden a su citoplasma, si son inhibitorias para las bacterias Gram positivas. Por lo tanto, el análisis del poder genotóxico de determinadas sustancias empleando únicamente bacterias Gram negativas, tales como E. coli o de S. Typhimurium, puede dar lugar a conclusiones erróneas.Thus, the elimination of the barrier effect played by the outer membrane of Gram-negative bacteria could be very useful for the detection of antitumor activities, since many agents that bind to DNA and are not active against these bacteria because they do not access to their cytoplasm, if they are inhibitory for Gram positive bacteria. Therefore, the analysis of the genotoxic power of certain substances using only Gram-negative bacteria, such as E. coli or S. Typhimurium , can lead to erroneous conclusions.

Además, el empleo de L. casei y E. coli supone una ventaja adicional respecto de bacterias tales como S. Typhimurium o bacterias modificadas genéticamente, ya que no conlleva riesgos para la salud humana y el medio ambiente y no debe realizarse en laboratorios especialmente acondicionados para la manipulación de este tipo de micro-
organismos.In addition, the use of L. casei and E. coli is an additional advantage over bacteria such as S. Typhimurium or genetically modified bacteria, since it does not entail risks to human health and the environment and should not be carried out in specially conditioned laboratories. for handling this type of micro-
organisms.

Por otro lado, el presente método únicamente precisa inocular el medio de cultivo, recoger muestras a tiempos determinados de incubación y preparar la reacción de PCR o RT-PCR. No es necesario sembrar los organismos en medios indicadores como ocurre con los métodos basados en detección de retromutaciones o en el microescrutinio, el cual precisa, además, de dos cepas, la lisogénica y la indicadora sobre la que se forman las placas de lisis. Además, en los métodos de PCR y RT-PCR las células no tienen que romperse como ocurre con el cromotest, ya que el calentamiento a 95ºC en el primer paso del PCR las lisa.On the other hand, the present method only it is necessary to inoculate the culture medium, collect samples in time determined incubation and prepare the PCR reaction or RT-PCR It is not necessary to sow organisms in indicator means as with detection-based methods of retromutations or in microscrutiny, which requires, in addition, of two strains, the lysogenic and the indicator on which They form the lysis plates. In addition, in the PCR methods and RT-PCR cells do not have to break as occurs with cromotest, since heating at 95 ° C in the first step of the PCR the lisa.

Así, un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método de detección y evaluación de agentes genotóxicos, mediante amplificación por PCR con cebadores que hibridan con regiones que comprenden al sitio attP del genoma de al menos dos fagos atemperados, capaces de infectar diferencialmente a bacterias Gram positiva y Gram negativa, que comprende:Thus, a first aspect of the present invention relates to a method of detection and evaluation of genotoxic agents, by PCR amplification with primers that hybridize with regions comprising the attP site of the genome of at least two tempered phages, capable of differentially infecting Gram positive and Gram negative bacteria, which includes:

a.-to.-: Incubar al menos una alícuota de una bacteria Gram positiva lisogénica para un fago y al menos una alícuota de una bacteria Gram negativa lisogénica para un fago.Incubate at least one aliquot of a Gram positive lysogenic bacteria for a phage and at least one aliquot of a lysogenic Gram negative bacterium for a phage

b.-b.-: Someter al cultivo a la acción de al menos un agente genotóxico.Subject the crop to the action of at less a genotoxic agent.

c.-C.-: Amplificar secuencias que comprendan la región attP, sus secuencias complementarias o fragmentos de las mismas.Amplify sequences that comprise the attP region, its complementary sequences or fragments thereof.

d.-d.-: Detección de los amplicones obtenidos en el paso c.Detection of the amplicons obtained in step c.

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En una realización preferida de este aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Lactobacillus casei, el fago atemperado para dicha bacteria es el fago A2 y la secuencia amplificada tiene al menos un 90%, preferentemente un 95% y más presentemente un 98% de homología con la secuencia SEQ ID 1, la secuencia complementaria o fragmentos de la mismas. En una realización aun más preferida la secuencia amplificada es la SEQ ID 1, la secuencia complementaria o fragmentos de las mismas. Y en una realización todavía mas preferida la región amplificada es el fragmento SEQ ID 2 o su secuencia complementaria.In a preferred embodiment of this aspect of the invention the Gram positive bacterium is Lactobacillus casei , the tempered phage for said bacterium is phage A2 and the amplified sequence has at least 90%, preferably 95% and more presently 98% of homology with the sequence SEQ ID 1, the complementary sequence or fragments thereof. In an even more preferred embodiment the amplified sequence is SEQ ID 1, the complementary sequence or fragments thereof. And in an even more preferred embodiment the amplified region is the SEQ ID 2 fragment or its complementary sequence.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Escherichia coli, el fago atemperado para dicha bacteria es el fago lambda y la secuencia amplificada tiene al menos un 90%, preferentemente un 95% y más presentemente un 98% de homología con la secuencia SEQ ID 5, la secuencia complementaria o fragmentos de la mismas. En una realización aun más preferida la secuencia amplificada es la SEQ ID 5, la secuencia complementaria o fragmentos de las mismas. Y en una realización todavía más preferida la región amplificada es el fragmento SEQ ID 6 o su secuencia complementaria.In another preferred embodiment of this aspect of the invention the Gram positive bacterium is Escherichia coli , the tempered phage for said bacterium is the lambda phage and the amplified sequence has at least 90%, preferably 95% and more presently 98% of homology with the sequence SEQ ID 5, the complementary sequence or fragments thereof. In an even more preferred embodiment the amplified sequence is SEQ ID 5, the complementary sequence or fragments thereof. And in an even more preferred embodiment the amplified region is the SEQ ID 6 fragment or its complementary sequence.

En otra realización preferida de la presente invención los cebadores tienen una longitud de al menos 10, preferentemente entre 15 y 30 nucleótidos. En una realización aun más preferida, dichos cebadores tienen cualquiera de las SEQ ID 3, 4, 5 y 6.In another preferred embodiment of the present invention the primers have a length of at least 10, preferably between 15 and 30 nucleotides. In one embodiment yet more preferred, said primers have any of SEQ ID 3, 4, 5 and 6.

En otra realización aun más preferida de la presente invención la PCR es una PCR múltiple.In another even more preferred embodiment of the Present invention the PCR is a multiple PCR.

Un segundo aspecto de la presente invención se relaciona con kit para la detección y evaluación de agentes genotóxicos que comprende al menos una bacteria Gram positiva, al menos una Gram negativa lisogénicas para fagos inducibles por respuesta SOS o el genoma de dichas bacterias y las secuencias que comprenden a los sitios attP de dichos fagos, sus secuencias complementarias o fragmentos de las mismas.A second aspect of the present invention relates to a kit for the detection and evaluation of genotoxic agents comprising at least one Gram positive bacterium, at least one lysogenic Gram negative for phages inducible by SOS response or the genome of said bacteria and the sequences of said bacteria. they comprise the attP sites of said phages, their complementary sequences or fragments thereof.

En una realización más preferida del presente aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Lactobacillus casei y la Gram negativa es Escherichia coli.In a more preferred embodiment of the present aspect of the invention the Gram positive bacterium is Lactobacillus casei and the Gram negative is Escherichia coli .

En otra realización aun mas preferida de este aspecto de la invención las secuencias que comprenden al sitio attP pertenecen a los fagos A2 y lambda y tienen al menos 90%, preferentemente un 95% y más preferentemente un 98% de homología con SEQ ID 1, SEQ ID 5, sus secuencias complementarias o fragmentos de las mismas. Y todavía más preferentemente, las secuencias que comprenden al sitio attP que tienen la SEQ ID 2, SEQ ID 6 o sus secuencias complementarias.In another even more preferred embodiment of this aspect of the invention the sequences comprising the attP site belong to phages A2 and lambda and have at least 90%, preferably 95% and more preferably 98% homology with SEQ ID 1, SEQ ID 5, its complementary sequences or fragments thereof. And even more preferably, the sequences comprising the attP site having SEQ ID 2, SEQ ID 6 or its complementary sequences.

En una realización preferida, el kit comprende cebadores capaces de amplificar cualquiera de las secuencias mencionadas en este aspecto de la invención. Mas preferentemente, dichos cebadores tienen cualquiera de las SEQ ID 3, 4, 7 y 8.In a preferred embodiment, the kit comprises primers capable of amplifying any of the sequences mentioned in this aspect of the invention. More preferably, said primers have any of SEQ ID 3, 4, 7 and 8.

Brief description of the figures

Figura 1.- Esquema de la disposición del ADN viral (línea gruesa) respecto al bacteriano. Los sitios attP y attB son los puntos en los que ocurre la recombinación que conducirá a la integración/escisión del ADN viral. Las flechas horizontales representan a los oligonucleótidos cebadores. Obsérvese que los oligonucleótidos, que tienen orientación divergente en el fago integrado, pasan a ser convergentes en el ADN viral autónomo. El rectángulo colocado entre ambos cebadores representa el segmento que resultará amplificado por PCR.Figure 1.- Scheme of the disposition of the viral DNA (thick line) with respect to the bacterial one. The attP and attB sites are the points at which recombination occurs that will lead to the integration / excision of viral DNA. The horizontal arrows represent the oligonucleotide primers. Note that oligonucleotides, which have divergent orientation in the integrated phage, become convergent in the autonomous viral DNA. The rectangle placed between both primers represents the segment that will be amplified by PCR.

Figura 2.- Influencia de la mitomicina C sobre la escisión del genoma del fago A2 del cromosoma de una cepa lisogénica de Lactobacillus casei, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago). \medbullet Cultivo sin Mitomicina C; \blacksquare 12,5 ng/ml; \ding{115} 50 ng/ml; \blacklozenge 300 ng/ml; \times 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; \Delta 10000 ng/ml. Nótese que en la gráfica los valores de Ct (eje de ordenadas) van de mayor a menor. La razón de este tipo de representación se deriva del hecho de que los valores de Ct son tanto más pequeños cuanto mayor es la concentración del ADN molde, que es el parámetro que nos indica la magnitud del efecto genotóxico de la mitomicina C.Figure 2.- Influence of mitomycin C on excision of phage A2 genome from the chromosome of a lysogenic strain of Lactobacillus casei , measured by RT-PCR (the amplified segment is flanked by two primers that frame the pt phage site). ? Culture without Mitomycin C; ? 12.5 ng / ml; 115 {115} 50 ng / ml; ? 300 ng / ml; 1000 ng / ml; ? 3000 ng / ml; ? 5000 ng / ml; ? 10000 ng / ml. Note that in the graph the values of Ct (ordinate axis) range from highest to lowest. The reason for this type of representation is derived from the fact that Ct values are all the smaller the higher the concentration of the template DNA, which is the parameter that indicates the magnitude of the genotoxic effect of mitomycin C.

Figura 3.- Influencia de la mitomicina C sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Lactobacillus casei lisogénico para el fago A2. Los sobrenadantes de cultivo se incluyeron en medio semisólido sembrado con L. casei no lisogénico, utilizando la técnica de la doble capa y se incubaron durante la noche hasta conseguir visualizar las placas de lisis en el césped de la cepa indicadora. \medbullet Cultivo sin Mitomicina C; \blacksquare 12,5 ng/ml; \ding{115} 50 ng/ml; \blacklozenge 300 ng/ml; \times 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; \Delta 10000 ng/ml.Figure 3.- Influence of mitomycin C on the production of new viruses by a culture of lysogenic Lactobacillus casei for phage A2. The culture supernatants were included in semi-solid medium seeded with non-lysogenic L. casei , using the double layer technique and incubated overnight until the lysis plates were visualized on the lawn of the indicator strain. ? Culture without Mitomycin C; ? 12.5 ng / ml; 115 {115} 50 ng / ml; ? 300 ng / ml; 1000 ng / ml; ? 3000 ng / ml; ? 5000 ng / ml; ? 10000 ng / ml.

Figura 4.- Influencia de la mitomicina C sobre la escisión del genoma del fago lambda del cromosoma de una cepa lisogénica de Escherichia coli, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago). \medbullet Sin Mitomicina; \blacksquare 12,5 ng/ml; \ding{115} 100 ng/ml; \blacklozenge 500 ng/ml; \times 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; \Delta 10000 ng/ml; \lozenge 20000 ng/ml.Figure 4.- Influence of mitomycin C on the cleavage of the lambda phage genome from the chromosome of a lysogenic strain of Escherichia coli , measured by RT-PCR (the amplified segment is flanked by two primers that frame the attP site of the phage). ? Without Mitomycin; ? 12.5 ng / ml; 115 {115} 100 ng / ml; ? 500 ng / ml; 1000 ng / ml; ? 3000 ng / ml; ? 5000 ng / ml; ? 10000 ng / ml; ? 20000 ng / ml.

Figura 5.- Correlación entre la concentración de mitomicina C (escala logarítmica) añadida a cultivos de L. casei lisogénico para el fago A2 y los valores de Ct obtenidos a las 3 h (\medbullet), 4 h (\blacksquare) y 5 h (\ding{115}) de incubación con el agente genotóxico. Obsérvese: a) que a concentraciones moderadas de mitomicina C (entre 12,5 y 300 ng/ml) los valores de Ct disminuyen al aumentar dicha concentración, b) que a partir de 500 ng/ml la mitomicina resulta tóxica y c) que, para cada concentración, los valores de Ct a las 4 y 5 horas son semejantes.Figure 5.- Correlation between the concentration of mitomycin C (logarithmic scale) added to cultures of L. casei lysogenic for phage A2 and the Ct values obtained at 3 h (?), 4 h (?) And 5 h ({{115}) incubation with the genotoxic agent. Note: a) that at moderate concentrations of mitomycin C (between 12.5 and 300 ng / ml) Ct values decrease with increasing concentration, b) that from 500 ng / ml mitomycin is toxic and c) that, for each concentration, the Ct values at 4 and 5 hours are similar.

Figura 6.- Correlación entre la concentración de mitomicina C (escala logarítmica) añadida a cultivos de E. coli lisogénica para el fago lambda y los valores de Ct obtenidos a 1 h (\medbullet) y 1:30 h (\blacksquare) de incubación con el agente genotóxico. Obsérvese que a 1:30 h los valores de Ct son semejantes en un amplio rango de concentraciones de mitomicina C.Figure 6.- Correlation between the concentration of mitomycin C (logarithmic scale) added to cultures of lysogenic E. coli for the lambda phage and the Ct values obtained at 1 h (?) And 1:30 h (? Black) of incubation with the genotoxic agent. Note that at 1:30 h the Ct values are similar in a wide range of mitomycin C concentrations.

Figura 7.- Influencia de la mitomicina C sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Escherichia coli lisogénica para el fago lambda. \medbullet Sin Mitomicina; \blacksquare 12,5 ng/ml; \ding{115} 100 ng/ml; \blacklozenge 500 ng/ml; \times 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; \Delta 10000 ng/ml; \lozenge 20000 ng/ml. Los sobrenadantes de cultivo se incluyeron en medio semisólido sembrado con E. coli no lisogénica utilizando la técnica de la doble capa y se incubaron durante la noche hasta conseguir visualizar las placas de lisis en el césped de la cepa indicadora.Figure 7.- Influence of mitomycin C on the production of new viruses by a lysogenic Escherichia coli culture for lambda phage. ? Without Mitomycin; ? 12.5 ng / ml; 115 {115} 100 ng / ml; ? 500 ng / ml; 1000 ng / ml; ? 3000 ng / ml; ? 5000 ng / ml; ? 10000 ng / ml; ? 20000 ng / ml. The culture supernatants were included in semi-solid medium seeded with non-lysogenic E. coli using the double layer technique and incubated overnight until the lysis plates were visualized on the lawn of the indicator strain.

Figura 8.- Influencia de la radiación ultravioleta sobre la escisión del genoma del fago A2 del cromosoma de una cepa lisogénica de Lactobacillus casei, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago). \medbullet 0 J/m^{2}; \blacksquare 1 J/m^{2}; \ding{115} 5 J/m^{2}; \blacklozenge 10 J/m^{2}; \times 30 J/m^{2}; \medcirc 50 J/m^{2}; \Box control positivo con Mitomicina C.Figure 8.- Influence of ultraviolet radiation on the excision of the phage A2 genome of the chromosome of a lysogenic strain of Lactobacillus casei , measured by RT-PCR (the amplified segment is flanked by two primers that frame the attP site of the phage). ? 0 J / m2; 1 J / m2; 115 115 J / m2; J 10 J / m2; J30 J / m2; ? 50 J / m2; Positive control with Mitomycin C.

Figura 9.- Influencia de la radiación ultravioleta sobre la escisión del genoma del fago lambda del cromosoma de una cepa lisogénica de Escherichia coli, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago). \medbullet 0 J/m^{2}; \blacksquare 1 J/m^{2}; \ding{115} 5 J/m^{2}; \blacklozenge 10 J/m^{2}; \times 30 J/m^{2}; \medcirc 50 J/m^{2}; \Box control positivo con Mitomicina C.Figure 9.- Influence of ultraviolet radiation on the cleavage of the lambda phage genome of the chromosome of a lysogenic strain of Escherichia coli , measured by RT-PCR (the amplified segment is flanked by two primers that frame the attP site of the phage). ? 0 J / m2; 1 J / m2; 115 115 J / m2; J 10 J / m2; J30 J / m2; ? 50 J / m2; Positive control with Mitomycin C.

Figura 10.- Influencia de la radiación ultravioleta sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Lactobacillus casei lisogénico para el fago A2. \medbullet 0 J/m^{2}; \blacksquare 1 J/m^{2}; \ding{115} 5 J/m^{2}; \blacklozenge 10 J/m^{2}; \times 30 J/m^{2}; \medcirc 50 J/m^{2}; \Box control positivo con Mitomicina C.Figure 10.- Influence of ultraviolet radiation on the production of new viruses by a culture of lysogenic Lactobacillus casei for phage A2. ? 0 J / m2; 1 J / m2; 115 115 J / m2; J 10 J / m2; J30 J / m2; ? 50 J / m2; Positive control with Mitomycin C.

Figura 11.- Influencia de la radiación ultravioleta sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Escherichia coli lisogénica para el fago lambda. \medbullet 0 J/m^{2}; \blacksquare 1 J/m^{2}; \ding{115} 5 J/m^{2}; \blacklozenge 10 J/m^{2}; \times 30 J/m^{2}; \medcirc 50 J/m^{2}; \Box control positivo con Mitomicina C.Figure 11.- Influence of ultraviolet radiation on the production of new viruses by a lysogenic Escherichia coli culture for lambda phage. ? 0 J / m2; 1 J / m2; 115 115 J / m2; J 10 J / m2; J30 J / m2; ? 50 J / m2; Positive control with Mitomycin C.

Figura 12. Influencia de la ciprofloxacina sobre la escisión del genoma viral medida por RT-PCR. Los símbolos llenos representan a la combinación lambda - E. coli; los vacíos a A2 - L. casei. O Cultivo de E. coli sin antibiótico; \blacksquare 10 nM; \ding{115} 50 nM; \blacklozenge 500 nM. También se ensayaron las concentraciones 1 nM, 30 nM, 1500 nM, y 5000 nM cuyos datos no se muestran pero que corroboran las conclusiones indicadas en el texto.Figure 12. Influence of ciprofloxacin on cleavage of the viral genome measured by RT-PCR. The full symbols represent the combination lambda - E. coli ; the gaps to A2 - L. casei . O Culture of E. coli without antibiotic; 10 nM; 115 {115} 50 nM; 500 nM. The concentrations of 1 nM, 30 nM, 1500 nM, and 5000 nM were also tested, the data of which is not shown but which corroborates the conclusions indicated in the text.

Figura 13. Efecto de la ciprofloxacina sobre la producción de nuevos virus por cultivos de E. coli y L. casei lisogénicas para los fagos lambda y A2 respectivamente. \medcirc Sin Inducir; \blacksquare 10 nM; \ding{115} 50 nM; \blacklozenge 500 nM. La concentración de fagos en los sobrenadantes se determinó por la técnica de la doble capa.Figure 13. Effect of ciprofloxacin on the production of new viruses by cultures of E. coli and L. casei lysogenic for lambda and A2 phages respectively. Without inducing; 10 nM; 115 {115} 50 nM; 500 nM. The concentration of phages in the supernatants was determined by the double layer technique.

Figura 14. Influencia del Etopósido sobre la escisión del genoma viral medida por RT-PCR. Los símbolos llenos representan a la combinación lambda - E. coli; los vacíos a A2 - L. casei. O Cultivo de L. casei sin antibiótico; \blacksquare 50 nM; \ding{115} 1500 nM; \blacklozenge 5000 nM. También se ensayaron concentraciones intermedias. Los datos obtenidos corroboran las conclusiones indicadas en el texto.Figure 14. Influence of Etoposide on viral genome excision measured by RT-PCR. The full symbols represent the combination lambda - E. coli ; the gaps to A2 - L. casei . O Culture of L. casei without antibiotic; 50 nM; 115 {115} 1500 nM; 5000 nM. Intermediate concentrations were also tested. The data obtained corroborate the conclusions indicated in the text.

Figura 15. Efecto del Etopósido sobre la producción de nuevos virus por cultivos de E. coli y L. casei lisogénicas para los fagos lambda y A2 respectivamente. \medcirc Sin Inducir; \blacksquare 50 nM; \ding{115} 1500 nM; \blacklozenge 5000 nM. La concentración de fagos en los sobrenadantes se determinó por la técnica de la doble capa.Figure 15. Effect of Etoposide on the production of new viruses by cultures of E. coli and L. casei lysogenic for lambda and A2 phages respectively. Without inducing; 50 nM; 115 {115} 1500 nM; 5000 nM. The concentration of phages in the supernatants was determined by the double layer technique.

Detailed statement of the invention

El sistema que proponemos pertenece a la categoría de los ensayos microbianos de genotoxicidad que detectan el estímulo de la respuesta SOS mediante la observación de la inducción de profagos residentes en el genoma de bacterias lisogénicas. La originalidad en este caso estriba en que se cuantifica un paso muy temprano de dicha inducción como es la separación del ADN viral y el bacteriano, en vez de observar la culminación del proceso, es decir la generación de la progenie viral, que es lo que hacen los métodos descritos en el estado de la técnica.The system we propose belongs to the category of microbial genotoxicity tests that detect the stimulation of the SOS response by observing the induction of profagos resident in the bacterial genome lysogenic The originality in this case is that quantify a very early step of such induction as is the separation of viral and bacterial DNA, instead of observing the culmination of the process, that is, the generation of the progeny viral, which is what the methods described in the state of the technique.

El protocolo se basa en las siguientes premisas: durante el proceso de integración tanto el ADN viral como el bacteriano se abren en puntos específicos denominados attP y attB respectivamente y se produce una soldadura entre ambas moléculas de ADN. La liberación del ADN viral, consecuencia de la activación de la respuesta SOS, es el proceso inverso al anterior y ocurre en los mismos puntos. De este modo, los segmentos de ADN viral que se encuentran a cada lado de attP y que, por lo tanto, están contiguos en el ADN del fago independiente, quedan separados por todo el ADN bacteriano después de la integración y vuelven a quedar adyacentes una vez que se libera el profago (Fig. 1).The protocol is based on the following premises: during the integration process both viral and bacterial DNA open at specific points called attP and attB respectively and a weld occurs between both DNA molecules. The release of viral DNA, a consequence of the activation of the SOS response, is the reverse process to the previous one and occurs at the same points. In this way, the segments of viral DNA that are located on each side of attP and that, therefore, are contiguous in the independent phage DNA, are separated by all bacterial DNA after integration and become adjacent again. Once the prophane is released (Fig. 1).

Basándonos en esos principios, se han diseñado parejas de oligonucleótidos cuyas secuencias se corresponden con segmentos de ADN viral que se encuentran a ambos lados de attP y están orientados hacia él, es decir, son convergentes. Dichos oligonucleótidos deberán inducir la amplificación del segmento intermedio en un PCR cuyo molde sea el ADN viral independiente, pero no cuando el molde es dicho ADN integrado en el genoma celular, ya que, en ese caso, su orientación sería divergente (Fig. 1). En otras palabras, el ADN obtenido a partir de células lisogénicas no será amplificable, pero si lo será una vez que la respuesta SOS induzca la liberación del ADN viral.Based on these principles, oligonucleotide pairs have been designed whose sequences correspond to segments of viral DNA that are on both sides of attP and are oriented towards it, that is, they are convergent. Said oligonucleotides should induce the amplification of the intermediate segment in a PCR whose template is the independent viral DNA, but not when the template is said DNA integrated into the cell genome, since, in that case, its orientation would be divergent (Fig. 1) . In other words, the DNA obtained from lysogenic cells will not be amplifiable, but it will be once the SOS response induces the release of viral DNA.

En la aplicación de la PCR a tiempo real (RT-PCR) en lugar de una PCR normal podrá obtenerse un valor cuantitativo de la reacción de liberación del profago. En los experimentos de RT-PCR se obtiene un dato numérico, denominado Ct, que se corresponde con el umbral a partir del que se detecta el segmento de ADN amplificado. Cuanto menor sea ese valor la detección es más precoz, lo que es indicativo de una mayor concentración de moléculas molde en la mezcla de reacción. En este caso, los moldes se generan como consecuencia de la acción inductora de la respuesta SOS, que a su vez responde a la alteración del ADN por diferentes condiciones físicas (radiaciones) o compuestos químicos (genotóxicos). Por ello, el método puede revelar la potencia de dichos agentes en relación a otro usado como control o medir la intensidad/concentración de uno de estos agentes respecto a una curva patrón obtenida, con concentraciones conocidas del mismo.In real-time PCR application (RT-PCR) instead of a normal PCR can be obtained a quantitative value of the prophane release reaction. In RT-PCR experiments you get a data numeric, called Ct, which corresponds to the threshold from from which the amplified DNA segment is detected. The smaller it is this detection value is earlier, which is indicative of a higher concentration of template molecules in the reaction mixture. In In this case, the molds are generated as a result of the action inducer of the SOS response, which in turn responds to the DNA alteration due to different physical conditions (radiation) or chemical compounds (genotoxic). Therefore, the method can reveal the potency of said agents in relation to another used as control or measure the intensity / concentration of one of these agents with respect to a standard curve obtained, with known concentrations of the same.

Para demostrar la aplicabilidad del principio, el sistema se puso a punto con dos asociaciones bacteria lisogénica - bacteriofago muy diferentes: Escherichia coli - fago lambda y Lactobacillus casei - fago A2. En el primer caso se usó la asociación habitual en métodos previos para facilitar la comparación con ellos. Complementariamente, así se podrá aprovechar la enorme diversidad de cepas de E. coli con diferentes características y utilidades específicas que se han ido desarrollando a lo largo del tiempo.To demonstrate the applicability of the principle, the system was developed with two very different lysogenic bacterial - bacteriophage associations: Escherichia coli - phage lambda and Lactobacillus casei - phage A2. In the first case, the usual association was used in previous methods to facilitate comparison with them. In addition, this way you can take advantage of the enormous diversity of E. coli strains with different characteristics and specific utilities that have been developed over time.

La asociación L. casei - fago A2, además del propósito ya enunciado de demostrar la aplicabilidad general del principio desarrollado, tenía otras dos metas; por un lado, trabajar con una bacteria Gram positiva y, por otro, con un organismo inocuo para la salud. Las bacterias Gram positivas presentan una pared de naturaleza esencialmente polisacarídica y muy porosa que no supone una barrera efectiva a la difusión de compuestos hidrofílicos hasta la membrana plasmática. Así se facilitará el acceso al citoplasma (y por ende al ADN) de determinados compuestos cuya actividad genotóxica se quiere evaluar (como se indicó anteriormente, la membrana externa de las bacterias Gram negativas, de naturaleza lipídica, puede suponer una barrera muy efectiva para este tipo de sustancias).The L. casei -phage A2 association, in addition to the stated purpose of demonstrating the general applicability of the developed principle, had two other goals; on the one hand, work with a Gram positive bacterium and, on the other, with an organism harmless to health. Gram positive bacteria have a wall of essentially polysaccharide and very porous nature that does not represent an effective barrier to the diffusion of hydrophilic compounds to the plasma membrane. This will facilitate access to the cytoplasm (and therefore to DNA) of certain compounds whose genotoxic activity is to be evaluated (as indicated above, the outer membrane of Gram-negative bacteria, of a lipid nature, can be a very effective barrier for this type of substances).

Por otro lado, L. casei es una bacteria láctica que pertenece al grupo de organismos GRAS (Generally Regarded As Safe), que es consumida habitualmente en grandes cantidades como parte de los productos lácteos y que, por lo tanto, no presenta ningún riesgo para la salud de los manipuladores de la técnica. De las bacterias usadas previamente en la detección de genotoxicidad, Salmonella typhimurium es un patógeno primario, mientras que E. coli, aunque es un organismo habitualmente inocuo, se asocia frecuentemente a infección urinaria, pudiendo producir cuadros graves, incluso septicemias, en individuos inmunocomprometidos.On the other hand, L. casei is a lactic bacterium that belongs to the group of organisms GRAS (Generally Regarded As Safe), which is usually consumed in large quantities as part of dairy products and, therefore, does not present any risk for the health of the manipulators of the technique. Of the bacteria previously used in the detection of genotoxicity, Salmonella typhimurium is a primary pathogen, while E. coli , although it is a normally innocuous organism, is frequently associated with urinary infection, being able to produce serious conditions, including sepsis, in immunocompromised individuals.

A continuación se ilustrará la invención mediante los ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método.The invention will be illustrated below through the tests carried out by the inventors, who put I express the specificity and effectiveness of the method.

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Bacterial strains, bacteriophages and culture conditions

Las bacterias utilizadas fueron:The bacteria used were:

a) Lactobacillus casei ATCC393 y su derivado lisogénico, que alberga el ADN genómico del bacteriofago A2 insertado al final del gen bacteriano que codifica para el RNA de transferencia específico para leucina cuyo anticodon es CAA.a) Lactobacillus casei ATCC393 and its lysogenic derivative, which houses the genomic DNA of bacteriophage A2 inserted at the end of the bacterial gene that codes for the leucine-specific transfer RNA whose anticodon is CAA.

b) Escherichia coli W3110 y una variante de la misma conteniendo el ADN del fago lambda insertado en su sitio primario de lisogenización, entre los genes ybhB e ybhC.b) Escherichia coli W3110 and a variant thereof containing the lambda phage DNA inserted at its primary lysogenization site, between the ybhB and ybhC genes.

L. casei se propagó en medio MRS líquido (Oxoid) suplementado con CaCl_{2} (10 mM) y SO_{4}Mg (10 mM) a 30ºC sin agitación. E. coli se incubó en medio LB (Sambrook, J., E., Fritsch, F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A laboratory manual". 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989) a 37ºC con agitación. L. casei was propagated in liquid MRS medium (Oxoid) supplemented with CaCl 2 (10 mM) and SO 4 Mg (10 mM) at 30 ° C without stirring. E. coli was incubated in LB medium (Sambrook, J., E., Fritsch, F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A laboratory manual". 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989) a 37 ° C with stirring.

La determinación de la concentración de fagos presentes en los cultivos se llevó a cabo por el método de la doble capa, usando los mismos medios indicados anteriormente, a los que se añadió agar-agar a concentraciones del 1,5% (capa inferior) y del 0,7% (capa superior).Phage concentration determination present in the cultures was carried out by the double method layer, using the same means indicated above, to which agar-agar was added at concentrations of 1.5% (lower layer) and 0.7% (upper layer).

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Real-time PCR conditions

Para la amplificación de un segmento de ADN que incluye el sitio attP del fago A2 se utilizaron como cebadores la pareja de oligonucleótidos: SEQ ID 3 y SEQ ID 4, que lo flanquean y originan un fragmento de 226 pares de bases (pb). En el caso de lambda, los cebadores fueron SEQ ID 7 y SEQ ID 8, que limitan un segmento de 186 pb.For the amplification of a segment of DNA that includes the attP site of phage A2, the oligonucleotide pair was used as primers: SEQ ID 3 and SEQ ID 4, which flank it and give rise to a fragment of 226 base pairs (bp). In the case of lambda, the primers were SEQ ID 7 and SEQ ID 8, which limit a 186 bp segment.

La mezcla de reacción tenía los siguientes ingredientes: cultivo 1,25 \mul, cebadores 0,6 \muM (concentración final), mezcla PCR Q SYBR Green (Bio-Rad) 7,5 \mul y agua hasta 15 \mul.The reaction mixture had the following Ingredients: 1.25 µl culture, 0.6 µM primers (final concentration), PCR mixture Q SYBR Green (Bio-Rad) 7.5 µl and water up to 15 µl.

Las condiciones para la amplificación del ADN del fago A2 fueron las siguientes: estadio 1: 95ºC (3 min); estadio 2: 30 ciclos a 95ºC (45 s), 67ºC (45 s) y 72ºC (45 s); estadio 3: 72ºC (10 min). En el caso de lambda las condiciones de los estadios 1 y 3 fueron idénticas a las usadas con A2, pero en el estadio 2 se usaron los siguientes parámetros: 95ºC (35 s), 57ºC (35 s) y 72ºC (35 s).The conditions for DNA amplification of phage A2 were the following: stage 1: 95 ° C (3 min); stadium 2: 30 cycles at 95 ° C (45 s), 67 ° C (45 s) and 72 ° C (45 s); stage 3: 72 ° C (10 min). In the case of lambda the stadium conditions 1 and 3 were identical to those used with A2, but in stage 2 it They used the following parameters: 95ºC (35 s), 57ºC (35 s) and 72ºC (35 s).

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Process

Los cultivos de L. casei o de E. coli, lisogénicos para los fagos A2 o lambda respectivamente, se incubaron hasta alcanzar una absorbancia (a 600 nm) de 0,1. En ese punto se repartieron en varios tubos (volumen final de 25 ml). A cada uno de ellos se le añadió el agente cuya actividad genotóxica se quería conocer, a concentraciones comprendidas habitualmente entre 50 y 5000 nM (dado que muchos de estos compuestos no eran solubles en agua, se comprobó que el solvente utilizado no ejerciera ningún efecto sobre la viabilidad de los cultivos ni sobre la inducibilidad de los profagos). Cada 15 min (E. coli) o cada 30 min (L. casei) se tomaban dos alícuotas de 50 \mul. Una de ellas se congelaba inmediatamente y se mantenía en esas condiciones hasta su uso en la PCR. La otra se centrifugaba a 4ºC y el sobrenadante se diluía para cuantificar los fagos presentes en el mismo.The cultures of L. casei or E. coli , lysogenic for phage A2 or lambda respectively, were incubated to an absorbance (at 600 nm) of 0.1. At that point they were distributed in several tubes (final volume of 25 ml). To each of them was added the agent whose genotoxic activity was to be known, at concentrations usually between 50 and 5000 nM (since many of these compounds were not soluble in water, it was found that the solvent used did not exert any effect on the viability of the crops or the inducibility of the profagos). Two 50 µl aliquots were taken every 15 min ( E. coli ) or every 30 min ( L. casei ). One of them froze immediately and remained in these conditions until it was used in the PCR. The other was centrifuged at 4 ° C and the supernatant was diluted to quantify the phages present therein.

Para evaluar si el procedimiento detectaba el poder genotóxico de la radiación, los cultivos, a una absorbancia de 0.1, se centrifugaban y las células se suspendían en 1/10 del volumen inicial de ClNa al 0,85%. A continuación se sometían a radiación UV (1 jul/m^{2}) durante diferentes periodos de tiempo. Posteriormente, se añadía medio de cultivo precalentado a las suspensiones celulares hasta alcanzar el volumen inicial y se proseguía la incubación. La toma de muestras y su procesamiento posterior se llevaba a cabo tal como se ha indicado en el párrafo anterior.To assess whether the procedure detected the genotoxic power of radiation, crops, to absorbance of 0.1, they were centrifuged and the cells were suspended in 1/10 of the initial volume of 0.85% ClNa. They then underwent UV radiation (1 jul / m2) for different periods of time. Subsequently, preheated culture medium was added to the cell suspensions until the initial volume is reached and incubation continued. Sampling and processing subsequent was carried out as indicated in the paragraph previous.

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Examples of realization

Como ejemplo de los resultados que puede proporcionar la metodología desarrollada por la presente invención, a continuación se exponen los datos obtenidos del análisis de la actividad genotóxica de un compuesto químico, la mitomicina C, y de un agente físico, la radiación ultravioleta. El efecto genotóxico de la primera, y por tanto la inducción de la respuesta SOS, ocurre porque la mitomicina C se une al ADN e impide la separación de las cadenas, bloqueando así la replicación. Este modo de actuación ha promovido su uso como quimioterápico anticanceroso en determinados países. La radiación UV se usa como agente microbiocida e induce fundamentalmente la formación de dímeros de pirimidina en el ADN. Complementariamente, se presentan los resultados obtenidos con la ciprofloxacina y el etopósido. La primera es una quinolona fluorada que inhibe la acción de la ADN - girasa bacteriana. El etopósido es un compuesto antitumoral que inhibe el estadio G2 del ciclo de desarrollo de las células de mamífero. El propósito es ilustrar la utilidad que tiene el procedimiento combinado de detección de la respuesta SOS que presentamos, dado que cada uno de los dos compuestos la induce en uno de los sistemas fago - bacteria pero no en el otro. Se incluye, asimismo, una tabla con los resultados de inducción obtenidos con otros compuestos genotóxicos.As an example of the results you can provide the methodology developed by the present invention, The data obtained from the analysis of the Genotoxic activity of a chemical compound, mitomycin C, and of A physical agent, ultraviolet radiation. Genotoxic effect of the first, and therefore the induction of the SOS response, occurs because mitomycin C binds to DNA and prevents the separation of chains, thus blocking replication. This mode of action has promoted its use as an anticancer chemotherapeutic in certain countries UV radiation is used as a microbiocidal agent and induces fundamentally the formation of pyrimidine dimers in the DNA. In addition, the results obtained with the Ciprofloxacin and etoposide. The first is a fluorinated quinolone which inhibits the action of bacterial DNA gyrase. The etoposide is an antitumor compound that inhibits the G2 stage of the cycle of development of mammalian cells. The purpose is to illustrate the utility of the combined procedure of detecting the SOS response we present, since each of the two compounds induces it in one of the phage systems - bacteria but not in the other one. It also includes a table with the results of induction obtained with other genotoxic compounds.

Example 1 Detection and analysis of the genotoxic effect of mitomycin C on the induction of the lytic cycle of profago A2

Efecto de la mitomicina C sobre la inducción del ciclo lítico del profago A2. La escisión del genoma del fago A2 residente en el cromosoma de L. casei, es detectable a concentraciones muy bajas del compuesto genotóxico, del orden de 12,5 ng/ml de medio de cultivo (Fig. 2). Incrementos sucesivos de la concentración de mitomicina C resultan en un aumento correlativo de la respuesta detectada, hasta llegar a valores 24 veces superiores (300 ng/ml) al que originaba la respuesta inicial. Incrementos posteriores de la concentración de mitomicina C se traducen en una inhibición gradual de la respuesta, hasta que a 10 000 ng/ml ya no se aprecian diferencias respecto al control al que no se le había añadido el agente genotóxico.Effect of mitomycin C on the induction of the lytic cycle of profago A2. The excision of the genome of phage A2 resident on the L. casei chromosome is detectable at very low concentrations of the genotoxic compound, of the order of 12.5 ng / ml of culture medium (Fig. 2). Successive increases in the concentration of mitomycin C result in a correlative increase in the response detected, reaching values 24 times higher (300 ng / ml) than the original response originated. Subsequent increases in the concentration of mitomycin C result in a gradual inhibition of the response, until at 10,000 ng / ml differences are no longer appreciated with respect to the control to which the genotoxic agent had not been added.

Adicionalmente, se determinó la producción de fagos que resultaba de la inducción de los cultivos con mitomicina C (Fig. 3), para comparar la sensibilidad del RT-PCR con la del microescrutinio. Los datos obtenidos son semejantes a los correspondientes a la detección de la liberación de los profagos con algunas excepciones. Así, la concentración mínima de mitomicina C que induce una respuesta es la misma en ambos casos y hay un incremento de dicha respuesta según se va aumentando la concentración de agente genotóxico. Sin embargo, mientras por RT-PCR las muestras recogidas a las dos horas de incubación ya mostraban incrementos significativos respecto a los controles, únicamente empezaba a aparecer fago en las muestras recogidas a las tres horas de inducción. Debe tenerse en cuenta, además, que el procesamiento de la muestra por RT-PCR hasta que se obtienen los datos es de unas dos horas, mientras que la observación de las placas de lisis, en la que se basan los métodos de microescrutinio, solo puede hacerse al día siguiente. Por otra parte, el microescrutinio parece ser más susceptible al efecto tóxico de la mitomicina C. Así, por ejemplo, a una concentración de 5000 ng/ml ya no se detecta incremento en la generación de nuevos fagos, pero aún existe una amplificación del segmento de ADN viral evidente. Esta última diferencia está motivada, probablemente, por el hecho de que la liberación de los genomas virales no requiere de la síntesis de ADN, que es precisamente el proceso que inhibe la mitomicina C, mientras que la producción de nuevos fagos si depende de que haya replicación del material genético viral.Additionally, the production of phages resulting from the induction of cultures with mitomycin C (Fig. 3), to compare the sensitivity of the RT-PCR with that of microscrutiny. The data obtained are similar to those corresponding to the detection of the liberation of the profagos with some exceptions. So, the minimum concentration of mitomycin C that induces a response is the same in both cases and there is an increase in said response according to the concentration of genotoxic agent is increasing. Without However, while the samples collected by RT-PCR at two hours of incubation already showed increases significant with respect to controls, only beginning to phage appear in the samples collected three hours after induction. It should also be noted that the processing of the sample by RT-PCR until the data is about two hours, while observing the lysis plates, on which the microscrutiny methods are based, It can only be done the next day. On the other hand, the microscrutiny seems to be more susceptible to the toxic effect of the mitomycin C. Thus, for example, at a concentration of 5000 ng / ml increase in the generation of new phages is no longer detected, but there is still an obvious viral DNA segment amplification. This last difference is probably motivated by the fact that the release of viral genomes does not require the DNA synthesis, which is precisely the process that inhibits the mitomycin C, while the production of new phages does depend that there is replication of the viral genetic material.

Example 2 Effect of mitomycin C on the induction of the Rico cycle of bacteriophage lambda

La concentración mínima del genotóxico que induce la escisión es la misma que para A2 y, al igual que ocurría en este caso, al aumentar su concentración se incrementaban las tasas de liberación, hasta que la toxicidad inherente de la mitomicina C provocaba la disminución de la respuesta, lo que ocurría, en el caso de la asociación lambda - E. coli, a concentraciones de 15.000-20.000 ng/ml (Fig. 4).The minimum concentration of the genotoxic that induces cleavage is the same as for A2 and, as in this case, increasing its concentration increased the release rates, until the inherent toxicity of mitomycin C caused the decrease in response, what happened, in the case of the lambda- E. coli association , at concentrations of 15,000-20,000 ng / ml (Fig. 4).

Sin embargo, el perfil de las curvas de variación de la Ct con el tiempo es diferente. En el caso de A2 se alcanza rápidamente una meseta, independientemente de la concentración de mitomicina C utilizada (Fig. 2). En el de lambda, por el contrario, a concentraciones bajas del quimioterápico, existe una variación continua en los valores de Ct, de manera que todas las curvas alcanzan valores de Ct similares, si se incuban los cultivos con la mitomicina C el tiempo suficiente (Fig. 4). La diferencia de comportamiento de ambos sistemas la interpretamos como un reflejo de la mayor permeabilidad de las células de L. casei con respecto a las de E. coli.However, the profile of the Ct variation curves over time is different. In the case of A2 a plateau is rapidly reached, regardless of the concentration of mitomycin C used (Fig. 2). In lambda, on the contrary, at low concentrations of chemotherapy, there is a continuous variation in Ct values, so that all curves reach similar Ct values, if the cultures are incubated with mitomycin C long enough ( Fig. 4). We interpret the difference in behavior of both systems as a reflection of the greater permeability of L. casei cells with respect to those of E. coli .

En el primer caso, la mitomicina C penetra rápidamente en las células y en aquellas en las que se alcanza un nivel crítico de concentración se inicia la respuesta SOS. Al aumentar la concentración de genotóxico que se añade a los cultivos, el número de células en las que se alcanza el umbral a partir del que se dispara la respuesta SOS y, con ella, la liberación del profago, aumentará correlativamente. Como consecuencia, la meseta aparecerá a valores de Ct progresivamente decrecientes (recuérdese que cuanto menor es Ct mayor es el número de moléculas molde para la RT-PCR).In the first case, mitomycin C penetrates quickly in the cells and in those in which a Critical level of concentration starts the SOS response. To the increase the concentration of genotoxic that is added to cultures, the number of cells in which the threshold is reached from which the SOS response is triggered and, with it, the release of the prophet will increase correlatively. How consequently, the plateau will appear at Ct values progressively decreasing (remember that the smaller is Ct the greater the number of template molecules for RT-PCR).

En el caso de E. coli, la mitomicina C tendría más dificultades para entrar. A pesar de ello, a concentraciones elevadas se alcanzarían los valores umbral relativamente pronto en todo el cultivo, pero cuando la concentración del genotóxico fuera limitante se establecería un gradiente continuo de células que irían alcanzando los niveles que disparan la respuesta SOS, lo que se apreciaría como una variación continua de los valores de Ct. De aquí se deduciría que, en realidad, la respuesta SOS de E. coli es mucho más sensible a la mitomicina C que la de L. casei, porque, por ejemplo, a la concentración mínima representada, 12,5 ng/ml, la liberación de profagos llega a ser prácticamente completa, mientras que en L. casei los valores de escisión de A2 se quedan muy por debajo de los que se obtienen a concentraciones mayores del antibiótico (Figs. 2 y 4).In the case of E. coli , mitomycin C would have more difficulty entering. Despite this, at high concentrations the threshold values would be reached relatively soon throughout the culture, but when the concentration of the genotoxic was limiting, a continuous gradient of cells would be established that would reach the levels that trigger the SOS response, which would be appreciated. as a continuous variation of Ct values. From this it would be deduced that, in reality, the SOS response of E. coli is much more sensitive to mitomycin C than that of L. casei , because, for example, at the minimum concentration represented, 12.5 ng / ml, the Release of profagos becomes practically complete, while in L. casei the cleavage values of A2 remain well below those obtained at higher concentrations of the antibiotic (Figs. 2 and 4).

Paradójicamente, la liberación de los profagos de A2 se inhibe a concentraciones de mitomicina C menores que las necesarias para obtener el mismo efecto con lambda [a partir de 5.000 ng/ml la inhibición es evidente en el primer caso, mientras en el segundo, a 20.000 ng/ml aún se produce una escisión prácticamente general (Figs. 2 y 4)]. Nuevamente, la dificultad de entrada del genotóxico puede explicar este comportamiento. En L. casei se alcanzan rápidamente concentraciones intracelulares tóxicas, mientras que en E. coli, la penetración más lenta hace que no se alcancen dichos niveles al menos hasta después de que se produzca la inducción del profago.Paradoxically, the release of the A2 profagos is inhibited at mitomycin C concentrations lower than those necessary to obtain the same effect with lambda [from 5,000 ng / ml the inhibition is evident in the first case, while in the second, a 20,000 ng / ml a practically general excision still occurs (Figs. 2 and 4)]. Again, the difficulty of genotoxic entry can explain this behavior. In L. casei , toxic intracellular concentrations are rapidly reached, while in E. coli , the slower penetration means that these levels are not reached at least until after the induction of the profago occurs.

En términos prácticos, los resultados expuestos tienen dos consecuencias:In practical terms, the results presented They have two consequences:

1) Los datos representados en la Fig. 2 permiten simplificar la metodología a aplicar en la cuantificación del efecto genotóxico, cuando ésta se hace con cultivos de L. casei lisogénico. Sería suficiente con tomar una única muestra del cultivo tratado, siempre que se hiciera después de las tres horas de incubación, ya que los valores de Ct permanecen esencialmente constantes a partir de ese momento y reflejan el efecto de cada concentración del agente sobre la escisión del profago A2 (Fig. 5). En el caso de lambda, sin embargo, únicamente a la hora de incubación los valores de Ct varían con la concentración del agente genotóxico (Fig. 6).1) The data represented in Fig. 2 make it possible to simplify the methodology to be applied in the quantification of the genotoxic effect, when this is done with cultures of L. casei lisogenic. It would be sufficient to take a single sample of the treated culture, provided that it was done after three hours of incubation, since the Ct values remain essentially constant from that moment and reflect the effect of each concentration of the agent on the cleavage of the profago A2 (Fig. 5). In the case of lambda, however, only at the time of incubation do Ct values vary with the concentration of the genotoxic agent (Fig. 6).

2) El tandem E. coli - lambda, sería el más útil a concentraciones muy altas del agente, ya que se detecta el efecto genotóxico cuando la respuesta de L. casei - A2 esta ya completamente bloqueada.2) The E. coli -lambda tandem would be the most useful at very high concentrations of the agent, since the genotoxic effect is detected when the response of L. casei -A2 is already completely blocked.

El experimento complementario de microescrutinio (producción de viriones del fago lambda como consecuencia de la inducción de su ciclo lítico) refleja los datos ya comentados para la liberación del ADN aunque, a bajas concentraciones de mitomicina C, el ritmo de aparición de nuevos virus fue muy lento (Fig. 7).The complementary microscrutiny experiment (production of phage lambda virions as a result of induction of its lithic cycle) reflects the data already commented for DNA release though, at low concentrations of mitomycin C, the rate of appearance of new viruses was very slow (Fig. 7).

Example 3 Detection and analysis of the genotoxic effect of radiation ultraviolet on the lytic cycle of phages A2 and lambda

La luz U.V. ejerció un efecto inductor de la respuesta SOS, determinada como liberación de los profagos, muy notable tanto en L. casei como en E. coli, incluso a intensidades tan bajas como 1 J/m^{2} (Figs. 8 y 9, respectivamente). Dicha respuesta se mantuvo en valores máximos independientemente de la intensidad de la radiación aplicada (hasta, al menos, 50 J/m^{2}). La evaluación de la producción de nuevos fagos dio resultados semejantes (Figs. 10 y 11).The UV light exerted an inducing effect of the SOS response, determined as release of the profago, very noticeable in both L. casei and E. coli , even at intensities as low as 1 J / m2 (Figs. 8 and 9, respectively). This response was maintained at maximum values regardless of the intensity of the radiation applied (up to at least 50 J / m2). The evaluation of the production of new phages gave similar results (Figs. 10 and 11).

Example 4 Detection and analysis of the genotoxic effect of ciprofloxacin and the etoposide on the lytic cycle of phages A2 and lambda

La ciprofloxacina provoca la inducción del fago lambda pero no la de A2 (Fig. 12, y 13) debido a que la cepa de L. casei lisogénica es resistente al antibiótico, presumiblemente porque presenta una ADN - girasa a la que no se puede unir. La liberación del profago parece ser más sensible que la generación de nuevos viriones (compárense las curvas obtenidas a la concentración 10 nM de ciprofloxacina).Ciprofloxacin causes the induction of the lambda phage but not that of A2 (Fig. 12, and 13) because the strain of L. casei lisogenic is resistant to the antibiotic, presumably because it has a DNA-gyrase to which it cannot bind . The release of the profago seems to be more sensitive than the generation of new virions (compare the curves obtained at the 10 nM concentration of ciprofloxacin).

El etopósido indujo el ciclo lítico del fago A2 pero no el de lambda, porque E. coli es impermeable al quimioterápico (Figs 14 y 15).The etoposide induced the lytic cycle of phage A2 but not that of lambda, because E. coli is impermeable to chemotherapy (Figs. 14 and 15).

Estos últimos ejemplos ilustran la capacidad de la utilización combinada de las dos asociaciones fago - bacteria para aumentar el rango de compuestos genotóxicos evaluables.These last examples illustrate the ability to the combined use of the two phage associations - bacteria to increase the range of evaluable genotoxic compounds.

En la tabla 1 se presenta el efecto inductor de una serie de compuestos en relación con la mitomicina C.Table 1 shows the inducing effect of a series of compounds in relation to mitomycin C.

TABLE 1 Capacidad inductora de la respuesta SOS de diversos agentes genotóxicos, medida por la liberación de los profagos A2 y lambda de cultivos lisogénicos de L. casei y E. coli respectivamenteInductive capacity of the SOS response of various genotoxic agents, measured by the release of the A2 and lambda profagos from lysogenic cultures of L. casei and E. coli respectively

1one

<110> universidad de Oviedo<110> University of Oviedo

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<120> Método rápido de detección y evaluación de agentes genotóxicos<120> Rapid detection method and genotoxic agent evaluation

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<130> ES1624.1<130> ES1624.1

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<160> 8<160> 8

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<170> PatentIn version 3.3<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1<210> 1

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<211> 226<211> 226

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Fago A2<213> Phage A2

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<400> 1<400> 1

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<210> 2<210> 2

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<211> 19<211> 19

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Fago A2<213> Phage A2

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<220><220>

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<221> mi sc_feature<221> my sc_feature

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<222> (0)..(8)<222> (0) .. (8)

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<223> Región attP <223> attP region

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<400> 2<400> 2

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tgataccggt gatcggggt

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tgataccggt gatcggggt

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<210> 3<210> 3

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<211> 25<211> 25

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<212> DNA<212> DNA

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<213> secuencia artificial<213> artificial sequence

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<221> cebador<221> primer

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<222> (1)..(25)<222> (1) .. (25)

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<400> 3<400> 3

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<210> 4<210> 4

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<211> 22<211> 22

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<212> DNA<212> DNA

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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

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<221> cebador<221> primer

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<222> (1)..(22)<222> (1) .. (22)

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 4<400> 4

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagaatgc cggtttaaag cc

\hfill

22

 \ hskip-.1em \ dddseqskip

gcaagaatgc cggtttaaag cc

 \ hfill

22

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 5<210> 5

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 150<211> 150

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> fago lamda<213> phage lamda

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 5<400> 5

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

1919

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 6<210> 6

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> fago lamda<213> phage lamda

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<221> misc_feature<221> misc_feature

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<222> (1)..(8)<222> (1) .. (8)

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> Región attP <223> attP region

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 6<400> 6

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttagtat

\hfill

8

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cttagtat

 \ hfill

8

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 7<210> 7

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 19<211> 19

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> secuencia artificial<213> artificial sequence

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<221> cebador<221> primer

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<222> (1)..(19)<222> (1) .. (19)

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<223> cebador<223> primer

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 7<400> 7

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgattcat agtgactgc

\hfill

19

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gttgattcat agtgactgc

 \ hfill

19

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 8<210> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 18<211> 18

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> DNA<212> DNA

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<213> Secuencia artificial<213> Artificial sequence

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<221> cebador<221> primer

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<222> (1)..(18)<222> (1) .. (18)

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<400> 8<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgatagtga cctgttcg

\hfill

18

 \ hskip-.1em \ dddseqskip

ctgatagtga cctgttcg

 \ hfill

18

Claims

1. Method of detection and evaluation of genotoxic agents, by PCR amplification with primers that hybridize with regions comprising the attP site of the genome of at least two tempered phages, where said phages are capable of differentially infecting Gram positive and Gram negative bacteria characterized in that it comprises:

2. Method according to the preceding claim wherein the Gram positive bacterium is Lactobacillus casei , the tempered phage for said bacterium is phage A2 and the amplified sequence has at least 90% homology with the sequence SEQ ID 1, the complementary sequence or fragments from the same.

3. Method according to the preceding claim wherein the amplified sequence has at least 95% homology with the SEQ ID 1, the complementary sequence or fragments of the same.

4. Method according to the preceding claim wherein the amplified sequence has at least 98% homology with the SEQ ID 1, the complementary sequence or fragments of the same.

5. Method according to the preceding claim where the amplified sequence is SEQ ID 1, the sequence complementary or fragments thereof.

6. Method according to the preceding claim where the amplified region is the SEQ ID 2 fragment or its sequence complementary.

7. Method according to any of the claims 2-6 where the primers have any of SEQ ID 3, 4.

8. Method according to claim 1 wherein the Gram negative bacterium is Escherichia coli , the tempered phage for said bacterium is the lambda phage and the amplified sequence has at least 90% homology with the sequence SEQ ID 5, the complementary sequence or fragments of them.

9. Method according to the preceding claim where the amplified sequence has at least 95% homology with SEQ ID 5, the complementary sequence or fragments of the same.

10. Method according to the preceding claim where the amplified sequence has at least 98% homology with SEQ ID 5, the complementary sequence or fragments of the same.

11. Method according to the preceding claim where the amplified sequence is SEQ ID 5, the sequence complementary or fragments thereof.

12. Method according to the preceding claim where the amplified region comprises the SEQ ID 6 fragment or its complementary sequence

13. Method according to any of the claims 8-12 wherein the primers have any of SEQ ID 7 and 8.

14. Method according to any of the previous claims where the PCR is a timely PCR real.

15. kit for the detection and evaluation of genotoxic agents comprising at least one Gram positive bacterium and a lysogenic Gram negative for phages inducible by SOS response or the genome of said bacteria and the sequences comprising the attP sites of said phages, their complementary sequences or fragments thereof.

16. Kit according to the preceding claim wherein the Gram positive bacterium is Lactobacillus casei and the Gram negative is Escherichia coli .

17. Kit according to the preceding claim wherein the sequences comprising the attP site belong to phages A2 and lambda and have respectively at least 90% homology with SEQ ID 1 and SEQ ID 5, their complementary sequences or fragments thereof.

18. Kit according to the preceding claim wherein the sequences comprising the attP site have at least 95% homology with SEQ ID 1 and SEQ ID 5, their complementary sequences or fragments thereof.

19. Kit according to the preceding claim wherein the sequences comprising the attP site have at least 98% homology with SEQ ID 1, and SEQ ID 5, their complementary sequences or fragments thereof.

20. Kit according to the preceding claim wherein the sequences comprising the attP site have the sequence SEQ ID 1 and SEQ ID 5, their complementary sequences or fragments thereof.

21. Kit according to the preceding claim wherein the sequences comprising the attP site have the sequence SEQ ID 2, SEQ ID 6 or its complementary sequences.

22. kit according to any of the claims 16-23 comprises primers whose sequence is chosen from the group:

--: SEQ ID 3SEQ ID 3

--: SEQ ID 4SEQ ID 4

--: SEQ ID 7SEQ ID 7

--: SEQ ID 8.SEQ ID 8.