ES2306752T3 - Metodo para indentificar compuestos biologicamente activos con propiedades antiasmaticas y/o antialergicas. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un compuesto biológicamente activo con propiedades antiasmáticas, y/o antialérgicas que comprende las siguientes etapas: a) Poner en contacto un TLR2 (llamado receptor 2 tipo Toll) con dicho compuesto biológicamente activo b) Determinar si dicho compuesto biológicamente activo aumenta la actividad basal de este susodicho TLR2.
Description
Método para identificar compuestos
biológicamente activos con propiedades antiasmáticas y/o
antialérgicas.
La presente invención se refiere a métodos
nuevos para identificar compuestos biológicamente activos con
propiedades antiasmáticas, antialérgicas y/o inmunosupresoras.
Varios factores pueden afectar el asma alérgico.
El asma alérgico se caracteriza por una concentración sérica mayor
de IgE específica al antígeno e inflamación oesinófila de las vías
respiratorias, que está acompañada de una reactividad mayor de las
vías respiratorias. Las citoquinas IL-4
(interleuquina-4), IL-5
(interleuquina-5), e IL-13
(interleuquina-13) parecen tener un papel clave en
la patogénesis de las enfermedades alérgicas. El antígeno/alergeno
induce en los individuos sensibilizados el entrecruzamiento de IgE
en los mastocitos seguido de la liberación de varias moléculas
bioactivas preformadas tales como, histamina, triptasa, y factor
quimotáctico de los eosinófilos de la serotonina (ECF), lo que
produce una bronco constricción aguda, secreción de moco,
vasodilatación e inflamación del pulmón debido a la liberación de
moléculas nuevamente formadas como leucotrienos, prostaglandinas y
varias citoquinas (IL-4, IL-5,
factor necrótico tumoral \alpha o
TNF-\alpha).
La incidencia de asma ha aumentado en los
últimos veinte años y la necesidad de terapias más específicas es
real.
Los receptores de Toll se describieron por
primera vez en la Drosófila donde la proteína de Toll controla los
patrones dorso ventrales durante el desarrollo embrionario de la
Drosófila (Hashimoto et al., 1988, Cell, vol. 52, páginas
269-279; Belvin y Anderson, 1996, Annu. Rev. Cell
Dev. Biol., vol. 12, páginas 393-416 y es requerida
para la respuesta inmune antifúngica en la mosca adulta (Lemaitre
et al., 1996, Cell, vol. 86, páginas
973-983). La proteína de Toll es un receptor de
transmembrana de tipo I con un dominio extracelular que contiene
repetidores ricos en leucina (LRR) y un dominio citoplasmático
similar al del receptor de la interleuquina 1 en los mamíferos.
Se han identificado homólogos de Toll en los
mamíferos, designados como receptores tipo Toll (TLRs). Los TRLs de
los mamíferos son homólogos con y tienen la estructura preservada
del sistema Toll de la Drosófila (Medzhitov et al., 1997,
Nature, Vol. 388, páginas 394-397). Se han descrito
hasta la fecha 10 miembros de la familia TLR y esos miembros se
llaman TLR1 al TRL10 (Underhill y Ozinski, 2002, Curr. Opin.
Immunol., vol.14, páginas 103-110). Se sabe que los
miembros de la familia TRL activan el factor de transcripción NFkB
por medio de una proteína de adaptación MyD88 y una serina/treonina
quinasa IRAK (Medzhitov et al., 1998, Mol. Cell., vol. 2,
páginas 253-258; Muzio et al., 1998, J. Exp.
Med., vol. 187, páginas 2097-2101; Kawai et
al., 1999, Immunity, vol. 11, páginas 115-122).
Además, las TRLs de los mamíferos tienen un papel esencial en la
inmunidad innata reconociendo patrones moleculares conservados
asociados con patógenos e iniciando la activación de NFkB y otros
caminos de señalización a través de la proteína de adaptación MyD88
(Schnare et al., 2001, Nature Immunology, vol. 2, páginas
947-950).
Los estudios han mostrado que, entre los
miembros de la familia TLR, TLR2 está implicado en el reconocimiento
de varios componentes de la pared celular bacteriana. Takeuchi
et al. (1999, Immunity, vol. 11, páginas
443-451) demostraron que TLR2 tiene un papel
importante en el reconocimiento de bacterias Gram positivas ya que
TLR2 es esencial para la respuesta al péptidoglicano bacteriano
(PGN) que es un componente esencial en el reconocimiento bacteriano
Gram positivo. Así, TRL2 media las respuestas celulares a una amplia
variedad de patógenos infecciosos y sus productos. Estos incluyen
paredes celulares de las levaduras, bacteria enteras,
lipoarabinomanan de micobacterias, bacterias enteras Gram
positivas, peptidoglicano (PGN), anclaje de glicolípido de Treponema
y anclaje de glicofosfatidilinositol de Tripanosoma cruzi
(para una revisión, véase Akira et al., 2001, Nature
Immunology, vol. 2, páginas 675-680).
Además, TLR2 media las respuestas a las
lipoproteínas que son antígenos secretados derivados de M.
tuberculosis, Borrelia burgdorfei, Treponema palidum y Micoplasma
fermentans (para una revisión, véase Akira et al., 2001,
Nature Immunology, vol. 2, páginas 675-680). Además,
Werts et al. (2001, Nature Immunology vol. 2, páginas
346-352) describió que se requiere TLR2 en las
respuestas inmunes innatas a los lipopolisacáridos de leptoespira
(LPS). La Leptospira interrogans pertenece al orden de las
espiroquetas que constituye un filum de eubacterias.
También se ha demostrado que TLR2 debe
dimerizarse con otros TLRs como TLR1 o TLR6 u otros TLRs para
detectar ligandos e inducir la señalización (Ozinsky et al.,
2000, PNAS, vol. 97, páginas 13766-13771; Takeuchi
et al., 2002, J. Immunol., vol. 169, páginas
10-14).
Los siguientes documentos
- \quad
- LIEN E et al: "Toll-like receptor 2 functions as a pattern recognition receptor for diverse bacterial products" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 274, nº 47, 19 de Noviembre de 1999 (1999-11-19), páginas 33419-33425, XP002161197 ISSN: 0021-9258, document de patente internacional WO 01/36488A,
- \quad
- TAKEUCHI OSAMU et al: "Cutting Edge: Role of toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins. "JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 169, nº 1, 1 de Julio de 2002 (2002-07-1), páginas 10-14, XP002228542 1 de Julio, 2002 ISSN: 0022-1767, y FLO T H; HALAAS O; LIEN E; RYAN L; TETI G; GOLENBOCK D T; SUNDA A; ESPEVIK T: "Human toll-like receptor 2 mediates monocyte activation by Listeria monocytogenes, but not by group B streptococci or lipopolysaccharide" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 164, nº 4, 15 de Febrero del 2000 (2002-02-15), páginas 2064-2069, XP002161196 USA ISSN: 0022-1767
describen la investigación de varios compuestos
tales como compuestos bacterianos en cuanto a su habilidad para
alterar (por ejemplo aumentar) la actividad basal de TLR2 en las
células.
- \quad
- El documento de patente internacional WO 01/55386 A describe métodos de criba para moduladores de TLR9 útiles por ejemplo contra el asma.
- \quad
- El documento de patente internacional WO 99/66947 A proporciona métodos y compuestos para el tratamiento de trastornos alérgicos y otros trastornos inmunes asociados con la producción excesiva de citoquinas tipo Th2 por células T específicas a los antígenos.
- \quad
- El documento de patente internacional WO 01/74375 A proporciona composiciones y métodos para inhibir respuestas inmunes asociadas con enfermedades autoinmunes y respuestas alérgicas.
- \quad
- El documento de patente internacional WO 99/52549 A describe vacunas que protegen contra las infecciones, alergia y cáncer.
Los inventores se preguntaron si el receptor de
señalización de la inmunidad innata, TLR2, tiene un papel regulador
en un modelo experimental de asma alérgica. Usando ratones
deficientes en TLR2, los inventores encontraron un aumento
dramático de hiperreactividad bronquial (BHR) después del
enfrentamiento con ovoalbúmina a ratones inmunizados. El aumento de
BHR estuvo asociado con un aumento de tres veces en los eosinófilos
en el fluido de BAL (lavado bronco alveolar) y en el tejido
pulmonar. A la inversa, la administración local de lipoproteína
(LP), un agonista natural de TLR2, inhibió BHR y la eosinofilia en
los pulmones. Los datos demuestran por primera vez que TLR2 tiene
un papel crítico en el control del asma inducido por alergenos, y
que la activación de TLR2 previene el asma alérgico. Por lo tanto,
TLR2 representa una diana para fármacos para terapia nueva del asma
bronquial y los trastornos alérgicos en general.
La presente invención se refiere a un método
para identificar un compuesto biológicamente activo con propiedades
antiasmáticas y/o antialérgicas en donde este comprende las
siguientes etapas:
a) Poner en contacto un TLR2 con dicho compuesto
biológicamente activo, y
b) Determinar si dicho compuesto biológicamente
activo aumenta la actividad basal de dicho TLR2.
En cuanto a compuestos biológicamente activos,
la invención da una consideración particular a compuestos químicos
naturales o sintéticos tales como, por ejemplo, pero no restringidos
a proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, polisacáridos,
etc... La validación de la actividad biológica de dicho compuesto
puede realizarse utilizando un modelo animal sensibilizado en el
que la hiperreactividad bronquial (BHR), la cantidad de eosinófilos
en el fluido del BAL (lavado bronco alveolar) y en el tejido
pulmonar se miden y se comparan antes y después de la administración
de dicho compuesto.
En una primera realización, la etapa (a) en el
método objeto de la presente invención comprende las siguientes
etapas:
i) cultivar células que expresan TLR2 funcional,
y
ii) incubar dichas células con dichos compuestos
biológicamente activos.
Ventajosamente, las células cultivadas en la
etapa (i) del método objeto de la invención son células que expresan
en exceso TLR2. Cualquier célula, que puede expresar TLR2 en
exceso, puede usarse en el alcance de la invención. Dichas células
son preferiblemente células de mamífero, dichas células de mamífero
se escogen del grupo constituido por células HEK293 humanas y
células BAF3 murinas.
Puede usarse para transformar las células que
expresan en exceso TLR2 una molécula que codifique TLR2 o un vector
como se describe anteriormente.
La molécula que codifica ácido nucleico que
codifica TLR2 es ventajosamente una molécula que codifica TLR2 de
mamíferos y, más preferiblemente, una molécula que codifica TLR2
humano. Las secuencias de estas moléculas pueden obtenerse en
Genbank con los números (NM_003264 para la humana y NM_011905 para
el ratón).
Debido a la degeneración de secuencias que
codifican a nucleótidos, otras secuencias de ADN, que codifican
sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que el gen de
TLR2 pueden usarse en la práctica de la presente invención. Estas
incluyen pero no están limitadas a secuencias de nucleótidos que
comprenden todo o parte de los genes de TLR2 que están alterados
por la sustitución de codones diferentes que codifican un residuo
de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia,
produciendo así un cambio silencioso. En cuanto al residuo de
aminoácido funcionalmente equivalente, debe entenderse, por ejemplo,
un aminoácido que pertenece a la misma clase que el aminoácido
silvestre. La persona con conocimiento de la técnica conoce las
clases de aminoácidos, que son los aminoácidos no polares
(hidrófobos), los aminoácidos neutrales polares, los aminoácidos
cargados positivamente (básicos) y los aminoácidos cargados
negativamente (ácidos). Además, las secuencias genéticas de TLR2
usadas en la presente invención pueden producirse por varios métodos
conocidos en la técnica.
Además, la persona con conocimientos de la
técnica podrá obtener un ácido nucleico que codifique TLR2 usando
el mARN de TLR2 obtenido de Genbank con los números (NM_003264 para
el humano y NM_011905 para el ratón) y usar la transcripción
inversa.
El vector que puede usarse en el alcance de la
presente invención para transformar las células que expresan en
exceso TLR2 o TLR2 asociado con TLR1 o TLR6 u otros TRLs comprende
al menos una molécula de ácido nucleico que codifica TLR2 como se
describe anteriormente, ventajosamente asociado con secuencias de
control adaptadas, junto con un proceso de producción o expresión
en un hospedante celular de TLR2. El vector usado se escoge en
función del hospedante (células cultivadas) dentro del que se va a
transferir; puede ser cualquier vector tal como un plásmido. La
preparación de estos vectores así como la producción o expresión en
una proteína hospedante de la invención puede llevarse a cabo con
técnicas de biología molecular e ingeniería genética bien conocidas
por aquellos conocedores de la técnica.
Además, como se ha demostrado que TLR2 debe
dimerizarse con otros TLRs como TLR1 o TLR6 u otros TLRs para
detectar ligandos e inducir la señalización (Ozinsky et al.,
2000, PNAS, vol. 97, páginas 13766-13771; Takeuchi
et al., 2002, J. Immunol. Vol. 169, páginas
10-14), las células que expresan o que expresan en
exceso TLR2 pueden también expresar en exceso otros TLRs como TLR1
o TLR6. Todo lo que se describe anteriormente en relación a TLR2 (o
sea, molécula de codificación de ácido nucleico, vector) es
aplicable también a otros TLRs y más particularmente a TLR1 y TLR6.
La persona con conocimientos de la técnica podrá obtener una
molécula que codifique ácido nucleico que codifica TLR1 o TLR6 en
Genbank con los números NM_003263 para el TLR1 humano y NM_030682
para el TLR1 del ratón; NM_006068 para el TLR6 humano y NM_011604
para el TLR6 de ratón, respectivamente.
Un compuesto que aumenta la actividad basal de
un receptor, se llama normalmente un agonista. La unión de un
agonista a un receptor ocasiona un cambio en la conformación del
receptor, y dentro de la célula, y esta señal se transduce con
segundos mensajeros como intermediarios. Consecuentemente, el objeto
de la etapa (b) en el procedimiento de la invención es, después de
poner en contacto el compuesto capaz de ser agonista de TLR2 o de
TLR2 asociado con TLR1 o TLR6 u otros TLRs, medir por cualquier
medio apropiado la afinidad entre dicho compuesto y dicho
receptor.
El contacto entre el compuesto que se va a
probar y el TRL2 o TRL2 en asociación con TLR1 o TRL6 u otros TRLs
puede llevarse a cabo usando células que expresan dichos receptores
al menos en su superficie confirmado por marcaje con anticuerpos y
citometría de flujo. Si el compuesto probado constituye un agonista,
su contacto con las células transformadas induce señales
intracelulares, que se originan con la fijación de dicho compuesto
en el receptor.
Así, la determinación de que el compuesto
biológicamente activo probado es un agonista de TRL2 en la etapa
(b) del método objeto de la presente invención puede realizarse por
cualquier método conocido por cualquiera con conocimientos de la
técnica. Ventajosamente, puede medirse un aumento del nivel de
actividad basal de TLR2 o TRL2 en asociación con TLR1 o TRL6 u
otros TRLs. Dicho aumento de actividad basal puede medirse gracias
al aumento de la actividad inducida de TRL2. La actividad inducida
de TRL2 puede medirse por activación de un acontecimiento de
transducción de señal (obteniéndose típicamente la activación de
NF-kB) o activación de transcripción de un gen
reportero (regulado típicamente por medio de elementos sensibles a
NF-kB.
La persona con conocimientos de la técnica podrá
encontrar procedimientos y condiciones para medir la activación de
un evento de transducción de señal tal como la actividad de IRAK de
la serina/treonina quinasa y la activación/translocación de
NF-kB.
Más particularmente, la activación inducida de
TRL2 puede ser medidas en pruebas de genes reporteros como se
describe en Werts et al. (2001, Nature Immunology, vol. 2,
páginas 346-352). La activación inducida de TRL2
medida es ventajosamente la activación de NF-kB. La
activación de un gen reportero tal como la alcalinofosfatasa
inducida por TRL2; puede medirse fácilmente con la luciferasa o la
proteína verde fluorescente utilizando una prueba de colorimetría o
fluorimetría adecuada. La persona con conocimientos de la técnica
encontrará las condiciones adecuadas para realizar estas pruebas de
gen reportero.
En una segunda realización, las etapas (a) y (b)
del método de la presente invención pueden también llevarse a cabo
fijando uno o varios TRL2 en una de varias membranas. El TRL2 puede
de esta forma ser también integrado con un biosensor. En dicho
sistema, es posible visualizar en tiempo real las interacciones
entre el compuesto que se está probando y el receptor. Se fija uno
de los componentes de la pareja receptor/ligando en una interfase,
que puede contener una matriz, cubierta de cadenas alifáticas. Esta
matriz hidrófoba puede ser fácilmente cubierta con una capa de
lípidos por la fusión espontánea de liposomas inyectados en el
contacto. El TRL2 insertado en los liposomas o vesículas puede así
integrarse en los biosensores. El compuesto biológicamente activo
se analiza de esta manera en relación a uno o varios TRL2. En este
tipo de experimentación, como se describió anteriormente, el TRL2
puede estar asociado con TLR1 o TRL6 u otros TRLs.
\newpage
Se probarán aproximaciones alternativas tales
como la unión del agonista con TRL2 humano usando el BioSensor, que
además permite medir la afinidad de la unión.
La presente invención se refiere también al uso
de cualquier agonista de TRL2 para la fabricación de un medicamento
útil para tratar y/o prevenir el asma y/o las alergias,
en donde el agonista de TRL2 se escoge entre el
grupo constituido por glicolípidos de Triponema, anclaje de
glicofosfatidilinositol de Tripanosoma cruzi, lipoproteínas
derivadas de Borrelia burgdorfei, Triponema palidum y
Micoplasma fermentans y lipopolisacáridos de leptoespira.
La cantidad del compuesto biológicamente activo
o agonista de TRL2 que será eficaz en el tratamiento y/o prevención
del asma y/o alergias dependerá de la naturaleza del trastorno o
condición y puede determinarse por técnicas estándares
experimentales y clínicas. Además, pueden emplearse opcionalmente
las pruebas in vitro para ayudar a identificar intervalos de
dosificación óptimos. Además, la dosis precisa que se emplee en la
formulación dependerá también de la vía de administración. Las
dosis eficaces pueden extrapolarse de las curvas de dosis/respuesta
derivadas de los sistemas de prueba in vitro o de modelos
animales.
Otras ventajas y características de la invención
serán aparentes leyendo los siguientes ejemplos que conciernen al
papel de TRL2 en la hiperreactividad bronquial (BHR) inducida por
los antígenos, y la inhibición por la lipoproteína del asma
alérgico, y en los que:
La figura 1 se refiere al aumento de BHR en
ratones TLR2 KO sensibilizados por antígeno versus ratones tipo
silvestre;
Las figuras 2 se refieren al aumento en el
número total de células en el BAL (A) y el reclutamiento de
eosinófilos en el BAL de los ratones TLR2 KO (B);
La figura 3 se refiere al aumento en la
infiltración peribronquial de eosinófilos en ratones TLR2 KO;
La figura 4 se refiere al aumento de las
concentraciones de IL-4, IL-5 e
IL-13 en BAL;
La figura 5 presenta concentraciones séricas
aumentadas de IgE específica en ratones TLR2 KO;
La figura 6 presenta la inhibición por
lipoproteína (LP, 10 \mug) de BHR (A); reclutamiento de
eosinófilos (B) en ratones tipo silvestre sensibilizados con el
antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones TLR2 -/- y +/+ se obtuvieron de Dr C
Kirschning. El comité ético local aprobó todos los protocolos
empleados en este estudio. Los ratones, de 6 a 8 semanas de edad, se
inmunizaron por vía subcutánea dos veces a intervalos semanales con
0,4 ml de ClNa que contenía 100 g de Ova y 1,6 mg de alumbre. Los
ratones fueron enfrentados por vía intranasal dos veces a
intervalos semanales, una semana después de la segunda inmunización,
en los días 14 y 21 con anestesia ligera intravenosa de ketamina
(que prevenía la tos) aplicando 2 x 25 \mul Ova con solución
salina libre de alumbre (10 \mug) o solución salina sola como
control. Se administró la lipoproteína bacteriana (10 \mug) 1
hora antes del enfrentamiento a los ratones TLR2 +/+ sensibilizados
con Ova.
\vskip1.000000\baselineskip
La resistencia de las vías respiratorias se
evaluó por pletismografía de cuerpo entero 24 horas después del
último enfrentamiento (día 22). Se investigó la hiperreactividad
bronquial a la metacolina en aerosol en varios tiempos después del
enfrentamiento con Ova. Ratones conscientes no inmobilizados se
colocaron en cámaras de pletismografía de cuerpo entero (Buxco
Electronic, Sharon, CO, USA). Se ventiló a los ratones para evitar
la hipoxemia inducida por la administración de metacolina (Corry
et al 1998). Se administró como aerosol metacolina a 300 mM
durante 50 segundos y se obtuvo lecturas de la media de la
broncoconstricción de las vías aéreas medida por el aumento de la
pausa respiratoria (Enhanced Respiratory Pause) (PenH), en periodos
de 15 minutos. PenH puede ser conceptualizada como la fase de
cambio de las curvas del flujo torácico y el flujo nasal; una fase
de cambio mayor se correlaciona con una resistencia mayor del
sistema respiratorio. PenH se calcula con la fórmula PenH =
(Te/RT-1) x PEF/PIF, donde Te es el tiempo de
expiración, RT es el tiempo de relajación, PIF es el valor máximo
del flujo inspirador, PEF es el valor máximo del flujo
expirador.
Los valores de PenH se corresponden con una
media de once eventos (ciclos) cada cinco segundos de datos
brutos.
Después del análisis de los datos, se indican
los valores de PenH para 3 puntos (-3 minutos a 1 minuto) antes y
14 puntos (+ 1 minuto a + 14 minutos) después de la nebulización de
la metacolina. En este caso, el valor indicado de PenH en cada
punto se corresponde con la media de los valores de PenH entre 1
minuto antes y 1 minuto después del punto (por ejemplo, valores de
PenH a +5 minutos se corresponden con la media de todos los valores
entre el punto +4 minutos y el punto +6 minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el BAL 3 días después del
enfrentamiento intranasal con anestesia fuerte de ketamina lavando
con 4 volúmenes de 0,5 ml cada uno de PBS a la temperatura de hielo
fundente. Se centrifugó el fluido de lavado, se resuspendió, se
contó en una cámara de hematocitómetro y la preparación de citospin
se realizó usando una citocentrífuga de Shandon. Se analizaron las
células después de teñido diferencial con
May-Gruenwald-Giemsa.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del lavado broncoalveolar, se mataron
los ratones (3 días después del enfrentamiento con Ova). Se tomó el
pulmón entero y se fijó con formaldehído tamponado al 4% para el
análisis estándar con microscopio usando manchas de H&E y PAS
(mucosidad). Se evaluó el infiltrado peribronquial y la hiperplasia
del músculo liso con un contaje semi cuantitativo (0 - 3) por dos
observadores independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomó fluido de BAL 48 horas después del
último enfrentamiento y se analizó para IL-4,
IL-5 e IL-13 por ELISA usando kits
comerciales (Pharmingen).
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomó sangre 48 horas después del último
enfrentamiento y se preparó el suero para dosificación de IgE
específica para OVA por ELISA usando IgE de rata antiratón (BD
Biosciences) para la captura y ovoalbúmina biotinilada y conjugado
de ExtrAvidina peroxidasa para revelar. Se usó suero de ratones
hiperinmunizados con OVA en alumbre como estándar en el ELISA de
IgE específica para OVA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos se presentan como la media y el error
estándar de la media (SEM) indicado con barras de error. La
significación estadística se determinó usando la prueba t de
Student. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente
significativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Primeramente, se investigó el papel de TLR2 en
la hiperreactividad bronquial inducida (Ova) por el antígeno. El
enfrentamiento del antígeno en ratones de tipo silvestre
sensibilizados causó BHR (figura 1). En ausencia de TLR2, por
ejemplo en ratones deficientes en TLR2, BHR aumentó al menos 2 veces
si se compara con los controles del tipo silvestre sensibilizados
(p<0,05).
Segundo, el contaje celular total y diferencial
fue llevado a cabo en el fluido BAL en ratones sensibilizados con
Ova. El enfrentamiento del antígeno de los ratones de tipo silvestre
causó un aumento apreciable de las células mononucleares y
especialmente de eosinófilos (figuras 2A y 2B). En ratones
deficientes TLR2 se encontró un aumento significativo (p<0,01)
adicional de las células totales y eosinófilos en el fluido BAL.
Pudo demostrarse un reclutamiento marcado de eosinófilos en las
secciones del pulmón de ratones sensibilizados y enfrentados a Ova,
que fue claramente más prominente en ratones deficientes TLR2. El
reclutamiento en las células peribronquiales está asociado con
hiperplasia del músculo liso bronquial y las células de goblet con
hipersecreción mucosa que fue más prominente en ausencia de TLR2 en
comparación con los controles (figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
El asma alérgico está asociado con una
producción aumentada de citoquinas Th2. Por lo tanto, los inventores
se preguntaron si las citoquinas Th2 estaban aumentadas en los
ratones TLR2KO. Las concentraciones de IL-4,
IL-5, e IL-13 estaban aumentadas en
el fluido BAL de ratones de tipo silvestre enfrentados a Ova.
Además, en la ausencia de TLR2 las concentraciones de citoquinas
estaban significativamente elevadas (figura 4).
La respuesta de la citoquina Th2 prevalente está
asociada con concentraciones de IgE aumentadas. Por tanto, las
concentraciones de citoquinas aumentadas favorecerían la síntesis
aumentada de IgE. Realmente, las concentraciones de IgE fueron
además aumentadas en la ausencia de TLR2 si se comparaba con los
ratones de tipo silvestre (figura 5).
Los datos actuales sugieren que TLR2 controla la
respuesta alérgica y que la ausencia de TLR2 aumenta la producción
de citoquinas Th2 y la producción de IgE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya que la ausencia de TLR2 aumenta la respuesta
alérgica, los inventores probaron la posibilidad de que un agonista
de TLR2 pudiera modular la BHR. Los inventores administraron el
agonista TLR2, lipoproteína (LP), intranasalmente a 10 \mug justo
antes del enfrentamiento con el antígeno a ratones tipo silvestre
sensibilizados.
Los inventores mostraron que LP previno
significativamente BHR (figura 6A). La inhibición de BHR por LP es
comparable a aquella del esteroide budesonida (datos no
mostrados).
Además, LP inhibió el reclutamiento de las
células dentro del fluido BAL, con una reducción dramática de
eosinófilos en BAL (figura 6B).
Juntos, los datos obtenidos con el agonista LP
de TLR2 sugiere que la activación de TLR2 puede inhibir el asma
alérgico en ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio demuestra por primera vez que el
reconocimiento y señalización de TLR2 pueden ser críticos en la
respuesta bronquial alérgica. Ratones deficientes en TLR2 tienen
aumentado BHR, el reclutamiento de eosinófilos, las concentraciones
de IgE y las concentraciones de IL-4. Aunque el
alérgeno, Ova, no es reconocido por el receptor inmune innato, los
antígenos ambientales que incluyen la endotoxina y otros pueden ser
reconocidos por TLR2 y señalizar una señal protectora. Si está
ausente como en ratones deficientes de TLR2, una respuesta inmune de
Th2 prevalece conduciendo a una respuesta de asma aumentada.
La participación de TLR2 en los ratones de tipo
silvestre mediante el agonista LP de TLR2 previene BHR y el
reclutamiento de eosinófilos dentro de BAL y los tejidos
pulmonares.
Para explotar estos descubrimientos, agonistas
químicos pequeños de TLR2 necesitan ser identificados y probados en
la prevención y tratamiento del asma alérgico.
El presente estudio sugiere que TLR2 representa
una nueva diana de fármaco para medicinas para tratar asma bronquial
y trastornos alérgicos en general.
Claims (13)
1. Un método para identificar un compuesto
biológicamente activo con propiedades antiasmáticas, y/o
antialérgicas que comprende las siguientes etapas:
- a)
- Poner en contacto un TLR2 (llamado receptor 2 tipo Toll) con dicho compuesto biológicamente activo
- b)
- Determinar si dicho compuesto biológicamente activo aumenta la actividad basal de este susodicho TLR2.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
dicha etapa (a) comprende las etapas siguientes:
- i)
- Cultivar células que expresan TLR2 funcional, y
- ii)
- Incubar dichas células con dichos compuesto biológicamente activo.
3. El método según la reivindicación 2, en donde
las células cultivadas en la etapa (i) son células que expresan en
exceso TLR2.
4. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 o 3, en donde las células cultivadas en la etapa
(i) son células de mamífero.
5. El método según la reivindicación 4, en donde
las células de mamífero se escogen del grupo constituido por células
HEK293 y células BaF3.
6. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en donde las células cultivadas en la etapa
(i) son transformadas con una molécula de ácido nucleico que
codifica TLR2, o con un vector que comprende al menos una molécula
de ácido nucleico que codifica TLR2, ventajosamente asociada con
secuencias de control adaptadas.
7. El método según la reivindicación 6, en donde
la molécula de ácido nucleico que codifica TLR2 es una molécula que
codifica un TLR2 de mamífero y, más preferiblemente, una molécula
que codifica un TLR2 humano.
8. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, en donde en las células cultivadas en la
etapa (i) se expresan en exceso además otros TLRs tales como TLR1 o
TLR6.
9. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicho aumento en el nivel de
actividad basal de TLR2 se mide gracias al aumento en la activación
inducida de TLR2.
10. El método según la reivindicación 9, en
donde dicha activación inducida de TLR2 se mide a través de la
activación de un acontecimiento de transducción de señal o
activación de transcripción de un gen reportero.
11. El método según la reivindicación 1, en
donde, en dicha etapa (a), el TLR2 está insertado en liposomas o
vesículas e integrado dentro de biosensores.
12. El método según la reivindicación 11, en
donde TLR2 está asociado con TLR1 o TLR6 u otros TLRs.
13. El uso de un agonista de TLR2 para la
preparación de una medicina útil para el tratamiento o la prevención
de asma y/o alergias, en donde dicho agonista TLR2 es elegido entre
el grupo constituido por glicolípidos de Treponema, anclaje de
glicofosfatidilinositol de Tripanosoma cruzi, lipoproteínas
derivadas de Borrelia burgdorfei, Treponema pallidium y
Micoplasma fermentans, y lipopolisacáridos de
leptospira.
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