ES2307165T3

ES2307165T3 - Xilosa reductasa mutada en la fermentacion de xilosa por s. cerevisiae.

Info

Publication number: ES2307165T3
Application number: ES05728073T
Authority: ES
Inventors: Marie-Francoise Gorwa-Grauslund; Marie Jeppson
Original assignee: Scandinavian Technology Group AB
Current assignee: Scandinavian Technology Group AB
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2025-03-24
Also published as: PT1727890E; SE0400816D0; CA2561302C; WO2005093041A1; CA2561302A1; EP1727890B1; DK1727890T3; EP1727890A1; US20070128706A1; ATE395411T1; DE602005006763D1

Abstract

Una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae que utiliza xilosa que fermenta xilosa a etanol donde la cepa expresa a) dos copias de un gen XYL1 de P. stipitis mutado K270M, b) el gen XYL2 de P. stipitis nativo y c) expresa en exceso el gen XKS1 endógeno de Saccharomyces cerevisiae.

Description

Xilosa reductasa mutada en la fermentación de xilosa por S. cerevisiae.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae que tiene propiedades mejoradas de fermentación de xilosa a etanol.

Antecedentes de la invención

El etanol es producido eficazmente a partir de hexosas por Saccharomyces cerevisiae, pero se necesitan cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes susceptibles de utilización de xilosa para ampliar la gama de sustrato a un producto hidrolizado lignocelulósico. Mediante la integración de los genes XYL1 y XYL2 de Pichia stipitis que codifican la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) y el gen XKS1 endógeno que codifica la xiluloquinasa (XK), se han obtenido cepas de S. cerevisiae fermentadoras de xilosa estables. No obstante, el xilitol es secretado como resultado de la diferencia en el uso de cofactores entre las etapas de la XR dependiente de NAD(P)H y la XDH estrictamente dependiente de NAD^{+}.

Debido a su utilización dual de cofactores, se ha preferido la XR de P. stipitis para la construcción de cepas de S. cerevisiae recombinantes fermentadoras de xilosa. En la actualidad ninguna XR conocida puede reducir la xilosa a xilitol con NADH como único cofactor. Entre las levaduras que utilizan xilosa naturales la XR de Candida utilis utiliza exclusivamente NADPH, mientras las XR de C. shehatae, P. segobiensis, P. stipitis y Pachysolen tannophilus utilizan tanto NADPH como NADH en la reducción de xilosa a xilitol. La XR de C. parapsilosis también utiliza tanto NADPH como NADH para la reducción de xilosa, pero a diferencia de otras levaduras prefiere NADH. Solamente las levaduras que albergan actividad xilosa reductasa unida a NADH presentan una fermentación alcohólica significativa.

El rendimiento de etanol en las cepas de S. cerevisiae recombinantes que fermentan xilosa está lejos del máximo teórico de 0,51 g g^{-1}, debido parcialmente a que una fracción significativa de la xilosa consumida es secretada en forma de xilitol. La formación de xilitol en P. tannophilus ha sido reducida mediante la adición de aceptores de hidrógeno. Estos compuestos re-oxidaban NAD^{+}, que es necesario en la reacción de la XDH. La formación de xilitol en S. cerevisiae recombinante se ha reducido por medio de la adición de acetoína, furfural y acetaldehído. La formación de xilitol también ha disminuido desplazando el uso de cofactores en la etapa de la XR de NADPH a NADH. Esto se logró cambiando la reserva intracelular de NADPH bloqueando o reduciendo el flujo de la ruta oxidativa de la pentosa fosfato (PPP) por medio de la modificación de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Esto dio como resultado un mayor rendimiento de etanol a expensas del deterioro de la velocidad de crecimiento y la disminución de la velocidad de consumo de xilosa.

El gen XYL1 ha sido sometido a mutagénesis de sitio específico para reducir la afinidad de XR por el NADPH (Zhang y Lee, 1997, Site-directed mutagenesis of the cystein residues in the Pichia Stipitis Xylose reductase. FEMS Microbiol Lett 147:227-232, y Kostrzynska et al 1998, Mutational analysis of the role of the conserved lysine 270 in the Pichia Stipitis xylose reductase, FEMS Microbiol Lett. 159:107-112). Los estudios de modificación química sobre XR demostraron que los restos cisteína e histidina podrían estar implicados en la unión del NADPH. No obstante, la mutación de tres restos cisteína (Cys19, Cys27 y Cys130) por serina potenciaron la Km aparente para el NADPH menos de 4 veces, indicando que ninguno de estos restos cisteína estaba directamente implicado en la unión del NADPH. Se obtuvo una afinidad 17 veces más baja para NADPH cuando el gen XYL1 portaba la mutación K270M (lisina \rightarrow metionina), mientras la afinidad para NADH permanecía sin cambios. La única diferencia entre NADPH y NADH es la presencia de un grupo fosfato en el NADPH, y esto sugirió que Lys270 se unía al grupo fosfato de NADPH.

También se han realizado intentos para cambiar la especificidad del cofactor de XDH a NADP^{+}. Se introdujo una secuencia de reconocimiento de NADP^{+} de Thermoanaerobium brockii en el gen XYL2 dando como resultado valores de Km aparente iguales para NAD^{+} y NADP^{+}. Sin embargo, esto se logró a expensas de una reducción de la especificidad para NAD^{+} combinada con una especificidad para NADP^{+} inalterada. El gen XYL2 mutado mediaba el crecimiento de xilosa cuando se expresaba simultáneamente con el gen XYL1 en S. cerevisiae si bien no se informó de una fermentación etanólica de xilosa.

Compendio de la presente invención

La presente invención se refiere a cepas de Saccharomyces cerevisiae novedosas que expresan el gen XYL1 de P. stipitis mutado K270M (Kostrzynska et al 1998) a dos niveles diferentes junto con el gen XYL2 de P. stipitis nativo y el gen XKS1 endógeno expresado en exceso. Las cepas se compararon con las cepas que expresaban el gen XYL1 de P. stipitis nativo junto con los genes XYL2 y XKS1, en cuanto al consumo de xilosa y la formación de etanol.

Materiales y métodos Cepas

Se utilizó Escherichia coli DH5\alpha (Life Technologies, Rockville, MD, USA) para la subclonación. Todas las cepas se almacenaron en glicerol del 20% a -80ºC. Se utilizaron células de levadura de placas YPD recién sembradas en estrías para la inoculación. Las cepas de levadura se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1 Cepas de levadura utilizadas en la presente investigación

1

Manipulación del ácido nucleico

Se preparó ADN plasmídico con un Biorad Plasmid Miniprep Kit (Hercules, CA, USA). Las enzimas de restricción y modificación se obtuvieron de Fermentas (Vilnius, Lituania). Se utilizó QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN GmBH, Hilden, Alemania) para las extracciones de ADN a partir de agarosa.

Transformación

Se prepararon células competentes de E. coli DH5\alpha y se transformaron mediante el método de Inoue. La transformación de levadura se realizó utilizando el método del acetato de litio. Las células de levadura se incubaron durante la noche en medio YPD antes de ser sembradas en estrías en medio selectivo. Los transformantes de E. coli se seleccionaron sobre placas de Luria-Bertani (LB) con 100 \mug ml^{-1} de ampicilina (IBI Shelton Scientific Inc., Shelton, CT, USA). Los transformantes de S. cerevisiae se seleccionaron sobre placas con Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids (Difco, Sparks, MD) que contenía 20 g l^{-1} de glucosa y 50 mg l^{-1} de uracilo o en placas de YPD con 100 \mug ml^{-1} de zeocina (Invitrogen, Groningen, Holanda).

Construcción de una nueva cepa TMB3270

Se separaron cortando el promotor y el terminador de PGK1 a partir de PGK pB3 utilizando NarI y SacI, y se insertaron en YIplac211 utilizando los mismos sitios, dando como resultado YIplac211 PGK. La XYL1 mutada (K270M) se amplificó a partir de pSX (K270M) utilizando los cebadores descritos previamente añadiendo sitios BamHI en ambos extremos. El producto de la PCR XYL1 se cortó con BamHI y se insertó después del promotor de PGK1 en el sitio BglII de Ylplac211 PGK, dando como resultado YIplac211 PGK XYL1 (K270M). La correcta orientación se verificó mediante PCR y la corrección del vector se verificó mediante análisis de restricción.

Se escindió YIplac211 PGK XYL1 (K270M) con Bpu101 dentro del gen URA3. El producto de la escisión se utilizó para la transformación de TMB3265 (XDH-XK) dando como resultado TMB3270. La integración en el locus correcto de TMB3270 se verificó con una PCR, utilizando el cebador 5' CAC GGA AAT GTT GAA TAC TCA TAC TC 3' que hibrida con el vector YIplac211 PGK XYL1 (K270M) y 5' GTT ACT TGG TTC TGG CGA GGT A 3' que hibrida aguas abajo del gen URA3 en el genoma de levadura. La mutación K270M se verificó mediante secuenciación.

Construcción de una nueva cepa TMB3271

El promotor y el terminador de PGK1 junto con el gen de XYL1 (K270M) se separaron por corte de YIplac211 PGK XYL1 (K270M) utilizando NarI y SacI. El fragmento se insertó en pB3 PGK después de la eliminación del promotor y el terminador de PGK1 con NarI y SacI, dando como resultado pB3 PGK XYL1 (K270M). La corrección del vector se verificó mediante análisis de restricción y la mutación K270M se verificó mediante secuenciación. El plásmido se escindió con BshTI dentro el gen XYL1. El plásmido escindido se utilizó para la integración en el gen XYL1 K270M de TMB3270. El transformante TMB3271 se seleccionó sobre placas YPD con zeocina.

Fermentación por lotes

Se llevó a cabo la fermentación por lotes con oxígeno limitado de la xilosa como se ha descrito previamente (Jeppsson, M., B. Johansson, B. Hahn-Hägerdal, y M. Gorwa Grauslund. 2002. Reduced oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Appl. Environ. Microbiol. 68:1604-1509).

Cultivo continuo

Se utilizaron células de un cultivo durante la noche para la inoculación de 1,5 l de medio mineral definido (30) con 10 g l^{-1} de glucosa y 10 g l^{-1} de xilosa en un fermentador Bioflo-III (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA). Se añadió antiespumante al 0,05% (v/v) (Dow Corning® Antifoam RD Emulsion, BDH Laboratory Supplies, Poole, UK). Después de agotar la glucosa, se ajustó el cultivo continuo con 10 g l^{-1} de glucosa y 10 g l^{-1} de xilosa a una velocidad de dilución de 0,06 h^{-1} a 30ºC y un pH de 5,5 controlado mediante KOH 3 M. Las condiciones anaerobias se obtuvieron purgando el fermentador con 0,2 l min^{-1} de nitrógeno (que contenía menos de 5 ppm de O_{2}) medido con un medidor de flujo de la masa de gas (Bronkhorst, Ruurlo, Holanda) y se utilizó una velocidad de agitación de
200 rpm.

Análisis

Las concentraciones de sustrato y producto, el peso seco celular, el ARN, las proteínas y los carbohidratos se midieron como se ha descrito antes (Jeppsson, supra). Se utilizó el modelo de flujo estequiométrico desarrollado previamente (3) para evaluar el uso del cofactor por XR.

Actividades enzimáticas

Se determinaron las actividades enzimáticas en las células de cultivos en matraces con movimiento oscilatorio que crecían exponencialmente en medio mineral definido (Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W. A. y Van Dijken, J.P. 1992. Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast. 8: 501-517) con 20 g l^{-1} de glucosa como fuente de carbono. Los pre-cultivos se prepararon en las mismas condiciones. Los extractos brutos se obtuvieron utilizando el reactivo YPER (Pierce, Rockford, IL, USA). La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de análisis de proteínas de Coomassie (Pierce) con seralbúmina bovina como patrón. Se determinó la actividad XR como se ha descrito previamente
(Eliasson, A., C. Christensson, C.F. Wahlborn, y B. Hahn-Hägerdal. 2000, Anaeobic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2 y XKS1 in mineral medium chemostat cultures Appl. Environ. Microbiol. 66:3381-3386) excepto para las cepas que portaban la XR mutada, donde se utilizaron xilosa 1,05 M y NADPH 0,3 mM.

Resultados Efecto de la mutación XYL1 K270M sobre la fermentación de xilosa

Kostrzynska et al. (1998) sometieron la XR de P. stipitis a mutagénesis de sitio específico con el fin de modificar la afinidad para NADPH. La mutación en la posición del aminoácido 270 dio como resultado una Km aparente de 185 \muM para el NADPH, que es 17 veces superior que la Km aparente para el NADPH de la XR nativa (11 \muM). No obstante, la mutación en XR K270M también aumentaba la Km aparente para la xilosa 15 veces (625 mM frente a 43 mM), mientras la Km aparente para NADH no resultaba afectada (31 \muM frente a 27 \muM).

Se introdujo el gen XYL1 K270M en la cepa S. cerevisiae TMB3265 que ya albergaba XYL2 de P. stipitis y los genes XKS1 expresados en exceso endógenamente, dando como resultado la cepa TMB3270. La actividades de XR dependientes de NADPH y NADH fueron 0,74 y 0,63 U mg^{-1}, respectivamente, en TMB3270 (Tabla 2). En la cepa de control TMB3001, que alberga el gen XYL1 nativo junto con los genes XYL2 y XKS1, hubo unas actividades dependientes de NADPH y NADH de 0,48 y 0,31 U mg^{-1}, respectivamente.

TABLA 2 Actividad XR específica (U mg proteína^{-1}) para TMB3001, TMB3260, TMB3270 y TMB3271. Los datos mostrados son los valores medios de dos medidas con una variación de menos de 10%

2

La formación de producto a partir de xilosa se analizó en una fermentación por lotes con células en reposo desarrolladas en glucosa utilizando xilosa en condiciones de oxígeno limitado (Tabla 3). En estas condiciones se forma muy poca biomasa. TMB3270 (XYL1 K270M) tenía una velocidad de consumo de xilosa (0,155 g biomasa^{-1} h^{-1}) muy similar a la de TMB3001 (0,145 g biomasa^{-1} h^{-1}). El rendimiento de etanol (0,36 g g^{-1}) aumentó y el rendimiento de xilitol (0,17 g g^{-1}) se redujo en TMB3270 en comparación con la cepa de control TMB3001 (0,31 g etanol g xilosa^{-1}, 0,29 g xilitol g xilosa^{-1}). Los rendimientos de acetato y glicerol fueron bajos, pero superiores en TMB3270 (0,035 g g^{-1}, 0,072 g g^{-1}) que en TMB3001 (0,025 g g^{-1}, 0,052 g g^{-1}).

TMB3270, que albergaba la XR mutada, consumió xilosa de un modo similar a la cepa de control TMB3001 en el cultivo por lotes con 50 g/l de xilosa. Sin embargo, la inferior afinidad por la xilosa de la XR mutada podría reducir la velocidad de consumo de xilosa a bajas concentraciones de xilosa. La mutación también podría influir en la formación de producto durante la fermentación simultánea de la glucosa y la xilosa. Por lo tanto se llevó a cabo el cultivo continuo anaerobio con TMB3001 y TMB3270 a 10 g l^{-1} de glucosa y 10 g l^{-1} de xilosa (Tabla 4). TMB3270 (XYL1 K270M) tuvo una velocidad de consumo de xilosa un 58% inferior que la cepa de control TMB3001. Los rendimientos de etanol y CO_{2} fueron aproximadamente un 10% superiores en TMB3270 (0,40 y 0,48 g sustrato^{-1}) que en TMB3001 (0,37 y 0,43 g.g de sustrato^{-1}). TMB3270 tuvo un rendimiento de xilitol reducido por xilosa consumida (0,31 g\cdot g xilosa^{-1}) en comparación con TMB3001 (0,52 g\cdotg xilosa^{-1}), lo que coincide con los resultados de la fermentación por lotes (Tabla 3). TMB3270 también tuvo un rendimiento de glicerol inferior (0,084 g\cdotg sustrato^{-1}) que TMB3001 (0,095 g\cdotg sustrato^{-1}), mientras el rendimiento de acetato fue ligeramente superior en TMB3270 (0,002 g\cdotg sustrato^{-1}) en comparación con TMB3001 (0,001 g\cdotg sustrato^{-1}). Los rendimientos de biomasa fueron similares en las dos cepas (0,094 y 0,095 g\cdotg sustrato^{-1}). La formación de biomasa fue de 1,1 y 1,0 g l^{-1} en TMB3001 y TMB3270, respectivamente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Efecto sobre la disminución de la afinidad de XR por NADPH en la fermentación de xilosa por S. cerevisiae recombinante en lotes con oxígeno limitado con 50 g l^{-1} de xilosa como única fuente de carbono. La velocidad de consumo de xilosa específica (g x g de biomasa^{-1} x h^{-1}) y los rendimientos de etanol, xilitol, acetato y glicerol (g x g de xilosa consumida^{-1}) y las recuperaciones de carbono (cmoles fuera (cmoles dentro)^{-1}) se determinaron al cabo de 60-70 horas. Los valores presentados son la media de los experimentos de fermentación independientes mas/menos la desviación de la media. En el cálculo de la recuperación de carbono se supone que se forman 0,5 moles de CO_{2} por cada cmol de etanol o acetato producido

3

Efecto del aumento de expresión de XYL1 K270M sobre la fermentación de xilosa

Se ha demostrado que TMB3001 utiliza tanto NADPH como NADH en la reacción de XR. La formación de producto en el cultivo por lotes (Tabla 3) y continuo (Tabla 4) indicó que el aumento del valor de Km para NADPH de la XR mutada en TMB3270 daba como resultado un uso reducido de NADPH en la etapa de XR. Puesto que la actividad dependiente de NADH era similar en las dos cepas (Tabla 2), una actividad demasiado baja de XR podría explicar el consumo de xilosa inferior en TMB3270. Se ha demostrado previamente que la actividad XR limitaba la velocidad de consumo de xilosa en TMB3001.

4

Se integró otra copia del gen XYL1 mutado (K270M) en TMB3270, dando como resultado TMB3271. La actividad XR dependiente de NADPH y NADH en TMB3271 fue 4,04 y 1,50 U mg^{-1}, respectivamente, que es 2-5 veces superior que en TMB3270 (Tabla 2). La cepa TMB3260 de elevada actividad XR fue incluida como cepa de control para TMB3271 en esta investigación. TMB3260 albergaba dos copias del gen XYL1 nativo junto con los genes XYL2 y XKS1, y tenía actividades dependientes de NADPH y de NADH de 3,11 y 1,63 U mg^{-1}, respectivamente (Tabla 2).

Se compararon el consumo de xilosa y la formación de producto con TMB3271 (2 copias de XYL1 (K270M)) con TMB3270 (1 copia de XYL1 (K270M)), TMB3001 (1 copia de XYL1) y TMB3260 (2 copias de XYL1) en una fermentación por lotes con oxígeno limitado utilizando células en reposo (Tabla 3). No hubo diferencias significativas entre TMB3260 y TMB3271 que expresaban elevados niveles de XYL1 y XYL1 (K270M), respectivamente. Ambas tuvieron una velocidad de consumo de xilosa superior, un descenso en el rendimiento de xilitol, un aumento de los rendimientos de glicerol y acetato, y un rendimiento de etanol similar en comparación con TMB3001.

La formación de producto con TMB3260 y TMB3271, que portaban 2 copias de los genes XYL1 y XYL1 (K270M), respectivamente, también fue determinada en un cultivo continuo anaerobio con 10 g l^{-1} de glucosa y 10 g l^{-1} de xilosa como fuentes de carbono (Tabla 4). El aumento de actividad XR dio como resultado una absorción de xilosa 58% y 220% superior en TMB3260 y TMB3271 (XYL1 K270M), en comparación con sus respectivas cepas de actividad XR baja TMB3001 y TMB3270 (XYL1 K270M). La mutación K270M en TMB3271 dio como resultado un mayor rendimiento de etanol y CO_{2} (0,40 g g^{-1} y 0,40 g g^{-1}) que para la cepa de control TMB3260 (0,36 g g^{-1} y 0,39 g g^{-1}), que coincide con el aumento de los rendimientos de etanol y CO_{2} encontrado a una baja actividad de XR en TMB3270 (Tabla 4). El rendimiento de xilitol fue inferior en TMB3271 (0,44 g xilitol g de xilosa^{-1}) que en TMB3260 (0,58 g xilitol g de xilosa^{-1}). El rendimiento de biomasa fue superior en TMB3271 (0,098 g\cdotg de sustrato^{-1}), que en TMB3260 (0,85 g\cdotg de sustrato ^{-1}). La formación de biomasa fue de 1,1 y 1,2 g l^{-1} en TMB3260 y TMB3271, respectivamente. TMB3271 tuvo un descenso de 2 veces el rendimiento de glicerol y un ligero descenso en el rendimiento de acetato de etilo en comparación con TMB3260.

Análisis de Flujo

Se utilizó un modelo de flujo estequiométrico (3) para elucidar el uso del cofactor por XR en cepas que albergan XYL1 nativo (TMB3001 y TMB3260) y XYL1 K270M mutado (TMB3270 y TMB3271), respectivamente. El modelo demostró que las cepas que expresaban XR mutada utilizaban una fracción mayor de NADH en la reacción de XR que las cepas que expresaban XR nativa (Figura 1). De acuerdo con el modelo, la reacción de XR en TMB3001 utilizaba un 47% de NADH, mientras la reacción de XR en TMB3270 (K270M) utilizaba solamente NADH para la reducción. En las cepas con una actividad XR superior, TMB3260 y TMB3271 (XYL1 K270M), se utilizaba un 36 y un 86% de NADH, respectivamente, en la etapa de XR. La ruta oxidativa de las pentosas fosfato es una fuente principal de NADPH en levadura, y se canalizaba más glucosa por medio de esta ruta en TMB3001 (15%) y TMB3260 (22%) que en TMB3270 (7%) y TMB3271 (12%) que portaban el mutante. Como resultado se formaba menos dióxido de carbono en las cepas que portaban el mutante.

Se ha demostrado previamente que XR reducía la dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) con NADPH. El modelo de flujo, sin embargo, suponía una reducción de DHAP estrictamente dependiente de NADH. Cuando la reacción cambiaba en el modelo para utilizar 50% de NADH y 50% de NADPH para la reducción de DHAP, el uso de NADH en la reacción de XR aumentaba para todas las cepas, y era superior en las cepas que portaban XR mutada. Las cepas que portaban XR mutada (TMB3270 y TMB3271) también tenían un flujo de PP oxidativo menor en el modelo cambiado.

Utilizando una XR mutada con una afinidad menor para NADPH, los autores de la presente invención pretendieron el desplazamiento de la formación de producto de xilitol a etanol en S. cerevisiae recombinante. TMB3270 y TMB3271 que albergaban la XR mutada mostraron rendimientos de xilitol y glicerol inferiores, acompañados de mayores rendimientos de etanol y CO_{2} en comparación con las cepas con XR nativa. El rendimiento de glicerol anaerobio significativamente reducido en TMB3271 resultaba muy probablemente del descenso de la demanda para la reoxidación de NAD^{+} cuando se utiliza principalmente NADH. Un modelo de flujo metabólico demostró que las cepas que albergaban XR mutada utilizaban una fracción mayor de NADH en la reducción de xilosa. El aumento de rendimiento de biomasa encaja con el descenso en el rendimiento de glicerol en TMB3271, puesto que NAD^{+} se consume durante la formación de biomasa y se regenera durante la formación de glicerol.

Se han adoptado numerosos enfoques para mejorar el rendimiento y la productividad de etanol cambiando el metabolismo rédox durante la fermentación de xilosa en cepas recombinantes de S. cerevisiae (Tabla 5). Se observaron un aumento del rendimiento de etanol y un descenso del de xilitol (30 y 70%, respectivamente) en TMB3255 interrumpidos en el gen ZWF1 de la PPP oxidativa, como resultado de que se encuentra disponible menos NADPH para la reacción XR (4). También era probable que la producción excesiva de transhidrogenasa de Azotobacter vinelandii, que convierte NAD^{+} y NADPH en NADH y NADP^{+} en S. cerevisiae, redujera la concentración de NADPH intracelular. La cepa con una producción excesiva de TH mostró un ligero descenso en el rendimiento de xilitol mientras no se observó cambio alguno en el rendimiento de etanol (5).

La expresión de una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) dependiente de NADP^{+} en S. cerevisiae aumentó el rendimiento de etanol a partir de xilosa en un 25% (Verho et al. 2003). Engineering of redox cofactor metabolism for improved pentose fermentation in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 69: 5892-7). Se sugirió la modificación para dar como resultado un flujo de PPP menos oxidativo y por tanto una producción de CO_{2} más baja. El rendimiento de etanol aumentó un 127% cuando el gen ZWF1 de la PPP oxidativa era interrumpida en combinación con una producción excesiva de GADPH. Sin embargo, el rendimiento de etanol no era mayor que en los otros estudios debido a un bajo rendimiento inicial de la cepa de control.

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Asimismo se obtuvo un aumento del rendimiento de etanol sobre la xilosa mediante diseño metabólico de la asimilación de amonio (7). El rendimiento de etanol aumentó 19%, y el rendimiento de xilitol disminuyó 16%, suprimiendo el gen GDH1, que codifica una glutamato deshidrogenasa dependiente de NADPH, y expresando en exceso el gen GDH2, que codifica una glutamato deshidrogenasa dependiente de NADH. Otra estrategia fue la expresión en exceso de los genes GLT1 y GLN1, que codifican el complejo GS-GOGAT que requiere NADH y ATP, en la cepa con GDH1 suprimido, lo que dio como resultado un rendimiento de etanol 16% más alto.

Esta investigación demuestra que es posible mejorar el rendimiento de etanol (11% superior en TMB3271 que en TMB3260) a una velocidad de consumo de xilosa mantenida expresando el mutante XYL1 K270M a un nivel elevado. Las condiciones de cultivo no fueron las mismas en las diferentes investigaciones, pero puesto que TMB3001 había sido incluida en todos los casos excepto para las cepas con una producción excesiva de GDP1, está claro que TMB3260 (2copias de XYL1), TMB3271 (2 copias de XYL1 (K270M)) y CBP.CR5 (\Deltagdh1 GS-GOGAT), tenían velocidades de consumo de xilosa comparativamente altas (Tabla 5). Las cepas CBP.CR5 (\Deltagdh1 GS-GOGAT) y TMB3271 (2 copias de XYL1 (K270M) también tenían rendimientos de etanol elevados en comparación con TMB3001. Los resultados del diseño metabólico de los diferentes estudios demuestran cuán difícil es aumentar el rendimiento de etanol interfiriendo en el metabolismo redox, y suscita la cuestión del límite de flexibilidad de las rutas metabólicas centrales en S. cerevisiae.

Leyenda de la figura

Figura 1. Flujos en la ruta de la xilosa (mmol * g biomasa^{-1} * h^{-1}) para TMB3001 (valor superior, no negrita), TMB3270 (valor inferior, no negrita), TMB3260 (valor superior, negrita) y TMB3271 (valor inferior, negrita) cultivadas en un cultivo continuo con 10 g l^{-1} de glucosa y 10 g l^{-1} de xilosa. La absorción de azúcar (glucosa + xilosa) se normalizó a 100 mmoles * g biomasa^{-1} * h^{-1}.

Referencias

1. Eliasson, A., C. Christensson, C. F. Wahlbom, and B. Hahn-Hägerdal. 2000. Anaerobic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and XKS1 in mineral medium chemostat cultures. Appl. Environ. Microbiol. 66:3381-3386.

2. Jeppsson, M., K. Träff, B. Johansson, B. Hahn-Hägerdal, and M.-F. Gorwa-Grauslund. 2003. Effect of enhanced xylose reductase activity on xylose consumption and product distribution in xylose-fermenting recombinant. Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 3:167-175.

3. Träff-Bjerre, K. L., M. Jeppsson, B. Hahn-Hägerdal, and M.-F. Gorwa-Grauslund. 2004. Endogeneous NADPH-dependent aldose reductase activity influences product formation during xylose consumption in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Yeast 21:141-150.

4. Jeppsson, M., B. Johansson, B. Hahn-Hägerdal, and M. Gorwa-Grauslund. 2002. Reduced oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Appl. Environ. Microbiol. 68:1604-1609.

5. Jeppsson, M., B. Johansson, P. Ruhdal-Jensen, B. Hahn-Hägerdal, and M. Gorwa-Grauslund. 2003. The level of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity strongly influences xylose fermentation and inhibitor sensitivity in recombinant Saccharomyces cerevisiae strains. Yeast 20:1263-1272.

6. Zhang, Y., and H. Lee. 1997. Site-directed mutagenesis of the cysteine residues in the Pichia stipitis xylose reductase. FEMS Microbiol. Lett. 147:227-232.

7. Roca, C., J. Nielsen, and L. Olsson. 2003. Metabolic engineering of ammonium assimilation in xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae improves ethanol production. Appl. Environ. Microbiol. 69:4732-4736.

Claims

1. Una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae que utiliza xilosa que fermenta xilosa a etanol donde la cepa expresa

a): dos copias de un gen XYL1 de P. stipitis mutado K270M,

b): el gen XYL2 de P. stipitis nativo y

c): expresa en exceso el gen XKS1 endógeno de Saccharomyces cerevisiae.